Années 2020-2021

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Université de Montpellier

Laboratoire de Pharmacognosie

1

^ère

PARTIE : INITIATION

TP UE3 - VASAM-Pharmacognosie du DFGSP2 - 2020-2021

Enseignants :

technicien : GUERMACHE Raluca, ROCHEL Sandra MCF : VIGOR Claire, MAILLARD Ludovic

Pr : VERCAUTEREN Joseph

Université de Montpellier

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des grandes classes de Substances Actives Médicamenteuses d’origine végétale

INTRODUCTION

TRAVAUX PRATIQUES DE VASAM - PHARMACOGNOSIE

Extraction, Caractérisation et Purification (Voies d’Accès) de Substances Actives Médicamenteuses d’Origine Végétale.

Les Travaux Pratiques de Pharmacognosie débutent dès votre DFGSP2, dans le cadre de l’UE3 VASAM-Pharmacognosie (Voie d’Accès aux Substances Actives Médicamenteuses d’origine végétale) de l’UE3. Ils se poursuivront en DFGSP3 (UE13).

En DFGSP2, il s’agit d’une phase d’initiation à la « chimie extractive des substances actives médicamenteuses ». Les 6 séances de TP ont pour but de vous faire découvrir les propriétés des principales classes de Substances Actives Médicamenteuses qui conditionnent leur extraction, leur caractérisation (« voie d’accès), et leur réactivité.

Ils sont indispensables pour vous permettre d’accéder en DFGSP3, à la phase d’utilisation, de mise en « pratique » des compétences acquises, pendant laquelle vous aurez à préparer par vous-même, à partir d’une drogue végétale, une Substance Active pure que vous validerez avant sa transformation en Médicament.

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CONSIGNES DE SECURITE

Sécurité dans la salle de TP Tarbouriech Travaux Pratiques de VASAM-Pharmacognosie

Au cours des travaux pratiques de VASAM-Pharmacognosie, chaque étudiant est amené à manipuler de la verrerie, des produits chimiques qui peuvent être toxiques, inflammables…, à réaliser ou utiliser des montages complexes ou à exécuter des opérations délicates. Tous ces facteurs peuvent engendrer des risques d'accidents (brûlures, coupures,…) ou d'intoxications graves pour soi-même ou pour ses voisins. C’est pourquoi, des règles élémentaires de sécurité doivent être impérativement respectées dans la salle, sous peine d’exclusion temporaire des séances de travaux pratiques.

Protection oculaire :

Le port des LUNETTES de sécurité est OBLIGATOIRE pendant toute la durée de la séance de travaux pratiques, même lorsque vous ne manipulez pas (il y a toujours des personnes qui manipulent autour de vous).

Les verres de contact sont à éviter : des vapeurs organiques ou corrosives peuvent les endommager de façon irréversible ou s'infiltrer sous la lentille.

Blouse :

Le port d’une BLOUSE pendant la séance est OBLIGATOIRE. Les blouses doivent être en tissu de COTON résistant. Elles doivent être assez longues pour protéger les jambes et dotées de manches longues. Il est préférable de porter des chaussures qui recouvrent entièrement le pied.

Cheveux :

Les cheveux longs doivent être impérativement attachés pendant les séances.

Comportement :

Il est INTERDIT de FUMER, MANGER, BOIRE, COURIR et TÉLÉPHONER dans le laboratoire.

Étiquetage des flacons :

Les flacons de produits chimiques à utiliser pendant la séance sont étiquetés. Il est donc impératif de bien lire les étiquettes avant d’utiliser les produits chimiques.

Au début de la première séance de travaux pratiques, il vous est demandé de PRENDRE CONNAISSANCE DES REGLES DE SECURITE s’appliquant pendant des travaux pratiques Pharmacognosie (cf ci-dessus) et de vous ENGAGER A RESPECTER CES CONSIGNES DE SECURITE. Le non-respect de ces consignes peut conduire à l’EXCLUSION temporaire des Travaux Pratiques VASAM- Pharmacognosie.

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INTRODUCTION

TP de VASAM-Pharmacognosie : 1

^ère

partie (DFGSP2)

Initiation à l’extraction et à la reconnaissance des grandes classes de Substances Actives Médicamenteuses (SAM) d’origine végétale

Ces travaux pratiques ont pour but de vous familiariser avec les « manipulations » à pratiquer sur les drogues végétales pour en extraire des substances médicamenteuses. Les drogues traitées sont choisies en fonction de la nature chimique (grandes classes chimiques) des principes actifs (PA) majeurs que l’on peut en extraire.

Au cours des 4 premières séances, vous apprendrez à reconnaître des drogues végétales, sur la base de leur contenu en l’une ou l’autre des 4 principales catégories de SAM suivantes :

§ ALCALOÏDES : quinquina (alcaloïdes quinoléiques).

§ TANINS + FLAVONOÏDES : pépins de raisin (tanins catéchiques), sophora (flavonoïdes).

§ SAPONOSIDES : racines de polygala (Polygala senega/tenuifolia)

§ ANTHRACÉNOSIDES : bourdaine, rhubarbes (Rheum officinalis et R.

rhaponticum).

Les métabolites végétaux sont, en général, mis en évidence par des réactions caractéristiques, en présence de réactifs "spécifiques". Pour la plupart de ces drogues, vous devrez réaliser des identifications ou des essais en suivant fidèlement ceux qui figurent à la monographie de la 11^ème Éd. de la Pharmacopée Française, mais surtout, de la 10^ème Éd. de la Pharmacopée Européenne. Dans certains cas, ici, ces monographies ont fait l’objet de modifications, ou des adaptations sont proposées, qui rendent possible leur réalisation dans des tranches horaires

« limitées » à 3h (TP), ou avec les moyens disponibles dans vos salles de TP.

Les essais « préliminaires » sur une plante ou partie de plante (la drogue) représentent toujours la première étape de son étude chimique, et doivent permettre d'orienter les recherches ultérieures. Les techniques de détection utilisables pour une recherche des substances actives doivent être rapides, simples, reproductibles et sensibles afin de ne mettre en œuvre qu'une faible quantité de drogue.

Les méthodes abordées ici en TP, sont donc limitées à une extraction et une mise en évidence rapides des quelques groupes chimiques de Principes Actifs (SAM) qui satisfont ces critères. Elles n'ont évidemment qu'une valeur indicative, et une confirmation ultérieure par des méthodes plus précises et plus sélectives peut être indispensable.

Utilisation des connaissances nouvellement acquises : caractérisation des SAM de deux drogues végétales

Au cours des 2 dernières séances, vous utiliserez les connaissances acquises pendant les 4 premières : l'enjeu sera de faire le diagnostic de mise en évidence/d'identification des SAM contenues dans 2 poudres de plantes "inconnues", en utilisant les réactions caractéristiques de votre choix.

