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Existe-t-il une activation de la transmission pour le
Turnip Mosaic Virus?
Edwige Berthelot
To cite this version:
Edwige Berthelot. Existe-t-il une activation de la transmission pour le Turnip Mosaic Virus?. Biologie végétale. 2015. �hal-02800685�
Master Biologie des Plantes et des Micro-organismes,
Biotechnologies, Bioprocédés
Spécialité : Biologie des Plantes
Parcours : Biologie Fonctionnelle des Plantes
Année Universitaire 2014-2015
Existe-t-il une activation de la transmission pour le
Turnip Mosaic Virus ?
Edwige BERTHELOT
Biologie et Génétique des Interactions Plante-Parasite
Remerciements
Tout d’abord, je souhaite remercier Monsieur Stéphane Blanc, chef de l’équipe Virus-Insecte-Plantes dans laquelle j’ai réalisé mon stage, pour avoir transmis ma candidature à l’ensemble des chercheurs de son équipe et la SIPRE (Semence, Innovation, Protection, Recherche, Environnement) pour le financement de mon stage.
Un grand Merci à…
Martin Drucker, pour m’avoir accueilli en tant que stagiaire au sein de son équipe de recherche. Je le remercie également pour son encadrement et son implication dans ma recherche de publications scientifiques, la réalisation de mes manipulations, ses nombreuses relectures dans la rédaction de mon rapport et pour les explications qu’il m’a apportées tout au long de ce stage.
Stéphane Blanc, Florence Vignols, chercheure à l’UMR Interactions Plantes Microorganismes Environnement de l’IRD de Montpellier et Vianney Poignavent, thésard de Florence Vignols, pour leurs conseils qui ont grandement contribués à l’orientation de mes manipulations.
Jean-Luc Macia pour l’élevage des pucerons que j’ai utilisé dans mes expériences, son aide dans la réalisation de mes tests de transmission et la relecture de ma partie du rapport en lien avec le matériel biologique que j’ai utilisé et les tests de transmission. Je remercie également Sophie Le Blaye pour la préparation des plants que j’ai utilisés en routine durant mon stage.
Jean-Louis Zeddam et Marie Ducousso pour toutes les petites aides du quotidien dans le laboratoire. Je remercie également Marie pour avoir réalisé les inoculations hebdomadaires des plantes de navets avec le TuMV et pour le passage des commandes indispensables à la réalisation de mes manipulations.
Daniel Gargani pour toutes les expériences complémentaires qu’il a réalisé au microscope sur la localisation des protéines HC-Pro et CP des protoplastes issus de feuilles de navets infectés
Marie-Stéphanie Vernerey pour ma formation à l’utilisation des microscopes confocal et épifluorescence.
Gaël Thébaud pour ses conseils dans le choix du test statistique le plus adapté à mes résultats.
Albin Teulet pour son aide dans ma recherche de références bibliographiques et pour les nombreux échanges scientifiques que nous avons partagés.
Enfin, mes remerciements vont aussi à toute l’équipe Virus-Insectes-Plantes pour leur accueil et pour la semaine passée aux 15èmes rencontres de Virologie Végétale du 18 au 22 janvier 2015 à Aussois.
Abréviations
a < b : a supérieur à b a > b : a inférieur à b -SH : groupement thiol
A. thaliana : Arabidopsis thaliana ADN : Acide DésoxyriboNucléique ARN : Acide ribonucléique
ARNm : Acide ribonucléique messager B. rapa : Brassica rapa
CaMV : Cauliflower mosaic virus CP : Coat Protein
GFP : Green Fluorescent Protein GRX1 : human glutaredoxin 1
HC-Pro : Helper Component Proteinase
NADPH oxydase : Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate-Oxidase PAMPs : Pathogen-Associated Molecular Patterns
PRR : Pattern Recognition Receptor
RbohD : Respiratory burst oxidase homolog protein D RbohF : Respiratory burst oxidase homolog protein F ROS : Reactive Oxygen Species
sb : simple brin
TA : Activation de la Transmission TuMV : Turnip mosaic virus VPg : Viral genome linked Protein
Produits et réactifs
BCIP : 5-Bromo-4-Chloro-3'-Indolyphosphate P-toluidine salt Carborundum : carbure de silicium
DTT : dithiothréïtol
FDA : Fluorescein DiAcetate H O : Peroxyde d’hydrogène
HEPES : acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthane sulfonique LaCl3 : lanthanum(III) chloride
MgCl2 : chlorure de magnésium
NaBH4 : borohydrure de sodium
NaCl : chlorure de sodium
NBT : Nitro-Blue Tetrazolium chloride TBS : Tris Buffered Saline
TBS-L : poudre de lait à 5% dans du TBS TG : Tris-Glycine
Unités
Facteurs de multiplication : k : kilo- (103) m : milli- (10-3) µ : micro- (10-6) % : pourcent °C : degré Celsium g : gramme Da : Dalton M : mole par litre m : mètre m3 : mètre cube mol : mole L : Litre pb : paires de bases pH : potentiel Hydrogène rpm : tour par minute W : WattListe des Figures
Figure 1. Représentation schématique de la transmission d’un virus par puceron.
Figure 2. L’activation de la transmission du CaMV par les pucerons.
Figure 3. Symptômes du TuMV sur navet (Brassica rapa).
Figure 4. Représentation schématique du génome d’un Potyvirus.
Figure 5. Représentation schématique des motifs de HC-Pro impliqués dans la transmission.
Figure 6. Schéma du complexe transmissible chez les Potyvirus.
Figure 7. Effet des différents réactifs sur la transmission du TuMV à partir de protoplastes.
Figure 8. Taux de viabilité des protoplastes infectés par le TuMV incubés ou non avec les différents réactifs.
Figure 9. Effet des différents réactifs sur la transmission du TuMV à partir d’extraits cellulaires.
Figure 10. Effet de différents mutants sur la transmission du TuMV à partir de feuilles.
Figure 11. Immunomarquage de protoplastes de navets infectés par le TuMV.
Figure 12. Effet des différents traitements des protoplastes sur l’oligomérisation de HC-Pro et de la CP.
Figure 13. L’oligomérisation de HC-Pro est réversible et dépend des ponts disulfures. Figure 14. Modèle de l’activation de la transmission du TuMV par le puceron.
Figure 15. Principe et étapes du Duolink.
Figure 16. Mise en évidence de l’interaction tubuline / P2 par la méthode du Duolink.
Figure 17. Les étapes d’un test de transmission par protoplastes ou extraits cellulaires.
Sommaire
1. Résumé
2.
