Étude des anthracénosides des rhubarbes (POLYGONACÉES)
TRAITER LES 2 RHUBARBES EN MÊME TEMPS Les anthracénosides de la rhubarbe de Chine et du rhapontic
Étant donné que la nature des PA des rhubarbes sont des mélanges de O-hétérosides de plusieurs anthraquinones, mais aussi, de O,C-diglucosides de monomères (rhéinosides), et de dimères (sennosides), il sera plus difficile que dans la bourdaine d’avoir une réaction positive avec ces drogues.
Il est donc nécessaire d’utiliser le cas général (hydrolyse + oxydation*) de la réaction de Bornträger, selon la monographie p. 49, pour une bonne caractérisation des anthracénosides présents.
* NOTE : Cependant, il faut savoir que cette oxydation détruit en grande partie le rhaponticoside, un (poly)phénol fluorescent caractéristique du rhapontic, dont la présence frauduleuse n’est décelable que par l’observation de sa fluorescence.
Comme la Pharmacopée Européenne 10ème éd., préconise une recherche spécifique du rhaponticoside, il est indispensable de faire sa recherche, avant l’étape d’oxydation. Ainsi, le protocole général (p. 49), doit-il être adapté. Il se fait en 2 temps :
- Hydrolyse à observation de la fluorescence (UV 365 nm) ; - Oxydation à extraction à test de Bornträger, proprement dit.
60% de 6 et 8-O-Glucosides de chrysophanol + aloé-émodol
+ physcion + émodol GlcO
sennosides C et D
O émodol + chrysophanol
+ physcion
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Substances Actives Médicamenteuses ANTHRACÉNOSIDIQUES (TP n°4)
Analyse des anthracénosides de la rhubarbe de Chine et du rhapontic : test de Bornträger adapté
1) Hydrolyse à observation de la fluorescence (UV 365 nm) Introduire dans un 1er tube à essai :
- poudre de rhizome de Rhubarbe de Chine: environ 300 mg
- acide sulfurique à 10% : 4 ml
Introduire dans un 2ème tube à essai :
- poudre de rhizome de Rhubarbe des jardins : environ 300 mg
- acide sulfurique à 10% : 4 ml
Porter au bain-marie bouillant à 95°C pendant 3 minutes.
À CE STADE, comparer la FLUORESCENCE SOUS UV à 365 nm des deux extraits, Observation sous lumière Ultraviolette : recherche du
rhaponticoside*
Les extraits sulfuriques (env. 4 ml) « Rhu » (Rhubarbe officinale) et « Rha » (Rhapontic), placés chacun dans un tube à essais sont observés en UV à 365 nm.
« Rhu » (tube contenant la rhubarbe de Chine) ne doit pas avoir de fluorescence bleue mais une couleur jaune-verte (anthraquinones).
« Rha » (tube contenant le rhapontic) présente une fluorescence bleue « sombre » (rhaponticoside).
Conclure sur la possible falsification du lot de Rhubarbe de Chine étudié, par le rhapontic.
2) Oxydation à extraction des anthraquinones
Réaliser ensuite l’étape d’oxydation*, ajouter à vos 2 tubes : - eau oxygénée (H2O2) à 30 vol. : 1 ml Porter au bain-marie bouillant (à 95°C) pendant 8 minutes.
Filtrer à chaud sur papier-filtre dans un tube à essais rodé (À CHAUD !).
Laisser refroidir le filtrat.
Ajouter un égal volume d’éther (4 ml environ). Travailler sous la hotte.
Agiter par retournement du tube fermé par un bouchon rodé, DOUCEMENT, pour ne pas former d’émulsions.
Décanter l’éther (phase supérieure) et le prélever à l’aide d’une pipette Pasteur SÈCHE. Le répartir en 2 parties égales :
- une première portion dans 1 tube à essais (test de BORNTRÄGER) et
Comparaison des extraits des 2 rhubarbes par fluorescence à 365 nm
Rhu Rha
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soit, 4 tubes au total pour les 2 rhubarbes (2 tubes à essais + 2 tubes à hémoiyse).
Répéter l’opération autant que nécessaire, afin de bien extraire les anthraquinones : elles colorent en jaune citron la phase éthérée.
