@ Num^ro de publication : Mandataire Guerre, Dominique et :

(g)

EuropaischesPatantaimt EuropeanPatent Office

Officeeurop6en

des

brevets

@ ^{Num^ro}

^de publication:

0 656 421 A1 DEMANDE DE BREVET EUROPEEN

@ ^Num6ro

^{ded6pdt:94420339.7}

@

^{Datededdpdt:02.12.94}

®

^Inta.«:

^C12Q

^{1/04, //}

^C12Q1/18

Priority:d2.1Z93

FR

9314687

@

^{Inventeur:Jay, Corrine}

30 nje Gabriel P6rl

F^OiOO

Vnieufbanne(FIQ

@

^Datedeput)iicationdela

demande

:

07.06.95Bulietin95/23

@

^{Mandataire: Guerre,}

^Dominique

^{et ai}

Cabinet

Genmain

et

Maureau

(g) Etats contractants dteign6s

:

20 Boulevard

Eugene

Deruelle

AT BE CH DE DK ES FR GB GR

iEIT

U NL PT BP

3011

SE

F-69392

Lyon C6dex

03(FR)

@ ^Demandeur

^: BIO IMERIEUX F-69280 MarcyITtolle(FR)

@

^{Miiieunutrfflfpouriaculture}

^de

microorganismes.

@

^LInvention

^conceme

^{un milieu nutritif pour ia culture de} microorganismes comprenant de I'alanine,

de Targinine, de I'asparagine, de I'acide aspartique, de la cysteine, de la glutamine, de I'acide glutamique. de la glycine, de Thistidine, deTisoleucfne, dela leucine, dela lysine, de la methionine,

de

la phenylalanine, dela proline, de laserine, de la threonine, dutryptophane, delatyrosine,de lavaline,

de la biotine, du pantothenate de calcium,

de

Tadde folique, de Tinositol, de la vitamine PR, de la vitamine B6, du chlorure dethiamine, de Tacide lipoTque, de lacholine, de I'oxaloacetate tfethyle, dela spermidine, du

Tween

80, des nucleosides puriques et pyrimldiques, du glucose, de Tacide malique,

du

fer, du potassium, du magnesium, du caldum. du sodium, du chlorure. de i'ion phosphate, de i'ion

ammonium,

dun

tampon acide, etd'untampon basique.

L'invention

conceme

aussi i'utiiisationd'un telmlieu.

<

a.

Jouve, 18,

ma

SakKOenis. 75001PARIS

EP0656

421

A1

Lapr6sente inventionapourobjetunmilieunutritifessentiellement synth^tique pour microorganrsmes.

En

particulter,inventionserapporte

d

unmilieunutritifpourlaculture

de

microorganismesetsonutilisation

dansladeterminationdeI'activitdd'unesubstanceactivecontralesditsmicroofQanismes.

Parmilieu essentiellementsynth6tiqueselonI'invention,

on

entend unmilieudentau moinsiesconsti- 5 tuants indispensablesdTobtentionde cemilieuayantIesproprietyd^critesplusloin,sontsynth§tiques.

LesqualityrequisespourIesmilieuxnutritifspour microorganismes sontcellesd^critesparEricssonH.M.

etal.(J.C. 1977.AntibioticSensitivityTesting., Reportofaninternational collaborative study.Munksgaard, Kobenhavn) dsavoir

:

- permettielacroissanced'unemajoritydebad^riesdiniquementimportantessansndcessitdtfenrichis- 10 sementcompl^mentaire,

- contenirdes6l6mentsde base(peptones)dequaiitd satisfaisante,

- assurerunereproductibiiitddestestsdesensibiiitdquel

que

soit lelotet/oulefournisseur, - ne paspr6senterd'antagonismevis-d-visdesantibiotiques,

- ne pasdtre sujetdd'importantesvariationsdepH,

IS - §treisotoniquepourdesbact6ries etsupporterI'addition

de

sang sansprovoquer d'hSmolyse.