3. 1. Introduction
1 1.1. Transmission 1 1.2. Activation de la transmission 2 1.3. Le virus de la mosaïque du navet (TuMV)
2
1.4. Les réponses de la plante à la présence du puceron 4
2. Résultats
5
2.1. Tests de transmission et viabilité 5
2.1.1. Tests de transmission à partir de protoplastes 5
2.1.2. Viabilité des protoplastes 5
2.1.3. Tests de transmission à partir d’extraits cellulaires 6
2.1.4. Tests de transmission à partir de feuilles 6 2.2. Immunomarquage 6 2.3. Western blot 7
2.3.1. Effet de traitements mimant des réponses rapides de la plante 7
2.3.2. Caractérisation de l’oligomérisation de HC-Pro
8
3. Discussion
9
3.1. H2O2 augmente la transmission du TuMV
9
3.3. Hypothèse : les formes oligomériques de HC-Pro sont formées par des réactions d’oxydoréduction 10 3.4. Perspectives
11
4. Matériels et méthodes
14 4.1. Matériel biologique 144.1.1. Arabidopsis thaliana et Brassica rapa 14
4.1.2. Myzus persicae 14 4.2. Inoculation du virus 15 4.3. Préparation des protoplastes de feuilles de navets
15 4.4. Préparation des extraits cellulaires infectés
16 4.5. Traitements des protoplastes
16
4.6. Tests de transmission et viabilité 16
4.6.1. Test de transmission à partir de protoplastes ou d’extraits cellulaires 16
4.6.2. Test de viabilité des protoplastes 17
4.6.3. Test de transmission à partir de feuilles
17 4.7. Immunomarquage
18 4.8. SDS-PAGE et Western blot
18 4.9. Test statistique
19
Références
Résumé
Le TuMV est transmis, comme des centaines d’autres virus de plante, de manière non-circulante, selon la stratégie moléculaire « facteur assistant de la transmission », par les pucerons. Cela indique que les particules virales (virions) transmises s’attachent aux stylets (les pièces buccales des pucerons) en quelques secondes, et sont transportées vers une nouvelle plante hôte. La liaison entre le TuMV et les stylets n’est pas directe, un facteur assistant de la transmission (la protéine virale HC-Pro pour Helper Component Protease) y intervient en créant le lien moléculaire entre les virions et les stylets. Pour un autre virus non-circulant et utilisant un facteur assistant de la transmission, le CaMV, la présence des vecteurs sur la plante induit le passage de l’état pour lequel le virus n’est pas transmissible à l’état où il le devient. La transmission du TuMV a été testée dans le but de déterminer si ce virus suit également cette stratégie, appelée « Transmission Activation (TA) ». Des tests de transmission par les pucerons à partir de protoplastes incubés ou non dans différents réactifs ont été réalisés. Les résultats de ces tests ont montré qu’un ROS (Reactive Oxygen Species), H2O2 (peroxyde d’hydrogène) active la transmission du TuMV tandis qu’un bloqueur de la
signalisation calcique, LaCl3 (Lanthanum(III) chloride) l’inhibe. Ensuite, par la technique du
SDS-PAGE / Western blot un phénotype de la TA a pu être caractérisé par la présence / absence des oligomères de HC-Pro dans les cellules infectées, corrélées avec l’activation et l’inhibition de la transmission du TuMV par les pucerons. Le TuMV est donc un deuxième exemple pour la TA.
TuMV is transmitted by aphids and using, like hundreds of other plant virus, the noncirculative mode, according to the molecular “helper” strategy. This indicates that the virus particles (virions) transmitted attach within seconds to the stylets (mouthparts of aphids), and are transported to a new host plant. The connection between TuMV and the stylets is not direct, a transmission helper component (the viral protein HC-Pro Helper Component Protease) intervenes by creating the molecular link between virions and stylets. For another noncirculative virus using the helper strategy, CaMV, the presence of vectors on the plant induces the passage from a state where the virus is not transmissible to a state where it becomes transmissible. The transmission of TuMV has been tested in order to determine if
Aphid transmission tests were performed using infected protoplasts as viral source, which were incubated or not in different reagents. The results of these tests showed that a ROS (Reactive Oxygen Species), H2O2 (hydrogen peroxide) activates the transmission of TuMV
while a blocker of calcium signaling, LaCl3 (Lanthanum(III) chloride) inhibits it. Then, by the
technique of SDS-PAGE / Western blot, a phenotype for TuMV TA could be characterized by the presence / absence of oligomeric HC-Pro in infected cells, which correlated with the activation and inhibition of the transmission of TuMV by aphids. Thus, TuMV is a second example for the TA.
Figure 1. Représentation schématique de la transmission d’un virus par puceron. A gauche : Lors d’une
transmission non circulante, le puceron enfonce ses stylets jusqu’à l’épiderme et au parenchyme. Le virus (points rouges) reste attaché au niveau des stylets ou du précibarium du puceron. Le virus ne se réplique pas dans le vecteur. A droite : Lors d’une transmission circulante, le puceron enfonce ses stylets jusqu’au phloème. Le virus est aspiré avec la sève du phloème et, après ingestion, effectue un cycle à l’intérieur du puceron. Il passe par le lumen et traverse le tube digestif (TD) jusqu’à la cavité générale (CG) avant d’envahir les glandes salivaires (GS). De là, le virus pourra être inoculé, à l’occasion d’une autre piqûre, dans un nouvel hôte. Dans de nombreux cas, le virus se réplique dans le vecteur.
Mode de transmission du virus Non circulant Circulant
Temps d’acquisition Très court
(piqûre de gustation)
Long
(piqûre de nutrition)
Temps de latence Très court Long
Temps d’inoculation Très court
(piqûre de gustation)
Long
(piqûre de nutrition)
Persistance de la transmissibilité Court Important
Lutte Pas de traitement insecticide
Huile minérale
Traitements insecticides dès l’arrivée des pucerons
1. Introduction
1.1. Transmission
La transmission est une étape centrale du cycle d'infection des virus de plante puisqu'elle contrôle leur dissémination dans l'environnement. La transmission permet aux virus de couvrir la distance entre deux hôtes et de s’affranchir de la barrière imposée par la paroi cellulaire. Les virus ont donc dû développer des stratégies sophistiquées pour garantir le bon résultat de cet événement. Quelques virus peuvent être transmis mécaniquement (contact direct) ou par le vent, mais la plupart des virus de plantes font appel à un organisme tiers, un vecteur. Dans ce cas, l’interaction est dite tripartite entre le virus, le vecteur et la plante. Les vecteurs concernés peuvent correspondre par exemple à des nématodes, des champignons mais il s’agit surtout d’arthropodes. Parmi cette dernière catégorie, se sont notamment les arthropodes ayant un comportement alimentaire piqueur-suceur (par exemples les pucerons, les mouches blanches, les cicadelles…) qui sont vecteurs des virus de plantes (Whitfield et al., 2015).
Il existe deux modes d'interactions virus-vecteur : la transmission non circulante et la transmission circulante (figure 1 et tableau 1). Dans la transmission non circulante, deux modes moléculaires de l’interaction virus-vecteur sont décrits. Soit la particule virale (virion) se lie directement aux pièces buccales du puceron, soit une protéine virale non-structurale, la Helper Component ou facteur assistant de la transmission, fait le lien entre le virion et le vecteur (Brault et al., 2010).
La transmission circulante dépend intimement des relations entre le virus et son vecteur, ce qui permet le franchissement de la barrière intestinale et l'invasion des glandes salivaires. Ceci est moins clair pour la transmission non circulante. En effet, la liaison des particules du virus aux pièces buccales du vecteur est souvent considérée comme similaire à la transmission par contact direct d’une plante à l’autre, donc sans prérequis particulier. Cependant, dans la transmission non circulante, il existe également un certain degré de spécificité de vecteur, ce qui suggère que ce mode de transmission n’est pas un événement aléatoire. En outre, l'existence des facteurs assistants étant spécialisés dans la liaison au vecteur indique que la transmission non circulante est plus complexe (Blanc et al., 2014).
Figure 2. L’activation de la transmission du CaMV par les pucerons (Blanc et al., 2014, d’après Martinière
et al., 2013). (a) En l’absence du vecteur, les cellules végétales infectées contiennent de nombreuses usines
virales (VF) contenant la plupart des virions qui sont enfermés dans une matrice de la protéine virale P6 (en gris). Ces cellules comprennent également un unique corps à transmission (TB) contenant la totalité de la protéine virale P2, le facteur assistant du CaMV et indispensable pour la transmission, et P3, la protéine aidant à la fixation de P2 aux stylets des pucerons. (b) Lorsqu’un puceron vecteur atterrit sur une plante et insère ses stylets, la piqûre élicite (éclairs oranges) une réaction de défense de la plante et une réaction des VF et du TB. Cela induit un afflux de la tubuline (vert du TB) dans le TB qui se désintègre instantanément, et son contenu en P2 se relocalise sur les microtubules. Simultanément, les VF libèrent des virions. (c) Ceci aboutit en quelques secondes à la formation de réseaux mixtes sur les microtubules (traits fins verts) contenant la P2 (bandes rouges) et les virions. Ces complexes transmissibles sont alors répartis dans toute la cellule et facilement accessibles pour le puceron. (d) Le mécanisme présenté sur cette figure est réversible et, quelques minutes après de départ du puceron, la cellule infectée repasse de l’état « c » à l’état « a ».