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INTRODUCTION

En binôme pendant la 5^ème séance, ce sera une séance "d'essai", pendant laquelle vous vous entraînerez à cette mission, avec l'aide de vos enseignants. Pendant la 6^ème séance, ce sera le moment ou jamais de "faire parler la poudre" : lors de cette 6^ème séance, vous aurez à faire seul(e) le diagnostic du type de SAM (alcaloïdes, (poly)phénols, saponosides ou anthracénosides) que renferment deux drogues végétales « inconnues », à l’état de poudre. Par la méthode de diagnose qui vous semblera la plus rapide et/ou efficace, il vous sera demandé de retrouver la nature des PA et de nous présenter vos conclusions justifiant cette identification, sur Moodle®.

Évaluation des Travaux Pratiques de VASAM-Pharmacognosie

Un contrôle continu :

Chacune des 4 premières séances génèrera une note (mini-Quiz Moodle® de 5 min.).

Vous devez préparer la séance avant votre TP : votre efficacité en dépend. Il s’agit pour vous, de savoir, avant d'arriver en TP, sur quels principes reposent la « mise en évidence » des SAM que vous aurez à traiter pendant la séance. Pour vous inciter à cette préparation, une interrogation "surprise" peut être faite (quiz de 5 min.), en tout début de chaque séance. S'il n'y a pas d’interro en début, vous aurez un quiz en fin de séance (5 min.), qui visera à évaluer les acquisitions réalisées pendant la séance... et votre compréhension.

La 6^ème séance donnera lieu à une note qui résumera votre travail en TP et votre capacité à reconnaître les types de SAM que contiennent les 2 poudres végétales « inconnues ».

Ordre de réalisation des TP 1 à 4 :

À chaque séance, chaque groupe (A à E) est réparti en 2 séries :

La série 1 fera les TP 1 à 4 dans l'ordre suivant : La série 2 fera les TP 1 à 4 dans l'ordre suivant :

• Alcaloïdes (séance 1) • (poly)phénols (séance 1)

• (poly)phénols (séance 2) • Alcaloïdes (séance 2)

• Saponosides (séance 3) • Anthracénosides (séance 3)

• Anthracénosides (séance 4) • Saponosides (séance 4)

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INITIATION

Table des matières pour les étudiants des séries 1 Pour les séries 2, il convient d’intervertir TP1 avec TP2, et TP3 avec TP4

TP1 : Substances Actives Médicamenteuses ALCALOÏDIQUES 7

TP2 : Substances Actives Médicamenteuses (POLY)PHENOLIQUES : TANINS saponifiables et

CONDENSÉS & FLAVONOÏDES 14

TP3 : Substances Actives Médicamenteuses SAPONOSIDIQUES 23

TP4 : Substances Actives Médicamenteuses ANTHRACÉNOSIDIQUES 30

TP5 : Utilisation des connaissances nouvellement acquises : Diagnostic (diagnose) des

SAM de deux drogues végétales « inconnues » (mode entraînement) 39

TP6 : Vérification des compétences acquises : Diagnostic (diagnose) des SAM de deux

drogues végétales « inconnues » (mode « examen ») 40

TABLEAU RÉCAPITULATIF d’aide à la DIAGNOSE des principaux TYPES de SAM 41

RÉACTIFS 50

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Substances Actives Médicamenteuses ALCALOÏDIQUES

TP1 : Substances Actives Médicamenteuses ALCALOÏDIQUES

Méthode générale d’extraction des alcaloïdes

La solubilité des alcaloïdes présente la particularité de varier radicalement en fonction du pH :

Les alcaloïdes sont donc solubles dans l’eau et les solvants organiques polaires, comme les alcools, tant qu’ils sont placés en milieu acide (parce que sous forme de sels d’alcaloïdes (ammonium). Par contre, ils sont solubles dans les solvants organiques peu polaires comme le dichlorométhane, le chloroforme, etc.…, en milieu alcalin (car ils sont sous forme de base, beaucoup moins polaires). Cette propriété, spécifique des alcaloïdes, est mise à profit dans les procédés d’extraction et de purification des « totum alcaloïdiques ». Par simple modification du pH, ils passent de la phase aqueuse à la phase organique et réversiblement :

Pour l’extraction des alcaloïdes, deux possibilités s’offrent donc à nous :

• Utiliser un acide fort (H2SO4) qui permettra la solubilisation des alcaloïdes présents dans la plante en les déplaçant de leurs combinaisons avec les acides organiques faibles et/ou les tanins, dans l’eau ou le méthanol.

• Alcaliniser la plante (NaOH, Na2CO3, …) et réaliser une extraction par un solvant organique peu polaire. L’avantage de cette seconde méthode est liée à la moindre chaleur massique d’évaporation du solvant organique par rapport à l’eau et à la facilité que nous avons de concentrer le totum alcaloïdique, notamment pour la réalisation d’une chromatographie sur couche mince (CCM), par exemple.

- - - +/- +++

la solubilité des alcaloïdes dépend du pH

solvants organiques peu polaires (benzène, éther, dichlorométhane)

solvants organiques

polaires (alcools) Eau milieu basique (alc. BASES)

milieu acide (alc. SELS)

+++ + - - -

H OH

Sels d'alcaloïdes alcaloïdes Bases

(solubles dans les solvants organiques) (solubles dans l'eau)

H OH

H₃C N

O

H CH₂OH

atropine O

3-α

(R,S) N

H₃C

O

H CH₂OH

atropinium O^(R,S) H

3-α

(8)

Substances Actives Médicamenteuses ALCALOÏDIQUES

Ensuite, en ajustant le pH, on pourra donc faire passer alternativement le totum alcaloïdique des sels aux bases, et réciproquement, et donc, de la phase aqueuse à la phase organique, et réciproquement, jusqu’à l’obtention d’un totum purifié qui peut conduire, parfois, à la cristallisation d’un PA (alcaloïde) majoritaire.

En résumé, l’extraction des alcaloïdes comporte les 3 étapes suivantes :

1. Déplacement des alcaloïdes de leurs combinaisons au sein de la plante, par un agent acide (H₂SO₄) ou alcalin (chaux, soude, potasse) forts.

2. Extraction proprement dite des alcaloïdes (« sels » ou « bases », par un solvant (polaire (eau, méthanol) ou non polaire (dichlorométhane = CH2Cl2), selon l’agent ajouté en 1).

3. Purification par extraction liquide/liquide (de la phase aqueuse ou organique par un solvant organique (dichlorométhane = CH2Cl2) ou de l’eau acide (H₂SO₄ 2%), selon la phase obtenue en 2).

Cristallisation, parfois (vincamine, hémisulfate de quinine).

Méthode générale de détection des alcaloïdes

La méthode la plus générale pour mettre en évidence des alcaloïdes consiste à les précipiter par les « réactifs généraux des alcaloïdes ». Ces réactions générales de précipitation sont fondées sur la capacité qu'ont les alcaloïdes à former des complexes insolubles (précipités) avec des métaux lourds : Bi, Hg, Pt, W, et/ou des métalloïdes : I^-, I2, ... Il s’agit principalement, des :

• R. de Bouchardat (AcOH iodo-ioduré) • R. de Mayer (mercuri-iodure de K⁺)

• R. de Dragendorff (tétraiodo-bismuthate de K⁺)

Ces réactions de précipitation doivent toujours avoir lieu à partir de solutions aqueuses acides (maximum de solubilité des alcaloïdes), pour pouvoir apprécier plus facilement l’apparition de précipités.