Lemilieuactuellement Gonsld6r6

comme

milieuder§fdrencepar I'ensemble dessp^cialistes estlemilieu Mueller-Hlntong^losdquisatisfaitreiativement bien toutescesexigences.Cependant,diff6rentsprobi^mes sont rencontr§squisontlaconsequence

de

soncaractferecomplexe,lemilieuMueller-Hlntonetant constitue d'infusion

de

vlandedeboeuf.d'hydrdysatdecas6lneetd'amidon.Notamment, en cequiconcerneretude 20 desantibiotiques,unmilieucomplexe ne permet pas demattriserlaconcentrationdesconstituantsconnus, telsquelesionsbivalents,lattiymidine.lePBA(acidepara-aminobenzoTque), I'addefolique,pour optimlser leuractivity,cequirendfastidleuse, voire impossible, toute tentative visant

d

correier

une

differenced'activite d'un antibiotlque avec unedifferencedecomposition.Parailleurs, non seulementlacompositiondumilieu Mueller-Hlntonpeutverierd'unlot

e

I'autreen provenanced'un

m§me

fournteseur,mais

une

importantedif- 25 ferenceaetemiseenevidencelorsdeschangementsdefournisseur. Cettevariabilite

de

compositionentraTne un

manque

dereproductibllitedelacroissance bacterienneetdeI'adivitedesantibiotiques.

Ces

probiemes setrouventaccrueaveclaformeliquide

de

cemilieu,qui

de

plus n'estpasparfaitementadaptee euneutili-

sationsurunautomate,enraisonde sesmediocresqualitesoptlques,dufait qu'ilcontientdesconstituants peusolubles

comme

I'amidon.

30 Pourresoudrelesprobiemes

de

reprodudibtlite,desmilieuxditssynthetiques ont ete proposes,c'est-d- duredesmilieux quisontessentiellementdepourvusde composantsnaturels. Parailleurs,cesmilieuxlors- qu'ilssontsousformeliquidepresentent

une

qualiteoptiquesuffisantepour permettreune mesureflableet reprodudible surdesautomates.

Cependant,d'une te^ongenerale,lesmilieuxsynthetiquesdecrits pouri'antibiogrannmenesont presentee 35 quepour quelques espeoes, souventcdlesayanties

ex^enoes

nutritiveslesplusfaibles,etleurs qualitesnu- tritivessontinferieuresecellesdumilieuMuelier-Hintondereference(voirparexemplelesartidesdeHoeprich P.D. et al., Syntfietic

medium

for susceptibility testing, anti-microbial.agents and chemotherapy(1970) ;

DoughertyP.P.etal..Chemically defined

medium

forsusceptibilitytestingof antimicrobialagents,Antimicro- bial,agentsandchemotherapy, 10(6) 2.923-925(1976), LawrenceR.M.etal.,Totallysynthetic

medium

for 40 susceptibility testing.Antimicrobialagents

and

chemotherapy. Vol13,3,394-398(1978)).Parailleurs, lebre- vetEP-0 019 054decritunmilieusynthetlquepour^lacroissancedemicroorganismesetsonutilisationpour ladeterminationdefactivited'unesubstance therapeutiquementactivecontraunmicroorganisme.Lacompo*

sitiondecemilieufait qu'iln'estapplicablequ'elacroissanceeteladeterminationdela sensiblliteauxanti- biotiquesdes germesles pluscourantsetdesbacteriesanaerobies.

De

plus, ladetermination

de

la sensibiiite 45 auxantibiotiquesnepeutetreeffectuee qu'apres12

d

24heuresd'Incubatlon.

IIdevenaitdonen6cessairededisposerd'un milieusynthetlquequipresentelesqualitesnutritivesdumi- lieuMuelier-Hintondereference etqui,deplus,soltadapte pourlacroissanceetladeterminationdelasen-

sibiiiteauxantibiotiquesdes baderieslespluscourammentisoieesenclinlque.

AussI,laDemanderesse amisaupointunmilieu quirepondauxexigencesprecitees et quiparailleure, so lorsqu'ilestsous formeliquide,permet unelecture

de

I'antibiogrammetres rapide,hsavoirapr^s3

d

5heures d'Incubatlonpouriesenterobacteries etmoins de1

0

heures pourles

Pseudomonas

paranalyse

de

lacinetique decroissance.