Figure 3. Symptômes du TuMV sur navet (Brassica rapa). La feuille de gauche est infectée par le TuMV. Elle
1.2. Activation de la transmission
Une découverte récente du laboratoire d’accueil a mis en évidence que la transmission non-circulante n’est effectivement pas si simple. On a pu montrer pour la première fois, qu’un virus, en général, et dans ce cas particulier, un virus non-circulant, le Cauliflower mosaic virus (CaMV), est en mesure d'aider activement à sa transmission, comme le font bien d’autres pathogènes multicellulaires plus complexes (helminthes, toxoplasmes…) (Blanc et al., 2014 et Matthews, 2011). Il a été montré que ce virus utilise un facteur assistant qui répond à l’arrivée de son vecteur en formant, précisément au moment de la transmission, des formes spécifiques pour la transmission (figure 2). Les auteurs ont nommé ce phénomène "transmission activation (TA)" (Martinière et al., 2013). L’activation de la transmission correspond donc au passage de l’état où le virus n’est pas transmissible à l’état où il le devient, en présence de son vecteur. Ce résultat ouvre de nouveaux horizons de recherche en virologie. D’abord il serait intéressant d’étudier comment le CaMV perçoit via la plante hôte la présence des pucerons, et quels sont les mécanismes moléculaires derrière la formation des réseaux mixtes. Une autre question pertinente, d’intérêt encore plus générale, et qui correspond également à l'objectif principal de ce stage est : La TA est-elle utilisée par d’autres virus pour stimuler leur transmission ?
1.3. Le virus de la mosaïque du navet (TuMV)
Afin d’élargir ce phénomène de TA à d’autres virus, les travaux réalisés au cours de ce stage se sont focalisés sur le virus de la mosaïque du navet, Turnip mosaic virus (TuMV). Le choix s’est porté sur ce virus puisqu’il est transmis par les pucerons de manière non circulante et utilise la stratégie de transmission passant par un facteur assistant, tout comme le CaMV. De plus, le TuMV fait partie de la famille Potyviridae et appartient au genre Potyvirus comprenant environ 30% des virus de plantes connus, y compris de nombreux virus importants pour l’agriculture (Revers et García, 2015). Les plantes infectées présentent des symptômes tels que des lésions locales et chlorotiques, un rabougrissement, une mosaïque déformante jaune et verte sur les feuilles, des plissements ou encore de la rugosité (Agrios, 1997 et Shukla et al., 1994) (figure 3).
Figure 4. Représentation schématique du génome d’un Potyvirus (Revers et García, 2015). Le génome est
présenté par un rectangle horizontal. La VPg est représentée par un cercle noir à l’extrémité 5’ et la queue poly-A se situe à l’extrémité 3’. Le principal cadre de lecture de l’poly-ARN génomique code pour une polyprotéine. Les activités protéolytiques de la P1 (flèche courbée noire) et de Pro (flèche courbée blanche) libèrent P1 et HC-Pro de la polyprotéine. Toutes les autres protéines sont libérées par l’activité de la NIa (ensemble de flèches noires) et représentées par les rectangles supérieurs. Un second cadre de lecture (cadre +2) existe pour la protéine PIPO (rectangles inférieurs). Les fonctions pour chaque protéine sont également indiquées.
VPg : Viral genome linked Protein ; P1 : Protéase virale 1 ; HC-Pro : Helper Component Proteinase ; P3 : Protéase virale 3 ; PIPO : Pretty Interesting Potyviridae ORF ; 6K1 : protéine mature 1 de 6kDa ; CI :
Cylindrical Inclusion protein ; 6K2 : protéine mature 2 de 6kDa ; NIa : Nuclear Inclusion protein a ; NIb : Nuclear Inclusion protein b ; CP : Coat Protein ; poly A : queue polyadénylée
Figure 5. Représentation schématique des motifs de HC-Pro impliqués dans la transmission. Chaque rond
entier représente un acide aminé et les ronds en pointillés correspondent à une suite de plusieurs acides aminés. Les quatre cystéines en rouge pourraient former un motif en doigt de zinc. Le motif « KITC » de HC-Pro est nécessaire pour l’interaction avec les stylets et donc pour la transmission. Actuellement, sa liaison directe avec des récepteurs des stylets n’a pas été montrée. Le motif « PTK » interagit avec le motif « DAG » de la capside du Potyvirus.
Son virion est un filament flexible. Son ARN génomique d’environ 10000 pb est linéaire, monopartite (une seule molécule) et simple brin (sb) de sens positif (Revers et García, 2015). Le cycle d’infection des virus à ARN positif est décrit en annexe 1. Une petite protéine virale, la Viral genome linked Protein (VPg) est attachée à son extrémité 5’ et une queue polyadénylée l’est à son extrémité 3’. L’ARN génomique code pour une grande polyprotéine qui est clivée ultérieurement en dix protéines fonctionnelles (Wei et al., 2010 ) (figure 4) et pour une petite protéine, PIPO. Parmi ces protéines, figurent la Coat Protein (CP) qui compose la particule virale et la Helper Component Proteinase (HC-Pro). Ces deux protéines d’environ 37 kDa et 52 kDa ont leur importance dans la transmission par les pucerons : la CP car le virus est transmis sous la forme de particules virales et HC-Pro car elle correspond au facteur assistant. Effectivement, en plus de ses nombreuses autres fonctions (suppression du silencing, mouvement…), HC-Pro joue un rôle central dans la transmission par les pucerons, puisqu’elle lie le virion dans les stylets du vecteur. HC-Pro contient un motif « PTK » interagissant avec le motif « DAG » de CP. Cette interaction a été démontrée comme jouant un rôle indispensable dans la transmission du TuMV par les pucerons. De plus, HC-Pro dispose d’un motif conservé « KITC » qui est assumé être impliqué dans la liaison aux stylets des pucerons et d’un éventuel motif en doigt de zinc contenant quatre cystéines et conservé entre les Potyvirus (figure 5) (Blanc et al., 1998 ; Granier et al., 1993 et Seo et al., 2010). De façon générale la transmission des Potyvirus exige la formation d’un complexe transmissible, composé du virion et HC-Pro (figure 6). Actuellement, la localisation de ce complexe n’est pas connue. Il pourrait se former dans les cellules infectées, au moment de l’acquisition, ou dans les stylets du vecteur. De même, le phénomène de la TA pour le TuMV n’a pas été démontré.
L’objectif de ce stage était de tester si le phénomène de la TA existe pour le TuMV. Comment cela pourrait-il être testé ? Afin de répondre à cette question, les connaissances sur la TA du CaMV ont fait office de point de départ. Dans cet exemple, la piqûre d’un puceron dans une cellule constitue un stress mécanique (mouvement des stylets) ou chimique (par exemple un composé de la salive) qui induit la formation des réseaux mixtes (figure 2). Ceci implique que le stress induit par le puceron est perçu par la cellule végétale (événement de reconnaissance), qu’il y a une cascade de signalisation qui transporte l’information dans la cellule et possiblement vers d’autres cellules, et qu’il y a des événements en aval qui transforment
Figure 6. Schéma du complexe transmissible chez les Potyvirus. Avant ou au moment de la transmission du
virus, le motif « DAG » de la CP, qui forme la particule virale, et le motif « PTK » de HC-Pro interagissent pour former un complexe transmissible (Blanc et al., 1998). HC-Pro est reconnu par des récepteurs de la cuticule des stylets du puceron ce qui permet aux Potyvirus d’être véhiculés.
l’information en une réponse. Le laboratoire d’accueil dispose de résultats non publiés indiquant que la TA du CaMV requiert la signalisation calcique.
On suppose qu’au moins les premières étapes (reconnaissance et signalisation) sont en commun pour les virus qui utilisent la TA et qui sont transmis par les pucerons. Donc, en testant si la transmission du TuMV dépend de la signalisation calcique, comme la transmission du CaMV, ou peut être altérée par d’autres substances induites par des réponses rapides de la plante, la TA du TuMV pourrait être déterminée si elle existe. Seules les réponses rapides de la plante sont considérées puisque l’acquisition se fait très rapidement (de quelques secondes à quelques minutes). Comment ces réactifs pourraient activer la transmission ? Par exemple, ce changement pourrait induire des modifications post-traductionnelles de CP ou HC-Pro mais aussi, ces protéines pourraient interagir entre elles ou avec une autre protéine, et/ou être relocalisées, et/ou changer de conformation.