Des réactions plus spécifiques, permettant une mise en évidence de classes particulières d’alcaloïdes, peuvent aussi être utilisées :

• R. de Van Urk (p-DMAB) : à alc. indoloisopréniques de l’ergot.

• R. au sulfate cérique et ammoniacal : à alc. indoliques • R. de Vitali-Morin (HNO₃fumant + KOH) : à alc. tropaniques

• Test de fluorescence : à alc. du Quinquina (type quinine).

Bouchardat Mayer Dragendorff

solut. acide

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Substances Actives Médicamenteuses ALCALOÏDIQUES (quinoléiques) (TP n°1)

Alcaloïdes quinoléiques du Quinquina (RUBIACÉES)

En TP, une seule drogue sert de support à l’apprentissage de la recherche des alcaloïdes dans une drogue végétale.

il s’agit du Quinquina.

Les quinquinas sont de grands arbres originaires d'Amérique du Sud, cultivés en Indonésie et en Afrique équatoriale. Il en existe plusieurs espèces caractérisées par la couleur générale de l'écorce : jaune, rouge (qui servent à l'extraction de la quinine), et gris, plus parfumés, utilisés pour la fabrication d'apéritifs :

- Quinquina gris : Cinchona officinalis L.

- Quinquina rouge : Cinchona pubescens Vahl (= succirubra Pavon)

- Quinquina jaune : Cinchona calisaya Weddell ou C. calisaya var. ledgeriana Howard Une monographie est présente à la Pharmacopée Européenne (Ph. Eur., 10^ème Ed. 01/2011:0174, corr.

10.0). Déf. : "Écorce séchée, entière ou fragmentée, de Cinchona pubescens Vahl (Cinchona succirubra Pav.), de Cinchona calisaya Wedd. ou de Cinchona ledgeriana Moens ex Trimen ou de leurs variétés ou de leurs hybrides.

Teneur : au minimum 6,5 % d'alcaloïdes totaux dont 30% à 60% sont constitués par des alcaloïdes du type de la quinine (drogue desséchée).

Les PA du Quinquina : des alcaloïdes quinoléiques

Les principes actifs les plus importants sont des alcaloïdes, issus du tryptophane, donc de la voie shikimique qui se sont réarrangés en dérivés quinoléiques. Les deux principaux sont la quinine utilisée comme antimalarique et la quinidine comme antiarythmique.

Le quinquina contient également des composés (poly)phénoliques de type tanins condensés qui (par oxydation) colorent la poudre en « rouge » : le « rouge de Quinquina ». Ils donnent une réaction avec le FeCl3 et de BATE-SMITH positives (voir protocole de la réaction, décrit p. 45), ce qui permettra de confirmer qu’il s’agit bien du Quinquina (voir p. 13).

DEBUT des MANIPULATIONS de TP 1

L’étude macro-/micro-scopique de la poudre n’est pas effectuée en TP.

Étude des alcaloïdes du Quinquina

Extraction des AT du quinquina pour réactions générales + CCM

Préparer d’abord un extrait "organique", après alcalinisation de la poudre :

H N

N R

HO H carbinol quinuclidine

quinoléine

N N H₃CO

HO H

N N H

HO H

N N H₃CO

HO H

N N H

HO H

(+)-cinchonine (–)-quinine

(–)-cinchonidine

(+)-quinidine

2 2

3 3

série 2R, 3S série 2S, 3R

N H N

R H

HO carbinol

quinuclidine

quinoléine 2

3

2 3

OH HO OH

HO COOH

ac. quinique

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Substances Actives Médicamenteuses ALCALOÏDIQUES (quinoléiques)

- Dans un Erlen en polypropylène de 100 ml (muni de son bouchon), introduire successivement :

Poudre de quinquina 400 mg Lessive de soude à 50 g/litre 1,5 ml

Laisser en contact pendant au moins 2 minutes en homogénéisant à la spatule.

L’objectif est de bien humecter (alcaliniser) la poudre, uniformément, pour déplacer efficacement les alcaloïdes de leurs sels.

- Ajouter 10 ml de chlorure de méthylène (CH2Cl2).

- Agiter périodiquement de façon manuelle, pendant 10 min (phase d’extraction proprement dite : "macération").

- Filtrer sur un entonnoir muni d’un coton, directement dans une ampoule à décanter de 100 ml.

- Extraire la phase organique une 1^ère fois par 10 ml d’acide sulfurique à 2%

(obtenu par dilution au 1/5^ème d’acide sulfurique à 10%). Vérifier que le pH de la phase aqueuse après extraction est bien acide (papier pH). Extraire une 2^ème fois à nouveau par 10 ml d’acide sulfurique à 2%. Ne jeter la phase organique (poubelle à solvants chlorés), qu’après s’être assuré qu’elle est totalement extraite.

- Réunir les 2 extraits aqueux (total = 20 ml, env.) : "solution aqueuse de sels d’AT de Quinquina"

- Répartir cette solution dans 4 tubes (de 16 ml) : 0,5 ml (1 ml maximum), environ chacun

*

.

*

Le reste sera utilisé pour étudier les AT par CCM : p. 11.

Mise en évidence DES AT DU QUINQUINA par les réactifs généraux

Cet extrait de Quinquina donne des réponses positives marquées aux 3 réactifs généraux des alcaloïdes :

Aux 3 premiers tubes**, ajouter 1 à 2 gouttes (pas plus) de : 1. Réactif de MAYER : il se forme un précipité jaunâtre ; 2. Réactif de BOUCHARDAT : il se forme un précipité brun ; 3. Réactif de DRAGENDORFF : il se forme un fin précipité orangé.

Observer les précipités caractéristiques. Conclure.

+ R. de Mayer + R. de Bouchardat + R. de Dragendorff sol. Acide

** Le quatrième tube sert, tel quel, pour le test de la fluorescence (p 11)

D ra ge ndor ff solut . a cide

B ouc ha rda t

Mayer

NE PAS JETER !!!

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Confirmation n° 1 pour le Quinquina : Test de fluorescence

La fluorescence est spécifique de certains alcaloïdes quinoléiques du quinquina : observer la solution sulfurique du 4^ème tube* sous lumière ultraviolette à 365 nm. Une intense fluorescence bleue apparaît.

Ceci est caractéristique du noyau quinoléine méthoxylé de la quinine et de la quinidine, qui constitue le fluorochrome (= chromophore fluorescent) Cette fluorescence est exaltée en présence d’acides oxygénés (H2SO4, HNO3).

Elle disparaît cependant (extinction de fluorescence), après addition d’une goutte d'un acide non oxygéné, tel HCl concentré : les halogénures sont de puissants « piégeurs » de fluorescence (« quench » de la fluorescence).

CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE des AT du Quinquina Pour la chromatographie (CCM), placer :

1. le reste de la solution (phase aqueuse : 16-18 ml environ) dans une ampoule à décanter. Nous pourrons ainsi procéder à la réextraction des AT purifiés par du CH2Cl2 neuf. Pour ce faire, ajouter :

2. dichlorométhane (CH2Cl2) : 5 ml (ATTENTION densité = 1,45 à phase inférieure).

3. lessive de soude à 200 g/l afin d’alcaliniser la phase aqueuse : QS pH nettement alcalin (de l’ordre de 3 à 6 ml. Ajouter graduellement !). Vérifier à l'aide du papier indicateur universel.

Une fois le pH alcalin atteint, agiter doucement par 15-20 retournements.

Décanter et soutirer la phase organique dans un Erlen sec.

Répéter l’extraction par CH2Cl2 5 ml

Rassemblez les 2 extraits organiques dans l’Erlen.

Sécher sur Na2SO4.

Filtrer sur papier filtre dans un entonnoir SEC, directement dans un ballon SEC à col rodé (100 ml) : "solution chlorométhylénique (CH2Cl2) d’AT de Quinquina".

I - Préparation de la solution pour chromatographie

- Évaporer à siccité (à sec) à l’évaporateur rotatif à 60°C, la solution chlorométhylénique (CH2Cl2), obtenue ci-dessus.

- Après refroidissement du ballon, redissoudre le résidu dans 3 à 4 gouttes de méthanol = « solution méthanolique d’AT de Quinquina pour CCM ».

II – Chromatographie

- Support : Silice sur feuille d’aluminium - 3 pistes - Migration sur 7,5-8 cm.

N

N H₃CO

HO H

(–)-quinine (+)-quinidine

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1°) 4 fois de la solution méthanolique d’AT de Quinquina.

2°) 4 fois le « témoin » pour chromatographie des alcaloïdes du quinquina 3°) le mélange des 2 (piste centrale).

Solvant d’élution : dans une cuve à chromatographier sèche (bécher haut + couvercle de boîte de Pétri), préparer avec précision (sous la hotte) 7,4 ml du solvant :

Toluène – Acétate d’éthyle - Diéthylamine (4 / 2,4 / 1 ; v/v/v) Bien agiter. Le solvant doit être « monophasique » !

Placer la plaque dans la cuve, la fermer. Ne plus déplacer la cuve ! Laisser le chromatogramme se développer sur 8 cm, environ.

Quand le front du solvant a atteint la ligne supérieure (env. 10 min), retirer la plaque.

Note : Pendant la migration, vous pouvez effectuer la réaction caractéristique des (poly)phénols du quinquina : la réaction de Bate-Smith (voir page 13).

III – Révélation

- Placer la plaque sous la hotte, et sécher à l’air (séchoir à cheveux), afin d'éliminer toute trace de solvants.

- Examiner le chromatogramme en lumière à 254nm, entourer les bandes en trait plein.

- Examiner le chromatogramme en lumière ultraviolette à 365 nm, et constater qu'il n'y a pas de taches présentant une fluorescence notable.

- Tamponner (à l’aide d’un bout de coton) une solution éthanolique à 5 % d'acide para toluène sulfonique (PTS). SECHER la plaque au sèche-cheveux. Observer à nouveau en lumière ultraviolette à 365 nm et repérer d'un trait de crayon pointillé les taches de fluorescence bleue.

- Tamponner ensuite sur le même chromatogramme, le réactif à l'iodoplatinate.

- Observer directement

Caractériser les taches formées par les AT du quinquina en comparant couleurs, fluorescences et Rf à ceux des témoins :

Chromatographie des alcaloïdes du quinquina (réactif à l’iodoplatinate)

après PTS (sous UV à 365 nm)

Témoin Mélange

0,380,32

0,47 Violet

Violet Violet cinchonine

quinidine cinchonidine

0,25 + Bleu quinine +++

front de solvant

1 cm ^{2 mm} ^{2 mm} _Extrait^{2 mm}

+++

(R_F)

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Confirmation n° 2 pour le Quinquina : Mise en évidence des (poly)phénols

Le quinquina contient également des composés (poly)phénoliques qui donnent une réaction positive au test général du FeCl3 (voir explications, p. 44).

Appartenant à la classe des tanins condensés, ces (poly)phénols colorent la poudre d’écorces de quinquina en rouge (« rouge de quinquina ») et donnent une réaction de BATE-SMITH positive (voir principe de la réaction p. 15).

Pour faire ce test de mise en évidence des (poly)phénols du Quinquina (tanins condensés), procéder de la manière suivante : Réaction de Bate-Smith :

Dans un tube à essais rodé avec bouchon en verre, ajouter :

• Poudre d’écorces de Quinquina : 200 mg

• butanol chlorhydrique : 4 ml

Porter le tube au bain-marie à 90°C, 5 à 6 minutes en agitant de temps en temps.

Observer la coloration rouge (cyanidol) intense qui se développe.

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Substances Actives Médicamenteuses (POLY)PHENOLIQUES

TP2 ^: Substances Actives Médicamenteuses (POLY)PHENOLIQUES : TANINS SAPONIFIABLES et CONDENSÉS & FLAVONOÏDES

Généralités sur les (POLY)PHENOLS

Les (poly)phénols se caractérisent par la présence de noyaux aromatiques porteurs de fonctions hydroxyles (phénoliques, donc). Effets inductif et mésomère : conséquences.

Propriétés et méthode générale d’extraction des (poly)phénols

Le dipôle des (nombreuses) fonctions phénoliques confère aux (poly)phénols une certaine polarité, qui sont donc plutôt hydrophiles. À l’inverse, leurs noyaux aromatiques, ayant une faible affinité pour l’eau sont eux, à l’origine d’une hydrophobie et même, d’une certaine « lipophilie » (solubilité dans les corps gras).

Ces propriétés « duales » (mixtes) vis à vis de la solubilité dans l’eau, font que les (poly)phénols sont donc "amphiphiles".

Ainsi, les mélanges "eau + alcool" ou "eau + acétone" sont-ils meilleurs solvants que l’eau seule ou l’éthanol ou l’acétone seuls, pour obtenir de tels extraits. Il y a lieu de considérer en outre, les forces d’empilement dues à ces noyaux aromatiques (« p- stacking ») qui ajoutent, selon les cas (flavonoïdes), à la complexité de leur caractère amphiphile (voir aussi, cours de VASAM-Gnosie, p. 27 à 30).

Propriétés et mise en évidence des (poly)phénols

Les (poly)phénols ont la capacité de former des chélates colorés (« complexes de transfert de charge ») avec les métaux lourds. Leur présence au sein d’une drogue à étudier est mise en évidence par l’apparition d’une coloration ou la formation d’un précipité vert-noirâtre intense, après ajout de perchlorure de fer à l’extrait de cette drogue (voir p. 20 et annexe p. 44).

En TP, nous apprendrons à reconnaître 2 des principales catégories de (poly)phénols que sont les tanins et les flavonoïdes.