Lemilieuselonrinventioncomprend unmilieunutritifpourlaculturedemicroorganismes. caraderiseen cequ'ilcomprend7-70 mg/ld'alanine,8-80 mg/ld'arginine,5-50 mg/ld'asparagine,6-60 mg/id'acideaspar- 55 tique.2-20mg/ldecysteine.4-40 mg/ldeglutemine.8-80 mg/ld'addeglutamique,7-70 mg/ldeglycine,2,5- 25mg/ld'histidine,6-60 mg/ld'isoleudne,9-90 mg/l

de

leucine,9-90 mg/ldelysine,4-40mg/l

de

methionine, 5-50 mg/l

de

phenylalanine,4-40 mg/ldeprdine,4-400mg/ideserine.5-50 mg/ldethreonine,2-20 mg/lde tryptophane,4-40 mg/idetyrosine,8-80 mg/ldevaline,0,01-0,2mg/ldebiotine,0,01-0,3nng/idepantothe-

2

EP0656421 A1

natedecalcium,0.001-0,01 mg/ld'acldefollque,0,01-0,5mg/ld'Inositol.0.04-0,2mg/ldevftamlne PP, 0,02- 0,3mg/i

de

vitamlne B6.0,01-0,1mg/ldechloairedethiamine,0,005-0,05 mg/ld'addelipoTque,0,1-5mg/l decholine,1-10 mg/ld'oxaloacdtated'6thyle,0.1-1mg/ldespermidine,5-50mg/l

deTween

80[eorbltan

mono-

&-octadecenoatepoly(Qxy.1 .2-ethanediyl)rtMrenc^ souslenombre 7455 dans

THE MERCK INDEX

(10th Edi- 5 ^tion)].desnucleosides puriquesetpyrimidiquesdansunrapportdespremiersaux secondscompris entre1,5 et 2. lesnucleosides puriquesconsistantenl'ad6noslne etlaguanosine,dans unrapportdelapremieredla

secondecompris entreenviron 0,8 et1,2,lesnucleosides pyrimidiquesconsistantenlacytidine etI'uridine.

dans unrapportdelapremieredlasecondecompris entre1et3,100-10000mg/l

de

glucose,100-10000mg/i d'addemalique. 0,02-0,583 mg/ldefer.49.3-493mg/ldepotassium. 1.2-12 mg/lde magnesium,2,7-27.2mg/l 10 decalcium, 1,18-3,15

de

sodium,1820-5000mg/lenchlorure,17.8-178.3mg/lenionphosphate. 33.6-338,0

mg/lenIon

ammonium,

2000-20000mg/ld'untampon adde,et1000-10000mg/l d'untamponl>asique.

En

particulier, lemilieuselon^1'inventioncomprend5-50 mg/l d'addnosine, 3-30 mg/ldecytidine,6-80 mg/l deguanosine,1-10 mg/id'uridine,0,2-5mg/t

de

pyrophosphateferrique,100-1000mg/l

de

phosphate

de

po- tassiumdibasique,10-110 mg/ldechlorurede magnesium,10-100mg/ldechlorure

de

calcium,100-1000mg/l 16 dechlorure d'anrvnonium.3000-8000mg/l

de

chloruredescxJium.

Avantageusement,lemilieudeI'inventioncomprend enoutre jusqu'd0,022 mg/l

de

molybdene,depre- ferencesous fbnme

de mdybdate

d'ammonium, enconcentrationauplus6gale

d

0,04mg/i,jusqu'e 0,010mg/l deoot)alt,

de

preferencesous forme

de

chloruredecobalt,enconcentration

au

plus6gale

e

0,04mg/i,Jusqu'e 0.027mg/lde manganese,

de

preferencesousformedechlorursde manganese, en concentrationauplus 20 egalee0.1 mg/l,jusqu'e 0,007 mg/l dezinc,depreferencesous forme

de

sulfatedezinc,enconcentration au plusegalee0.03 mg/l.jusqu'd0.128 mg/ldecurvre.depreferencesous forme

de

sulfate decurvre.en concentrationauplusegalek0,5 mg/l, jusqu'e0,088 mg/ldebore,depreferencesous formed'acide borique, enconcentrationauplusegalee0,5 mg/l,Jusqu'd 18,4 mg/ld'lonsulfate,depreferencesous fonmedesutfete depotassiuni,enconcentratfonauplusegalee100mg/l,jusqu'd0,1 mg/l

de

riboflavine,jusqu'e0,005 mg/l 25 decyanocobalamine, Jusqu'd0,1 mg/l

de

menadione,jusqu'e0,5mg/ld'acidet>oriqueet/oujusqu'e5mg/l

deglycerol.

