Les médicaments plasmatiques et recombinants utilises dans le traitement de l'hémophile

INTRODUCTION

Le plasma humain contient de nombreuses protéines de la coagulation qui peuvent être extraites après plusieurs étapes de purification et être utilisées comme moyen thérapeutique. On parle de produits sanguins stables ou de médicaments dérivés du sang (MDS).

Les MDS sont à l’origine de contamination massive par le virus de l’hépatite C (VHC) et par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH). Une sélection rigoureuse des donneurs de sang a permis de diminuer très significativement l’incidence des lots de plasmas contaminés.

La transfusion de sang total ou de plasma a été le premier traitement de l’hémophilie jusqu'au milieu du XXe siècle. Le rendement de ces traitements était faible. En effet, les concentrations en FVIII et FIX étant infimes, il fallait transfuser des volumes importants de sang ou de plasma pour obtenir un effet hémostatique. De plus ces techniques nécessitaient une hospitalisation de 7 à 10 jours et les risques de contaminations virales étaient importants. Le complexe PPSB (prothrombine, proconvertine, facteur Stuart, facteur antihémophilique B) fut ensuite utilisé pour le traitement de l’hémophilie B, mais les injections répétées et les doses élevées de PPSB pouvaient être responsables d’une coagulation intravasculaire disséminée.

En 1964, Pool développa la cryoprécipitation comme technique de fractionnement du plasma [1]. La congélation du plasma puis sa décongélation lente permettait d’obtenir un cryoprécipité riche en FVIII. Cette technique a

le cryoprécipité ne pouvait pas être assimilé à un véritable produit substitutif puisqu'il contenait d’autres protéines plasmatiques. Il présentait par ailleurs un risque élevé de transmission virale. Le développement de nouvelles techniques de purification plasmatique (chromatographie, élimination/ inactivation virale) ont permis la production de MDS plus concentrés, plus purs et de moins en moins contaminants. La pureté et les concentrations ainsi obtenues ont permis de diminuer le nombre et le volume des injections nécessaires, d'améliorer la tolérance au traitement et d'augmenter la qualité de l’hémostase.

En france, la loi 93-5 du 4 janvier 1993, relative à la sécurité en matière de transfusion sanguine et de médicament, distingue d’une part les produits sanguins labiles (éléments cellulaires) et d’autre part les produits sanguins stables, appelés MDS [2]. Cette loi donne le statut de médicament à des produits sanguins d’origine humaine. Ils sont soumis à la législation encadrant les médicaments avec une pharmacovigilance renforcée. Le décret 95-566 du 6 mai 1995, relatif à la pharmacovigilance exercée sur les MDS humains impose la mise en place d’un système de traçabilité, parallèle à celui des produits sanguins labiles [3]. Ce système de traçabilité est un élément clé de la sécurité sanitaire car il permet le suivi des lots depuis le donneur jusqu’au receveur.

L’essor du génie génétique puis le clonage des gènes humains codant pour les FVIII et FIX ont permis la production de MDS d’origine recombinante. Ils ne

Objectif de ce travail :

- Rapporter les procédés de fabrication des médicaments antihémophiliques plasmatiques et recombinants.

- Rapporter les principaux produits plasmatiques et recombinants antihémophiliques.

PREMIERE PARTIE :

CONCEPT DE LA COAGULATION DANS

L’HEMOPHILIE

Chapitre 1 : Hémophilie

L'hémophilie est une maladie hémorragique constitutionnelle à transmission récessive liée à l’X, résultant d'un déficit en FVIII (hémophilie A) ou en FIX (hémophilie B). L’incidence de l’hémophilie A est estimée à 1 cas sur 5000 naissances masculines. L'hémophilie B est environ cinq fois moins fréquente que l'hémophilie A [4].

1. Historique [5]

Il y déjà près de 2000 ans, le Talmud babylonien stipulait que si deux frères étaient décédés de complications hémorragiques après circoncision, le troisième enfant devait en être dispensé. Cette observation généralement considérée comme se rapportant à l'hémophilie permet d'apprécier tout à la fois la gravité et l'ancienneté de la maladie. La première description circonstanciée date de 1793 mais c'est John Otto qui publie réellement en 1803 à Philadelphie la première revue détaillée de la maladie : An account of a haemorrhagic disposition existing in certain families. Le terme même d'hémophilie est introduit en 1823 par Schonlein et son mode de transmission liée au sexe est établi en 1813 par Hay. L'hémophilie devint aussi connue sous le nom de la « maladie des rois » car

affectant à la fin du XIXe siècle les familles royales des cours d'Angleterre, de

Prusse, de Russie et d'Espagne. En 1911 Bulloch et Fildes publient une revue monumentale sur le sujet, comportant plus de 1000 références et plus de 200 arbres généalogiques.

après il est montré que l'allongement du temps de coagulation est corrigé in vitro par l'apport de sang ou de plasma normal. Le facteur plasmatique responsable de cette correction est appelé par Patek et Taylor en 1937 antihaemophilic globulin (AHG) ou « facteur antihémophilique ». Par la suite, un défaut de transformation de la prothrombine en thrombine, corrigé par l'apport de « thromboplastine » normale est mis en évidence par Brinkhous et Quick en 1947. Ceci permet de mettre au point les tests de consommation de la prothrombine et de génération de la thromboplastine de Biggs et Douglas, qui seront largement utilisés en pratique clinique. L'hémophilie était donc définie dans les années 1950 comme une maladie hémorragique liée au sexe caractérisée par un défaut de conversion de la prothrombine et un déficit en facteur antihémophilique. Ce dernier se voyait attribué le numéro VIII selon les règles de la nomenclature internationale de l'époque. Cependant Pavlosky faisait en 1947 la constatation, a priori surprenante, que le sang de certains hémophiles corrigeait in vitro le temps de coagulation d'autres patients hémophiles. Un autre facteur antihémophilique était donc identifié. Ce facteur d'abord appelé plasma thromboplastin component (PTC) ou Christmas factor était finalement identifié sous le nom de FIX. Les deux formes d'hémophilies étaient ainsi reconnues, l'une liée au déficit en FVIII (hémophilie A) et l'autre au déficit en FIX (hémophilie B).

L'histoire de l'hémophilie est liée très étroitement à celle de la transfusion. Les

France, en Angleterre, en Suède. Le PPSB, si longtemps utilisé dans le traitement de l'hémophilie B, est préparé en 1959 à Paris par Soulier. Mais c'est en 1964 qu'un bond considérable est fait dans le traitement de l'hémophilie A avec la mise au point par Judith Pool du cryoprécipité, obtenu par congélation-décongélation lente du plasma et contenant une concentration importante de FVIII. Les cryoprécipités utilisés sous forme congelée ou lyophilisée marquent réellement le début du traitement ambulatoire. L'activité spécifique des cryoprécipités était cependant faible (0,1 à 0,3 U/mg) car ils contenaient aussi d'autres protéines cryoprécipitantes, dont le fibrinogène, la fibronectine, le facteur Willebrand, ainsi que des immunoglobulines. Par ailleurs la remise en solution était souvent longue et difficile et les injections plus ou moins bien tolérées. Des procédés d'adsorption sur gel d'alumine, précipitation du fibrinogène et de la fibronectine permettaient de préparer des concentrés dits de « pureté intermédiaire » (activité spécifique [AS] allant de 0,4 à 1) puis de « haute pureté « (AS allant de 1 à 4). Ces concentrés seront largement utilisés en France jusque dans les années 1980. L'introduction de la chromatographie sous toutes ses formes a ensuite permis d'accroître rapidement la pureté de ces concentrés et d'atteindre des AS de l'ordre de 150 à 200 U/mg, améliorant à la fois la tolérance et la commodité d'utilisation (dissolution rapide, volumes injectés faibles). Le clonage des gènes FVIII et FIX, respectivement en 1984 et 1982, permettait enfin la préparation de concentrés de FVIII et FIX par les techniques de génie génétique.