Généralités sur les TANINS Nature des TANINS

Il existe deux types de tanins, différant par leur structure et leur origine biogénétique :

§ Les tanins saponifiables ou hydrolysables (esters « galliques / éllagiques »), et

§ les tanins condensés ou catéchiques ou « Oligomères ProCyanidoliques ».

O HO

OH

OH OH

OH

O OH

H

O

H O

H

«M^»

O

H O

H

«-I»

(15)

1- Les tanins saponifiables ou hydrolysables ou « galliques / éllagiques » :

Ce sont des oligo- ou des poly-esters d’un sucre "central", estérifié par un nombre variable de molécules d’acide phénol, les acides gallique et/ou ellagique (dimère gallique). Comme leur nom l’indique, ces tanins sont "saponifiables" (en milieu alcalin) ou "hydrolysables" (en milieu acide), car ils renferment des fonctions esters, détruites dans ces deux conditions :

Esters du glucose par des acides gallique et ellagique : tanins saponifiables

Ces tanins ne seront pas étudiés en TP.

2- Les tanins condensés ou catéchiques ou « ProCyanidoliques = OPC » :

Ces tanins font partie des flavonoïdes lato sensu. Ce sont des polymères flavanoliques, constitués d’unités flavan-3-ols liées entre elles par des liaisons interflavaniques, C4-C6, mais le plus souvent C4-C8. Ils résultent d’un couplage ente le C4 électrophile d’une unité flavanyle, issue d’un flavan-4-ol ou d’un flavan-3,4-diol, et un carbone aromatique nucléophile (C8, plus rarement C6), d’une autre unité, généralement un flavan-3-ol, tel la catéchine ou l’épicatéchine :

Les flavan-3-ols monomères et le dimère B2

D’autres exemples d’OPC (dimères) sont donnés en annexe, p. 44.

Propriétés et caractérisation des « tanins condensés »

Les (poly)phénols de l’extrait de pépins de raisin sont des tanins condensés résultant de la condensation de monomères de type catéchine et épicatéchine à tanins « catéchiques » (voir p. 15). Leurs liaisons "interflavaniques" étant clivables en milieu acide (HCl), il est donc possible de les caractériser, par la couleur rouge caractéristique (cyanidol) qu’ils libèrent dans ces conditions (voir schéma réactionnel p. 15, et protocole, p. 20) : c’est la réaction de BATE-SMITH.

Réaction de BATE-SMITH (caractéristique des tanins condensés)

Son principe repose sur l’hydrolyse des liaisons "interflavaniques" en milieu acide : l’unité catéchique « supérieure » forme un cation benzylique hautement oxydable (par simple contact à l’air), qui se transforme rapidement en un flavylium, le

HO

COOH

HO HO

OH

O

OH OH OH

OH HO

O HOOC

HO O

O

O O

OH

OH OH O

O OH OH OH

OH O

OH O HO

HO HO

O

O HO

HO

HO O

OH O

OH OH

OH OH O

O OH O O O

O

HO COCO

OH HO

HO HO

OH HO

OH

HO

OH C

C HO

OH O

O ac. gallique

ac. ellagique n

gallotanins: n= 0, 1, 2, 3,...

depsides

tanin éllagique

"ellagitanins"

ac. gallique

O OH O

OH HO

HOOH

OH OH

B2 ^OH HO

OH

OH OH

OH

3(S) : (+)-catéchine 3(R) : (-)-épicatéchine

8

4

6 3

O HO

OH

OH HO

R¹

R¹= R²= H : afzéléchine R¹= R²= OH : gallocatéchine

R² O

OH flavan-3-ol 8

4

6 3

4 8

liaison interflavanique

(16)

cyanidol, de couleur rouge à ce pH. En partant du dimère B2, le mécanisme de formation de cette couleur rouge est le suivant :

réaction de Bate-Smith (mécanisme de formation spécifique du pigment cyanidolique)

C’est la raison pour laquelle, ces tanins sont encore appelés « tanins ProCyanidoliques » ou OPC (Oligomères ProCyanidoliques).

Généralités sur les FLAVONOÏDES Nature des FLAVONOÏDES (stricto sensu)

Ce sont les plus abondants du groupe des flavonoïdes lato sensu. Ils constituent les principaux pigments « jaunes » des fleurs avec une origine biogénétique identique à celle des flavanols mais se caractérisent par la présence d’un carbonyle en C4 accompagné ou non d’une double liaison en C2-C3 :

squelette des principales génines flavonoïdiques au sens strict

Propriétés et extraction et mise en évidence des « flavonoïdes »

Les flavonoïdes sont des (poly)phénols de même squelette que la catéchine. Ils en possèdent donc les principales propriétés physicochimiques : leur extraction a lieu dans des conditions assez proches. Cependant, à la différence des tanins condensés, ils sont « plans » et « aromatiques » (doués de la facilité de créer des empilements : voir p. 27 du cours) et sont très fréquemment liés à des sucres (à hétérosides) et sont alors plus polaires et hydrophiles. Dans la plupart des cas, les solvants d’extraction sont alors des alcools ou des mélanges hydroalcooliques dont on fera varier la teneur en eau et/ou la température pour obtenir des polarités comparables.

Propriétés et caractérisation des « flavonoïdes »

Comme tous les (poly)phénols, ils donnent une réaction positive au perchlorure ferrique (p. 20 et annexe p. 44).

La réaction spécifique de caractérisation des flavonoïdes est la réaction dite « de la cyanidine ».

Ox

H⁺

O OH O

OH HO

OH O

OH OH

OH OH H

O OH O

OH HO

OH O

OH OH

OH H OH

H

O OH HO

OH

OH OH

O OH O

OH OH H H

OH OH

OH

O OH HO

OH

OH OH B2

épicatéchine

cation en 4 (benzylique)

flavylium = cyanidol (rouge)

H⁺ liaison interflavanique

4

O OH HO

HO

OH

O

OH HO

OH

OH O

OH

flavanones chalcones

O OH HO

HO

OH

O OH flavonols

O OH HO

HO

OH

O flavones

(17)

Réaction spécifique de caractérisation des flavonoïdes : réaction « de la cyanidine »

Elle utilise en effet le pouvoir réducteur de métaux en milieu acide (formation de l’hydrogène « naissant »), pour réduire spécifiquement le noyau flavonoïdique. La réaction de la cyanidine est basée sur l’obtention de couleurs caractéristiques du noyau de départ, après sa réduction par l’hydrogène naissant :

structures flavonoïdiques mises en évidence par la réaction de la cyanidine

O OH HO

HO

OH

O

OH HO

OH

OH O

OH

flavanones chalcones

O OH HO

HO

OH

O OH flavonols

O OH HO

HO

OH

O flavones

Mg + HCl H₂ MgCl₂

O OH HO

HO

OH

OH OH

O OH HO

HO

OH O OH

HO

OH

OH Mg + HCl H₂ MgCl₂

Mg + HCl H₂ MgCl₂

rouge cerise orange rouge violacé

négatif

(ne sont pas des flavonoïdes au sens strict)

(18)

Substances Actives Médicamenteuses (POLY)PHENOLIQUES (TP n°2)

Les (poly)phénols (tanins condensés) des pépins de raisin

Les pépins de raisin (Vitis vinifera L., VITACÉES) ne constituent pas une drogue

"médicinale" et n’ont pas de monographie à la Pharmacopée, mais ils sont une source industrielle d’extraits d’OPC (pour "Oligomères ProCyanidoliques", doués de propriétés « vitaminiques P »), utilisés dans la fabrication de la spécialité pharmaceutique Endotélon®.

