THEME 3A - Variation génétique et santé TP1 – La mucoviscidose, une maladie génétique
Lara, 10 ans, est une jeune fille atteinte de mucoviscidose. Elle doit régulièrement faire des séances de kinésithérapie respiratoire. En effet, du mucus épais s’accumule dans les bronches, ce qui rend la respiration très difficile et peut aboutir à la mort du patient. Ses parents, Paul et Sophie, viennent d’avoir un troisième enfant et Lara, soucieuse, se demande si son frère risque d’être atteint de cette maladie comme elle.
Problématique : Comment une mutation de l’ADN peut-elle produire une telle maladie ?
Matériel :
- Manuel BELIN p242 à 245 + Exercice 5 p253 (pour les documents) - PC équipé du logiciel Anagène/GenieGen2 et du logiciel RASTOP/LibMol
- Fichiers : CFTR.edi, CFTR-complet.pdb, CFTR-muté.pdb, fragment_sain.pdb et fragment_mute.pdb - Matériel d’électrophorèse d’ADN (Cuve flashgel, Gel et échantillons d’ADN de la famille à déposer) - Documents 1 à 6
Aide :
- Fiche Technique (FT) : RASTOP / LibMol - Fiche Technique (FT) : Anagène / GenieGen2 - Fiche Protocole (Electrophorèse d’ADN)
Activités et déroulement des activités Capacités & Critères de réussite ETAPE 1 : Proposez une stratégie expérimentale
A partir du document 1 et de vos connaissances, proposez une stratégie permettant de comprendre comment une mutation de l’ADN peut aboutir à la mucoviscidose et de déterminer si le frère de Laura est atteint de cette maladie.
Appelez le professeur pour vérification ETAPE 2 : Mettez en œuvre le(s) protocole(s) proposé(s)
Réalisez l’électrophorèse d’ADN pour identifier si le frère de Laura risque d’être atteint.
Utiliser le logiciel ANAGENE pour comparer les séquences nucléiques et peptidiques de CFTR
Utilisez le logiciel RASTOP pour identifier les conséquences de la mutation du gène CFTR
Appelez le professeur pour vérification
ETAPE 3 : Récapitulez vos résultats sous la forme la plus appropriée
Votre production devra récapituler les caractéristiques de la mutation (nature et localisation) sur l’ADN et sur la protéine et le fonctionnement de la protéine CFTR (s’aider des documents 2 et 3).
Vous devrez également identifier si l’enfant à naître est atteint de mucoviscidose ETAPE 4 : Répondez au problème initial et identifier
- Rédigez un texte qui répond au problème.
En fin de séance, rangez le matériel et fermez la session informatique.
Recenser, extraire des informations Qu’est-ce que je fais, Comment je le fais, A quoi je
m’attends ?
Réaliser une manipulation (Electrophorèse d’ADN) Réaliser un dépôt propre, dans le bon puits, savoir se servir
d’une pipette de précision.
Utiliser un logiciel de traitement de données (ANAGENE) Comparer les séquences d’ADN et les séquences de
protéines. Savoir utiliser le compteur (ADN/Protéine)
Utiliser un logiciel de traitement de données (RASTOP) Colorer les acides aminés en cliquant sur atome > colorer >
par groupe, faire apparaître les noms des acides aminés en cliquant sur atome > étiquette > résidus.
Rédiger un texte scientifique On a vu que, Or on sait que, Donc Gérer et organiser le poste de travail
VISUALISATION DE MOLECULES AVEC RASTOP
Barre de menu Quelques détails des menus
Afficher la molécule sélectionnée «Fichier / ouvrir» ou «Fichier charger un fichier de molécules» :
Imprimer la molécule affichée ou celle qui est sélectionnée : «Fichier / Imprimer»
Sélectionner ou modifier l'affichage : «Éditer/
sélectionner/Expression» : même fonction que l’éditeur de commande
Fixer le diamètre des sphères :
«Atomes/Représentation/rayon fixe»
Afficher la molécule en ruban, sous la forme du squelette carboné notamment : «Rubans»
Afficher plusieurs molécules si plusieurs fichiers ont été ouverts: «Fenêtres/Mosaïque»
Sélection et choix de la représentation de la partie sélectionnée dans la fenêtre active Informations sur les molécules
avec l’éditeur de commandes avec les pictogrammes de choix
Le nom des chaînes est donné au bas de l’écran en passant le curseur de souris sur la chaîne (fréquemment H pour chaîne lourde, L pour légère), P ou Y pour les antigènes.
