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de concept à l’activité biologique
Franciane Paul
To cite this version:
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Délivré par
l’Université de Montpellier
Préparée au sein de l’école doctorale ED-168
Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (CBS2)
Et de l’unité de recherche UMR5235 CNRS DIMNP
Spécialité : Biologie Santé
Présentée par PAUL Franciane
Soutenue le 24 novembre 2016 devant le jury composé de
Madame Catherine BRAUN-BRETON, PR, UMR5235 CNRS, Montpellier Madame Sandra PELLEGRINI, DR, U1221 INSERM, Paris
Monsieur Marc DALOD, DR, U1104 INSERM, UMR7280 CNRS, Marseille Madame Florence APPARAILLY, DR, U1183 INSERM, Montpellier Monsieur Pierre GENIN, CR, UMR 3691 CNRS, Paris
Monsieur Gilles UZE, DR, UMR5235 CNRS, Montpellier
Président Rapporteur Rapporteur Examinateur Examinateur Directeur de thèse
CIBLAGE DE L'ACTIVITE DE
L'INTERFERON ALPHA
J’adresse mes sincères remerciements aux membres du jury qui m’ont fait l’honneur de juger mon travail : Professeur Catherine Braun-Breton, pour avoir accepté de présider le jury,
Docteur Sandra Pellegrini et Docteur Marc Dalod, pour avoir accepté et assuré la fonction de rapporteur, leurs commentaires m’ont permis d’améliorer la qualité de ce mémoire,
Docteur Florence Apparailly et Docteur Pierre Génin, pour avoir accepté de participer à ce jury et d’examiner ce travail.
Je remercie tout particulièrement mon directeur de thèse, le Docteur Gilles Uzé de m’avoir encadrée dans ce projet innovant et passionnant pendant ces quatre années qui, j’espère, ne sont qu’un début. Je vous en suis vraiment très reconnaissante, même si cela ne se voit pas forcément, eu égard à mon « autisme ».
Je remercie également le Professeur Guillaume Cartron pour m'avoir donné l'opportunité de réaliser cette thèse pendant mon internat et qui m’a orientée vers cette équipe de recherche : mes compagnons de bureau, de paillasse et d’animalerie Yann (merci aussi pour le FACS) et Geneviève (merci aussi pour le Laser Game), ManuE qui m’a supportée pendant son Master 2, Jean-Michel, Anne-Laure, Nadir, Alexandra et plus récemment Leentje. Je remercie très chaleureusement le Docteur Jan Tavernier au VIB à Ghent, et son équipe (Anje, Annick, Sarah, Thomas, …) pour leur étroite collaboration et leur fructueuse contribution. Je remercie aussi le Docteur Javier Hernandez et Gabriel pour leur précieuse aide avec le modèle « insHA », ainsi que le Docteur Mireia Pellegrin et son équipe pour leur accueil si chaleureux, et en particulier Mar qui m’a consacré du temps, que je sais si précieux, pour les expériences d’activation des LT CD8+.
J'exprime ma profonde gratitude envers tout le personnel de l’animalerie de l’INM, notamment pour leurs bons soins aux souris et pour la gestion du problème sanitaire que nous avons rencontré.
J’adresse mes vifs remerciements aux membres de mes comités de thèse pour leurs réflexions constructives: le Docteur Marc Dalod, le Professeur Marie Alix Poul et le Docteur Florence Apparailly.
Je tiens à remercier tous les membres de l’UMR 5235, pour la bonne ambiance de travail qui y règne : le trio de choc (tout est dit) Cathy-Ricky-Brad, Jana (entre autres pour nos innombrables pauses sucrées et nos sorties culturelles), Naoill, Nausicaa, Sandra et le “ZebraClub” (Etienne, Georges, Karima, Laura, Tien …), Prisca et Alejandra, mais aussi Christine, Gael, Véronique, Nathalie, Luc, Christian … et bien sûr les membres du "Journal Club" (Ewelina, Marianna, Caty, Alicia ...) pour nos rencontres studieuses et festives. Je remercie enfin les Professeurs Florence Cymbalista et Fanny Baran Marszac pour mes débuts passionnants en recherche lors de mon stage de Master 1, il y a 10 ans !
Cette thèse a pu être réalisée pendant mon internat (disponibilité accordée par l’ARS du Languedoc Roussillon), grâce au soutien financier de la Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer les 2 premières années mais surtout grâce au SIRIC Montpellier Cancerqui m’a permis de poursuivre en finançant la 3ème année. Merci au Dr Uzé d’avoir assuré la transition entre ces 2 financements et qui a, avec le Pr Cartron, exercé un rôle essentiel dans l’obtention de ces 2 bourses.
Papa, Maman,
Aucun mot ne peut exprimer mon amour infini pour vous, ni ma profonde reconnaissance pour tout ce que vous m’avez apporté. Tout ce parcours professionnel, je vous le dois, par la Grâce de Dieu.
Tonton, Lulu, Réré, Chou, Shou, Mammy Françoise, Clare, Henry … : Plus ou moins loin, d’Haïti à ici en passant par Paris (enfin, le 9-3), la famille est en fait toujours tout près. Merci pour tout, LOVE.
Le ciblage de l’activité de l’IFN! est une stratégie développée afin d’augmenter l’index thérapeutique de cette cytokine, dont l’efficacité requiert de fortes doses au site d’action, responsables d’une toxicité systémique. Du fait de l’expression ubiquitaire de son récepteur, le ciblage de l’IFN! par la technologie des immunocytokines est limité. En se basant sur le concept d'immunocytokine et utilisant un IFN! muté, peu actif, une efficacité de ciblage de 3 log a pu être obtenue, dans le système humain et murin, grâce au rétablissement de l'activité de l'IFN! sur les cellules ciblées. Ces IFN! ciblés sont doués d'une activité biologique, notamment anti-tumorale, dont la cible cellulaire reste à déterminer. Une stratégie inverse, en cours d'optimisation, permet d'inhiber l’activité des IFN-I spécifiquement sur les cellules ciblées. Cette double stratégie de ciblage de l’activité et de l’inhibition de l’IFN devrait permettre de déterminer les cibles des effets bénéfiques et néfastes des IFN-I, avec des applications thérapeutiques éventuelles.
Mots clés : Interféron !, ciblage, immunocytokine, anti-tumoral
Abstract
Targeting IFN activity is a strategy developed to increase the therapeutic index of this cytokine, whose efficiency requires high doses to site of action, responsible for systemic toxicity. Due to the ubiquitous expression of its receptor, the targeting efficiency of IFN-based immunocytokine is limited. Using a mutated IFN!, poorly active, a 3 log targeting efficiency was achieved, in the human and mouse system, by restoring the activity of IFN! on targeted cells. The biological activity of these targeted IFN! include an antitumoral effect, the cellular target remains to be determined. A reverse strategy being optimized, can inhibit IFN-I activity specifically on targeted cells. This dual targeting strategy of the activity and inhibition of IFN should identify the targets of beneficial and deleterious effects of IFN-I, with possible therapeutic applications.
Abréviations
... 1
Introduction
... 5Chapitre 1. Les interférons de type I (IFN-I) : Focus sur l’IFN!2 et l’IFN" humains ... 7
I. Historique des IFN-I : de la découverte au clonage ... 7
II. Evolution des gènes des IFN-I ... 8
III. Gènes et structure des protéines des IFN-I ... 9
IV. Expression des gènes des IFN-I ... 11
V. Récepteur des IFN-I : IFNAR ... 17
VI. Complexe IFN-I/IFNAR : Illustration avec l’IFN!2 humain ... 18
VII. Signalisation des IFN-I ... 21
VIII. Activité biologique des IFN-I ... 25
IX. Utilisation thérapeutique des IFN-I ... 39
X. Effets délétères des IFN-I ... 43
Chapitre 2. Les immunocytokines à visée antitumorale : une immunothérapie ciblée ? .... 52
I. Immunité antitumorale ... 52
II. Le concept d’immunocytokines ... 59
Objectifs
... 66Matériels et méthodes
... 68Résultats
... 78Partie 1. Ciblage cellulaire de l'activité de l'IFN! ... 79
I. Preuve de concept avec l’IFN!2 humain ... 79
II. Ciblage de l'IFN!2 humain sur des cellules d’intérêt ... 97
III. Ciblage cellulaire de l'activité de l'IFN!11 murin ... 122
Partie 2. Activité biologique des IFN ciblés ... 127
I. Activité biologique in vitro ... 127
II. Evaluation du ciblage dans des modèles in vivo ... 128
Partie 3. Inhibition ciblée de l’activité de l’IFN!2 humain ... 144
Discussion générale
... 148Conclusion et perspectives
... 165Bibliographie
... 166Annexe ….