En TP, nous utiliserons la même source végétale, les pépins de raisin (Vitis vinifera L., VITACÉES, mis gracieusement à disposition par le Groupe Grap’Sud, 30360 Cruviers-Lascours) pour apprendre à en extraire les procyanidols (OPC), à les mettre en évidence par la réaction du perchlorure ferrique, et à les caractériser par la réaction de BATE-SMITH. Comme dans l’industrie, la chromatographie sur couche mince permettra de vérifier la qualité « oligomères procyanidoliques » de l’extrait.

Étude de la drogue : les pépins de raisin

L’étude macro-/microscopique n’est pas effectuée en TP.

Extraction des tanins catéchiques pour la CCM

L’extraction des tanins catéchiques est effectuée en gardant les pépins de raisin entiers. Afin d’obtenir une meilleure extraction, la drogue est placée directement, au contact du solvant extractif, sans broyage préalable (pour éviter les émulsions qui se formeraient avec l’huile présente dans les cotylédons de ces graines).

Dans un Erlen de 250 ml, peser la drogue : 25 g de pépins.

Ajouter un mélange acétone - eau (6/3) : 45 ml (30 acétone + 15 eau) - Laisser macérer (drogue au contact du solvant, à température ambiante), pendant

au moins 10 min. Agiter sur agitateur magnétique.

- Filtrer (filtre Buchner) sous vide, dans une fiole de à vide.

- Transvaser le filtrat dans un ballon rond de 250 ml.

- Evaporer l’acétone au rotavapor.

- Placer la « solution » aqueuse résiduelle (12 ml d’eau environ) en ampoule à décanter (100 ml).

- Extraire la phase aqueuse une 1^ère fois par 10 ml d’acétate d’éthyle (d=0.9). Séparer les 2 phases, récupérer la phase organique dans un erlen sec, puis replacer la phase aqueuse dans l’ampoule. Extraire une 2^ème fois à nouveau par 10 ml d’acétate d’éthyle.

* Les tanins catéchiques sont plus solubles dans la phase organique que dans l’eau. ATTENTION : densité de l’AcOEt <

celle de l’eau.

- Réunir les 2 phases organiques (supérieures) dans un Erlen SEC de 125 ml.

- Ajouter du sulfate de sodium anhydre et agiter pour sécher la phase organique.

- Filtrer sur un entonnoir sec muni d’un coton, directement dans un ballon rond (à col rodé) de 100 ml sec.

Extraction par l’acétate d’éthyle

(19)

- Concentrer à siccité par évaporation sous vide (rotavapor) : à « extrait sec d’OPC de pépins de raisin ».

CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE des OPC de pépins de raisin I - Préparation de la solution pour chromatographie

- Dissoudre l’extrait sec d’OPC de pépins de raisin (dans le ballon), en ajoutant, dans un premier temps, 4 à 5 gouttes de méthanol = "solution d’OPC".

II - Chromatographie

- Support : film de Silice sur plaque aluminium - 3 pistes - Migration sur 7,5 cm.

- À l’aide d’un capillaire, déposer :

1°) 4 fois de la solution préparée ci-dessus (solution d’OPC).

2°) 4 fois le témoin pour chromatographie de tanins catéchiques (catéchine).

3°) Leur mélange (piste centrale = 4 + 4).

Ne jeter pas le reste de votre "solution d’OPC". Il est utilisé pour mettre en évidence les (poly)phénols (FeCl3) et identifier leur nature (Bate-Smith).

- Développer avec :

Chloroforme - Méthanol - Acide acétique (8 / 2 / 0,3 ; v/v/v). Ce solvant de migration est tout prêt dans un flacon muni d’une dispensette qui délivre la quantité nécessaire de solvant (8 mL), pour garnir la cuve à chromatographier dont dispose chaque binôme.

ATTENTION !!! La cuve à chromatographier doit impérativement être sèche.

Placer dans votre cuve garnie de ce solvant, votre plaque chromatographique et fermer la cuve (couvercle).

Développer le chromatogramme sur 7-8 cm. NE TOUCHER PLUS LA CUVE JUSQU’À MIGRATION COMPLÈTE.

Lorsque le front du solvant a atteint la ligne supérieure (environ 30 mn) : retirer le chromatogramme.

III – Révélation

- Placer le chromatogramme sous la hotte, et sécher à l’air (séchoir à cheveux), afin d'éliminer toute trace de solvants.

- Tracer le trait du front de solvant.

- Observer le chromatogramme sous lumière UV (254 nm et 365 nm) et entourer au crayon de papier les taches observées.

- Tamponner avec un coton le réactif à l'anisaldéhyde. Chauffer au "heat-gun", pour révéler le chromatogramme.

- Repérer les monomères, les dimères et les trimères, par rapport à la position de la catéchine, témoin, calculer leur Rf.

Pour mettre en évidence et caractériser les (poly)phénols de cette drogue végétale, procéder de la manière suivante :

Diluer le reste de la "solution d’OPC" dans 3 ml de méthanol (MeOH).

catéchine

dimères trimères monomères front de solvant

(R_F)

(20)

Mise en évidence des (poly)phénols dans l’extrait de pépins de raisin par la réaction au perchlorure ferrique

Comme tous les (poly)phénols, les (poly)phénols de l’extrait de pépins de raisin donnent une réaction positive en présence de métaux lourds (FeCl3, voir p. 14 et annexe, p. 44).

Au tube contenant 1 ml de "solution d’OPC", on ajoute : 2 gouttes de perchlorure ferrique (FeCl3 à 10%).

Observer le précipité noir-vert intense, caractéristique.

Caractérisation des tanins condensés de pépins de raisin par la réaction de BATE-SMITH

Les (poly)phénols de l’extrait de pépins de raisin sont des tanins condensés ou « catéchiques » formés par condensation de monomères de type flavan-3-ol ((+)- catéchine, (-)-épicatéchine), voir p. 15, et formation de liaisons "interflavaniques" qui sont fragiles en milieu acide Ainsi, le réactif de BATE-SMITH, le butanol chlorhydrique (BuOH, HCl) sur les tanins condensés, provoque-t-il la libération du cyanidol de couleur rouge caractéristique (voir schéma réactionnel p. 19).

Pour caractériser la nature procyanidolique des tanins de pépins de raisin, on utilise la réaction de BATE-SMITH. Le protocole de cette réaction est le suivant : Au tube contenant 2 ml de "solution d’OPC", ajouter :

• réactif au butanol chlorhydrique : 2 ml environ Porter au bain marie (90°C)

pendant 5 minutes au moins, en agitant à intervalles réguliers (pour favoriser l’oxydation du cation benzylique).