Seule la partie terminale des anticorps est modélisée quand il ne s’agit pas de la molécule entière.
Ce qui est affiché correspond à la séquence de l'ensemble de la molécule.
Sélectionner :
* l’ensemble des chaînes affichées dans la fenêtre (permet aussi d’annuler toute sélection plus serrée)
*L la chaîne L
114 l’acide aminé n° 114 de toutes les chaînes 20-75 les acides aminés du n°20 au n°75
*L ,*H les chaînes L et H
*L and 20-75 les acides aminés de 20 à 75 de la chaîne L
Sélectionner 1 atome en cliquant dessus
Sélectionner 1 chaîne
Afficher ce qui est sélectionné, cliquer pour revenir à l’affichage standard
avec la palette de couleurs: avec les pictogrammes «affichage»
Choisir une couleur qui affectera la sélection ou une couleur de fond (choisir fond blanc pour l’impression)
Sphères : afficher la sélection sous forme de sphères
Rubans : afficher la sélection sous la forme d’un ruban
ZOOM : shift tenu, bouton gauche de la souris enfoncé, avancer la souris : Zoom avant Observation d’une molécule en profondeur
L’icône « front» et les deux flèches juxtaposées à droite assurent un déplacement en avant et en arrière de la molécule par rapport à l’écran.
COMPARAISON - CONVERSION AVEC ANAGENE (Version 2)
Les icônes de la barre d’outils Numérotation des éléments d’une séquence
1. Banque de séquences 2. Thèmes d'étude 3. Programmes et
documents 4. Voir le classeur 5. Enregistrer 6. Imprimer 7. Couper
8. Copier 9. Coller 10. Effacer 11. Convertir les
séquences 12. Comparer les
séquences
13. Action enzymatique
14. Graphique de ressemblance
15. Information sur ligne pointée
16. Code génétique 17. Grand curseur 18. Fermer toutes les
fenêtres
Echelle de repérage des nucléotides
Echelle de repérage des acides aminés
Attention au décalage des numéros
Cliquer sur l’échelle pour passer de l’échelle des nucléotides à celle des acides aminés.
Utiliser le curseur
Surligner pour sélectionner la partie de la séquence choisie. Cliquer sur l’icône « grand curseur ».
Bulles d’aide
Une bulle d’aide s’affiche sur l’objet pointé par le curseur de la souris
Editer une séquence Sélectionner une séquence
Sélectionner cette séquence dans l’un des répertoires d’Anagène :
Banque de séquences
Thèmes d’étude
Programmes et documents ou par «Fichier / Ouvrir / sauve»
Cliquer sur le bouton de sélection. La séquence sélectionnée s’inscrit sur fond blanc. On peut sélectionner plusieurs séquences.
La flèche rouge indique la ligne pointée, sur laquelle il est possible d’obtenir des informations et que l’on peut déplacer à l’aide des flèches grises, haut - bas.
Convertir une séquence Comparer des séquences
Menu «traiter / convertir ces séquences». Pour traiter une séquence, elle doit être au préalable sélectionnée.
ATTENTION : pour comparer, la séquence de référence est toujours celle qui est placée en premier.
Menu «traiter / comparer les séquences» ou «convertir ces séquences».
Pour traiter une séquence, elle doit être au préalable sélectionnée.
La comparaison des séquences ne peut se faire que sur des séquences de même nature. Les flèches grises haut-bas permettent de placer la séquence de référence.