1.4. Les réponses de la plante à la présence du puceron
Le puceron et la plante se reconnaissent très vite, mais les événements qui y sont associés sont mal connus. En général, lors de la reconnaissance des insectes par la plante il peut être observé, dans les premières secondes, une dépolarisation de la membrane plasmique et l’influx de calcium dans le cytoplasme. Ces flux sont assumés être induits par la liaison des éliciteurs, appelés PAMPs pour pathogen-associated molecular patterns, à des protéines réceptrices transmembranaires, nommées PRR pour pattern recognition receptor (Monaghan et Zipfel, 2012). Actuellement, les PAMPs pour les pucerons ne sont pas connus. Cependant, la chitine ou des composants de la salive (protéines ou autres molécules) semblent être de bons candidats (Bruce, 2014 et Hogenhout et Bos, 2011). La reconnaissance des PAMPs par les PRR déclenche des voies de signalisations chez les plantes telles que des réponses calciques, active la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), notamment de peroxyde d’hydrogène (H2O2), des cascades MAPK kinases mais aussi, plus tardivement, des
réponses hormonales telles que la production d’acide jasmonique, d’acide salicylique ou d’éthylène (Apostol et al., 1989, Nicaise, 2014 et Tena et al., 2011). La plupart de ces réponses a été démontrée pour un grand nombre d’agents phytopathogènes dont les insectes herbivores (Arimura et Maffei, 2010). Cependant, le manque d’expérimentations de ces phénomènes sur les pucerons ne permet pas d’affirmer que les mêmes mécanismes se produisent lorsqu’ils infectent les plantes.
Figure 7. Effet des différents réactifs sur la transmission du TuMV à partir de protoplastes.
L’histogramme fait l’objet d’une expérience représentative sur trois pour chaque condition, provenant des valeurs brutes de l’annexe 2. Les différentes conditions sont indiquées par les couples de colonnes de même couleur. Les protoplastes ont été incubés avec les différents réactifs indiqués, puis les pucerons se sont nourris des protoplastes avant d’être placés sur des plantes tests pour l’inoculation. Les taux de transmission ont été déterminés trois semaines plus tard. Contrôle = protoplastes infectés par le TuMV, non traités ; H2O2 = traités
avec 2mM de H2O2 pendant cinq minutes ; LaCl3 = traités avec 1mM de LaCl3 pendant cinq minutes ; chitine =
traités avec 0,4g/L de chitine pendant cinq minutes. Les barres indiquent le pourcentage d’erreur et la présence du symbole « * » montre une différence significative entre les protoplastes traités et non traités, selon le test ANOVA.
Figure 8. Taux de viabilité des protoplastes infectés par le TuMV incubés ou non avec les différents réactifs. L’histogramme fait l’objet d’une expérience représentative sur trois pour chaque condition, provenant
des valeurs brutes de l’annexe 3. Les différentes conditions sont indiquées par les couples de colonnes de même couleur. Les protoplastes ont été incubés avec les différents réactifs indiqués, puis utilisés en tests de transmission et leur viabilité a été déterminée par le test FDA.Contrôle = protoplastes infectés par le TuMV, non traités ; H2O2 = traités avec 2mM de H2O2 pendant cinq minutes ; LaCl3 = traités avec 1mM de LaCl3 pendant
cinq minutes ; chitine = traités avec 0,4g/L de chitine pendant cinq minutes. Les barres indiquent le pourcentage d’erreur et la présence du symbole « * » montre une différence significative entre les protoplastes traités et non traités, selon le test ANOVA.
2. Résultats
2.1. Tests de transmission et viabilité
2.1.1. Tests de transmission à partir de protoplastes
L’acquisition du TuMV par les pucerons se fait en quelques secondes. De ce fait, s’il y a TA, elle requiert des voies de signalisations rapides comme le calcium et les ROS. Des suspensions de protoplastes infectés par le TuMV ont donc été ou non incubées avec H2O2 (un
ROS) ou du LaCl3 (inhibiteur des canaux calciques) avant de les utiliser dans des tests de
transmission par les pucerons. Comme le montrent la figure 7 et l’annexe 2, la présence de H2O2 a fortement augmenté la transmission du TuMV, contrairement à celle du LaCl3 qui a
réduit sa transmission. Ces résultats suggèrent que la transmission du TuMV peut être activée et que les voies de signalisations par des ROS et le calcium y sont impliquées. Puis, la chitine, un candidat pour un PAMP, a été testée. Aucun effet n’a été trouvé (figure 7 et annexe 2). Donc, la chitine ne contribue probablement pas à la transmission du TuMV par les pucerons.
2.1.2. Viabilité des protoplastes
Ce test a été réalisé pour vérifier que les différents réactifs n’ont pas biaisé les résultats des tests de transmission par un taux de viabilité plus ou moins élevé, puisqu’il a été rapporté que l’acquisition du TuMV dépend des cellules vivantes (Martinière et al., 2011). Les taux de viabilité des protoplastes n’étaient pas significativement différents pour les différentes conditions (figure 8 et annexe 3). Cependant, pour une répétition de test de transmission avec du LaCl3, la viabilité des protoplastes en contact avec ce réactif était légèrement supérieure au
contrôle (annexe 3). Comme le résultat de ce test a montré que malgré une viabilité supérieure des protoplastes incubés avec le LaCl3, le taux de transmission était inférieur aux contrôles
(annexe 2), cette différence de viabilité n’a pas biaisé les résultats du test de transmission. Les protoplastes incubés avec la chitine avaient des taux de viabilité supérieurs aux contrôles, sans que la chitine ait augmenté la transmission. Il n’y a pas d’explication évidente pour ce résultat. Cependant, des hypothèses peuvent être émises : il ne faut qu’un certain seuil de protoplastes vivants pour permettre la transmission, ou la présence de chitine a eu un effet amenant les pucerons à moins piquer, et en dépit d’une activation de la transmission dans ces cellules, le comportement altéré (moins de piqûres) des pucerons a empêché de voir cet effet.
Figure 9. Effet des différents réactifs sur la transmission du TuMV à partir d’extraits cellulaires.
L’histogramme fait l’objet d’une expérience représentative sur deux pour chaque condition, provenant des valeurs brutes de l’annexe 4. Les différentes conditions sont indiquées par les couples de colonnes de même couleur. Les extraits cellulaires ont été incubés avec les différents réactifs indiqués, puis les pucerons se sont nourris des ces extraits avant d’être placés sur des plantes tests pour l’inoculation. Les taux de transmission ont été déterminés trois semaines plus tard. Contrôle = protoplastes infectés par le TuMV, non traités ; H2O2 = traités
avec 2mM de H2O2 pendant cinq minutes ; LaCl3 = traités avec 1mM de LaCl3 pendant cinq minutes. Les barres
indiquent le pourcentage d’erreur. Des tests statistiques ANOVA ont été réalisés mais aucune différence significative n’a été observée.
Figure 10. Effet de différents mutants sur la transmission du TuMV à partir de feuilles. L’histogramme
présente une seule expérience pour chaque contrôle et mutant, représentée par des couples de colonnes de même couleur. Les valeurs brutes sont issues de l’annexe 5. Les taux de transmission ont été déterminés trois semaines après les tests de transmission. Col0 = feuilles sauvages infectées par le TuMV ; rbohD/F = feuilles mutantes hétérozygotes non fonctionnelles sur rbohD et homozygotes non fonctionnelles sur rbohF infectées par le TuMV ; rbohD = feuilles mutantes homozygotes non fonctionnelles sur rbohD infectées par le TuMV. Les barres indiquent le pourcentage d’erreur et la présence du symbole « * » montre une différence significative entre les protoplastes traités et non traités, selon le test ANOVA.