La coloration rouge qui apparaît, caractéristique du cyanidol, témoigne de la nature ProCyanidolique des tanins de pépins de raisin.

H

⁺

Ox

O

₂

de l'air

butanol, HCl

(21)

Les flavonoïdes (rutine) du Sophora japonica (FABACÉES)

Pour réaliser ces essais « positifs », en TP, vous disposez d’une source végétale qui en est riche :

- boutons floraux de Sophora (Sophora japonica L., Fabacées)

(= rutine : 3-O-rhamnoglucososide de quercétol = 3-O-rutinosylquercétol)

Le bouton floral de Sophora, Styphnolobium japonicum (L.) Schott (syn Sophora japonica L., Fabacées : (Ph. Eur. 10^ème Éd., 01/2015:2427, corr. 10.0) contient jusqu’à 20% de rutine (=rutoside). De ce fait, il constitue la source principale utilisée par l’industrie pharmaceutique. D’autres plantes en renferment et sont des sources alternatives de rutoside : feuilles d’eucalyptus, Eucalyptus globulus Labill., Myrtacées Ph. Eur. 10^ème Éd., 07/2014:1320, corr. 10.0. (jusqu’à 15 % de rutoside), ou encore les parties aériennes de sarrasin, Fagopyrum esculentum Moench. (syn. : F. tataricum (L.) Gaertn., Polygonum fagopyrum), Polygonacées, Ph. Eur. 10^ème Éd., 07/2013:2184, corr. 10.0 (au minimum 3,0 % de rutoside/drogue desséchée). Feuilles à 5-8% rutoside

Extraction des flavonoïdes des boutons floraux de Sophora

L’extraction des (poly)phénols est effectuée à partir de la poudre de boutons floraux, placée au contact du solvant d’extraction : solution hydroalcoolique.

Dans un tube à essais de 16 ml, peser la drogue : 200 mg de poudre.

Ajouter : - éthanol : 4 ml - eau : 1 ml

- Placer le tube au bain marie à 65°C, pendant au moins 10 min.

- Filtrer à chaud l’alcoolat sur papier-filtre plissé, dans 2 tubes à essais (16 ml) =

"solution de flavonoïdes".

Mise en évidence des (poly)phénols de Sophora par la réaction au perchlorure ferrique

Pour mettre en évidence les (poly)phénols de cette drogue végétale, procéder de la manière suivante :

Dans un des 2 tubes de 2 ml environ de "solution de flavonoïdes", ajouter :

HO O OH

OH HO

O O O

HO OH

OH O O

HO

HO OH

rutoside

(22)

1 goutte de perchlorure ferrique (FeCl3

à 10%) :

Voir p. 14 et annexe, p. 44.

Observer le précipité noir-vert intense, caractéristique des (poly)phénols.

Conclure.

Caractérisation des (poly)phénols (= flavonoïdes) de Sophora par la réaction de la "CYANIDINE"

Cette réaction permet de mettre en évidence spécifiquement une deuxième catégorie de (poly)phénols : les flavonoïdes (voir p. 45).

Attention : Lors du test, placer votre tube à essai dans un bêcher (250 ml) rempli d’eau froide, afin d’éviter l’élévation de température et l’emballement de la réaction.

Dans le 2^ème tube de "solution de flavonoïdes" : 2 ml environ, ajouter : 0,5 ml (7- 8 gouttes) d’acide chlorhydrique concentré puis une rognure de magnésium.

Une coloration caractéristique du flavonoïde (rutoside majoritaire = flavonol, ici) par réduction (voir Cours de VASAM-Gnosie, p. 29) en cyanidol (ou "cyanidine", rouge cerise), se développe lentement, avec une disparition totale de la couleur jaune citron

une réduction progressive du flavonoïde (rutoside), jaune citron, par l’hydrogène « naissant » (métal

en milieu acide) forme de la cyanidine de couleur rouge-cerise

Conclure, en fonction de votre résultat (voir p. 17 et 45).

réaction à la cyanidine réaction au FeCl3

(23)

Substances Actives Médicamenteuses SAPONOSIDIQUES

TP3 : Substances Actives Médicamenteuses SAPONOSIDIQUES

Généralités sur les SAPONOSIDES

Les saponosides (ou saponines) existent sous forme « inactive » dans les plantes (condensés à de nombreux sucres qui sont hydrolysées quand nécessaire, ce qui les transforment en leurs formes « actives », qui en font tout l’intérêt :

• Anti-microbiens, anti-fongiques, parasiticides.

• Irritants cellulaires (sternutatoires, expectorants)

• perméabilité membranaire des cellules (extirpent le cholestérol ?) : détruisent les hématies (hémolytiques)

• Toxiques pour animaux sang froid (ichtyotoxiques, molluscicides à schistosomiases)

• Anti-Inflammatoires, anti-hémorroïdaires, cicatrisants, … Nature des SAPONOSIDES

Ce sont des hétérosides dont la génine stéroïdique ou triterpénique (lipophile) est reliée à des résidus sucrés (polaires), en nombre parfois important, et dont certains sont des acides uroniques.

dualité structurelle justifiant le caractère amphiphile des SAM saponosidiques

D’autres exemples de saponosides sont présentées en annexe, p. 46.

Propriétés et extraction des « SAPONOSIDES »

Cette structure particulière (duale) leur confère des propriétés amphiphiles qui en font de véritables savons (à saponosides). Le plus souvent, ces SAM ne sont :

- ni solubles dans l’eau seule,

- ni non plus dans les solvants organiques seuls.

Pour les extraire efficacement, il convient alors d’utiliser des mélanges de ces deux types de solvants : eau et organiques miscibles, donc, polaires (acétone, éthanol, méthanol, …).

La nature du solvant organique et ses proportions par rapport à l’eau, déterminent la sélectivité des types de SAM qui sont extraites de la drogue.

OH O

HO OHO

O O O O

COOH

O OH OH O

O HO

OH OH O

HO OH

OH OH

ESCINE

plage hydrophobe (squelette terpénique) plage hydrophile

(fonctions polaires)

(24)

Substances Actives Médicamenteuses SAPONOSIDIQUES

Mise en évidence des « SAPONOSIDES » : pouvoir aphrogène

La mise en évidence des saponosides dans une drogue végétale, est basée sur l’observation de leur pouvoir aphrogène, c'est-à-dire la capacité qu’ont leurs solutions aqueuses à mousser, après agitation.

Afin de garantir que la drogue est conforme, la teneur en saponosides a, jusqu'en Juillet 2019, été évaluée par la mesure de "l’INDICE DE MOUSSE", remplacée aujourd'hui par une mesure HPLC-UV-visible. La monographie du Polygala (traité en TP) est une des rares à toujours y recourir.

En annexe, figurent les méthodes « rapide » de mise en évidence, p. 46, et de

« dosage » des saponosides, p. 46.