2 suite à test de Bornträger, proprement dit
Aux deux tubes à essais ( !!! ), contenant les extraits éthérés de rhubarbe de chine (« Rhu ») et de rhubarbe des jardins (« Rha »), ajouter un égal volume de lessive de NaOH à 50 g/l. Agiter énergiquement.
La phase aqueuse (inférieure) se colore en rouge pourpre (dianions de diverses anthraquinones), la phase organique, initialement colorée en jaune citron (anthraquinones), se décolore totalement.
Sous forme de sels (dianions), les anthraquinones, polaires, ne sont plus solubles que dans l’eau et deviennent rouges (voir p. 31).
Conclure en comparant les résultats des deux extraits.
Comparaison des aglucones anthraquinoniques des 2 rhubarbes en CCM
Préparation de la CCM
Les deux tubes à hémolyse contenant la deuxième portion d’éther de chacune des 2 rhubarbes sont utilisés pour comparer leur composition en anthracénosides par CCM.
À chacun d’eux, ajouter un peu de Na2SO4, (le moins possible : une pointe de spatule !) : q.s. pour sécher vos extraits, uniquement si nécessaire.
Support : Silice sur feuille d’aluminium - 3 pistes Déposer :
1°) 40 fois* l’extrait « Rhubarbe de chine » 2°) 40 fois* l’extrait « Rhapontic »
3°) 2 fois le témoin pour chromatographie des anthraquinones (mélange d’émodol, aloé-émodol, chrysophanol et rhéine).
* oui, 40 fois !
NaOH
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ATTENTION : 2 migrations sur 3,75 et 7,5 cm dans 2 solvants différents :
Développer une première fois jusqu’à la moitié de la plaque CCM, avec l’ÉLUANT n°1 :
acétate d'éthyle - méthanol - eau (7,7/1,3/1 ; v/v/v) Bien le mélanger. Dans une cuve à chromatographier, placer 10 ml de ce solvant. Laisser les vapeurs saturer la cuve (10 min, env.).
Placer la plaque CCM et développer le chromatogramme.
Lorsque le front du solvant a atteint la ligne intermédiaire, à mi-chemin du parcours total, retirer le chromatogramme de la cuve.
Évaporation totale du solvant : sécher la plaque au sèche-cheveux.
Développer une deuxième fois jusqu’à 1cm du haut de la plaque CCM, avec l’ÉLUANT n°2 : toluène - formiate d’éthyle - acide formique (7,5/2,4/0,1 ; v/v/v)
Note : 2 gouttes de pipette Pasteur = ± 0,1 ml d’ac. formique.
Dans une cuve à chromatographier, placer 10 ml de ce solvant.
Bien le mélanger. Laisser les vapeurs saturer la cuve à chromatographier.
Placer la CCM complètement sèche (plus de solvant de la première migration), et développer.
Lorsque le front du solvant a atteint la ligne supérieure retirer le chromatogramme.
Évaporer le solvant de migration au sèche-cheveux (sous la hotte).
Révélation du chromatogramme :
- Sans aucune révélation les taches d’anthraquinones sont colorées en jaune.
- Révéler à 365 nm et entourer en pointillé les taches visibles (fluorescentes).
- Observer également à 254 nm et entourer (trait plein) les taches visibles.
- Révéler ensuite le chromatogramme en tamponnant avec un coton imbibé de potasse éthanolique
Chromatogramme des aglucones anthraquinoniques des 2 rhubarbes
(sans révélateur)
Témoin Extraits
Rhu Rha
2ème migration avec solvant n° 2 Tém.
Témoin Extraits
Rhu Rha
avec solvant n° 1 Tém.
STOP
1ère migration
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Substances Actives Médicamenteuses ANTHRACÉNOSIDIQUES (TP n°4)
sous UV à 365 nm réactif de Bornträger
Caractériser les taches fournies par les 2 rhubarbes en comparant leur RF et leur couleur à ceux du témoin.
Noter par des croix leurs importances relatives selon la rhubarbe.
Conclure sur les différences entre les deux rhubarbes étudiées, grâce aux trois tests effectués.
Rhu Rha Tém.