... 188
Abréviations
AcMo: Anticorp(s) monoclonal (aux)
ADC: Antibody drug conjugate
ADCC: Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity ADNc: Acide désoxyribonucléique complémentaire
AMM: Autorisation de mise sur le marché
ARNm: Acide ribonucléique messager
ATCC: American type cell collection
ATP: Adénosine triphosphate
BCL2: B-cell lymphoma 2
BiTE: Bispecific T cell engager
BM-DC: Bone marrow-dendritic cell(s)
BSA: Bovine serum albumin
CAR: Chimeric antigen receptor
CD: Cluster of differentiation
CDC: Complement-dependent cytotoxicity
cDC: Conventionnal dendritic cell(s)
Cdk: Cycline-dependent kinase
CDR: Complementarity determining region(s) CFSE: Carboxyfluorescein succinimidyl ester
cGAS: cyclic GMP-AMP synthase
CH25H: Cholesterol-25-hydroxylase
CHO: Chinese hamster ovary
CI: Complexe(s) immun(s)
CMH: Complexe majeur d'histocompatibilité CPA: Cellule(s) présentatrice(s) d'antigène(s)
CpG: Cytosine-phosphate guanine
CpG ODN: CpG oligodeoxynucleotides
CRT : Calréticuline
CSH: Cellule(s) souche(s) hématopoïétique(s) CTLA-4: Cytotoxic T-lymphocyte antigen 4
CTV: Cell trace violet
CXCL10: C-X-C motif chemokine ligand 10
DAI: DNA dependent activator of IRF
DAMP: Damage associated molecular pattern molecule(s)
DC: Dendritic cell(s)
DLI: Donor lymphocyte infusion(s)
DTT: DL-Dithiothréitol
E.Coli: Escherichia Coli
EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid eIF: eukaryotic initiation factor(s)
ERK: Extracellular signal-regulated kinases
FcR: Fc Receptor(s)
FcRn: neonatal Fc receptor
FNIII: Fibronectine de type III
FSC: Forward scatter
GAS: Interferon ! activation sequence
GFP: Green fluorescent protein
GM-CSF: Granulocyte macrophage colony-stimulating factor
HVC: Hépatite virale C
Hek: Human embryonic kidney cells
HMGB1: High mobility group box 1
HPLC: High-performance liquid chromatography
ICK: Immunocytokine(s)
IDO: Indoleamine2,3 dioxygenase
IFIT: Interferon-induced protein tetratricopeptide repeats IFITM: Interferon-inducible transmembrane
IFN: Interféron(s)
IFNAR: Interferon-"/# receptor IFNpathie: Interféronpathie
Ig: Immunoglobuline(s)
IKK: Inducible I$B kinase
IL: Interleukine
IMAC: Immobilized metal affinity chromatography IRF: Interferon regulatory factor(s)
IRDS: Interferon-related DNA damage-resistant signature
IRS: Insulin receptor substrate
ISG: Interferon stimulated gene(s) ISGF3: Interferon-stimulated gene factor 3 ISRE: IFN-stimulated regulatory elements ITK: Inhibiteur(s) de tyrosine kinase
IP: Intrapéritonéal
IT: Intratumoral
IV: Intraveineux
JAK: Janus kinase
JNK: c-Jun N-terminal kinase
KD: Constante de dissociation
KIR: Killer immunoglobin-like receptor
KO: Knock-out
LES: Lupus érythemateux systémique
LMC: Leucémie myéloïde chronique
LB, LT: Lymphocyte(s) B, Lymphocyte(s) T
LN: Lymph node (s)
LNH: Lymphome non hodgkinien
LES: Lupus érythemateux systémique
LPS: Lipopolysaccharide
LTC: Lymphocyte(s) T cytotoxique(s)
MAI: Maladie(s) autoimmune(s)
MAMP : Microbial-associated molecular pattern(s)
MAPK: Mitogen activated protein kinase
MAVS: Mitochondrial antiviral signalling protein(s)
MCA: Méthylcholanthrène
MCI: Mort cellulaire immunogène
MDA5: Melanoma differentiation associated gene 5
MDSC: Myeloid-derived suppressor cells
MET: Microenvironnement tumoral
MFI: Mean fluorescence intensity
miARN: micro-ARN
MIC: MHC class I chain-related protein
mTOR: Mammalian target of rapamycin
Mx: Myxovirus resistance
MyD88: Myeloid differentiation primary-response gene 88
ndLN: non draining lymph node(s)
NET: Neutrophil extracellular trap(s)
NF-$B: Nuclear factor-kappa light chain enhancer of activated B-cells
NK: Natural killer
NMR: Nuclear magnetic resonance
OAS: 2',5' Oligoadenylate synthetase
ORN: Oligoribonucléotide(s)
OV: Oncovirus
PAMP: Pathogen-associated molecular pattern(s) PBMC: Peripheral-blood mononuclear cell
PBS: Phosphate-buffered saline
PCR: Polymerase chain reaction
pDC: plasmacytoid dendritic cell(s)
PD1: Programmed cell death protein 1
PDL1: Programmed cell death protein ligand 1
PEG: Polyéthylène glycol
PI3 kinase: Phosphoinositide 3 kinase
PIAS: Protein inhibitors of activated STAT
PKC: Protéine kinase C
PKR: Protéine kinase R
pLN: pancreatic Lymph node (s)
PNN: Polynucléaires neutrophiles
PRD-LE: Positive regulatory domain-like element(s) PRR : Pathogen recognition receptor(s)
pSTAT: STAT phosphorylé(s)
RIG-I: Retinoid acid-inducible gene-I
RVP: Réponse virale prolongée
S1P1: Sphingosine 1-phosphate receptor-1
SAG: Syndrome d’Aicardi-Goutières
SC: Sous-cutané
scFv: Single-chain variable fragment
SSC: Side scatter
SEP: Sclérose en plaque
SIDA: Syndrome d'immunodéficience acquise
SOCS: Suppressors of cytokine signaling
SRN: Surnageant
STAT: Signal transducer and activation of transcription STING: Stimulator of interferon genes
SVF: Sérum de veau fœtal
TAM: Tumor associaed macrophages
TBK1: Tank-binding kinase 1
TCR: T cell receptor(s)
TGF: Transforming growth factor
TLR: Toll like receptor(s)
Th1: Lymphocyte T helper de type 1
TIR: Toll/IL-1 resistance
TNF: Tumor necrosis factor
TRAIL: Tumor-necrosis-factor related apoptosis inducing ligand
Tregs: Lymphocytes T régulateurs
TREX1: DNA 3’ repair exonuclease 1
TRIM: Tripartite motif
TRIF: TIR domain-containing adaptator inducing IFN#
UBP43: Ubiquitin protease 43
USP18: Ubiquitin Specific Protease 18
UV: Ultra violet
U.I: Unité internationale
VCML: Virus de la chorioméningite lymphocytaire VEGF: Vascular endothelial growth factor
VHC: Virus de l’hépatite C
VIH: Virus de l'immunodéficience humaine
VIS: Virus de l'immunodéficience simienne
VRE: Virus-responsive element(s)
Introduction
Les interférons : une famille, trois types
Les interférons (IFN) appartiennent à la famille des cytokines à structure hélicale. Ils ont été définis, lors de leur découverte en 1957 [1], par leur capacité à interférer avec la réplication virale. Les IFN de type I (IFN-I), les premiers types d’IFN à avoir été caractérisés, sont les IFN les plus largement utilisés à visée thérapeutique. A ce jour, 3 types d'IFN ont été distingués: l’IFN-II en 1965 [2] et les IFN-III en 2003 [3, 4]. Ils diffèrent notamment par le récepteur hétéro-dimérique sur lequel ils se fixent :
- Interferon-"/# receptor (IFNAR1 et IFNAR2) pour les IFN-I - Interferon-! receptor (IFNGR1 et IFNGR2) pour l'IFN-II
- Interferon-% receptor (IFNLR1 et IL10R2, sous-unité partagée avec le récepteur à l’interleukine 10 (IL10)) pour les IFN-III.