2. Epidémiologie

L’hémophilie, la plus repandue des affections hémorragiques constitutionnelles, après la maladie de Willebrand, représente une lourde charge sociale et économique.

En 2002, la Fédération Mondiale de L’Hémophilie (FMH) a réuni des données épidémologiques provenant de 77 organisations nationales. Ces données font état de 110233 hémophiles [6]. Leur répartition géographique se fait comme suit :

Tableau 1 : Répartition géographique de la population hémophile [6]

Afrique 2170 Amérique 33082 Méditerranée orientale 17368 Europe 41790 Sud-est Asiatique 7821 Pacifique occidental 8002

l’hémophilie A et 85000 d’hémophilies B [7] soit 78,75 % d’hémophilie A et 21,25% d’hémophilie B.

Au Maroc, une estimation avançait le chiffre de 1500 cas en 1990 [8].

3. Signes cliniques

L'hémarthrose constitue la manifestation hémorragique la plus typique et la plus fréquente. Par ordre de fréquence décroissante seront touchés les genoux, les coudes, les chevilles, les épaules et les hanches [4].

Plus grande sera la fréquence des hémarthroses ultérieures en l’absence de

traitement prophylactique [9] aboutissant tôt ou tard à la constitution de

l’arthropathie chronique [10]. Un traitement précoce permet au contraire une récupération rapide et complète en 1 à 48 heures.

Les autres manifestations hémorragiques se traduisent par des hématomes sous-cutanés ou musculaires.

Fig. 1 : Hémarthrose du genou droit en l’absence de traitement [11].

4. Génétique de l’hémophilie [4]

L'hémophilie est une maladie récessive liée à l’X. Les garçons sont atteints et les filles sont généralement indemnes de troubles cliniques. L'anomalie chromosomique est portée par le gonosome X. Un hémophile donne naissance à des garçons indemnes et à des filles qui sont conductrices obligatoires.

Dans 50 % des cas, une conductrice d'hémophilie peut donner naissance à un garçon ou à une fille normale dont la descendance sera indemne d'hémophilie. Dans 25 % des cas, une conductrice donnera naissance à un garçon hémophile et dans 25 % des cas à une autre conductrice. Dans 30 % des cas, on ne retrouve aucun contexte familial. Il peut s'agir d'une mutation ou encore d'une transmission de la maladie par des conductrices asymptomatiques sur plusieurs générations.

5. Diagnostic biologique de l’hémophilie

Le diagnostic biologique de l'hémophilie est simple. Les tests d'exploration de l'hémostase primaire sont normaux. Le temps de Quick est normal tandis que le temps de céphaline activateur est allongé. Le dosage spécifique des facteurs antihémophiliques précise le type de l'hémophilie et sa gravité.

Un taux de FVIII ou FIX indétectable ou inférieur à 1 % définit une hémophilie sévère où les accidents hémorragiques seront spontanés et nombreux. Un taux

est compris entre 15 % et 30 % le risque est de méconnaître l'hémophilie qui se manifestera par exemple par un accident hémorragique post-opératoire ou au décours d'une exploration invasive [4].

Chapitre 2 : Place de la coagulation dans l’hémostase

I : PHYSIOLOGIE DE LA COAGULATION

1) Définition de la coagulation

La coagulation correspond à la conversion du fibrinogène soluble en fibrine insoluble qui constitue l'armature du caillot. Cette conversion est la conséquence d'une cascade de réactions enzymatiques à laquelle participent plusieurs protéines plasmatiques appelées facteurs et inhibiteurs de la coagulation. (fig.2)

2) Activation plaquettaire [11]

Un phénomène essentiel à la coagulation se déroulant au cours de la phase d'activation plaquettaire est le phénomène de « flip-flop » membranaire, permettant aux structures phospholipidiques internes de la membrane de se repositionner vers l'extérieur en contact avec le plasma. Cette modification permet aux phospholipides chargés négativement, et notamment la phosphatidylsérine, de s'extérioriser et de devenir disponibles pour la fixation des facteurs de la coagulation vitamine K-dépendants, amplifiant par là considérablement les processus enzymatiques de la cascade de la coagulation.

Figure 2 : Cascade de la coagulation [12]

II : LES PROTEINES DE LA COAGULATION :

Les protéines de la coagulation sont des protéines plasmatiques qui incluent les facteurs et les inhibiteurs physiologiques de la coagulation. Une protéine membranaire présente dans la tunique externe du vaisseau, le facteur tissulaire, est l’élément déclenchant le processus de coagulation quand une lésion vasculaire l’amène au contact du sang. Les principales caractéristiques de ces protéines sont résumées dans le tableau 2.

Tableau 2. – Principales caractéristiques des protéines de la coagulation [13] Masse Moléculaire (kD) Fonction Concentration Plasmatique (mg/l) Demi-vie Plasmatique (h) Facteurs de la coagulation I (fibrinogène) II (prothrombine)* V (proaccélérine VII*(proconvertine)

VIII (facteur antihémophiliques A) IX (facteur antihémophiliques B)* X*(facteur Stuart)

XI (plasma thromboplastin antecedent XII (Hageman)

XIII (facteur stabilisant de fibrine) Prékallikriéne

Kininogène de haut poids moléculaire Facteur tissulaire** 340 72 330 50 330 57 59 160 80 320 85 100 47 Substrat Zymogène Cofacteur Zymogène Cofacteur Zymogène Zymogène Zymogène Zymogène Zymogène Zymogène Cofacteur Cofacteur 2-4×10 2 100-150 5-10 0 ,35-0 ,6 0,1-0,2 3-5 7-17 3-6 30-40 25-30 25-50 60-90 . 120 80 24 6 12 24 48 60 60 240 35 150 . Inhibiteur de coagulation Antithrombine Protéine C* Protéine S* HCII

TFPI (inhibiteur du facteur tissulaire)

65 62 70 65 42 Serpine Zymogène Cofacteur Serpine Inhibiteur de type Kunitz 180-300 2,7-6 25 60-110 0,1 60 6 ND 60 ND

Tous les zymogènes sont des précurseurs de sérine protéases, sauf le facteur XIII (zymogène d’une transglutaminase). HCII : cofacteur II de l’héparine, ND : non déterminé, * : Synthèse vitamine K-dépendante, ** : le facteur tissulaire n’est pas une protéine plasmatique mais une protéine membranaire.

1. Facteurs de coagulation [13]

Les facteurs de coagulation sont des protéines plasmatiques qui sont pour la majorité d’entre elles, désignées dans la nomenclature internationale par des chiffres romains (Exemple : prothrombine ou FII). Une fois activés, les facteurs de coagulation portent leur nom suivi du suffixe «a» ; exemple : FXa désigne le facteur Stuart activé.

2. Inhibiteurs physiologiques de la coagulation [14]

Les inhibiteurs physiologiques de la coagulation sont des protéines plasmatiques qui appartiennent à différentes familles dont les principales sont les serpines (AT), les protéines C et S et les inhibiteurs du facteur tissulaire (TFPI)

III.

Déroulement de la coagulation

La coagulation, qui vise à consolider le caillot formé lors de l’hémostase

primaire, a pour élément clé une enzyme, la thrombine (FIIa). Cette enzyme

clive le fibrinogène en fibrine qui se polymérise en créant un réseau qui

constitue la trame du caillot fibrinocruorique.

Le processus de coagulation peut se décomposer en trois étapes : une étape

fortes concentrations de thrombine induisant la formation d’un caillot stable [16, 17].

a. Etape d’initiation de la coagulation [18]

Suite à une brèche vasculaire, la coagulation est initiée soit par :

>>> Par le facteur tissulaire :

_ Lors d'une lésion vasculaire, FT fixe FVII circulant avec autoactivation immédiate du FVIl.