Dans

lapresenteinvention, "jusqu'e"veutdireeuneconcentrationauplusegalee.

Encoreplusavantageusement, lemilieu selonI'lnventioncomprend0,0005-0,005 mg/ldecyanocobala- mine, 0,01-0,1mg/l

de

menadione,0,01-0,5mg/l

de

menositol, 0,01-0,1mg/l

de

ribonavine. 0,1-5mg/l

de

gly- 30 cerd, 0,0004-0,04 mg/ldemolybdated'ammonium, 0.0004-0,04 mg/ldechlorure

de

cobalt,0,001-0.1 mg/l dechlorurede manganese,0.0003-0,03 mg/l

de

sulfetedezinc,2000-20000mg/l de tampon

MOPS

[3-[N- morphoiino]propane acidesulfonique,commercialise parlaSodete

SIGMA

souslaleferenceM(254)],1000- 10000mg/l

de

tamponTris(tri8(hydrQxymethyl]aminomethane),oommerdaIls6par

SIGMA

souslareference T-1503.

35 Avantageusement,lemilieudeI'lnventioncomprend au moins 65mg/ld'alanlne,

73

mg/ld'arginine,

43

mg/l d'asparagine,53mg/ld'acide aspartlque,16mg/ldecysteine.37mg/ldeglutamine,73mg/ld'acide glu- tamique.66mg/ldeglycine.22mg/ld'histidine,54mg/ld'i^leucine,84mg/l

de

leudne.89mg/ldelysine,

33mg/ldemethionine.

44

mg/ldephenylalanine.36mg/ldeproline,320mg/ldeserine,

43

mg/ldethreonine, 17 mg/idetryptophane,

36

mg/ldetyrosine,

70

mg/l

de

valine,0,03 mg/ldebiotine,0,03 mg/l

de

pantothenate 40 de caldum.0.0008 mg/l

de

cyanocobalamine, 0.005 mg/ld'addefollque.0,05 mg/lde menadione,0.15 mg/l demesolnositol,0,15 mg/ldevitamlne PP, 0,15 mg/ldevitamineB6. 0.03 mg/\deriboflavine,0,03 mg/lde chloruredethiamine, 0,01mg/ld'addelipolique,1,5mg/Idechdine,2,6mg/l

de

glycerol.5 mg/ld'oxaloacetate d'ethyle.0.75 mg/l

de

spermidine,10

n^l

de

Tween

80.15 mg/l d'adenosine, 10 mg/ldecytidine,

20

mg/lde guanosine.

6

mg/ld'uridine,750mg/ldeglucose.500mg/ld'addemalique, 0.004 mg/l demolybdated'am- 45 monlum,0,004 mg/ldechlorure

de

cobalt,0.016 mg/ldechlorure

de

manganese,_{0,003 mg/l}desulfatede

zinc,1,8mg/ldepyrophosphateferrique,0,25 mg/l

de

sulfate

de

cuivre,0,025 mg/ld'addeborique.50mg/l desulfate

de

potassium.

230

mg/ldephosphatedepotassiumdibasique,100mg/ldechlorure

de

magnesium, 90mg/ldechloruredecalcium,500mg/ldechlorured'ammonium, 7500mg/l

de

chloruredesodium,15000 mg/lde tampon

MOPS,

7000mg/l

de

tamponTris.

so

Dans

un

nwde

derealisationdeI'invention. lemilieucomprend deplus,au moins unpeptidek

une

concen- trationcomprise entre50 e 100mg/lou

un

melange

de

peptides

d

uneconcentration comprise entre50et 1000mg/i. lespeptides presentantunelongueur comprise entre

4

et15acides amines.

En

particulier.lepeptideestchoislpannilespeptides presentantlessequences d'addes aminessuivantes:

Ala-Gly-Ser-Glu,

55 Glu-Asp-Arg-Pro-Pro-Leu-Phe-Gly-Gln-Gly^Thr-Val.

et

Ala-Ser-Asp-Ala-Lys-Ala-Tyr-Asp-Thr-Glu-Ved.

SelonuneformulationavantageusedumilieudeI'lnvention,cedernier

comprend en

outreunextralt

de

3

EP

0656 421

A1

boeuf_,dontlaconcentrationestdepr6f6rencecomprise entre2et1

0

g/l.L'addltiond'unextraitdeboeufpermet notamment defavoriserlacrolssance d'espteestellesqueStaphylococcussaprophyticus,

Xanthomonas

mal- tophiliaetAcinetobacteriwoffi.