Selon l'analyse phylogénétique des IFN chez les vertébrés, les IFN-I et les IFN-III sont plus proches entre eux par rapport à l'IFN-II [5]. Cette similitude se retrouve au niveau des principales voies de signalisation (JAK/STAT) activées par les différents types d'IFN [6] : - Hétérodimère de STAT1- STAT2 phosphorylés par Jak1 et Tyk2, pour les IFN-I et IFN-III - Homodimère de STAT1 phosphorylés par Jak1 et Jak2, pour l'IFN-II.
de signalisation principale. De plus, ils sont souvent co-exprimés au cours d’une infection virale car ils ont des mécanismes d’induction similaires [13]. Il existe tout de même des différences entre ces 2 types d’IFN. Les IFN-III ont une activité antivirale surtout sur les cellules épithéliales [14] car leur récepteur est préférentiellement exprimé par les cellules épithéliales [13], alors que les IFN-I agissent sur toutes les cellules de l'organisme du fait de l'expression ubiquitaire de leur récepteur, avec des effets nettement moindres sur les cellules épithéliales qui expriment beaucoup plus fortement le récepteur IFNLR que le récepteur IFNAR [15]. Les IFN-III sont le type d’IFN préférentiellement exprimé au niveau des poumons des souris infectées avec le virus de la grippe et retrouvé dans des biopsies hépatiques de patients atteints d’hépatite virale C [13]. Les IFN-III semblent importants pour le contrôle du virus de l’hépatite C (VHC) par leur action sur les hépatocytes [16].
Chapitre 1. Les IFN de type I (IFN-I) : Focus sur l'IFN!2 et
l'IFN" humains
Les IFN-I représentent une famille d’au moins 8 sous-types (", #, &, ', $, (, ) et *) décrits chez différents mammifères avec des sous-types spécifiques d’espèces (IFN* ou limitines retrouvées chez la souris) et dotés de fonctions particulières, comme le développement précoce de la gestation (IFN& chez les cochons et IFN ( chez les ruminants).
Les IFN-I exercent une activité pléiotropique: en plus de leur activité antivirale, ils exercent une activité anti-proliférative et immuno-modulatrice. Leur utilisation thérapeutique est ainsi très variée: traitement des infections virales, de diverses tumeurs et de la sclérose en plaque. Les IFN-I sont par ailleurs des cytokines clés de la réponse immunitaire, à la fois innée et adaptative, notamment par leur action sur les cellules dendritiques (DC) qui sont à l’interface de l’immunité innée et adaptative. Ils sont sécrétés précocement après la reconnaissance par l’organisme de signaux de « danger » indiquant la présence de pathogènes ou de cellules endommagées, communément appelés pathogen-associated molecular patterns (PAMP) et
damage-associated molecular patterns (DAMP)[16]. Ils constituent ainsi une des premières
défenses de l’organisme mais interviennent aussi dans la mise en place de l’immunité adaptative, spécifique. En effet, les IFN-I modulent les 3 signaux de la synapse immunologique entre les DC et les LT, nécessaires à l’activation des LT par les DC: le complexe CMH-peptide antigénique, la co-stimulation et la production de cytokines [16, 17]. Les IFN-I favorisent ainsi la production d’anticorps par les lymphocytes B, l’activation des LT CD8+ [18] et la polarisation Th1 des LT CD4+ [19].
Après un bref rappel historique et quelques données d'évolution, nous exposerons les données biologiques des IFN-I humains et leur utilisation thérapeutique en nous focalisant sur l'IFN"2 et l'IFN#, les 2 sous-types d'IFN-I utilisés en thérapeutique et qui sont aussi les mieux caractérisés. Enfin, nous présenterons les effets potentiellement néfastes de ces cytokines dont la prévention est l'objectif de ce travail de thèse.
I. Historique des IFN-I : de la découverte au clonage
avec la multiplication d'un second virus, similaire ou non au premier. Ce phénomène avait déjà été décrit depuis les années 30 [20] mais ce n’est que 20 ans plus tard que les IFN ont été découverts par Alick Isaacs et Jean Lindenmann [1] qui ont réalisé l'expérience suivante: après une incubation d'une nuit d'une membrane chorio-allantoïdienne de poussin en présence d'un virus de la grippe inactivé par la chaleur, le surnageant a été utilisé comme milieu de culture pour une autre membrane chorio-allantoïque. Cette dernière a ensuite été incubée avec un virus vivant de la grippe et en a inhibé la réplication. Cette expérience a ainsi laissé suggérer la présence d'un facteur sécrété par la première membrane, qui a permis d'inhiber la réplication virale dans la deuxième membrane [20]. Ce facteur fut nommé IFN.
Basés sur cette expérience, plusieurs protocoles ont permis de produire de l'IFN, après stimulation virale de différents types cellulaires: initialement des membranes chorio-allantoïdiennes [21], puis des leucocytes humains issus du sang périphérique de donneurs sains [22]. Ces méthodes de production d'IFN avaient un faible rendement et ces préparations d’IFN étaient hétérogènes, comprenant différents types d'IFN.
Le clonage des gènes des IFN-I (basé sur leur activité antivirale) et la production d'IFN-I recombinant ont participé à la caractérisation des différents types d'IFN-I. Brièvement, les ARNm de cellules stimulées par des virus étaient isolés. Les ADNc correspondants furent insérés dans un plasmide puis clonés dans Escherichia Coli (E.Coli) pour produire les protéines. L'activité antivirale de ces protéines était utilisée pour définir les protéines produites en IFN. Les gènes d'IFN-I humains ont été clonés depuis 1980; les premiers étant l’IFN#, l’IFN"1 et l’IFN"2 [23-28]. Un même IFN pouvait avoir différentes dénominations selon l'équipe, tels que Hif-SN206 [25] et LeIF A [24] pour l'IFN"2. Ainsi dans un souci d'harmonisation, des nomenclatures ont été mises en place. Selon la nomenclature actuelle [29], IFN"2 correspond à la protéine codée par le gène IFNA2.
II. Evolution des gènes des IFN-I
rétrotransposition, qui consiste en la transcription inverse d’ARNm suivie de l’intégration de l’ADNc correspondant au génome. Malgré l'absence d'intron et d'épissage alternatif, il existe une diversité des IFN-I chez les mammifères euthériens, liée à une multiplicité de leurs gènes. Chez l‘Homme (Homo sapiens, Hsa), les IFN-I comprennent 17 membres [5] incluant 13 sous-types ", l'IFN #1, l'IFN )1, l'IFN '1 et l'IFN $1 dont les gènes sont tous localisés sous forme de cluster au niveau du chromosome 9 en 9p21 [29, 31]. Chez la souris (Mus musculus,
Mmu), les gènes des IFN-I sont co-localisés au niveau d'un locus sur le chromosome 4, en
position de synténie conservée avec le locus 9p21 chez l'Homme. Ces gènes codent pour 18 membres: les IFN "1 à "13, l'IFN #1, l'IFN '1 et 3 limitines (ou IFN *1 à 3). Les 13 gènes
IFNA résultent de duplications de gènes [32], qui est survenue après la spéciation [5]. En
effet, les gènes IFNA ont évolué indépendamment dans chaque espèce. Il y a ainsi une nette divergence entre les gènes IFNA humains (IFNA) et murins (Ifna), il n’y a donc pas d’orthologue connu chez la souris des gènes IFNA humains [33]. On retrouve des homologues directs des IFN" humains seulement pour des espèces de primates proches phylogénétiquement, comme le chimpanzé.
Le grand nombre de sous-types d'IFN-I suggère le développement, au cours de l'évolution, d'une pression de sélection, notamment exercée par les infections virales afin d'optimiser les réponses antivirales. Si la duplication des gènes a permis une multiplicité des gènes des IFN-I, la diversité de ces gènes résulte de l’acquisition de mutations. Ces mutations peuvent conférer une nouvelle fonctionnalité ou être inactivatrices, on parle alors de pseudogènes. L’étude de cette évolution au sein de la population humaine a révélé l’existence de 2 groupes de gènes selon la fréquence des mutations non synonymes ou non-sens [34]. Certains gènes, tels que
IFNA2 et IFNB ont très peu de mutations non synonymes ou non sens, ce qui suggère une
fonction essentielle non redondante. A l’inverse, d’autres gènes présentent une fréquence élevée de polymorphismes non synonymes et 2 gènes (IFNA10 et IFNE) semblent en voie de devenir des pseudogènes car des mutations non-sens ont été décrites à l'état homozygote dans la population générale.