_ Complexe FT-Vlla active ensuite FIX ou FX à la surface des membranes des plaquettes activées initiant la voie tissulaire de la coagulation (voie majeure). (Fig. 3).

>>> Par le système contact :

_ Exposition du collagène sous endothélial capable d’activer le système contact (prékallicréine, FXII, KHPM et FXI) aboutissant à l’activation du FXI.

_ FXIa active le FIX en présence des PLP initiant la voie intrinsèque de la coagulation (voie mineure).

Figure 3. Etape d’initiation de la coagulation [19].

A. Le facteur tissulaire (FT) est une protéine transmembranaire. La partie extracellulaire comporte deux sous-unités FT1 et FT2 qui interagissent avec le FVII de la coagulation. Le FVII est une proenzyme, comprenant un domaine Gla, deux sous-unités epidermal growth factor (EGF)-like (EGF1 et EGF2) puis un domaine catalytique.

B. L’interaction avec le FT induit une modification conformationnelle du FVII qui démasque son site catalytique. Il en résulte un complexe [FT-FVIIa] qui activera le FIX.

b. Etape d’amplification [18]

>>> Voie tissulaire :

Complexe FVIIa/FT/PLP/Ca²+ active par protéolyse FIX en FIXa ou FX en FXa :

>>> Voie endogène :

Prékallicréine est transformée en kallicréine par une protéase de la paroi vasculaire. La kallicréine active le FXII qui active le FXI.

FXIa active par protéolyse le FIX avec formation du FIXa qui forme le complexe tenase.

La thrombine formée amplifie sa propre formation par recrutement de nouvelles plaquettes, activation des cofacteurs VIII et V et activation du FXI.

Figure 4. Etape d’amplification de la coagulation [19].

A. Le complexe [FT-FVIIa] peut activer le FX et le FIX. Le FIXa active lui aussi le FX. Le FXa active la prothrombine (FII) en thrombine (FIIa). La thrombine génère les premières traces de fibrine, trame du caillot. Cette réaction se déroule à la surface des plaquettes.

B. La thrombine transforme le dimère FVIII en hétérotrimère FVIIIa. Le complexe [FVIIIa-FIXa] ou tenase intrinsèque induit une activation importante du FX. En outre la thrombine active le FV en FVa et le FXI en FXIa. À la fin de cette phase se concentrent à la surface des plaquettes plusieurs facteurs activés dont le FXa, le FIIa, le FIXa, le FVIIIa et le FVa.

>>> Au seuil critique, la thrombine convertit le fibrinogène en fibrine qui forme un réseau autour de l’agrégat de plaquettes. Le caillot est stabilisé par FXIIIa.

Fig. 5 : Etape de fibrinoformation [18]

_ L’activation du FXIII est réalisée par la thrombine.

_ FXIIIa est une transglutaminase qui stabilise le caillot en créant des liaisons covalentes entre les polymères de fibrine.

Chapitre 3. Facteurs antihémophiliques : Structure et

fonction

I.

FVIII

1. Gène FVIII

Le gène FVIII se localise au niveau de la bande distale du bras long du chromosome X, Xq28. Il se situe près du gène de G6PD (Glucose 6-Phosphate Déshydrogénase) à une distance d'environ 1 mégabase du télomère Xq. L'ordre des loci est : X centromère - G6PD - 3'FVIII - 5' FVIII - Xqter [20]. Ce gène s'étend sur 186 Kb et constitue environ 0,1 % du chromosome X [21]. La partie codante se répartie en 26 exons, la longueur des exons varie de 69 à 262 nucléotides sauf pour l'exon 14 et l'exon 26 qui font respectivement : 3106 et 1958 nucléotides (28,68). Les introns séparant les exons, sont au nombre de 25, leur longueur varie de 207 à 32400 pb [20]. Il y a 6 introns dépassant 14 Kb , l'intron 22 (IVS 22) a une taille de 32400 pb, il renferme des nucléotides CpG et il est associé, en plus, à deux transcrits [20]. Un premier transcrit de 1,8 Kb, nommé F8A, est exprimé abondamment dans une variété large de cellules, il est orienté dans le sens opposé du FVIII et son DNA génomique ne contenant pas d'introns. Le second transcrit est de 2,5 Kb, nommé F8B, il est orienté dans le même sens que le FVIII et il utilise, après un exon court particulier, les exons 23 et 26 du gène FVIII. Les 2 transcrits trouvent leur origine dans 122 nucléotides en commun. Les séquences de F8A et du DNA l'entourant (quelques Kb) sont aussi présentes dans 2 autres régions du télomère Xq, à environ 400 Kb du gène

FVIII. La fonction de F8A et F8B et leurs produits protéiques potentiels sont aujourd'hui inconnus.

Figure 6 : Structure du gène FVIII [22].

A : Chromosome X ;

B: Localisation du gène FVIII à 1Mb du Xqter, les 2 séquences homologues à F8A sont représentées ; C : Le gène FVIII avec les 26 exons intercalés des 25 introns ;

Figure 7. Facteur VIII : Structure et régions impliquées dans les principales interactions moléculaires [19]

2. Structure du FVIII [19]

Le FVIII est une protéine de 2332 acides aminés comportant trois domaines homologues A, un domaine B et deux domaines C organisés suivant la séquence A1-A2-B-A3-C1-C2. Entre ces domaines ont été identifiées des régions acides : a1 entre A1 et A2, a2 entre A2 et B, et a3 entre B et A3. Il existe une grande homologie parmi les espèces pour les acides aminés des trois domaines A et des deux domaines C. Les trois domaines A, essentiels pour l’activité cofacteur, présentent une homologie avec ceux du FV de la coagulation et de la céruloplasmine. Une grande partie du domaine B peut être délétée sans perte de l’activité. Avant sa sécrétion, le FVIII est clivé à la jonction B-A3 puis à l’intérieur du domaine B. Ceci génère une chaîne lourde comportant A1, A2, et B et une chaîne

légère composée des domaines A3, C1 et C2. L’association entre les chaînes lourdes et légères est médiée par un cation divalent.

Immédiatement après sa libération dans la circulation, il forme un complexe non covalent avec le vWF pour lequel il a une très forte affinité (kd< 0,5 nM). Deux régions de la chaîne légère du FVIII sont impliquées dans la liaison avec le vWF : la région a3, qui précède le domaine A3, et une ou plusieurs régions des domaines C1 et C2. Dans le complexe [vWF-FVIII], le FVIII est protégé de l’action catalytique de la protéine C activée, du FIXa et du FX activé (FXa), permettant de maintenir un taux de FVIII normal dans le plasma avant son activation. Le taux plasmatique est faible : 0,10 à 0,20 mg/l.

Figure 8. Facteur VIII (FVIII) et FVIII activé. Représentation schématique de la structure [19].

A. La molécule FVIII comporte une chaîne lourde de 93 kDa, constituée de trois sous-unités : A1, A2 et B, et une chaîne légère de 80 kDa constituée de trois sous-unités : A3, C1 et C2. Entre ces domaines ont été isolées des régions acides. Ces chaînes sont liées par un ion divalent.

B. Le FVIII activé est un hétérotrimère, comportant la sous-unité A1 associée à la région acide a1, la sous-unité A2 avec la région acide a2 et les sous-unités A3-C1-C2.