(25)

Substances Actives Médicamenteuses SAPONOSIDIQUES (TP n°3)

Saponosides de la racine de Polygala, Polygalacées

Pour étudier cette classe de composés, en Travaux Pratiques, nous prendrons les parties souterraines (racines/souches) de Polygala sp. (Polygalaceae) comme drogue modèle. La monographie de la Pharmacopée Européenne (Ph. Eur., 10^ème Éd., 07/2019:0202) indique :

DEFINITION :

Racine et souche de Polygala senega L. ou racine de Polygala tenuifolia Willd. entières ou fragmentées, débarrassées des radicelles et séchées.

La racine de Polygala tenuifolia Willd. est expectorante dans le cas de bronchite, fluidifie les viscosités présentes dans les muqueuses, dans les catarrhes et les emphysèmes. Ainsi elle est traditionnellement utilisée dans le traitement symptomatique de la toux. De nos jours en Europe, elle est peu employée. Elle est par ailleurs traditionnellement utilisée en médecine chinoise depuis des milliers d'années pour ses propriétés expectorantes, toniques, tranquillisantes et pour le traitement des démences, de l'amnésie dans la neurasthénie.

CARACTÈRES :

• Odeur faible et douceâtre, légèrement rance ou rappelant le salicylate de méthyle.

• Pulvérisée, la racine de polygala est irritante et sternutatoire. Agitée avec de l’eau, la poudre donne une mousse abondante.

Les SAM des racines de Polygala : des saponosides

La drogue renferme des lipides (environ 5%), du salicylate de méthyle, des acides phénols, des oligosaccharides et de 5 à 10% de saponosides.

Ce sont des saponosides essentiellement triterpéniques formés d'un mélange complexe de composés bidesmosidiques avec principalement la présénégine comme aglycone. Les autres saponosides ont des structures diversifiées en fonction des espèces de polygala.

Les saponosides de P. tenuifolia sont dénommés onjisaponines.

R R¹ R² R³

onjisaponine A

onjisaponine

E ^H ^H

onjisaponine

G ^H ^H

Onjisaponines A, E et G de la racine de P. tenuifolia¹

1

O

OCH3 O

OH HO

CH₃

HO O

OH HO HO

O

OH OH CH2OH HO

O

OCH3 OCH3

OCH3

O

OH OH CH₂OH HO

O

OCH3 OCH3

OCH3

O

OH HO HO

HO

COOH

CH₂OH

présénégénine

OO CH₂OH OH

OH HO Glc

CO OO CH₃ RO

OR¹ O

Fuc

O CH₃ O

R²O OH O

OH OH R³O

Xyl Rha

(26)

Substances Actives Médicamenteuses SAPONOSIDIQUES (TP n°3)

Pour caractériser des saponosides : il faut les extraire et les purifier. C’est une opération assez difficile qu’on ne pourra faire en TP. Aussi préfèrera-t-on, ici, nous en tenir à une estimation de leur pouvoir aphrogène.

Saponosides de Polygala tenuifolia Willd.

Réactions d’identification rapide des Saponosides

Note : Pour une recherche rapide de saponosides dans une drogue inconnue, utiliser la méthode générale de mise en évidence de ces substances, décrite p. 46, directement sur la poudre de drogue.

Étude des Saponosides en CCM

A - PRÉPARATION DE L’EXTRAIT : filtrat hydroalcoolique Dans un tube à essais de 16 ml, introduire :

• Poudre de polygala : 1 g

• Éthanol : 7 ml

• Eau : 3 ml

Porter au bain-marie à 65°C, pendant 15 minutes.

Filtrer à chaud l’alcoolat (papier-filtre plissé/entonnoir) dans 1 tube à essais de 16 ml.

Ce filtrat alcoolique est utilisé pour la CCM.

B – CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE (CCM)

- Support : Silice sur film aluminium - 3 pistes - Migration sur 7,5 cm.

- Déposer : 1°) 4 fois de la solution préparée ci-dessus

2°) 4 fois le témoin des saponosides pour chromatographie (escine).

3°) Leur mélange (piste centrale).

- Développer avec le mélange de 3 solvants acétate d’éthyle – n-propanol - H2O, dans les proportions suivantes (en volumes) :

40% - 40% - 20%.

Chaque binôme préparera le solvant pour sa propre cuve à chromatographier.

- Un bon compromis, pour ne pas gaspiller de solvant inutilement, serait de préparer 7,5 ml au total avec les volumes suivants, qui respectent ces proportions :

acétate d’éthyle : 3 ml n-propanol : 3 ml

H2O : 1,5 ml

Bien agiter : seul un solvant monophasique permet une élution correcte !

Lorsque le front du solvant a atteint la ligne supérieure, retirer les CCM.

Favoriser l’évaporation du solvant par agitation à l’air, ou mieux, au sèche-cheveux, sous la hotte.

Années 2020-2021

Université de Montpellier

Laboratoire de Pharmacognosie

1

PARTIE : INITIATION

TP UE3 - VASAM-Pharmacognosie du DFGSP2 - 2020-2021

TRAVAUX PRATIQUES DE VASAM - PHARMACOGNOSIE

Extraction, Caractérisation et Purification (Voies d’Accès) de Substances Actives Médicamenteuses d’Origine Végétale.

TP de VASAM-Pharmacognosie : 1

partie (DFGSP2)

Initiation à l’extraction et à la reconnaissance des grandes classes de Substances Actives Médicamenteuses (SAM) d’origine végétale

Utilisation des connaissances nouvellement acquises : caractérisation des SAM de deux drogues végétales

Évaluation des Travaux Pratiques de VASAM-Pharmacognosie

INITIATION

Table des matières pour les étudiants des séries 1 Pour les séries 2, il convient d’intervertir TP1 avec TP2, et TP3 avec TP4

TP1 : Substances Actives Médicamenteuses ALCALOÏDIQUES

- - - +/- +++

+++ + - - -

Méthode générale de détection des alcaloïdes

Alcaloïdes quinoléiques du Quinquina (RUBIACÉES)

*

*

D ra ge ndor ff solut . a cide

B ouc ha rda t

Mayer

Confirmation n° 1 pour le Quinquina : Test de fluorescence

Confirmation n° 2 pour le Quinquina : Mise en évidence des (poly)phénols

TP2 : Substances Actives Médicamenteuses (POLY)PHENOLIQUES : TANINS SAPONIFIABLES et CONDENSÉS & FLAVONOÏDES

Réaction spécifique de caractérisation des flavonoïdes : réaction « de la cyanidine »

Les (poly)phénols (tanins condensés) des pépins de raisin

Mise en évidence des (poly)phénols dans l’extrait de pépins de raisin par la réaction au perchlorure ferrique

Caractérisation des tanins condensés de pépins de raisin par la réaction de BATE-SMITH

H

Ox

O

de l'air

butanol, HCl

Les flavonoïdes (rutine) du Sophora japonica (FABACÉES)

TP3 : Substances Actives Médicamenteuses SAPONOSIDIQUES

Saponosides de la racine de Polygala, Polygalacées

Saponosides de Polygala tenuifolia Willd.

TP2 ^: Substances Actives Médicamenteuses (POLY)PHENOLIQUES : TANINS SAPONIFIABLES et CONDENSÉS & FLAVONOÏDES