III. Gènes et structure des protéines des IFN-I
A. Gènes et variants alléliques
Les gènes des IFN-I humains incluent 13 IFNA, l’IFNB1, l’IFNW1, l’IFNK1, l’IFNE1 [5] avec une homologie de séquence de 80 à 95 % entre les différents gènes IFNA et de 50% entre les gènes IFNA et l’IFNB1 [35]. Ces gènes, sans introns, sont localisés avec leurs pseudogènes sous forme de clusters en 9p21 [29] et codent pour les 13 sous-types d'IFN" (IFN"1, "2, "4, "5, "6, "7, "8, "10, "13, "14, "16, "17 et "21), l'IFN #1, l'IFN )1, l'IFN '1 et l'IFN $1. La protéine codée par le gène IFNA1 et identique à celle codée par le gène
IFNA13. Il y a donc 12 IFN" différents [5].
Les gènes IFNA codent pour une pré-protéine comprenant un peptide signal de 23 acides aminés clivé lors de la sécrétion de la protéine mature de 166 résidus sauf pour l’IFN"2 qui est composé de 165 acides aminés. En effet, il manque à l’IFN"2 l’acide aspartique présent en position 44 chez les autres sous-types d’IFN". L'IFNA2 humain est caractérisé par des variants alléliques dont la fréquence au sein d’une population varie selon l’origine ethnique [36, 37]. Parmi les variants alléliques décrits, l’IFN"2a et l’IFN"2b, plus connus sous leur nom commercial (RoferonA et IntronA, respectivement) diffèrent l’un de l’autre par l’acide aminé en position 23: lysine pour le premier et histidine pour le second [38]. L’IFN# est constitué de 166 acides aminés et est glycosylé [39].
B. Les IFN-I: des cytokines à structure hélicale
Les 165 résidus de l’IFN"2 sont organisés sous forme de 5 hélices " (A à E). La structure tri-dimensionnellede l'IFN"2a été révélée par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire [40] et par cristallographie aux rayons X [41]. Les hélices A, B, C et E forment un barillet de 4 hélices " dont l'axe est orienté vers la gauche, caractéristique de la famille des cytokines à structure hélicale. Entre les hélices A et B, il existe une grande boucle, perpendiculaire à l'axe du barillet, la boucle AB. Le segment initial de la boucle AB est lié à l'hélice E par un pont disulfure (entre les cystéines 29 et 138). Un second pont disulfure (entre les cystéines 1 et 98) relie l'extrémité N-terminale à l'hélice C.
IV. Expression des gènes des IFN-I
A part l'IFN$ et l'IFN' produits respectivement par les kératinocytes et le tractus génital, les IFN-I peuvent être produits par toutes les cellules de l'organisme, en réponse à une infection virale.
A. Expression basale et inductible
A l’état basal, les IFN-I sont exprimés à un faible niveau [44], inférieur au seuil de détection des méthodes classiques [16]. Cette expression basale a pu être mise en évidence, notamment dans des souris exprimant la luciférase de la luciole (firefly) sous le contrôle du promoteur du gène Ifnb1 [45]. Dans ce modèle, l'activité luciférase a été observée essentiellement dans le thymus mais aussi, dans une moindre mesure dans le foie, la rate, l'intestin grêle et les ganglions lymphatiques. Ces données suggèrent que l'expression basale des IFN-I est faible et localisée.
Très précocement après une infection virale, une grande quantité d'IFN-I est produite et est détectable au niveau du site de l'infection [16, 46]. Lorsque l'infection virale est localisée, les IFN-I sont produits localement par les cellules infectées afin de bloquer la réplication du virus au niveau de son entrée dans l’organisme [16]. Les IFN-I constituent ainsi la première ligne de défense pour éviter la propagation des virus. Cependant, plusieurs virus ont développé des mécanismes de résistance en codant pour des gènes qui inhibent spécifiquement la production d’IFN-I dans les cellules infectées. Dans ce cas, l’infection virale peut devenir systémique et les DC plasmacytoïdes (pDC) spléniques constituent alors la principale source des IFN-I. Si l’infection virale est le principal inducteur d’IFN-I, d’autres signaux de « danger » sont reconnus et aboutissent à la production de grandes quantités d’IFN-I, comme illustré dans la figure 1.
L'expression des gènes des IFN-I est régulée au niveau transcriptionnel. Nous allons décrire les mécanismes de cette régulation transcriptionnelle puis les cascades de signalisation impliquées dans l'induction des IFN-I.
B. Régulation transcriptionnelle
IRF7 IRF3 p p p p VRE Nucleus Chromosome 9 Cytoplasm TBK1 IFNA2 Transcription IRF3 p p Endosome TLR3 TLR7/8 TLR9 CpG DNA ssRNA dsRNA DAI Cytosolic sensors dsRNA DNA IRF kinases Endosomal receptors IFNB STING Transcription cGAS RIG-I MDA5 TRAF3 TANK TRAF3 TRIF IKK! TRAF3 IKK" IRAK1 PI3K TRAF6 MyD88 IRAK4 IRF 3 IRF 7 IRF 3
Figure 1. Induction des IFN-I
Les motifs moléculaires associés aux pathogènes (PAMP) et aux dommages cellulaires (DAMP) sont reconnus par des senseurs cytosoliques ou des récepteurs endosomaux qui activent différentes voies aboutissant à l’activation de kinases d’IRF (IFN regulating factor). Ces kinases activent IRF3 et IFR7, qui une fois phosphorylés, transloquent dans le noyau, se lient au promoteur des gènes des IFN-I et activent leur transcription. Alors que IRF3 suffit à induire l’IFN#, l’induction des genes IFNA nécessite en général à la fois IRF3 et IRF7. Tiré de [47] (en annexe).
1. Les séquences cis-régulatrices: VRE et PRD
2. Les IRF
Chez l'Homme, il existe 9 IRF, impliqués dans la signalisation des IFN-I (IRF9) et dans la régulation positive ou négative de l’expression des gènes d’IFN-I. Les IRF1 à 8 ont tous une séquence homologue de liaison à l'ADN, au niveau des promoteurs des gènes IFNA et/ou
IFNB.
Les IRF1 et IRF2 sont constitutivement présents à l’état actif. IRF2 se lie au niveau du même site que l’IRF1 et inhibe son activité transcriptionnelle. La demi-vie d’IRF1 est plus courte que celle de l'IRF2, ceci expliquerait le faible niveau basal d’expression des IFN-I. De plus, IRF1 ne lie pas le VRE des gènes IFNA. Ceci suggère que les IFN-I exprimés de façon physiologique sont essentiellement constitués d’IFN# [44].
L'induction des IFN-I résulte de l’activation des VRE par 2 principaux IRF, les IRF3 et 7. IRF3 est constitutivement exprimé et suffit à l'induction de la transcription du gène IFNB mais nécessite IRF7 pour activer la transcription de la majorité des gènes IFNA. IRF7 n’est pas exprimé de façon constitutive dans la plupart des cellules et est induit par les IFN-I. Ainsi, l'induction des IFN" se réalise en 2 phases avec une synthèse préalable d'IFN# qui induit IRF7 [48, 50].
Pour être actifs, les IRF3 et IRF7 doivent être phosphorylés par des kinases d'IRF. Ces kinases sont elles-mêmes activées par différentes cascades de signalisation initiées par la reconnaissance de motifs moléculaires, les PAMP et les DAMP, indiquant respectivement la présence d'agents microbiens ou d'un stress cellulaire [16].
Les différents acteurs impliqués dans l'induction des IFN-I vont être détaillés dans les chapitres qui suivent.
C. Mécanismes d'induction
1. Les signaux initiateurs et leur détection
Les motifs moléculaires (PAMP et DAMP) sont des signaux de danger reconnus par des récepteurs appelés PRR, pour Pathogen recognition receptors [51]. Ces PRR comprennent des senseurs cytosoliques (d’ADN ou d’ARN) ou des récepteurs qui appartiennent à la famille des Toll like receptor (TLR).
a. Les PAMP et les DAMP
l'induction des IFN-I sont principalement des acides nucléiques exogènes. Ils sont distingués des acides nucléiques endogènes par différents mécanismes [52]:
- séquestration des TLR dans les endosomes et exclusion de l’ADN nucléaire et mitochondrial du cytoplasme ou du milieu extra-cellulaire
- différences entre les acides nucléiques endogènes et exogènes. On distingue par exemple parmi les acides nucléiques viraux, les ARN simple brin qui ont en 5' un groupe bi- ou tri-phosphates et les ARN double brin, structures qui chez les eucaryoytes sont généralement associées à des protéines qui les masquent aux PRR. De même, l'ADN bactérien est distingué de l'ADN des vertébrés, notamment par la différence de leurs motifs CpG. Les séquences CpG qui correspondent à de l'ADN contenant une séquence riche en cytosine-phosphate-guanine, sont très fréquentes et non méthylées dans les bactéries. A l'inverse, les séquences CpG présentes dans l'ADN des eukaryotes sont moins fréquentes et leur état de méthylation participe au contrôle épigénétique de la transcription.