Deux comparaisons possibles :
La comparaison par alignement permet de comparer avec discontinuité, en éliminant les décalages résultant de délétion(s) ou d’insertion(s), les valeurs affichées sont des ressemblances (identités),
La comparaison simple permet de comparer point par point des séquences sans aucun alignement, les valeurs affichées sont des différences.
Informations sur la ou les séquence(s) sélectionnée(s)
Menu «informations / sur la ligne pointée» pour obtenir des informations sur la sélection : soit d’une ligne, soit de toutes les lignes en cliquant d’abord devant « traitement ».Attention : les pourcentages obtenus portent soit sur des différences soit sur des ressemblances.
Créer des séquences
Menu «Fichier / créer». Choisir le type de séquence et le nommer.
Taper ou choisir dans la fenêtre d'«édition de séquences», votre séquence.
PROTOCOLE ELECTROPHORESE D’ADN
MATERIEL
- Cuve à électrophorèse (flashgel)
- Générateur (alimentation)
- Cassette (gel de type flashgel)
- Micropipette de précision réglable - Cônes/embout de
prélèvement (jaune) - Echantillon de
marqueur de
taille contenant des fragments d’ADN de taille connue afin de déterminer la taille des fragments testés.
- Echantillons d’ADN (Père, Mère, Lara, Nouveau-Né, ADN sain)
Chaque ADN a été traité avec 2 enzymes de restriction (Pst1 et Xho1) afin d’identifier des sites de restriction typiques de la maladie (mutation).
PRINCIPE
Le diagnostic d’une maladie génétique est réalisé via le principe des empreintes génétiques.
On connaît des enzymes de restriction qui sont capables de couper l’ADN au niveau de séquences spécifiques. Ainsi, lorsqu’on utilise une enzyme de restriction sur l’ADN d’une personne, on va obtenir un nombre et une taille de fragments d’ADN spécifiques de l’individu. Les fragments d’ADN sont ensuite déposés sur un gel d’électrophorèse et séparés au cours de la migration : c’est ce qu’on appelle son profil ADN (ou profil
génétique). Exemple de gel obtenu pour 2 ADN testés chacun avec une
enzyme de restriction.
PROTOCOLE
1 – Prélèvement de l’échantillon
- ATTENTION : Changer d’embout/cône à chaque prélèvement - Placer un embout sur la micropipette réglable
- Prélever 5µL de la solution à tester qui vous a été attribuée. Pour cela, - Appuyer sur le piston de la pipette jusqu’au « cran » (pas à fond) - Plonger l’embout dans la solution à pipeter
- Remonter doucement le piston jusqu’à la position maximale - Il faut éviter de faire des bulles sinon, le volume sera incorrect 2– Dépôt de l’échantillon sur le gel
- Placer la pointe de l’embout dans le puits du gel correspondant au plan de dépôt - Vider le contenu de l’embout dans le puits. Pour cela,
- Appuyer sur le piston en allant jusqu’au bout (dépasser le cran) - Ne pas chasser trop violemment (risque de reflux hors du puits) - Enlever l’embout et le jeter dans le bac prévu à cet effet
3– Migration des échantillons
- Insérer la cassette dans la cuve à électrophorèse - Brancher l’appareil et mettre en route la migration - Laisser migrer pendant 10 minutes
- Révéler les résultats en éclairant le gel
ADN1 + Pst1
ADN1 + Xho1
ADN2 + Pst1
ADN2 + Xho1
Plan de dépôt
-
Puits 1 : Marqueur de taille
-Puits 2 : ADN sain + Pst1
-Puits 3 : ADN sain + Xho1
-Puits 4 : ADN Lara + Pst1
-Puits 5 : ADN Lara + Xho1
-Puits 6 : ADN Père + Pst1
-Puits 7 : ADN Père + Xho1
-Puits 8 : ADN Mère + Pst1
-Puits 9 : ADN Mère + Xho1
-Puits 10 : ADN Enfant + Pst1
-Puits 11 : ADN Enfant + Xho1
Document 1 : Qu’est-ce que la mucoviscidose ?