3. Activation et inactivation du FVIII :

La forme active du FVIII, ou FVIIIa, est formée sur le site où se déroule le processus de coagulation par l’action sur le FVIII de deux enzymes : la thrombine (FIIa) et le FXa. Ces deux sérines protéases clivent la molécule FVIII au niveau des résidus Arg372 et Arg740 dans la chaîne lourde et Arg1689 dans

la chaîne légère. Ceci forme le FVIIIa, hétérotrimère A1, A2, A3-C1-C2 dans lequel l’association entre A1 et A3-C1-C2 reste médiée par un ion divalent. L’inactivation du FVIII peut se faire par dégradation protéolytique : clivage du FVIIIa par la protéine C activée (PCa) ou par le FXa. En fait, cette voie n’est pas majoritaire : il se produit aussi une inactivation par dissociation spontanée du domaine A2-a2 du dimère. Le catabolisme du FVIIIa fait intervenir une protéine apparentée aux récepteurs des lipoprotéines de faible densité (LRP), facilité par des protéoglycanes d’héparine sulfatée. Le FVIII délété du domaine B subirait une inactivation par la PCa deux à trois fois plus rapide que celle du FVIII plasmatique ou recombinant [23].

II.

FIX :

1. Géne du FIX

En 1982, CHOO et al [21] entreprirent avec succès le clonage du gène FIX. Plus tard, la séquence complète correspondant à une taille de 38 Kb de ce locus a été déterminée [20]. Il est localisé dans la portion distale du bras long du chromosome X, Xq27.1 [20] et situé près du locus Fragile.

possible de lui ajouter des éléments de régulation présents dans les séquences 5' ou 3' flanquantes. La taille des introns varie de 188 pb pour l'intron II à 9473 pb pour l'intron VI [21]. La taille des exons est rapportée dans le tableau 6 [21].

Il a été récemment décidé que le site majeur de début de la transcription du gène FIX dans le foie humain est le nucléotide -176 [21]. Ce site se place en amont du site initial qui était le nucléotide +1 [21]. La numérotation adoptée est toujours

Exon Nucléotides en 5' de l'exon (pb)

Séquence codante (pb)

Nucléotides en 3'de l'exon (pb) I II III IV V VI VII VIII 33 35 115 11 142 58 26 69 117 164 25 114 129 203 115 545 32 22 47 34 30 96 12 509

2. Structure du FIX :

Le FIX est une sérine protéase plasmatique circulante composée de 415 acides aminés [24]. Son poids moléculaire est de 57 kDa. Il comporte certains domaines ou structures caractéristiques : vers la partie N-terminale se trouvent 12 résidus gammacarboxylés (domaine GLA) qui permettent la liaison du FIX aux phospholipides par l’intermédiaire d’ions calcium (Fig. 9). Cette propriété est commune à tous les facteurs vitamine K-dépendants : FII, FVII, FIX, FX, protéine C et protéine S. Les deux domaines suivants sont de type EGF. Le premier domaine, de type B, contient des résidus impliqués dans la liaison de haute affinité avec le calcium ; le second domaine, de type A, pourrait jouer un rôle dans la liaison du FIX avec les plaquettes et dans l’interaction du FIXa avec son cofacteur, le FVIII. Après les domaines EGF-like se situe un peptide d’activation de 35 acides aminés qui précède le domaine sérine protéase, avec la triade catalytique histidine-aspartate-sérine

3. Activation et inactivation du FIX

Le FIX circule sous forme monocaténaire à un taux plasmatique de 3 à 5 mg/l. L’excision du peptide d’activation génère le FIXa, qui comporte une chaîne légère de 145 acides aminés, liée par un pont disulfure (C132-C289)

FXa et FIIa. Il peut être accéléré par la présence d’héparines ou d’héparanes sulfates [19].

III. Fonctions des facteurs antihémophiliques dans la

coagulation

Le FVIII et son transporteur vWF forment un complexe macromoléculaire [25].

La demi-vie du FVIII lié au vWF est de 10 à 14 h ; celle du FVIII libre n’est que 2,4 heures. Le taux de 30% est un minimal requis nécessaire à une hémostase efficace.

Le FIXa est activé par la thrombine, ce qui entraîne la succession de réactions enzymatiques et renforce la production de thrombine.

Mais il existe une autre voie d’activation du FIX (et donc l’initiation de la coagulation) dont l’importance est mineure comparée à l’initiation de la coagulation par le FT. Elle est la conséquence du contact de protéines plasmatiques avec le sous endothélium [26].

Le FVIIIa forme avec le FIXa, un complexe dénommé tenase, capable d’agir sur le FX, ceci est déterminant dans les tissus pauvres en facteur tissulaire (articulations). Les facteurs antihémophiliques servent alors de mécanisme de secours, sous forme de << boucle de renforcement >> (Jasso 1963), lorsque la quantité de FT est insuffisante [25].

DEUXIEME PARTIE :

FRACTIONNEMENT PLASMATIQUE

INDUSTRIEL

INTRODUCTION :

On définit les fractions « coagulantes du plasma » comme des produits de fractionnement du plasma ayant une teneur élevée en certains facteurs de coagulation. Ces fractions sont utilisées en prévention ou en traitement de syndromes hémorragiques, apparaissant lors d'anomalies constitutionnelles ou acquises de l'hémostase [27].

Les deux principales procédures intervenant dans la production des MDS

d’origine plasmatique sont le fractionnement plasmatique et

l’élimination/inactivation virale. L'objectif de ces techniques est d’obtenir le produit le plus pur possible, sans altération des propriétés physicochimiques et biologiques de la protéine d'intérêt et sans aucun agent infectieux contaminant. Selon l’addendum de 1998 pour la pharmacopée européenne [28], le plasma humain pour le fractionnement correspond à la fraction liquide du sang humain recueillie sur un anticoagulant, séparée des éléments figurés du sang, par filtration continue ou par centrifugation (aphérèse) [29, 30]. Les MDS d’origine plasmatique sont obtenus par des techniques qui permettent la séparation, dans les pools plasmatiques recueillis, des différentes protéines plasmatiques humaines et l'élimination ou l'inactivation des agents infectieux transmissibles. L’albumine est la principale protéine du plasma, avec une concentration variant

de 35 à 50 g.l-1. Les facteurs de coagulation sont présents dans des

concentrations nettement plus faibles, de 0,1 à 0,2 mg/l pour FVIII et de 3 à 7 mg/l pour le FIX [31]. (Figure 10)

Figure 10 : Composition protéique du plasma (en mg/l) [31]

Les pools sont réalisés par le mélange de 5000 à 15000 unités plasmatiques. Ce procédé augmente la probabilité de contaminer un lot entier. En effet, si un virus est présent dans une seule unité plasmatique, il contaminera l'ensemble du lot. C'est une des raisons principales de la contamination antérieure des hémophiles par le VIH, le VHB et le VHC.

Chapitre 1 : Les méthodes de fractionnement du plasma

I.

Cryoprécipitation : [32]

La principale technique de précipitation est la cryoprécipitation. Le plasma humain recueilli pour le fractionnement est conservé à une température inférieure ou égale à -20°C. On obtient une cryoprécipitation en décongelant le plasma à une température comprise entre 2 et 4°C ; il en résulte un cryosurnageant et un cryoprécipité qui seront séparés par centrifugation (Fig.11). Pool montra en 1964 l’intérêt du cryoprécipité et notamment leur richesse en facteurs antihémophilques par rapport au plasma frais congelé qui était utilisé auparavant [1] ; ce qui fut un tournant dans la prise en charge des patients hémophiles. Le cryoprécipité a longtemps servi au traitement de l’hémophilie A et de la maladie de Willebrand, étant donné sa composition [33]. Néanmoins son utilisation comporte des limites infranchissables :

– La cryoprécipitation ne permet pas l’atténuation virale et doit donc être suivie de méthodes d’inactivation/élimination virale ;

– Le fractionnement doit être complété par des chromatographies d'affinité pour améliorer la purification ;

– L’utilisation du cryoprécipité seul, sans purification supplémentaire, est contre productif et ne permet pas une valorisation suffisante des dons de sang [31].