Les DAMP sont générés au cours de lésions tissulaires et/ou cellulaires, ils correspondent notamment à des molécules intracellulaires libérées par les cellules lésées ou mourantes dans le milieu extracellulaire [53]. Parmi les DAMP qui induisent les IFN-I, la protéine High Mobility Group Box 1 (HMGB1) est une protéine chaperone de l'ADN qui libérée dans le milieu extra-cellulaire est un médiateur pro-inflammatoire impliqué dans l'endotoxémie [54]. Les acides nucléiques endogènes et leurs produits de dégradation générés au cours des réponses aux dommages à l'ADN peuvent être reconnus comme des DAMP s'ils contiennent des lésions causées par des stress oxydatifs (par exemple aux UV), s'ils ont une localisation ectopique (ADN ou ARN extracellulaire ou ADN cytosolique) ou s'ils sont associés à des protéines qui favorisent leur localisation endosomale et l'activation des TLR.
b. Les PRR : les TLR et les senseurs cytosoliques
spécifiquement, le TLR8 est activé par les produits de dégradation de l’ARN simple brin, avec 2 sites de reconnaisance distincts, un pour l’uridine et un pour des oligoribonucléotides (ORN) contenant de la guanosine [55], alors que le TLR7 a 2 sites de liaison au ligand essentiels à son activation [56]: un qui reconnaît un ORN contenant de l’uridine et l’autre qui lie la guanosine ou des dérivés méthylés ou hydroxylés [57]. Basés sur le mimétisme des motifs reconnus par les TLR, différents inducteurs d’IFN ont été développés: des oligonucléotides synthétiques avec des motifs CpG (CpG ODN), des analogues de la guanosine (Imiquimod) ou encore l’acide polyionisique-polycytidylique (polyI:C), qui sont des agonistes des TLR9, TLR7 et TLR3, respectivement.
Parmi les senseurs cytosoliques, RIG-I (Retinoic acid-Inducible Gene-I) et MDA5 (Melanoma Differentiation Associated gene 5) de la famille des hélicases type RIG-I reconnaissent l'ARN double brin alors que DAI (DNA dependent activator of IRF) et cGAS (cyclic GMP-AMP synthase) reconnaissent l'ADN double brin [58] et la protéine kinase R (PKR) induit la production d'IFN-I en réponse à l'ARN double brin [51].
Ainsi, les PRR qui induisent la production d’IFN-I sont situés dans le compartiment intra-cellulaire. Le TLR4 semblait être une exception mais en fait le TLR4 subit une endocytose (dépendante du CD14) induite par le LPS et signalise ainsi dans des endosomes pour la production d’IFN-I [59-61].
2. Transduction du signal
Après la reconnaissance des signaux de danger, les TLR et les senseurs cytosoliques activent différentes voies de signalisation par l'intermédiaire de diverses protéines adaptatrices: TRIF (TIR domain-containing adaptator inducing IFN!), MAVS (mitochondrial antiviral
signalling protein), STING (stimulator of interferon genes) et MyD88 (Myeloid Differentiation primary-response gene 88).
Les TLR activent essentiellement des voies de signalisation dépendantes de MyD88. Le TLR3 active des voies de signalisation qui font intervenir TRIF. Le TLR4 peut activer MyD88 et TRIF mais c'est TRIF qui est impliqué dans l'induction des IFN-I après activation du TLR4 par le LPS [62]. Cette signalisation médiée par TRIF nécessite l’endocytose du TLR4 [59]. Les senseurs cytosoliques activent des voies de signalisation qui font intervenir des protéines mitochondriales, les MAVS et STING est le principal adaptateur activé par les senseurs cytosoliques d’ADN [16].
phosphorylation au niveau de sérines. Une fois activés, les IRF3 et IRF7 homo- ou hétéro- dimérisent et se transloquent vers le noyau où ils se fixent sur les VRE des gènes IFNA et
IFNB pour activer leur transcription.
3. Les pDC: sources majeures d'IFN-I
Si toutes les cellules ont des senseurs nécessaires à la détection d'une réplication virale, les pDC peuvent reconnaître des signaux de danger sans être infectées, après endocytose de matériel infecté [16]. Ces DC ne sont donc pas sensibles aux mécanismes viraux d’inhibition de production des IFN-I [16]. Les pDC expriment spécifiquement les TLR7 et TLR9. Par ailleurs, les pDC expriment un niveau élevé d'IRF-7 de façon constitutive. Ainsi les pDC, équipées d'un puissant système de synthèse et de sécrétion protéique, sont les principales sources d'IFN-I, chez l’Homme [63, 64] mais aussi chez la souris [65-68]. En effet, les pDC sont responsables chez la souris de plus de 95% de la production d'IFN-I au cours d'une infection virale systémique [16].
4. Régulation de l'induction
Différents mécanismes permettent l'amplification de la production d'IFN-I. Différents gènes induits par les IFN-I codent pour des senseurs cytosoliques d'ADN ou d'ADN, le TLR7 ou encore IRF7 [16]. Ceci induit une boucle d'auto-amplification, médiée par l'induction de STING [69], cGAS [70] ou encore d'IRF7 [71, 72] par les IFN-I. Ceci explique qu'une grande quantité d'IFN est rapidement produite après infection virale. Cette production est aussi transitoire et s'explique entre autre par la demi-vie courte d'IRF7 [73], la dégradation de la forme phosphorylée d'IRF3 médiée par l’ubiquitine [74] et des boucles de rétrocontrôle négatif, telles que l’induction de Bst2 par les IFN-I qui se lie au récepteur ILT7 à la surface de pDC humaines et inhibe fortement la production d’IFN-I par les pDC [75].
V. Récepteur des IFN-I : IFNAR
A. Les gènes et leur expression
Le récepteur des IFN-I est composé de 2 sous-unités, IFNAR1 et IFNAR2, numérotés selon l'ordre chronologique de leur clonage. IFNAR1 a en effet été le premier récepteur des IFN-I à avoir été cloné en 1990 par Uzé et al. qui ont émis l'hypothèse que ce récepteur ne suffisait pas à lui seul à l'activité des IFN-I [76]. Cette hypothèse fut confirmée avec la découverte et le clonage d'IFNAR2 [77, 78]. Les gènes IFNAR1 et IFNAR2 sont tous 2 localisés au niveau du chromosome 21, en 21q22 [78].
Il existe 3 isoformes d'IFNAR2, résultant notamment d’épissage alternatif[79]:
-
la forme complète, IFNAR2.2 ou IFNAR2c [78], classiquement appelée IFNAR2-
la forme tronquée IFNAR2.1 ou IFNAR2b, qui ne permet pas l’activation de STAT [80]-
la forme sécrétée soluble, IFNAR2.3 ou IFNAR2a, retrouvée notamment dans les urines etle sérum [81].
Le récepteur des IFN-I est exprimé de façon ubiquitaire dans l'organisme. Le nombre de récepteurs IFNAR à la surface de la cellule est relativement bas, entre 100 et 1000 par cellule et varie d’un type cellulaire à l’autre [82].
B. Structure du récepteur
Le récepteur des IFN-I appartient, comme celui des IFN-II et des IFN-III, à la famille des récepteurs de cytokines à structure hélicale de classe II [83].
1. Récepteur de cytokines de classe II
Les récepteurs de cytokines à structure hélicale sont pour la plupart, constitués de 2 sous-unités, qui comportent chacune 3 parties:
- un domaine extra-cellulaire qui interagit avec le ligand - un seul domaine transmembranaire
- un domaine cytoplasmique pour la transduction du signal.
position des cystéines. La position des résidus cystéine a permis de distinguer 2 classes de récepteurs. Les récepteurs de classe II se distinguent des récepteurs de classe I, par ailleurs par l'absence du motif « WSXWS » au niveau du SD100B.