2.1.3. Tests de transmission à partir d’extraits cellulaires
Afin de montrer que l’effet de H2O2 et LaCl3 sur la transmission est biologique et non
chimique (artefact), des protoplastes ont été lysés dans le tampon SAKO, adapté pour l’acquisition du TuMV à partir d’extrait cellulaires. Ensuite, des tests de transmission ont été fait en présence ou absence de H2O2 ou de LaCl3 dans les extraits cellulaires sur lesquels les
pucerons pourront acquérir le TuMV. Aucune différence significative de taux de transmission n’a été observée entre un extrait cellulaire non traité et un extrait traité avec H2O2 ou LaCl3
(figure 9 et annexe 4). Il n’y a donc pas d’effet direct (chimique) de H2O2 et LaCl3 sur la
transmission du TuMV. Pour qu’elle puisse se faire, il est nécessaire d’avoir la présence d’un contexte cellulaire (biologique).
2.1.4. Tests de transmission à partir de feuilles
La présence de ROS dans les suspensions de protoplastes a augmenté la transmission. La transmission du TuMV a donc été testée à partir de feuilles entières issues de plantes d’A. thaliana mutées dans des gènes intervenants dans la synthèse de ROS : un mutant non fonctionnel homozygote pour rbohD et un double mutant hétérozygote non fonctionnel pour rbohD et homozygote non fonctionnel pour rbohF. Le double-mutant a engendré un taux de transmission plus faible (figure 10 et annexe 5). En revanche, le simple mutant rbohD n’a pas montré une baisse de la transmission (figure 10 et annexe 5). Puisque rbohD n’a pas d’effet sur la transmission à partir du simple mutant homozygote et qu’il n’est présent dans le double mutant que sous forme hétérozygote, ces résultats indiquent que la présence d’au moins RBOHF, et donc la production conforme de ROS, permet au TuMV d’être mieux transmis par les pucerons.
2.2. Immunomarquage
La TA du CaMV est caractérisée par un réarrangement de P2 et des virions vers les microtubules. Une expérience d’immunomarquage sur des protoplastes infectés par le TuMV a donc été réalisée pour déterminer si la TA observée dans les tests de transmission corrélait avec une relocalisation de HC-Pro et/ou de CP. Des protoplastes ont donc été traités avec H2O2 ou LaCl3 puis immunomarqués pour HC-Pro et CP. Dans les cellules non traitées, les
Figure 11. Immunomarquage de protoplastes de navets infectés par le TuMV. Des protoplastes ont été fixés
et immunomarqués pour HC-Pro (fluorescence en vert A, D, G) et CP (fluorescence en rouge B, E, H). C, F et I montrent les superpositions des marquages de HC-Pro et CP. (A à C) les protoplastes n’ont pas été traités. (D à F) les protoplastes ont été traités avec 2mM de H2O2 pendant quinze minutes. (G à I) les protoplastes ont été
traités avec 1mM de LaCl3 pendant quinze minutes. Des protoplastes infectés par le TuMV ont également été
marqués avec les anticorps primaires seuls ou les anticorps secondaires seuls, et des protoplastes sains ont été marqués avec les anticorps primaires et secondaires. Ces trois témoins négatifs, non présentés sur la figure, ne montrent aucune fluorescence, ce qui indique la spécificité des marquages. Echelle : 50µm.
avec H2O2 ou LaCl3 n’a pas changé la localisation de ces deux protéines qui se trouvaient
toujours reparties de manière homogène dans tout le cytoplasme (figure 11). L’activation de la transmission du TuMV ne se traduit donc pas par un réarrangement visible par immunomarquage de HC-Pro et/ou CP dans les protoplastes.
2.3. Western blot
2.3.1. Effet de traitements mimant des réponses rapides de la plante
La TA du TuMV n’étant pas corrélée avec un réarrangement de HC-Pro et/ou de CP, des modifications post-traductionnelles de ces protéines, pouvant correspondre à la TA, ont donc été recherchées. Pour les mettre en évidence, des Western blot ont été réalisés dans le but de révéler des changements de HC-Pro et ou de CP après traitement des protoplastes infectés. Dans un premier temps, les échantillons des protoplastes ont été préparés pour les Western blot avec du tampon Laemmli contenant du ß-mercaptoéthanol (agent réducteur). Lorsque les protoplastes ne sont pas traités, ou sont traités avec H2O2, LaCl3 ou de la chitine, les mêmes
bandes correspondant à la taille de HC-Pro entier et des bandes mineures sont observées après révélation de cette protéine en Western blot avec un HC-Pro antisérum (figure 12A). Aucun changement de migration de HC-Pro n’est donc induit par l’un des traitements. De même, après révélation de la CP sur les membranes, la bande correspondant à sa taille ne varie pas en fonction des traitements (figure 12B).
Tenant compte de ces résultats et du fait que HC-Pro contient beaucoup de cystéines qui pourraient former des ponts disulfures, les échantillons ont donc été préparés à partir de suspensions de protoplastes infectés par le TuMV mais avec du Laemmli ne contenant pas l’agent réducteur ß-mercaptoéthanol. Dans ces conditions, en plus de la bande majeure à 52 kDa, correspondant au monomère de HC-Pro, des bandes plus hautes et plus faibles, correspondant au dimère et certainement à un autre oligomère de HC-Pro sont observées après révélation de HC-Pro sur les membranes (figure 12C). Ces oligomères de HC-Pro ont déjà été rapportés (Thornbury et al., 1985, Plisson et al., 2003 et Ruiz-Ferer et al., 2005).
Avec la même préparation d’échantillons (sans ß-mercaptoéthanol), l’ajout de H2O2 dans les
protoplastes a provoqué l’apparition, ou l’augmentation, des bandes dimériques, trimériques et d’un autre oligomère de HC-Pro (figure 12C). En revanche, l’ajout de LaCl3 inhibe
totalement l’apparition des formes oligomériques de HC-Pro (figure 12C). Le traitement avec la chitine n’a pas eu d’effets (figure 12C).
Figure 12. Effet des différents traitements des protoplastes sur l’oligomérisation de HC-Pro et de la CP.
(A et B) Des protoplastes infectés par le TuMV ont été traités comme indiqué, puis analysés par Western blot après SDS-PAGE pour HC-Pro (A) et CP (B). Les échantillons ont été préparés dans un tampon contenant du β-mercaptoéthanol. (1) sans traitement ; (2-4) traitement avec (2) 2mM de H2O2 pendant quinze minutes ; (3) 1mM
de LaCl3 pendant vingt minutes ; (4) 0,4g/L de chitine pendant quinze minutes. (C à E) Analyse, par Western
blot après SDS-PAGE, des protoplastes infectés par le TuMV pour HC-Pro (C et E) et CP (D). Les échantillons ont été préparés dans un tampon ne contenant pas de β-mercaptoéthanol. (1) sans traitement ; (2-8) traitement avec (2) 2mM de H2O2 pendant quinze minutes ; (3) 1mM de LaCl3 pendant vingt minutes ; (4) 0,4g/L de chitine
pendant quinze minutes ; (5) double traitement avec H2O2 et LaCl3, ajoutés au même moment ; (6) double
traitement avec H2O2 et chitine, ajoutés au même moment ; (7) double traitement avec chitine et LaCl3, ajoutés
au même moment ; (8) triple traitement avec H2O2, LaCl3 et chitine, ajoutés au même moment. (E) Des
protoplastes ont été traités avec 2mM de diamide pendant quinze minutes (2), ou non traités (1), puis révélés pour HC-Pro comme pour (A et C).
M = marqueur de masse moléculaire (PageRuler de 10kDa à 170kDa) ; S = sans traitement, sur protoplastes sains ; * = qui pourrait correspondre à un oligomère non défini de HC-Pro ; TC = Témoin de Charge par Bleu de Coomassie (RUBISCO).