Figure 11 : Principe du fractionnement plasmatique par cryoprécipitation [34]

II.

Précipitation par l'alcool (méthode de Cohn)

Développée dans les années 40 aux États-Unis par E.J.Cohn [35], la méthode de Cohn repose sur une succession d'étapes de précipitation par l’éthanol à froid. Il existe des méthodes dérivées (Cohn-Oncley, Kistler-Nitschmann).

surnageant. La remise en solution du précipité permet de poursuivre la purification de cette même fraction. Les paramètres pris en compte sont la concentration d’éthanol (de 8 à 40 %), le pH (entre 4,5 et 7,4), la concentration protéique (5,1 % au début et 0,8 % aux dernières étapes), la force ionique (0,14 à 0,01 M) et la température (de 0 à- 8°C).

III. Chromatographie

Les techniques chromatographiques utilisées dans le fractionnement plasmatique permettent une sélection fine et une purification des différentes protéines plasmatiques, surtout de celles présentes en faible concentration. Elles ne doivent pas dénaturer la structure des protéines [31, 36], ce qui pourrait les rendre non fonctionnelles et/ou plus immunogènes. Elles peuvent être utilisées avec différents objectifs :

– purifier sélectivement les protéines d'intérêt,

– séparer les polymères des monomères,

– éliminer des stabilisants, des agents virucides et des sels,

– participer à la réduction virale.

Les principales méthodes chromatographiques sont :

– l’échange d’ions (anions ou cations),

– l’immuno-affinité,

III.

L’ultrafiltration

Est utilisée pour éliminer les composants de faible poids moléculaire (sels, alcool) et permet la concentration des solutions de protéines. [37]

Ce procédé a été appliqué dès le début des années 80 à la production de l'albumine et est utilisé lors de l’obtention d'autres protéines.

Plasma Ethanol 19% v /v pH 5, 85 -5°C Surnageant Précipité Ethanol 40% v/v Ethanol 13 % v/v pH 5,9 pH 5 ,1 -8°C -5°C Surnageant Surnageant Ethanol 40% v/v Ethanol 25 % v/v pH 4,8 pH 7, 2 -8°C -7°C

Surnageant d’albumine Précipité d’immunoglobulines

Albumine purifiée Immunoglobulines G

Figure 12- Schéma du fractionnement à l’éthanol selon Cohn (procédé modifié par Kistler-Nitschman) [35]

Chapitre 2 : Préparation des facteurs plasmatiques

antihémophiliques

I.

Méthodes courantes d’inactivation virale

Le chauffage fut la première technique d’inactivation virale utilisée dans les années 1980 [37] :

1. Chaleur sèche

Est un chauffage des produits lyophilisés entre 60° et 100 °C sur une durée allant de 30 minutes à 96 heures. L’efficacité sur le VIH était obtenue par chauffage à 68 °C pendant 96 heures. Réalisée à des températures supérieures ou égales à 80 °C, cette technique est efficace vis-à-vis des virus enveloppés et du VHA et, à un degré moindre, du parvovirus B19 [37].

2. Pasteurisation [39]

Principe du procédé

Les unités de plasma (moins de 100 dons pour chaque lot) sont découpées et sont mélangées pour décongélation à 30°C dans une cuve à double enveloppe thermostatée. Après décongélation, le plasma est additionné de différents stabilisants qui serviront de protecteurs des molécules plasmatiques durant

initiales. Après filtration stérilisante, le plasma pasteurisé est réparti en flacons et congelé (voir Figure n° 13).

La pasteurisation d’antithrombine III, l’Alpha 1- antitrypsine, éventuellement FVIII et PPSB exige la présence de doses parfois élevées de stabilisants (en particulier des sucres) qui peuvent contribuer à réduire l’ampleur de l’inactivation sans remettre en cause l’efficacité globale du procédé (MAULER et al, 1986).

L’application de cette technique aux concentrés de FVIII ou IX est difficile car le chauffage réduit nettement l’activité coagulante, et précipite le fibrinogène. Cette technique est efficace sur le VIH et sur les virus des hépatites, mais son efficacité est variable sur le parvovirus B19 et nulle sur les ATNC (de plus, cette technique entraîne une perte d’activité des fractions antihémophiliques).

Un autre procédé de chaleur humide est le chauffage sous tension de vapeur, au cours de laquelle les produits lyophilisés sont exposés à une température variable en fonction de la protéine concernée. [37].

Décongélation et mélange

Adjonction des stabilisants

Ultrafiltration (Dialyse et concentration) Filtration stérilisante Répartition Congélation

Unités plasmatiques congelées

1. Traitement par solvant-détergent [37]:

Technique de référence d’inactivation virale pour les virus enveloppés et mise en œuvre pour les fractions coagulantes, consiste en une incubation de la solution protéique en présence d’un solvant organique (le tri-n-butyl phosphate) et d’un détergent (polysorbate 80 ou octoxynol), aboutissant à la destruction des virus enveloppés. Dans un second temps, les agents chimiques utilisés sont éliminés par différentes séries de chromatographies, de précipitations ou d’ultrafiltrations. Cette technique n’entraîne pas de perte d’activité des protéines, mais, de par son principe, elle est inefficace sur les virus nus.

2. Nanofiltration

Elle est réalisée sur des filtres dont les pores ont un diamètre de 15 à 50 nm. Elle permet l’élimination des agents infectieux en fonction de leur taille, incluant le parvovirus B19, le VHA (filtration C et les ATNC [41], tout en conservant l’intégrité et l’efficacité des protéines du produit.

Traitement sur le flacon final Appliqués en cours de fractionnement Ch au ff ag e à se c p aste u risa ti on _{Nanofiltration} Ac id e ca p ry li q u e

pH acide pasteurisation Solvant détergent p_ro

cé d és Ch au ffa ge d ’u n pro du it ly op hil is e´ a`8 0 °C p o u r 7 2 h eu re s, o u a` 1 0 0 °C p o u r 3 0 m in utes , g én éra lem en t en p ré se nc e d ’a cid es am in és et/ o u d e su c re s et/ o u d e p o ly o ls [4 0 ]. Ch au ffa ge d ’u ne so lu ti on a ` 60 ° C pe nd an t d ix h eu re s d an s le flac o n fin al en p ré se n ce d’a cid es g ra s sta bil isa teu rs [40] F il tratio n d’u ne so lu ti on pro té iq ue su r de s m em bra ne s m ult ico uc he s d’u ne p oro sité´ de 1 5 a` 7 5 n m [4 0 , 4 6 ,4 7 ] In cu b ati o n a ` u n p H in fé rieu r a` 5 ,5 p en d an t 3 0 a ` 6 0 m in u tes a ` 2 0– 2 2 °C [4 4 ,4 5 ] In cu b ati o n a` u n p H ac id e (p ro ch e d e 4 ) p en d an t p lu sie u rs h eu re s a` 2 5– 3 7 °C [4 0 ,4 3 ] Ch au ffa ge d ’u ne so lu ti on a ` 60 °C pe nd an t dix h eu re s, g én éra lem en t en p ré se n ce d e sta b ili sa n ts (su cre s, p o ly o ls, ac id es am in és) [4 0 ,4 2 ] In cu b ati o n d e q u elq u es h eu re s en p ré se n ce de Tn BP e t d’ un o u plu sie urs d éterg en ts (Twe en 8 0 , Tri to n X -1 0 0 ) a` 2 0– 3 7 °C [4 0 ,4 1 ] p rin ci p e En v el o p p és n o n en v elo p p és En v el o p p és No n en v elo p p és En v el o p p és No n e n v elo p p és En v el o p p és En v el o p p és n o n en v elo p p és en v elo p p és No n en v elo p p és En v el o p p és Viru s ci b lés Le p arv o v ir u s B1 9 p eu t m o n trer u n e traitem en t .P oss ib il it é de 1 0 a` 20 % d e pe rte d’a cti les fra cti o n s co ag u lan tes . Ap p li q u e´ p ri o rit airem en t co ag u lan te Ré se rv e´ à l’alb um in e L’élimin ati on v irale s’e ffe ctu e pa r ex clu sio n sté riq d iffére n ti el d e taill e d es v iru s et d es n an o fil tres . A p a` to u te la g am m e d es p ro d u its p las m ati q u es, y m ass e m o léc u laire Ré se rv e´ au x imm u n o g lo b u li n es G Ré se rv e´ au x imm u n o g lo b u li n es G Le p arv o v ir u s B 1 9 p eu t m o n trer u n e ré sista n ce à ` ce co m p o siti o n d u m il ieu . P o ss ib ili té´ de 1 0 a` 30 % d b io lo g iq u e p o u r les fra cti o n s co ag u lan tes . Ap p li q u e´ co ag u lan tes , fi b rin o g èn e, an ti th ro m b in e, alp h a imm u n o g lo b u li n es In effica ce c o n tre les v iru s n o n e n v elo p p és. P as, o u d én atu ra ti o n d es p ro téin es p las m ati q u es. Les a g en éli m in és, (g én éra lem en t p ar p ro cé d és ch ro m ex trac ti on a ` l’h uil e). Ap pli ca ble e n pra ti qu e a` to p ro d u it s p las m ati q u es. Ca ra ctéristiq u es