2. IFNAR1 et IFNAR2
Le gène IFNAR1 est le seul récepteur de cytokines de classe II à avoir 4 SD100, classiquement notés SD1 à SD4. L'organisation des gènes (position et phase des introns par rapport aux exons) codant les SD100 d'IFNAR1 suggère que ces domaines résulteraient de la duplication de domaines SD100A et SD100B. En effet, l'organisation génique des domaines SD1 et SD3 est la même que celle des domaines SD100A, alors que les domaines SD2 et SD4 ont la même organisation génique que les domaines SD100B. Cependant, contrairement aux domaines SD1 à SD3, le domaine SD4 nécessaire à la signalisation, n'est pas impliqué dans la liaison à l'IFN"2 [84]. Ainsi, si le nombre de domaines a été doublé, ce n'est pas le cas du nombre d'unités de liaison au ligand.
IFNAR 2 est la sous-unité qui a la plus forte affinité intrinsèque au ligand. Son domaine extracellulaire contient 2 domaines SD100, connectés à 90° l'un de l'autre.
Le domaine intracellulaire est constitutivement associé à des kinases de la famille des Janus kinases (JAK): Jak1 pour IFNAR2 et Tyk2 pour IFNAR1. Ces kinases participent à la transduction du signal par la voie JAK/STAT. De plus, Tyk2 participe au maintien d’IFNAR1 à la membrane plasmique [85] en inhibant son endocytose et le protège ainsi de la dégradation [86].
VI.
Complexe IFN-I/IFNAR : illustration avec l'IFN!2 humain
Les IFN-I exercent leur activité biologique par différentes voies de signalisation, initiées par la formation d'un complexe ternaire entre les IFN-I et leur récepteur. Il est très probable que les IFN-I forment un complexe ternaire similaire à celui formé par IFNAR1-IFN"2-IFNAR2. Ceci est suggéré par la superposition parfaite décrite par Thomas et al. entre les complexes ternaires formés par l'IFN"2 et l'IFN) [87] mais aussi par d'autres données structurelles [88-92]. L'IFN"2 et l'IFN# partagent la même interface de liaison à IFNAR1 et à IFNAR2 [93], même si les résidus impliqués sont différents.
cartographie précise des résidus d'IFN"2 impliqués dans la liaison à IFNAR1et IFNAR2 a été établie et est représentée dans la figure 2. Nous allons donc décrire le complexe formé par les IFN-I avec leur récepteur en nous basant sur les données obtenues avec l'IFN"2, en apportant des précisions, si pertinentes, sur les autres sous-types d'IFN-I. Brièvement, une surface de 18 nm2 formée par une partie de la boucle AB et des hélices A et E, interagit avec IFNAR2. Le domaine d'interaction avec IFNAR1 est situé du côté opposé de la molécule d'IFN, il s'étend sur une surface de 22 nm2 qui contient les résidus situés au niveau des hélices B, C et D [82].
A. Les sites de liaison
Les données de mutagenèse et de structure (cristallographie à rayons X, spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (NMR, pour nuclear magnetic resonance) ont révélé que les sites de liaison de l'IFN"2 à IFNAR1 et IFNAR2 sont localisés sur des faces opposées de l'IFN"2 [94, 95].
1. IFN!2/IFNAR1
Les résidus d'IFN"2 impliqués dans la liaison avec IFNAR1 sont localisés au niveau des hélices B (H57, E58 and Q61), C (F64, N65, T69, L80, Y85 and Y89) et D (D114, L117 avec une partie composée de résidus chargés positivement : R120, K121, Q124, R125). R120 est le seul résidu « hotspot » de la liaison IFN"2/IFNAR1 décrit [96]. Les « hotspot » sont définis par des résidus qui ont une contribution énergétique élevée, leur mutation diminue ainsi la liaison globale de façon importante. Les 3 résidus H57, E58 et Q61 sont situés à proximité de R120. Les résidus E58 et Q61 sont conservés dans tous les IFN-I mais H57 est conservée dans tous sauf l’IFN# [82].
2. IFN!2/IFNAR2
dans l’IFN+ où il est l’acide aminé en position 33 est une asparagine et l’IFN, où l’arginine est en position 35 [87].
L'extrémité C-terminale de l'IFN"2, située après le résidu 158 se lie à 3 résidus d'IFNAR2, chargés négativement. Ainsi, la modification de la charge nette de cette extrémité C-terminale de l’IFN"2 contribue à la modification de l'affinité de la liaison à IFNAR2 [98].
Figure 2. Complexe ternaire IFN-IFNAR (A) avec les résidus d’IFN!2 humain d’intérêt dans l’interaction avec IFNAR2 (B).
A. Les sites de liaison des IFN-I à IFNAR1 (hélices B, C et D) et à IFNAR2 (boucle AB, hélices A et E) étant diamétralement opposés, ils permettent une liaison simultanée aux 2 sous-unités du récepteur IFNAR. Tiré de [87].
B. Les résidus d’IFN"2, hotspot pour l’interaction avec IFNAR2, sont en rouge. Les résidus en bleu sont d’autres résidus importants pour la stabilité du complexe. Tiré de [99].
B. La cinétique de liaison
La liaison des IFN-I à leur récepteur est dynamique avec une association et une dissociation. L'affinité de la liaison à chaque sous-unité du récepteur est estimée par la constante de dissociation à l'équilibre définie par le KD. Le KD est le ratio entre la constante d'association (kon ou ka) et la constante de dissociation (koff ou kd).
A
Tous les IFN-I se lient rapidement à IFNAR2 avec des kon qui peuvent être augmentées par des attractions électrostatiques. L’association à IFNAR1 est relativement lente. La différence d’affinité entre les différents IFN-I est essentiellement due à une différence dans les koff [82].
1. Un processus en 2 étapes
Tous les IFN-I présentent une dissymétrie dans l'affinité de la liaison à IFNAR1 et à IFNAR2. En effet, le KD de l'interaction avec IFNAR2 est de l'ordre du nM, bien plus bas que celui d'IFNAR1 qui est de l'ordre du µM [82]. Comme IFNAR1 and IFNAR2 ne sont pas pré-assemblés à la surface de la cellule [100], la formation du complexe ternaire se réalise en 2 étapes [101].
L’IFN"2 se lie d'abord à IFNAR2 pour former un complexe binaire qui recrute IFNAR1 dans une réaction bidimensionnelle où l'IFN"2 se lie aux domaines SD2 et SD3 d'IFNAR1. Ceci induit un changement conformationnel qui implique le domaine SD1 au site de liaison et stabilise ainsi le complexe ternaire. Ce changement de conformation qui se propage au domaine SD4, non impliqué dans la liaison au ligand, jouerait un rôle important dans la transmission du signal au niveau d’IFNAR1 du site de liaison au ligand (SD1-SD3) au domaine SD4 impliqué dans la transduction du signal [91]. Il n’y a pas de différence observée dans le changement conformationnel d’IFNAR1 induit par la liaison d’IFN"2 ou celle d’IFN#, ce qui suggère que sa propagation au domaine SD4 est conservée dans les IFN-I [82].
2. Importance de la stabilité du complexe
La stabilité du complexe ternaire détermine l’activité spécifique (exprimée en unité internationale (U.I) par unité de masse) d’un sous-type d’IFN-I pour une activité donnée [102]. La stabilité du complexe ternaire dépend du niveau d’expression du récepteur et de l’affinité à IFNAR1 et IFNAR2. Ainsi une affinité augmentée peut compenser une expression faible du récepteur [103]. Si le nombre de récepteurs à la surface de la cellule varie d'un type cellulaire à l'autre; il dépend aussi de l’endocytose, la dégradation et le recyclage d'IFNAR1.
VII.