En combinant simultanément les traitements chitine et H2O2, l’effet induit par le traitement
H2O2 seul est retrouvé. De même, lorsque les traitements chitine et LaCl3 sont combinés,
l’effet induit par le traitement LaCl3 seul est retrouvé (figure 12C). En revanche, lorsque les
traitements H2O2 et LaCl3, ou H2O2, LaCl3 et chitine sont combinés en même temps, un état
intermédiaire est constaté présentant la forme monomérique de HC-Pro ainsi que ses formes oligomériques (dimère, trimère et un autre oligomère) (figure 12C).
Ces traitements n’ont pas eu d’impacts sur la migration de la CP lorsque les échantillons ont été préparés dans un tampon ne contenant pas de β-mercaptoéthanol (figure 12D).
Afin de confirmer que la présence d’agents oxydants, et pas seulement celle de H2O2, induit
des oligomères de HC-Pro, le diamide a été testé dans les mêmes conditions que le traitement H2O2. Les mêmes bandes oligomériques de HC-Pro ont été observées avec le traitement
diamide qu’avec le traitement H2O2 (figure 12E). La présence d’agents oxydants favorise
donc la formation d’oligomères de HC-Pro.
L’effet de H2O2, du diamide et de LaCl3 a été mieux caractérisé. En effet, des cinétiques de
l’apparition des oligomères de HC-Pro ainsi que des concentrations suffisantes en H2O2 et
diamide, pour induire les oligomères de HC-Pro, ont été déterminées (annexe 6). Les annexes 6A et 6C montrent que des oligomères de HC-Pro sont détectables dès cinq secondes d’incubation en présence de H2O2 ou de diamide. De même, les bandes oligomériques de
HC-Pro pour l’échantillon non traité disparaissent dès cinq secondes d’incubation en présence de LaCl3 (annexe 6E). De plus, la cinétique de traitement avec LaCl3 montre que la bande
oligomérique de HC-Pro commence à réapparaitre après trente minutes de traitement (annexe 6E). L’action du LaCl3 a donc inhibé les formes oligomériques de HC-Pro de manière
transitoire. Pour les concentrations, 0,25mM de H2O2 et 0,5mM de diamide sont suffisants
pour l’induction des oligomères (annexe 6B et 6C). La figure 12 et l’annexe 5 présentent également des bandes sous celle correspondant à la taille du monomère de HC-Pro. Aucune information, ni hypothèse, ne permet d’identifier à quoi elles correspondent, mais il pourrait s’agir de produits de dégradation de HC-Pro ou de formes clivées. Ces résultats démontrent que l’apparition des formes monomériques et oligomériques de HC-Pro en Western blot corrèle avec l’activation de la transmission du TuMV par les pucerons.
2.3.2. Caractérisation de l’oligomérisation de HC-Pro
La réversibilité de la formation des oligomères de HC-Pro, produits par H2O2 ou le diamide, a
été testée, puisqu’elle pourrait indiquer si la TA du TuMV est ou non réversible, comme cela a déjà été montré pour le CaMV. Pour ce faire, des protoplastes ont été incubés avec ces
Figure 13. L’oligomérisation de HC-Pro est réversible et dépend des ponts disulfures. Des protoplastes
infectés par le TuMV ont été soumis aux traitements indiqués, puis la présence des oligomères de HC-Pro a été analysée par SDS-PAGE / Western blot. Les échantillons ont été préparés dans un tampon ne contenant pas de β-mercaptoéthanol. (A) Réversion de l’oligomérisation de HC-Pro. Des oligomères de HC-Pro ont été induits par traitement pendant cinq minutes avec 2mM de H2O2 ou de diamide, puis les protoplastes ont été rincés par
centrifugation pour enlever le réactif. Après une à deux heures sous agitation, les protoplastes ont été analysés pour contrôler les formes de HC-Pro. (1) sans traitement ; (2) traitement avec diamide ; (3) réversion ; (4) traitement avec H2O2 ; (5) réversion. (B) Effet du DTT sur HC-Pro. 5mM de DTT ont été ajoutés aux
protoplastes, pendant vingt minutes, après que les protoplastes aient été incubés dans les différents traitements. (1) 2mM de H2O2 pendant cinq minutes ; (2) ajout du DTT après le traitement H2O2 ; (3) sans traitement ; (4)
2mM de diamide pendant cinq minutes ; (5) ajout du DTT après le traitement diamide.
M = marqueur de masse moléculaire (PageRuler de 10kDa à 170kDa) ; S = sans traitement, sur protoplastes sains ; * = qui pourrait correspondre à un oligomère non défini de HC-Pro ; TC = Témoin de Charge par Bleu de Coomassie (RUBISCO).
réactifs et l’apparition des oligomères a été vérifiée par Western blot. Ensuite, les deux réactifs ont été enlevés du milieu et les protoplastes ont été analysés une à deux heures après. La figure 13A montre que les formes oligomériques de HC-Pro ont disparu au profit des monomères. La formation des oligomères est donc un processus réversible.
Parfois, des ponts disulfures intermoléculaires sont impliqués dans la formation des oligomères des protéines. Pour tester, si c’est aussi le cas pour HC-Pro, des protoplastes infectés par le TuMV ont tout d’abord été traités avec H2O2 ou du diamide, pour induire les
formes oligomériques de HC-Pro. Ensuite, du DTT (un agent réducteur qui détruit les ponts disulfures) a été ajouté. Sous cette condition, seule la forme monomérique de HC-Pro a été détectée (figure 13B). Ce résultat signifie que les HC-Pro sont reliés entre eux par des ponts disulfures, formant ainsi les différents oligomères. La bande du monomère de HC-Pro observée sous conditions réductrices est légèrement plus haute sur la membrane que celle observée sous conditions non réductrices. Cette différence peut s’expliquer par la présence des ponts disulfures intramoléculaires qui seraient réduits par le DTT.
3. Discussion
3.1. H2O2 augmente la transmission du TuMV
D’après les résultats obtenus en tests de transmission, la présence de H2O2 améliore nettement
la transmission du TuMV par les pucerons. Cet effet a été observé en tests de transmission à partir de protoplastes et conforté par des tests de transmission de plante à plante, donc sous des conditions plus naturelles que le système protoplaste. De plante à plante, la transmission du TuMV a été testée en utilisant un mutant d’A. thaliana perturbé dans la production de ROS puisque héterozygote pour un allèle non fonctionnel de rbohD et homozygote pour un allèle non fonctionnel du rbohF. Les gènes RBOH codent pour des NADPH oxydases qui produisent des ROS dans l’apoplaste. La transmission à partir des plantes mutées est significativement moins importante par rapport aux plantes sauvages.
Un phénotype de la transmission a donc été recherché pour comprendre comment H2O2 active
la transmission du TuMV. En immunofluorescence, HC-Pro et la CP colocalisent dans le cytoplasme qu’il y ait, ou non, incubation des protoplastes avec H2O2. Donc, une
l’activation de la transmission du TuMV. En revanche, la visualisation de HC-Pro, à partir d’échantillons préparés dans un tampon ne contenant pas de β-mercaptoéthanol, par la technique SDS-Page / Western blot indique que HC-Pro forme beaucoup plus d’oligomères dans les cellules exposées au réactif H2O2 que dans les cellules témoin. L’utilisation d’un
autre ROS, le diamide, amène aux mêmes observations. De plus, l’incubation avec du DTT après l’induction des oligomères de HC-Pro nous apprend que ces derniers sont reliés entre eux par des ponts disulfures. Il a été démontré que les ponts disulfures intermoléculaires peuvent changer la structure et donc la fonction d'une protéine (Fan et al., 2009). De ce fait, les formes oligomériques oxydées de HC-Pro pourraient jouer un rôle spécifique à la transmission, et la forme réduite pourrait jouer d’autres rôles dans le cycle viral.
L’effet de H2O2 est biologique et nécessite des cellules intactes et vivantes, puisqu’il n’exerce
aucun effet significatif sur la transmission à partir d’extraits cellulaires. H2O2 n’agit donc pas
directement sur HC-Pro mais s’accumule dans le cytoplasme, ce qui provoquerait des réactions d’oxydoréduction et induirait de manière indirecte l’activation de la transmission du TuMV par l’oligomérisation de HC-Pro.