II. Autres techniques d’inactivation virales : [39]

Il existe plusieurs autres techniques d’inactivation virale mais nécessitant toutefois des validations virales supplémentaires :

 Inactivation à l’état lyophilisé.

C’est une méthode qui a été développé pour inactiver des virus non enveloppés introduits dans un dérivé plasmatique subissant un cycle de lyophilisation.

Après la dessiccation, un mélange inactivant est vaporisé dans l’enceinte sous vide. Après un temps de contact suffisant pour imprégner le produit et provoquer l’inactivation des virus modèles, le mélange virulicide est repompé, le produit subit une dessiccation secondaire sous vide, puis est bouché sous atmosphère, convenant à la stabilité du dérivé. Le mélange inactivant est constitué d’éthanol, 70 % peroxyde d’hydrogène.

 Biotest : synergie bêta propiolactone- UV.

 Photo –inactivation : rayonnement laser, les composés apparentés

aux psoralènes.

 Action de l’ozone.

III. Assurance de l’efficacité des étapes d’inactivation et

d’élimination virale [37]

Cette efficacité est définie par le facteur

l’application du procédé considéré. Elle est appréciée en surchargeant, à l’échelle du laboratoire de virologie, le produit par un virus, avec mesure du titre viral initial et du titre viral résiduel obtenu après le traitement par le procédé

[38]. Ainsi, le facteur de réduction représente le logarithme du rapport entre

charge initiale et charge finale.

Toutes ces techniques d’élimination et/ou d’inactivation virale ont cependant leurs limites et aucune ne peut garantir à elle seule une sécurité virale absolue des produits fabriqués. À l’heure actuelle, il est préconisé d’utiliser, dans la fabrication des MDS, deux techniques distinctes et complémentaires, dont une au moins doit être efficace sur les virus nus [51]. L’association d’étapes d’inactivation de plus en plus complexes aux étapes de purification des procédés de fabrication doit permettre l’obtention de produits microbiologiquement sûrs, avec un niveau de sécurisation biologique conforme aux exigences en vigueur. Depuis leur application au cours de la fabrication des MDS, aucun cas de contamination par le VIH, le VHB et le VHC n’a été constaté [52]. Toutefois, conformément à la circulaire 98/231 du 9 avril 1998, une information des malades receveurs de MDS quant aux risques avérés ou théoriques de ces

IV. Production proprement dite :

1. Schéma de la production : [53]

La production proprement dite d’un concentré de facteur de la coagulation met en œuvre un schéma de production faisant appel aux techniques que nous avons décrites plus haut. Les techniques chromatographiques sont couplées aux techniques d’inactivation virale pour obtenir un produit final de qualité et de sécurité assurées.

Techniques utilisées

Remise en solution

Echange d’ions, affinité

Immunoaffinité

Pasteurisation, solvant détergent

Echange d’ions, affinité, immunoaffinité

Lyophilisation Conditionnement

Conditionnement pasteurisation, nanofiltration

chaleur sèche Chromatographie Inactivation virale Chromatographie Inactivation virale du produit semi fini Inactivation en fin de

production CRYOPRECIPITE ou SURNAGENT DE

Pour un même produit, toutes les étapes ne sont pas prises en compte. Plusieurs combinaisons existent pour aboutir à un concentré de facteur comme produit final. La flèche à angle droite est un exemple pour la purification d’un concentré en FVIII.

Enfin il faut signaler que les dérivés stables du sang purifiés industriellement sont des produits lyophilisés et leur administration parentérale exige un diluant qui est en général de l’eau ppi (pour préparation injectable) préparé selon les bonnes pratiques de fabrication. Cette préparation accompagne le médicament dans son conditionnement final.

2° Contrôles : [53]

On distingue le contrôle des matières premières, le contrôle en cours de fabrication et le contrôle du produit fini.

Contrôle des matières premières

Il s’agit du contrôle du sang mais aussi de tous les composants intervenant dans la fabrication du médicament. Les matières premières doivent être conforme aux normes fixées par la pharmacopée régissant la production de l’industrie pharmaceutique productrices (pharmacopée française, européenne, américaine, japonaise). La conformité des matières premières utilisées doit être établie vis-à-vis des monographies de ces pharmacopées.

2.2 Contrôle en cours de fabrication

On distingue le contrôle physico-chimique ou l’on dose l’activité du FVIII, les protéines, le fibrinogène. On mesure également le pH, l’osmolarité, l’humidité

résiduelle. Le contrôle biologique quant à lui vérifie la stérilité et l’apyrogénicité. On titre également l’Ag HBs, les Ac irréguliers, les Ac naturels et immuns.

La pharmacopée fixe les normes que tous ces contrôles doivent respecter de même que les conditions dans les quelles ces contrôles doivent s’effectuer.

En plus signalons que l’ensemble de la production est contrôlé et de ce fait garanti la qualité du produit fini : il s’agit de privilégier la production contrôlée au contrôle du produit fini.

2.3 Contrôle du produit fini

On dose l’activité du FVIII coagulant dans le produit final ainsi que son activité spécifique. Des essais limites doivent également être effectués pour un certain nombre de substances : protéines totales, fibrinogène, pH, osmolarité, humidité résiduelle, solubilité, Na, Cl, citrates, calcium, acides aminés, saccharose, solvant et détergent utilisés, pyrogènes.

Le contrôle en fin de production n’a de sens que si tout le processus de fabrication est contrôlé. Il ne sert donc qu’à s’assurer de la conformité du produit fini.

Chapitre

3 :

Principaux

produits

plasmatiques

antihémophiliques

I.

Concentrés de FVIII :

a- Produits [59]

Ils sont préparés à partir du cryoprécipité. On distingue le concentré de FVIII nanofiltré du LFB (Factane*) qui remplace le FVIII-LFB* depuis février 2001 et les FVIII immunopurifiés.