● La mucoviscidose est une maladie génétique et héréditaire qui touche environ 6000 personnes en France.
Elle affecte les cellules qui tapissent différents organes tels que les voies respiratoires, le tube digestif, les glandes sudoripares en altérant leurs sécrétions (mucus, sueur, …).
Extrait de https://www.orpha.net/data/patho/Pub/fr/Mucoviscidose-FRfrPub49.pdf
Photographie de tissu pulmonaire chez un individu atteint de mucoviscidose (en haut) et sain (en bas).
Graphique montrant l’expression de CFTR dans les principaux organes chez la femme et l’homme.
Document 2 : La cause génétique de la maladie
● Depuis 1989, on sait que cette maladie est due à une mutation sur le gène CFTR présent sur le chromosome 7, un chromosome non sexuel (autosome). La maladie est donc de type autosomale.
● De plus, il faut porter 2 allèles mutés pour être atteint de la maladie : il s’agit d’une maladie récessive.
● Ainsi, un couple dont les 2 parents portent la mutation aura 25% de risque d’avoir un enfant malade.
Document 3 : Structure générale de la protéine CFTR
● Le gène CFTR est grand (250 000 nucléotides) et forme une protéine CFTR de 1480 acides aminés qui a une forme globale en pointe de flèche, plantée dans la membrane. La protéine CFTR est un canal qui permet le passage des ions chlorure (Cl-) vers l’extérieur de la cellule. La mutation ΔF508 (entourée en rouge) affecte la partie interne du canal, ce qui change la forme du canal.
● Visualiser la protéine CFTR (Libmol) - https://libmol.org/?libmol=358
https://libmol.org/?libmol=358
Acide aminé modifié
Risque génétique = ½ x ½ = ¼ (25%)
Document 4 : Structure générale de la protéine CFTR
● La protéine CFTR peut être localisée dans la cellule en réalisant une fusion avec la protéine fluorescence verte : GFP (Green Fluorescent Protein).
La protéine normale se localise dans la membrane plasmique des cellules où elle peut réaliser son rôle de canal.
● A l’inverse, la protéine modifiée par la mutation (ΔF508) est localisée dans des organites à l’intérieur de la cellule. Sa fonction n’est alors plus réalisée, même si le canal pouvait faire passer du chlore.
Document 5 : Le dépistage de la mucoviscidose
En France, depuis 2002, un dépistage systématique est fait sur le nourrisson (3 à 4 jours), de 2 manières : ● Prélèvement sanguin et recherche de marqueurs génétiques de la maladie (séquence ADN spécifique) ● Test de sueur qui montre le taux de chlorure dans la sueur. Le test est réalisé plusieurs fois indépendamment car le taux fluctue en fonction du niveau d’hydratation de bébé (très variable).
Taux de chlorures Résultat du test
Inférieur à 40 mmol/L Négatif
Compris entre 40 et 60 mmol/L Douteux
Supérieur à 60 mmol/L positif
Test n° Concentration en cholorure
Test 1 53 mmol/L
Test 2 60 mmol/L
Test 3 76 mmol/L
Document 6 : Arbre généalogique de la famille
● La mucoviscidose touche un enfant sur 4500 naissances en France, c’est-à-dire que près de 200 enfants qui naissent chaque année sont atteints de mucoviscidose.
● Les parents ne sont pas forcément touchés car ils peuvent être porteurs sains : ils possèdent un allèle malade et un allèle sain : ils sont hétérozygotes.
● Le tableau ci-contre montre que les hétérozygotes (A//a) ont une fréquence de 2pq.
Fréquence de la mucoviscidose (a//a) : q2 = 1/4500 donc q ≈ 1/67
Or, p + q = 1
Donc p = 1 - q soit 1 - 1/67 c’est-à-dire p ≈ 66/67 Fréquence des hétérozygotes (A//a) :
2 pq soit 2 x 66/67 x 1/67 = 132/4489 soit 2pq ≈ 1/34 Un Français sur 34 est donc hétérozygote (A//a)