3.2. L’inhibition des canaux calciques diminue la transmission du TuMV
L’inhibition des flux calciques par un bloqueur des canaux calciques, le LaCl3, dans les
protoplastes est en corrélation avec une diminution de la transmission du TuMV par les pucerons. De plus, la visualisation de HC-Pro par la technique SDS-Page / Western blot, indique que HC-Pro ne forme plus d’oligomères.
Ces deux résultats suggèrent que la signalisation calcique détient également un rôle important dans la transmission du TuMV par les pucerons, toujours lié à la formation d’oligomères de HC-Pro. Comme pour H2O2, l’effet du LaCl3 est biologique et dépend des cellules vivantes,
puisqu’il n’est plus observé lorsque les pucerons transmettent le TuMV à partir d’extraits cellulaires.
3.3. Hypothèse : les formes oligomériques de HC-Pro sont formées par des réactions d’oxydoréduction
Les résultats montrent que le calcium et H2O2 sont impliqués dans la transmission du TuMV.
Ces deux réactifs sont des messagers secondaires impliqués dans la signalisation. Comment pourraient-ils agir sur la transmission du TuMV ?
F ig ure 14 . M odèle de l’ act iv at io n de la t ra ns m is sio n d u T u M V pa r le p ucer on. Un p u ce ro n in g èr e d e la n o u rr itu re su r u n e feu ille in fec tée p ar le T u MV , rep résen tée av ec d es c o n to u rs r o u g es. Au m o m en t o ù le p u ce ro n in tr o d u it ses s ty lets au tr av er s d e la p ar o i c ellu lair e, d es m éc an is m es d e d éf en ses d e la p lan te se m etten t e n p lace . L a pr em ièr e étap e ser ait la rec on naiss an ce d ’u n éliciteu r du p uce ro n par u ne pr otéin e réc ep tr ice per m ettan t ain si l’ ou ver tu re de s ca n au x ca lciq u es (cy lin d re ro se) . Il s lais ser aien t alo rs en tr er le ca lciu m d an s le cy to p lasme , ce q u i in d u ir ait la p ro d u ctio n d e R OS, p eu t-êtr e v ia les p ro téin es R b o h . L a p résen ce d e ce s R OS d an s le cy to plasme m od if ie (éc lair jau ne) s on p oten tiel d’ ox yd or éd uctio n. C ela gén èr e des éc han ges d’ élec tr o n s av ec HC -Pro ( ro n d s b leu s) d u T u MV ( tr ait n oir e) . E n l’ ab sen ce d e R OS, HC -Pro e st m ajo rita ir em en t so us s a fo rm e réd uite. Ma is , au m om en t où les R OS on t m od if ié le po ten tiel d’ ox yd or éd uctio n du cy to pl as m e, d es éc h an g es d’ élec tr on s on t lieu av ec les gr ou pe m en ts th io ls ( -SH) d es cy stéin es d e HC -Pro . C ette o x y d atio n g én èr e d es p o n ts d is u lf u res in ter m o lécu lair es (d o u b le b ar re en r o u g e) en tr e les HC -Pro . Ain si, la p ro téin e se retr o u v e m ajo ritair em en t so u s ses fo rm es o lig o m ér iq u es, in ter v en an t d an s la tr an sm is si o n , p eu t-êtr e p ar u n ch an g em en t d e la co n fo rm atio n d e la p ro téin e ca us ée p ar les po nts d is ulf ur es . L e vir us est do nc, ap rès ce tte étap e de l’ ac tiv atio n de la tr an sm is sio n, ac qu is d av an tag e par le p u ce ro n , rep résen té av ec d es co nto ur s ro ug es. Ap rès le dép ar t du v ec teu r, le po ten tiel d’ ox yd or éd uctio n du cy to plasme p ou rr ait r ev en ir au x v aleu rs n o rm ales , HC -Pro p o u rr ait êtr e réd u it e t r ev ien d rait à sa co n fo rm atio n h ab itu elle, co m p atib les av ec s es a u tr es f o n ctio n s d an s le cy cle v ir al.
D’après la littérature, la signalisation calcique et la production de ROS font partis des premières réponses de la plante en réponse à l’attaque d’un agent pathogène (Alvarez et al., 1998). De plus, il a été montré que les flux calciques réguleraient la production de ROS via certaines NADPH oxydases (Kobayashi et al., 2007). De ce fait, l’identification d’un agent pathogène, ici du puceron, par la plante, provoquerait à l’intérieur des cellules végétales des flux calciques qui contribueraient à la production de ROS. L’accumulation de ROS dans le cytoplasme des cellules végétales modifie son potentiel d’oxydoréduction et provoque des échanges d’électrons (Fleury et al., 2002 et Ueda et al., 2002). HC-Pro, étant localisé dans le cytoplasme, est sujet à ces échanges d’électrons. De même, HC-Pro contient une dizaine de cystéines dans sa séquence et cet acide aminé contient un groupement –SH pouvant, par des échanges d’électrons, s’oxyder pour former un pont disulfure avec un autre groupement –SH (Guo et al., 2011 et Robaglia et al., 1989). Ainsi, HC-Pro est capable de se lier avec un ou plusieurs autre(s) HC-Pro et donc de former des oligomères (Thornbury et al., 1985 et Plisson et al., 2003). Cette forme oligomérique et oxydée de HC-Pro serait celle impliquée dans la transmission. La figure 14 résume un modèle de l’activation de la transmission du TuMV, engendrée par la présence de son vecteur, le puceron. Maintenant, il faut comprendre comment l’oligomérisation de HC-Pro active la transmission du TuMV par les pucerons, mais par exemple on peut supposer que son oxydation change sa conformation et le rend capable d’interagir avec le virion ou les récepteurs des stylets des pucerons.
3.4. Perspectives
Les résultats ont montré que LaCl3 inhibe, probablement en bloquant l’entrée du calcium, la
transmission du TuMV par les pucerons. Des expériences complémentaires sont nécessaires pour valider l’effet du LaCl3 et montrer que c’est vraiment le calcium qui est à la base de
l’effet. Par exemple, du calcium, avec un ionophore pour le calcium, permettant de forcer son entré dans le cytoplasme, pourraient être directement ajoutés dans les suspensions de protoplastes pour vérifier si la transmission par les pucerons reste inchangée ou augmente. L’expérience contraire est aussi possible : en enlevant le calcium du milieu, la transmission devrait pouvoir être inhibée. En parallèle, des Western blot pourraient être réalisés afin de déterminer si la présence/absence de calcium induit ou non l’oligomérisation de HC-Pro.
Le système protoplaste mime un contexte cellulaire mais il n’est pas totalement conforme aux conditions naturelles. En effet, les cellules sont dépourvues de leur paroi et ne sont plus en contexte tissulaire. Elles ne peuvent donc plus communiquer via les plasmodesmes. Pour se rapprocher davantage des conditions réelles, des expériences avec des feuilles, voir des plantes entières, seraient nécessaires. Dans ce stage, des essais ont été réalisés sur des bouts de feuilles façonnés par un emporte-pièce, de manière à obtenir la même surface de feuille pour chaque échantillon (à la place des suspensions de protoplastes). Cependant, le façonnage a induit des stress sur les échantillons, ce qui a conduit à la formation de formes oligomériques de HC-Pro dans tous les échantillons, y compris dans les échantillons témoins, qui n’ont pourtant pas été en contact avec un réactif. Même en laissant reposer les bouts de feuilles plusieurs heures dans l’eau pour récupérer du stress, les formes oligomériques de HC-Pro sont toujours visibles par Western blot. Il serait intéressent d’améliorer cette technique et de pouvoir visualiser si l’on observe les mêmes résultats sur des bouts de feuilles entiers que sur des protoplastes.