Les caractéristiques du Factane* sont une purification par chromatographies échangeuses d’ions à partir des plasmas issus des dons du sang français, une inactivation virale par solvant-détergent et une étape d’élimination virale par double filtration à 35 nm puis 15 nm. Sa particularité est d’être stabilisée par le facteur Willebrand qui est sa protéine porteuse physiologique. Il ne nécessite donc pas l’addition d’albumine humaine. L’activité spécifique est supérieure à 100 UI/mg de protéines [59]. Les FVIII immunopurifiés importés, sont manufacturés et commercialisés par Baxter Highland Immuno (Hemofil-M*) et

Aventis Behring (Monoclate-P*). Ces produits sont purifiés par

chromatographie d’immunoaffinité utilisant des anticorps monoclonaux murins, qui sont ensuite éliminés par une chromatographie échangeuse d’ions. Ils comportent une étape d’inactivation virale par solvant-détergent (Hemofil-M*) ou par pasteurisation (Monoclate-P*). Ces facteurs étant particulièrement instables lorsqu’ils sont dissociés du facteur Willebrand, il est nécessaire d’ajouter de l’albumine humaine pasteurisée, ce qui réduit leur activité

Le FVIII est indiqué dans le traitement et la prévention des épisodes hémorragiques de l’hémophilie A sans inhibiteur, ou avec un taux inférieur à 10 unités internationales dites unités Bethesda (UB).

Unité Bethesda : 1UB est la concentration d’inhibiteur qui neutralise 50 % de FVIII pool.

Toute décision thérapeutique chez un hémophile doit être prise en collaboration avec le centre régional de traitement des hémophiles qui suit le patient. En règle générale, l’administration d’une UI de FVIII par unité de poids corporel, augmente le taux plasmatique de FVIII d’environ 2 %.

Le nombre d’unités nécessaires peut être calculé de la façon suivante :

Nombre d’unités = Poids (kg) × augmentation souhaitée du taux de FVIII × 0,5 La dose et la durée doivent être individualisées en fonction des besoins du patient. Elles dépendent du site et de l’importance de l’hémorragie, ou du type de l’intervention et de la sévérité des troubles de l’hémostase (tableau 5). Le renouvellement des injections est souvent indispensable : le plus souvent toutes les 8 heures [59].

c. Effets indésirables :

et de le titrer en UB. Le dépistage doit être particulièrement vigilant au cours des 100 premières journées d’exposition aux concentrés de FVIII chez l’hémophile sévère et lors d’une exposition massive chez les hémophiles modérés (chirurgie). La survenue d’anticorps inhibiteurs a été rapportée après changement de type de concentré de FVIII. Les autres effets indésirables sont les rares réactions allergiques, en règle peu sévères, et cédant à l’administration d’antihistaminiques, ou les exceptionnelles réactions anaphylactiques.

Tableau 5 : Concentrés de FVIII plasmatique [58]

FACTANE* HEMOPHILE M* MONOCLATE P*

Laboratoire LFB Baxter Aventis -Behring

Origine Plasma humain Recombinaison génétique Oui non Oui non Oui non Purification / élimination virale Chromatographie Nanofiltration Ultrafiltration /diafiltration Oui Oui Non Oui Non Non Oui Non Non Inactivation virale Solvant/détergent Chaleur Oui Non Oui Non Non Pasteurisation

Produit final stabilisé par albumine Non Oui Oui Protéine résiduelle de production Origine hamster Origine bovine Non Non Non Non Non Non

II.

Concentrés de F IX

a- Produits [59]

Deux produits sont d’origine plasmatique : FIX haute pureté du LFB (Bétafact*) nouvelle dénomination du FIX-LFB* depuis février 2001 et Mononine*. Ils sont préparés à partir du surnageant après cryoprécipitation du plasma.

Le Bétafact* est purifié par chromatographie échangeuse d’ions et d’affinité. L’activité spécifique est d’environ 150 UI/mg de protéines.

L’addition de stabilisant n’est pas nécessaire. La demi-vie du Bétafact* est de 33 ± 4 heures. Le Mononine* est immunopurifié par chromatographie d’immunoaffinité avec anticorps monoclonaux murins dirigés contre le FIX. L’activité spécifique est supérieure à 100 UI/mg de protéines. Le produit ainsi obtenu est stable, et ne nécessite pas l’addition d’albumine. La demi-vie du Mononine* est de 18 à 24 heures [59].

b- Intérêt thérapeutique :

Le FIX est indiqué dans le traitement préventif et curatif des épisodes hémorragiques de l’hémophilie B sans inhibiteur ou avec un taux inférieur à 5 UB. En règle générale, l’administration d’une UI de FIX par unité de poids corporel, augmente le taux plasmatique de FIX de 1 %. Le nombre d’unités nécessaires peut être calculé de la façon suivante :

Nombre d’unité nécessaire= Poids (kg) × augmentation souhaitée du taux de F IX (% de la normale) × 1,0

La dose et la durée du traitement doivent être individualisées en fonction des besoins du patient. Elles dépendent du site et de l’importance de l’hémorragie, ou du type de l’intervention et de la sévérité des troubles de l’hémostase (tableau 6). La demi-vie du FIX permet de réaliser deux administrations par jour dans les situations chirurgicales à risque élevé ou les accidents hémorragiques graves et une seule injection quotidienne.

c- Effets indésirables :

De rares cas de complications thromboemboliques ont été rapportés, toujours associés à d’autres facteurs de risque. Le risque d’apparition d’un inhibiteur du FIX est moindre que dans l’hémophilie A (3 % des cas d’hémophilie B sévère). L’inhibiteur doit être suspecté devant une réponse clinique insuffisante, après administration d’une dose correcte. Il est cependant recommandé de rechercher régulièrement la présence d’un inhibiteur du FIX et de le titrer.

Les autres effets indésirables sont des réactions allergiques rarement anaphylactiques.

Tableau 6 : Doses et rythmes des injections des facteurs antihémophilques A et B [59] Hémophilie A Hémophilie B

Tableau clinique Taux plasmatique de facteur VIII Posologie et fréquence des injections Taux plasmatique de facteur IX Posologie et fréquence des injections Accident hémorragique mineur Hématome, hémarthrose, épistaxis 15-30 % 20 UI Une injection A renouveler selon la gravité 20-40 % 30UI/kg Toutes les 24h, jusqu’à l’arrêt de l’hémorragie Accident hémorragique grave

Hématome dans une région dangereuse Traumatisme important Chirurgie mineure (extraction dentaire) 30- 50% 40 UI/kg toutes les 8h pendant 2 à 4 j jusqu’à cicatrisation 30- 60% 60 UI/kg Toutes les 24h pendant 2 à 3j au moins

*On conseille de se concerter avec le spécialiste de l’hémophilie pour décider la durée du traitement substitutif.

Tableau 7: FIX plasmatique ( hémophilie B) [58]

BETAFACT* MONONINE*

Laboratoire LFB Aventis- Behring

Origine Plasma humain Recombinaison Oui non Oui Non Purification / élimination virale Chromatographie Nanofiltration Ultrafiltration Oui Oui 15 nm Oui 2 ultrafiltrations de sodium à 100 KD Inactivation virale Solvant /détergent Pasteurisation Oui Non Thiocyanate de sodium Non

Produit final stabilisé par albumine Non Non Protéine résiduelle de production Origine hamster Origine bovine Origine murine Non Non Non Non Non Oui

III. Autres dérivés stables utilisés dans l’hémophilie

1-Concentré de complexe prothrombique activé

Durant leur fabrication, les PPSB, peuvent se trouver, volontairement ou non, activés.

Dans les années 1970, deux PPSB activés ont ainsi été mis au point : le

Feiba® (Immuno) et l'Autoplex® (Baxter). Il s'agit de PPSB contenant plus

ou moins de formes activées de certains facteurs de la coagulation (en particulier facteurs FIIa, VIIa, IXa) et des phospholipides. De ce fait d'ailleurs, ces fractions ont un net pouvoir thrombogénique observé in vitro dans des tests classiques comme le test de Wessler (modèle de

thrombogénicité chez le lapin avec stase veineuse). Le Feiba® est inactivé

par chauffage à la vapeur, l'Autoplex® par chauffage 144 heures à 60°.