Rhu Rha Tém.
rhéine aloé-émodol émodol chrysophanol
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Extraction et purification par CHROMATOGRAPHIE (TP n°5)
TP5 :
Utilisation des connaissances nouvellement acquises :Diagnostic (diagnose) des SAM de deux drogues végétales « inconnues » (mode entraînement)
Pendant la 5ème séance (qui ne sera pas notée), vous travaillerez en binôme sur 2 poudres inconnues, avec pour objectif de découvrir les catégories de SAM qu’elles contiennent. Il s’agit d’une séance "d'essai"
(préparatoire à la 6ème séance), qui doit vous permettre, en utilisant les connaissances nouvellement acquises pendant les 4 premières séances (mise en évidence des alcaloïdes, des (poly)phénols, des saponosides et des anthracénosides), d’élaborer une méthode de diagnose chimiotaxonomique la plus rapide et/ou efficace, pour retrouver la nature des SAM.
En présentant vos conclusions justifiant cette « identification » des SAM sur Moodle®, vous saurez immédiatement si elles sont correctes et éventuellement, si ce n’est pas le cas, vous pourriez refaire certains tests ou en faire d’autres, plus discriminants jusqu’à l’obtention de la bonne réponse. Une sorte d’entraînement en quelque sorte, puisque c’est cette méthode que vous appliquerez pendant la 6ème séance.
Pour vous aider dans cette mission, vous pouvez faire appel à l'aide de vos enseignants.
Nous mettons à votre disposition également, p. 41, un tableau récapitulatif d’aide à la DIAGNOSE des principaux TYPES de SAM que vous savez mettre en évidence, maintenant. Il renvoie aux pages des Annexes où sont rassemblées les réactions rapides les plus caractéristiques que vous devez utiliser pour tester une hypothèse…
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Extraction et purification par CHROMATOGRAPHIE de SAM (TP n°6)
TP6 :
Vérification des compétences acquises :Diagnostic (diagnose) des SAM de deux drogues végétales
« inconnues » (mode « examen »)
Cette 6ème séance donnera lieu à une note qui résumera votre travail en TP et votre capacité à reconnaître les types de SAM que contiennent les 2 poudres végétales « inconnues ». Ce sera le moment ou jamais de "faire parler la poudre", mais en monôme, cette fois.
Lors de la 6ème séance, vous aurez à faire seul(e) le diagnostic du type de SAM (alcaloïdes, (poly)phénols, saponosides ou anthracénosides) que ces poudres de drogues « inconnues » renferment.
Par la méthode de diagnose mise au point en séance 5, ou une autre, qui vous semblera la plus adaptée, il vous est demandé de trouver et d’assurer la catégorie de SAM qui les caractérise et de nous présenter vos conclusions justifiant cette identification, sur Moodle®.
À vos fioles … et autres trébuchets !!!
Tableau récapitulatif des éléments de DIAGNOSE CHIMIOTAXONOMIQUE
TABLEAU RÉCAPITULATIF d’aide à la DIAGNOSE des principaux TYPES de SAM
Les n° de page sont les chiffres qui figurent dans chaque case après les croix indiquant l’intensité « relative » de la réponse de la drogue au test considéré comme diagnostique du type de SAM.
SAM
réactifs généraux (Mayer, Dragendorff,
Bouchardat)
réaction au FeCl3
réaction de Bate-Smith
réaction de la
cyanidine pouvoir
aphrogène réaction de
Bornträger fluorescence bleue
à 365 nm CCM
Alcaloïdiques quinoléiques
(type Quinquina) +++++ 43 +++ 11 11
Autres +++ 43 pas inhibée par
HCl, si ++
(poly)phénoliques
Tanins condensés - 43 ++++ 44 +++++ 45 - 24 - 49 19
Flavonoïdes - 43 ++++ 44 ± 45 +++45 - 24 - 49 -
Autres - 43 +++ 44 - 45 - 45 - 24 - 49 -
Sapon- osidiques
triterpéniques
(type polygala) - 43 ++++ 24 - 49 26
Anthracé- nosidiques NON falsifiée
(type rhubarbe de Chine) - 43 ++++ 49 NON 36
falsifiée - 43 ++ 49 OUI 35 36
codes : : Cette case doit obligatoirement être positive
: Cette case peut être positive ou négative (non diagnostique) : Cette case doit obligatoirement être négative
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Annexe : tests d’identification rapide des diverses SAM Alcaloïdiques (résumé)