Les tests de transmission à partir de feuilles du simple mutant d’A. thaliana rbohD ou du double mutant rbohD et rbohF n’ayant été réalisés qu’une seule fois, les expériences doivent être réitérées afin de valider le rôle de ces deux NADPH oxydases dans la mise en place du phénotype d’activation de la transmission du TuMV. D’autres plantes mutées sur des oxydases différentes peuvent également être testées en tests de transmission pour déterminer celles qui contribuent à l’augmentation de la transmission du TuMV par les pucerons.
Une fois que l’implication de la signalisation calcique, des ROS et du contexte cellulaire dans l’activation de la transmission du TuMV par les pucerons sera bien confirmée, il serait intéressent de suivre en temps réel les variations du potentiel d’oxydoréduction entre des protoplastes ou des tissus incubés ou non avec H2O2 ou LaCl3 et entre des protoplastes étant
en contact ou non avec des pucerons. Il serait également intéressant de savoir si l’infection par le TuMV influence déjà le potentiel d’oxydoréduction. Ces expériences seront possibles en mesurant, par fluorescence ratiométrique, les concentrations intracellulaires du couple GSSG (forme oxydée du glutathion) / GSH (forme réduite du glutathion), correspondant au principal couple responsable de la force réductrice du potentiel d’oxydoréduction (Meyer et al., 2001 et Schafer et Buettner, 2001). Une autre technique permet de mesurer le potentiel d’oxydoréduction in vivo, toujours à partir du glutathion. Il s’agit d’utiliser des plantes
Figure 15. Principe et étapes du Duolink (Trifilieff et al., 2011). Le principe de cette méthode repose sur
l'utilisation d'anticorps primaires d'espèces différentes dirigés contre des protéines d'intérêts. (a) Tout d’abord, les anticorps primaires se fixent sur les protéines d'intérêts. (b) Ensuite, les anticorps secondaires, couplés chacun à un autre oligonucléotide formant ensemble les sondes PLA (Proximity Ligation Assay), reconnaissent les anticorps primaires. Le signal n’est généré que lorsque les deux sondes PLA sont fixées à proximité l’une de l’autre (<16nm). Cela permet la ligation des queues ADN, qui forment un cercle via l’action d’une ligase. (c) Puis, ce cercle est amplifié à l’aide d’une polymérase. (d) Après la réaction d’amplification, la réplication en grandes quantités du cercle d’ADN, reconnu par les sondes fluorescentes, met en évidence le produit. L'association peut alors être visualisée sous la forme d’une tache fluorescente par microscopie (figure 16).
Figure 16. Mise en évidence de l’interaction tubuline / P2 par la méthode du Duolink. Photo prise par Marie
Ducousso en microscopie confocale. L’interaction a été détectée sur des protoplastes de navets infectés par le CaMV à l’aide des anticorps primaires α-tubuline (souris) et α-P2 (lapin) et des anticorps secondaires (sondes PLA) souris (+) et lapin (-). Les chloroplastes des protoplastes sont représentés en gris, les noyaux en bleu (DAPI) et l’association des deux protéines en vert. Echelle : 40µm.
transgéniques GRX1-roGFP2 (human glutaredoxin 1 et Green Fluorescent Protein). Ces plantes sont donc sensibles aux variations du potentiel d’oxydoréduction et lorsque celui-ci change, la fluorescence verte émise par la GFP change aussi. Ainsi, le potentiel d’oxydoréduction peut être mesuré par radiométrie (Aller et al., 2013).
Aussi, il serait intéressant de localiser où les ponts disulfures se forment dans HC-Pro. Pour ce faire, HC-Pro, comportant de nombreuses cystéines dont quatre formeraient un motif en doigt de zinc, pourrait en être délété, soit dans le contexte viral, soit sur HC-Pro seul, dans le cas où les mutations rendent le virus non-infectieux. Ensuite, des plantes seraient infectées avec les virus mutés ou des plasmides codants pour des protéines HC-Pro modifiées seraient agroinfiltrés sur des feuilles de tabac. Puis, des protoplastes purifiés de ces plantes seraient, après incubation avec H2O2, analysés par Western blot pour détecter la présence des
oligomères de HC-Pro. Cela nécessite, pour HC-Pro exprimé hors contexte viral, de vérifier qu’il est toujours capable de former des oligomères en présence de H2O2 et pour les virus
mutés, que la délétion d’acides aminés dans HC-Pro les conserve infectieux. Puis, les mêmes protoplastes pourraient être utilisés pour la réalisation de tests de transmission du TuMV par les pucerons. Pour HC-Pro exprimé hors contexte viral, cela nécessite des tests d’acquisition séquentielle avec d’abord HC-Pro, puis les virions. La lecture de ces tests montrera si le TuMV est aussi bien transmis avec ou sans ces modifications. De même, en fonction de l’orientation du sujet de recherches, d’autres domaines pourraient faire l’objet de délétion et ces modifications seraient aussi testées en tests de transmission par les pucerons.
Pour finir, la localisation de la formation des complexes transmissibles n’est toujours pas définie (dans les plantes, dans les stylets des pucerons, ou dans les deux ?). Pour vérifier si des complexes transmissibles se forment directement dans les plantes et nécessitent la présence des formes oligomériques de HC-Pro, des protoplastes infectés par le TuMV, traités ou non avec H2O2, seraient analysés par Duolink (Inaba et al., 2011). Cette technique permet
de visualiser des interactions protéine-protéine in situ (figures 15 et 16). Alternativement, les complexes transmissibles pourraient se former dans les stylets des pucerons et pourraient certainement être détectés par la même technique dans les stylets.
Pour conclure, ces résultats montrent pour la première fois, qu’un virus autre que le CaMV utilise l’activation de la transmission et contribue ainsi à sa transmission. Ces nouvelles
avancées dans la caractérisation de la transmission du TuMV par les pucerons aideront à comprendre comment fonctionne la transmission du genre Potyvirus. De plus, le fait qu’un virus non apparenté au CaMV active également sa transmission suggère que l’activation de la transmission virale est un phénomène général. De ce fait, les recherches sur l’activation de la transmission pourront contribuer au développement de nouvelles stratégies pour lutter contre les maladies induites par ce mode de propagation.
4. Matériels et méthodes
4.1. Matériel biologique
4.1.1. Arabidopsis thaliana et Brassica rapa
Les plantes d’Arabidopsis thaliana (A. thaliana) utilisées sont de l’écotype Col0 sauvage, ou mutées sur une NADPH oxydase (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase), rbohD (homozygote) (Respiratory burst oxidase homolog protein D) ou sur les NADPH oxydases rbohD (hétérozygote) et rbohF (homozygote) (Respiratory burst oxidase homolog protein F) (Torres et al., 2002) dans le fond Col0, de façon à ce qu’ils soient non fonctionnels. La variété des plantes de navet Brassica rapa (B. rapa) utilisée est Just Right F1. Toutes les plantes sont semées en serre, selon les règles de confinement S2, et en jours longs (douze à quinze heures de jour entre 23 et 25°C, et 15°C la nuit). Les cinq premiers jours, les semis sont sous cloche puis à sept jours, au stade cotylédons, les plantes sont repiquées et conservées toujours sous serre. Les plantes d’A. thaliana sont placées en jours courts (huit heures de jour à 20°C et 17°C la nuit) tandis que les plants de B. rapa restent en jours longs. Le terreau sur lequel les deux espèces végétales ont été cultivées est le Humin-Substrat N2 Neuhaus (NPK 14/10/18 1,5kg/m3) de pH 5,8.
4.1.2. Myzus persicae
Le puceron choisi pour la réalisation des tests de transmission est Myzus persicae, parce qu’il transmet très bien le TuMV. De plus, ce puceron, distribué dans le monde entier, a un très grand nombre d’hôtes et il cause d’importants dégâts en tant que ravageur dans l’agriculture (Srinivasan et Alvarez, 2007). Les pucerons ont été élevés sur des plantes d’aubergines sous des conditions minimisant la production des stades aillés. Tous les stades, sauf les aillés, ont été pris pour la réalisation des tests de transmission.