L'efficacité de ces fractions activées a été comparée à celle de PPSB

classiques dans deux études randomisées. Le Feiba® s'est avéré légèrement

plus efficace que le PPSB (64 % contre 52 %) [60] alors qu'aucune

différence significative n'était notée entre Autoplex® et PPSB [61].

Les fractions activées déterminent dans environ 15 % des cas d'hémophilie A une réponse anamnestique liée à la présence de traces de FVIII : Ag dans les préparations. Des chiffres très variables, allant de 5 à 31 % des cas, sont

cependant cités avec le Feiba®. Le risque est accru en cas d'injections

traitement est poursuivi [63]. Bien évidemment, le Feiba® relance la production d'anticorps anti-FIX s'il est utilisé chez l'hémophile B.

2

- FVIII porcin

Ce concentré est préparé par fractionnement sur polyélectrolytes qui permet de séparer électivement du complexe FVIII/vWF la molécule de FVIII : c Ag. Celle – ci ainsi détachée du F Willebrand, doit être stabilisée par addition d’albumine porcine.

Cette préparation à une concentration de 25 à 40 UI /ml de FVIIIC avec une activité spécifique de 25 à 100. Il a l’avantage d’être dépourvu de tout virus pathogène pour l’homme et d’être utilisé dans le traitement des épisodes hémorragiques chez un hémophile A développant un inhibiteur de FVIII.

TROISIEME PARTIE :

Facteurs antihémophiliques issus du génie

génétique

Chapitre 1 : Procédés de fabrications de facteurs

antihémophiliques recombinants

Les MDS d’origine recombinante [34] :

Ils sont produits grâce au génie génétique et ils ne font pas appel au don de sang. La production de ces médicaments a été possible par le clonage des gènes codants pour les FVII, VIII et IX. Des protéines de structure primaire identique à celle des protéines naturelles sont produites par des cellules d'origine animale en culture dans lesquelles a été inséré l'ADN complémentaire (ADN sans les introns) de la protéine recherchée. Ces médicaments ont le même effet thérapeutique que les protéines d’origine plasmatique [64]. Les MDS d’origine recombinante ne remplacent pas toutes les protéines plasmatiques.

I.

Principes de la production des MDS d’origine recombinante

[65 ,66]

Les gènes humains codant pour les protéines des FVII, VIII et IX ont été isolés et clonés dans le but de les introduire dans un vecteur d’ADN (vecteur plasmidique). Ce vecteur est ensuite transfecté dans des cellules de mammifères en culture bien caractérisées (lignées cellulaires). Elles assurent les modifications post-traductionnelles nécessaires à l'activité coagulante des protéines. Ces lignées cellulaires modifiées sécréteront la protéine recherchée

– des cellules de reins de hamster nouveau-né (baby hamster kidney ou BHK).

La purification des protéines anti-hémophiliques recombinantes est réalisée par chromatographie d’immuno-affinité sur des colonnes d'anticorps monoclonaux spécifiques de la protéine recherchée. Cette dernière est spécifiquement retenue avec élimination du reste du milieu de culture cellulaire (Fig. 15) [67].

ADN humain

Isolement du gène

Gène codant pour FAH facteur antihémophilique

Clonage

Gène cloné

Vecteur del’ADN

Lignée cellulaires hôtes CHO ou BHK

Milieu de culture

Production de FAH

Purification et séparation du FAH

Chromatographie

II. Purification du facteur recombinant

Après une série de multiplications, la culture cellulaire atteint un stade de maturation suffisant pour commencer le recueil du surnageant. Le fluide contenant le facteur recombinant est alors récolté et purifié.

A partir de là, tout se passe pratiquement comme avec le plasma. La purification ici a pour objectif d’éliminer les fragments d’ADN et les protéines cellulaires du BHK ou du BHO de même que les protéines ajoutées au milieu de culture. Cette purification permet d’obtenir un produit ayant une activité spécifique très élevée.

Les méthodes chromatographiques sont là aussi les plus utilisées. Plusieurs séries de chromatographie peuvent s’avérer nécessaires. Les techniques chromatographiques utilisées sont les mêmes que celles utilisées dans la purification des facteurs de la coagulation à partir du plasma.

Plusieurs types de chromatographies sont utilisés avec des adsorbants variés pour purifier au maximum le F recombinant. Le tableau 8 montre Importance de la chromatographie dans la purification des facteurs antihémophiliques recombinants.

Tableau 8 : Importance de la chromatographie dans la purification des facteurs antihémophiliques recombinants [53]

Médicament Helixate Nexgen* Kogenate* NovoSeven*

Laboratoire fabriquant AVENTIS BAYER NOVONORDISK

Nombres d’étapes 5 5 4

chromatographiques

CM échangeuse d’anions oui oui oui

CM échangeuse de cations oui oui oui

III.

Avantages

et

inconvénients

des

médicaments

recombinants

Les MDS d’origine recombinante comporte des avantages :

– leur disponibilité n’est pas fonction du volume des dons de sang, ce qui diminue le risque de situation de pénurie mais ne l’exclut pas ;

– la transmission des virus d’origine humaine est impossible ;

– ils ont une très haute pureté.

L’inconvénient principal est la production d’anticorps anti-facteur de la coagulation. Des études médecine sont menées sur des groupes de patients hémophiles PUPs (Previously Untreated Patients) n’ayant jamais reçu de facteurs de coagulation d’origine plasmatique. D’après Bray et coll. 2 3, 9 % des PUPs traités par du Recombinate® (FVIII recombinant) développent des anticorps anti FVIII [68]. Avec le Kogénate® (FVIII recombinant), les anticorps apparaissent entre 1 mois et 5 ans après le début du traitement ; les 2/3 apparaissent pendant la troisième année [64]. Chez l’hémophile A, le risque de développer des anticorps anti-FVIII lié à l’utilisation de concentrés recombinants ou plasmatiques, n’est pas prévisible mais on sait que les allo-anticorps apparaissent plus tôt avec les produits recombinants.

IV. Contrôles de qualité :

Il s’agit du contrôle de la banque cellulaire utilisée pour la production du facteur antihémophilique recombinant. Des analyses approfondies sont menées pour attester qu’elle est indemne de toute présence d’agents infectieux, d’agents tumorigènes ou autres types d’agents de contamination.

Les processus apportés au cours du processus de fermentation notamment les protéines plasmatiques, l’insuline recombinante, les vitamines et les sels minéraux subissent une présélection rigoureuse ainsi que les tests de dépistage de présence virale.

2.. Assurance de la sécurité virale au cours du processus de fabrication

Malgré les mesures de sécurité prises au cours de la production, plusieurs contrôles sont effectués pour s’assurer de l’innocuité virale de la production. Cette vérification se fait par :

 Le contrôle de la stérilité du procédé de fermentation

 La validation des étapes de la purification notamment les étapes

d’inactivation et d’élimination virale. la validation de la sécurité virale se fait avec des virus classiques( VHB , VHC , VIH) et aussi des virus provenant de bovins ( BVDH= virus de la diarrhée virale bovine , virus de la rhinotrachéite bovine infectieuse) et ou de hamster ( X-MuLV= virus murins de hamster , MuIV= virus de la leucémie murine) .

épidémiologique ne vient soutenir la possibilté d’une transmission de ces agents par les produits sanguins labiles stables. Toutefois des inquiétudes sont apparues concernant le potentiel de transmission de la maladie par le biais de produits dérivés du plasma [69].

Le suivi virologique des patients permet de confirmer la validité du procédé d’inactivation virale.