Signalisation des IFN-I
Les données sur la signalisation des IFN-I ont été pour beaucoup générées par des études in
vitro portant sur l’IFN"2 mais à part quelques rares exceptions qui seront précisées plus loin,
A. Voies de signalisation JAK/STAT
Seul le complexe ternaire IFN-I/IFNAR 1 et 2 est capable d'induire la transduction du signal en activant différentes voies de signalisation. La voie canonique de signalisation des IFN-I est la voie JAK/STAT illustrée dans la figure 3. La formation du complexe ternaire induit la trans-phosphorylation des kinases de type JAK associées à IFNAR2 (Jak1) et IFNAR1 (Tyk2). Ces kinases phosphorylent à leur tour des résidus tyrosine (Y) spécifiques au niveau d'IFNAR1 et IFNAR2, qui sont des sites d'ancrage à des facteurs transcriptionnels, les STAT (signal transducers and activators of transcription). Ces STAT, recrutés au niveau du complexe ternaire, sont phosphorylés (pSTAT) au niveau de résidus Y spécifiques. Ceci aboutit à la dimérisation des pSTAT et à leur translocation vers le noyau où ils se fixent sur des séquences situées au niveau des promoteurs des gènes induits par l'IFN, les IFN-stimulated genes (ISG) [104], afin de réguler leur transcription. Le dimère de pSTAT activé varie selon le résidu Y phosphorylé au niveau IFNAR1 et IFNAR2, mais aussi le contenu en protéines STAT de la cellule. Selon le dimère de pSTAT activé, les IFN-I induisent différents ISG. Pour une activité transcriptionnelle optimale, les STAT sont aussi phosphorylés au niveau de sérines (Serine 727 pour STAT1) et ils s'associent au niveau des promoteurs des ISG à des co-activateurs. Ces co-activateurs incluent notamment des histone- acétyl-transférases qui favorisent la transcription en régulant le remodelage de la chromatine [105].
1. Voie canonique
Dans la voie de signalisation JAK/STAT principale activée par les IFN-I, la phosphorylation d'IFNAR1 au niveau de la tyrosine en position 466 (Y466) [96] est plutôt impliquée dans l’internalisation d’IFNAR1, alors qu’IFNAR2 recrute les STAT [106], activés par phosphory-lation (pSTAT). pSTAT2 (en Y689) et pSTAT1 (enY701) hétérodimérisent pour former avec IRF9, le complexe ISGF3 (Interferon-stimulated gene factor 3) [16]. Ce complexe se tran-sloque vers le noyau et se lie à des ISRE (IFN-Stimulated Regulatory Elements) dans la région régulatrice des ISG. Cette voie est activée dans tous les types cellulaires, du fait de l'expres-sion ubiquitaire d'IFNAR, de JAK1, Tyk2, STAT1, STAT2 et IRF9 [107]. STAT1, STAT2 et IRF9 sont induits par les IFN-I, ce qui résulte en une boucle d'auto-amplification.
2. Voies alternatives
induits par les IFN-I et l'IFN!. Selon les gènes, les éléments ISRE et GAS sont exclusifs ou peuvent coexister au niveau des promoteurs des ISG.
D'autres STAT (tels que STAT3, STAT4, STAT5 et STAT6), peuvent aussi être activés par les IFN-I et former des homo-ou des hétéro-dimères [105].
Jak1 Tyk2 Type I IFN Jak1 Tyk2 STAT2 STAT1 p p IRF9 Type I IFN Tyk2 Jak1 p p STAT2 STAT1 p p ISRE ISGs Transcription Nucleus DNA IRF9 Cytoplasm A B C ISGF3 IFNAR2 IFNAR1 D Figure 3. Voie de signalisation canonique des IFN-I
A. Les sous-unités IFNAR1 and IFNAR2, associées respectivement à Tyk2 et Jak1, ne sont pas pré-assemblées à l’état basal.
B. La liaison des IFN-I à leur récepteur, guidée par l’affinité de liaison est initiée par la liaison à IFNAR2, suivie de la liaison du complexe binaire à IFNAR1
C. La liaison à IFNAR1induit son changement conformationnel qui stabilise le complexe ternaire.
D. Ce complexe ternaire induit une phopshorylation des kinases JAK (Tyk2 et Jak1), qui à leur tour phosphorylent des tyrosines spécifiques au niveau d’IFNAR1 et
IFNAR2, qui deviennent des sites d’ancrage pour STAT1 et STAT2 où elles vont être phosphorylées. Ces STAT phophorylées (pSTAT2 et pSTAT1) s’hétérodimerisent, pour former avec IRF9, le complexe ISGF3. Ce dernier transloque dans le noyau et se lie à des éléments de réponse à l’IFN (ISRE), situés dans la region régulatrice des gènes induits par l’IFN (ISG).
B. Voies de signalisation indépendantes de STAT
Les IFN-I activent aussi différentes voies MAPK (mitogen activated protein kinase), la PI3K et des isoformes de protéine kinase C (PKC) [105, 108]. Les kinases Jak1 et Tyk2 phospho-rylent les IRS (Insulin receptor substrate) 1 et 2 où va se lier la PI3K qui va ensuite activer AKT et ainsi mTOR ou NF$B. De récentes données ont remis en cause l’activation de
la voie mTOR par les IFN-I, dans les cellules HeLa [109].L'activation des JAK active aussi le facteur Vav au niveau d'une tyrosine, ce qui va activer Ras, Rac1 et différentes MAPK (p38, JNK et ERK). La PKC - peut être activée par Vav ou AKT.
En plus de réguler la transcription des ISG, les IFN-I régulent aussi la traduction de leur ARNm en activant les facteurs d'initiation de la traduction, les eIF (eukaryotic initiation factors).
C. Arrêt de la signalisation
L'intensité et la durée de la stimulation aux IFN-I doivent être finement régulées afin d'éviter les effets néfastes des IFN-I et permettre aux IFN-I d'exercer une activité protectrice.
Toutes ces voies de signalisation expliquent que des milliers de gènes peuvent être induits par les IFN-I, communément appelés ISG même si le terme le plus approprié serait « IFN regulated genes ». En effet, même si les gènes cibles des IFN-I sont pour la plupart uprégulés, d'autres sont downrégulés. Les différents gènes régulés par les IFN sont répertoriés dans une base de donnée, appelée interferome. Si ce large nombre d'ISG est nécessaire pour inhiber différentes phases du cycle de vie de différents virus [16, 119], il est aussi responsable de l'activité pléïotropique des IFN-I qui se fixent sur un seul récepteur [16]. La majorité des ISG codent pour des protéines, mais certains codent pour des micro-ARN (miARN) [120]. Les miARN sont des petites molécules d'ARN (environ 22 nucléotides, en général) non codantes, qui se fixent sur des ARNm complémentaires et empêchent l'expression du gène cible en induisant la dégradation ou l'inhibition de la traduction des ARNm cibles, selon le degré de complémentarité entre miARN et ARNm. Les miARN induits par les IFN-I peuvent cibler les gènes viraux essentiels à leur réplication ou avoir un effet antiviral direct en ciblant les ARNm viraux.
VIII.
Activité biologique des IFN-I
Les IFN-I sont produits et agissent sur toutes les cellules nucléées de l'organisme et exercent une large variété d'activité biologique. Les données sur l’activité biologique in vivo des IFN-I et notamment sur leur fonctions physiologiques proviennent de l’étude de modèles murins de « knock-in » et « knock-out » (KO) de gènes intervenant dans l’induction ou la signalisation des IFN-I. Après une présentation du mécanisme général de l'activité biologique pléïotropique des IFN-I avec des effets parfois paradoxaux, protecteurs ou néfastes, nous évoquerons ici les effets bénéfiques des IFN-I. Nous débuterons par le rôle sur l'homéostasie de la production basale des IFN-I avant d'exposer les activités (antivirale, immunomodulatrice et antitumorale) des IFN-I.
A. Mécanisme général
Il existe 2 types d'ISG [103]:
- un groupe de gènes très sensibles à l'action des IFN-I. Ces gènes, dits « robustes » peuvent être induits par de faibles doses d'IFN-I dans des cellules ayant une faible expression de leur récepteur. Les gènes impliqués dans l'activité antivirale font partie de ce groupe de gènes. Ainsi, toutes les cellules nucléées de l'organisme peuvent avoir une activité antivirale même si le niveau d'expression d'IFN est faible, pour une clairance virale précoce.
- un groupe de gènes qui nécessitent un signal prolongé par un nombre élevé de complexes ternaires stables. Ces gènes, dits « tunables » sont ainsi induits par de fortes doses d'IFN-I de haute affinité qui agissent sur des cellules exprimant un nombre élevé de récepteurs. Parmi ces gènes, il y a ceux impliqués dans l'activité antiproliférative des IFN-I, souvent liée à l’apoptose et à des lésions tissulaires. Ceci explique leur induction plus régulée afin d'éviter des lésions non justifiées.
La spécificité des ISG régulés par les IFN-I et donc de l'activité des IFN-I varient selon le couple de pSTAT activés, qui dépend entre autres du contenu cellulaire en STAT.
L'activation de STAT1 a plutôt des effets antiprolifératifs, inflammatoires [121] et pro-apoptotiques [108] alors que celle STAT3 stimule la prolifération cellulaire, est anti-inflammatoire et anti-apoptotique. L'activation de STAT4 induit la prolifération et est requise pour la production d’IFN! alors que celle de STAT1 régule négativement l’induction d’IFN! dépendante des IFN-I.
Le contenu relatif des différents STAT varie selon le type cellulaire, leur état d'activation et/ou de différenciation [16]. Les cellules NK au cours de leur activation augmentent leur niveau de STAT1 au détriment de celui de STAT4. De même, la polarisation des LT CD4+ dépend des autres cytokines présentes. Les LT CD8+ naïfs ont surtout une réponse aux IFN-I par STAT1 [16] et au cours de l’engagement du TCR avec l’antigène, il y a une diminution de STAT1 au profit de STAT4 [107]. L'activation des STAT n'est pas spécifique de la signalisation des IFN mais peut être induite par d'autres cytokines. Ainsi, le microenvironnement cellulaire, notamment cytokinique, peut influencer la réponse cellulaire aux IFN-I.
B. Rôle homéostatique
et à la dégradation osseuse [44]. Les souris IFNAR1-/- ont une réduction du nombre de cellules souches hématopoïétiques (CSH). De plus, les souris IRF2-/- qui ont une augmentation de la sécrétion d'IFN#, ont un épuisement de la niche de CSH, qui peut être prévenu en absence d'IFNAR [122]. Ainsi, le taux basal d'IFN-I doit être sous le seuil de mobilisation des CSH et à un niveau suffisant pour maintenir la niche de CSH [44]. Les CSH IFNAR1-/- restent quiescentes après stimulation par l'IFN" [123] mais peuvent reconstituer le compartiment hématopoïétique de souris sauvages ayant reçu des doses létales d'irradiation [124]. Ceci suggère que les effets des IFN-I sur les CSH seraient médiés par leur action au niveau du stroma médullaire, dans la niche des CSH [44].
Le taux basal d’IFN# augmente l'activité de phagocytose des macrophages et inhibe la différenciation des macrophages en ostéoclastes, nécessaire au remodelage osseux. Les souris IFN#-/- et IFNAR1-/- ont ainsi plus d'ostéoclastes et une diminution de la densité osseuse. Le niveau de STAT1 et son ratio par rapport aux autres STAT seraient déterminés par le taux basal d'IFN# [44], qui permet un niveau adéquat de STAT1 et STAT2, tous 2 induits par l'IFN#. Ce niveau basal permet ainsi une activation de la réponse aux IFN-I très précoce après leur induction mais permet aussi de maintenir la signalisation à d'autres cytokines, telle que l'IL6 ou encore l'IFN! [125].
C. Activité antivirale
Si l'infection virale est le principal inducteur des IFN-I, ils sont aussi produits au cours d'infections à d'autres pathogènes. Les IFN-I induits au cours d'infections bactériennes, parasitaires ou fongiques peuvent avoir des effets protecteurs ou au contraire néfastes [126]. Nous ne parlerons ici que des effets antiviraux des IFN-I.
Si la production aigüe d’IFN-I à la phase précoce d’une infection virale permet de contrôler l’infection, l’activation chronique de la réponse IFN-I au cours des infections virales chroniques a plusieurs conséquences néfastes [127]. Nous allons dans cette partie traiter des infections virales aigües et les effets néfastes des IFN-I au cours des infections virales chroniques seront discutés plus loin, dans la partie sur les effets délétères des IFN-I.
1. Effecteurs antiviraux
[46]. L'activité antivirale directe des IFN-I s'exerce par différents mécanismes [6], notamment par l'action combinée de différents effecteurs antiviraux codés par des ISG, nécessaires au large spectre de l'activité antivirale de l'IFN. En effet, la réplication d'un virus donné est inhi-bée spécifiquement par un ensemble spécifique d'effecteurs antiviraux [119] qui interfèrent avec les différentes phases du cycle de vie viral [6, 16], comme illustré dans la figure 4. Tout ceci permet la prévention de la propagation de l'infection virale en inhibant l'entrée du virus dans les cellules non encore infectées et la libération de virions par les cellules infectées. Les effecteurs antiviraux ont souvent un spectre d’action large, même si certains sont plus spéci-fiques à certaines classes de virus [16].
a.
Rôle dans le cycle viral
b.
Mx, OAS/RNAseL, PKR et ISG15
Les effecteurs antiviraux ont été découverts par la susceptibilité virale induite par leur déficit chez les souris KO, et plus récemment par des approches basées sur l'utilisation combinée de petits ARN interférents spécifiques des ISG et d'autres spécifiques de plusieurs ISG. Ainsi les premiers effecteurs antiviraux décrits (Mx1, OAS/RNase L et PKR) sont aussi les plus puissants [128]. Ceci peut s'expliquer par l'action très précoce des protéines Mx1 et les boucles d'auto-amplification de la réponse AV induites par OAS et PKR. PKR stabilise l'ARNm des IFN-I et les ARN dégradés par la RNAse L peuvent à leur tour activer les senseurs RIG-I et MDA5 [16]. Chez l'Homme, un polymorphisme des gènes MxA, OAS1 et
PKR est associé à une susceptibilité augmentée à certains virus et notamment à celui de
l'hépatite C (VHC). La 2',5' oligoadenylate synthetase (OAS), la RNase L, protéine kinase R (PKR) sont constitutivement exprimées à faible taux sous forme de monomères inactifs, activés notamment par l'ARN viral [128]. En effet, l'ARN double brin viral induit la formation d'un tétramère d'OAS fonctionnel qui catalyse la formation d'oligomères d'adénosine triphosphates à partir d'ATP, les 2'-5'-oligoadénylates. Ces oligomères activent la RNAse L en induisant leur dimérisation, ce qui aboutit à la dégradation d'ARN. Le système OAS/RNAse L de dégradation d'ARN confère une protection bien établie contre les virus à ARN, même si un rôle dans les virus à ADN n'est pas exclu car ces virus ont des intermédiaires réplicatifs d'ARN double brin [128]. De plus, la liaison d'ARN viral induit un changement conformationnel qui permet in fine la formation d'un homodimère de PKR fonctionnel qui phosphoryle la sous-unité " du facteur d'initiation de la traduction (eIF2").
Figure 4. Rôle des effecteurs antiviraux dans le cycle viral.
Les différents effecteurs antiviraus sont impliquées à différentes phases du cycle viral : entrée du virus, décapsidation, réplication, transcription, traduction, assemblage et sortie des virus. Tiré de [6].
2. Mécanismes d'échappement viral
Plusieurs virus ont développé des mécanismes pour échapper à l'action de l'IFN [130-132]. Certains virus ont des mécanismes généraux d'inhibition de l'action de l'IFN, telles que la sécrétion de protéines neutralisant l'IFN ou l'interférence avec la machinerie de transcription de la cellule. La plupart des virus a élaboré des stratégies qui inhibent spécifiquement certaines protéines impliquées dans l'induction (senseurs et IRF) ou l'activité des IFN-I (signalisation et effecteurs antiviraux).
viraux. Certaines protéines virales dégradent IRF3 et d'autres inhibent l'activation d'IRF3. Certains virus expriment des homologues viraux d'IRF, les vIRF, qui ont un effet dominant négatif.
Les virus peuvent empêcher ou inhiber l'activation des effecteurs antiviraux. Des protéines virales se liant à l'ARN viral ou des petits ARN viraux qui se lient à PKR empêchent la liaison de l'ARN viral à PKR et OAS/RNAse L, nécessaire à leur activation. L'activation de PKR peut être inhibée par des protéines virales qui le dégradent ou l'inactivent. Des dérivés de 2'-5'-oligoadénylates préviennent l'activation de RNase L, qui peut être inhibée par certaines protéines ou des structures d'ARN virales.
Les protéines Mx ne sont pas constitutivement exprimées et inhibent la réplication virale très précocement après l'entrée du virus dans la cellule. D'autres mécanismes ont été mis en place par les virus pour contrer l'activité des protéines Mx, telles que la dissimulation de composants viraux cruciaux pour la réplication virale ou l'inhibition de l'expression du gène MxA [128, 130]. Certaines souches virales virulentes ont une vitesse de réplication accrue qui permet de distancer la mise en place de la réponse antivirale par les protéines Mx.