Lemilieu

de

I'inventionpeut indiffgremment§trepr6par6sous formeiiquideoug^los^e.Lorsqu*ilest pr6- 5 par6sous formeg6los6e,unagentg^lifiantestajout6aumilieu.L'agentg6iifiantpeutdtre toutagentg^lifiant conventlonneiconnutelque delagelatine,deragar,deI'agarose,etc.Cependant, pour conserverlanature essentiellement synth6tiquedumilieu,onchoisitdepn6f§rence Tagarosek

une

concentratbnd'environ10000 mg/l conrvneagentg6lifiant

Bien entendu,lescomposants dumilieutelsqued6critschdessuspeuvent%treremplac6s pardes6qui- 10 vaientssans quecelamodifielanatureetlespropri^t^dumilieudei'invention. Ainsi, lesselsd'acidesou de bases

mentbnnds

peuventStreremplacSs parunequantity^uivalente de baselibre

ou

d'acldeHbreou par

une

quantity6qulvalented'unselavec unacideou

une

basediffSrenL

De mdme,

une baselibre

ou

un acide IOmb peutdtrepresentsouslafonrad'unselapproprid.Egalement,un composantd6fini

comma

unhy- dratepeut6trepresentsous une forme anhydre ou§treremplac6parunhydratediff6rent qui aurait lesmfimes

IS propridt^s,selondesentiresconnus ensoi.

De m6me, un

agent 6mulsifiantetdispersantayant,selondes caract^ristiquesoonnues ensol,despropridtte identiques

ou

voisinesdu

Tween

80,pourraitdtresubstltud

k

celui-ci.

L'lnventlonseramieuxcomprise

d

lalecturedeladescriptionddtailltequivasuivre,ftilteenf^f&rence auxfiguresannex6es dansiesquelles lesabcisses repr^sententletemps

en

minuteset lesordonn^esune 20 densityoptiquek 650

nm

suri'appareii

MS2

delaSoci6t6

ABBOTT.

Lafigure1 montreI'effetd'une augmentationdelaconcentrationenserinedanslemilieudeI'invention symbolisd pariST,en comparalson aveclacrolssanceobtenue aveclemilieu Mueller-Hlntoncommercialism parlaSocldt6

DIFCO LABORATORIES

sousiar6f6rence0757-01^. Laoourbe

a repr^nte

lacrolssance obtenue aveclemilieuiST oomprenant uneconcentrationinitlaledeserinede

32

mg/l.Lacourbebrepr^sente 25 lacrolssanceaveclemilieuISTpouruneconcentrationenserineaugment6ed'un fecteur10.Lacourbe cre-

pr§sentelacrolssanceobtenue aveclemilieu Mueller-Hinton.

Lafigure

2

repr^enteI'effetde^laconcentration

en

acidesamines dumilieuISTsurlacrolssancede Pseu-

domonas

aeruginosa_;aillustre lacrolssanoeobtenueaveclaconcentrationinitialedesdiff6rentsacides ami- nes

de

108mg/l, etbmontreI'effetd'une augmentation

de

^laconcentrationenacidesaminesd'un fecteur3.

30 Lafigure3 montreI'influence

de

laconcentrationenchlorurede sodium dumilieu1ST surlacroissance deProteusmirabills;a, b,cetdlllustrentcette influenceddesconcentrations respectives

de Naa, de 0,3%

.

0,5%,

1%et

0,75%.

Lafigure4Illustre I'influencedeiaconcentrationenchlorure

de

sodium dumilieu iST,surlacroissance deVibrioparahaemolytlcus;a, b,cetdconrespondent

d

desconcentrations respectivesde

Naa, de 0,3%

,

35 0,5%,

0.75%

et1%.

Laf^ure5IllustreI'effet

de

I'acidefollquesurlacrolssance d'Enterococcus faecium.i-acourbearepr6- sentelesr^suitatsobtenus sans acidefollque, et lacourbe b repr^entelacroissanceobtenue avecaddition aumilieuIST

de

0,005 mg/ld'acidefollque.

Lafigure

6

montreI'effetdeI'acidellpoTquesurlacroissance d'Enterococcusfeecalis, lacourbe

a

repr6- 40 sentantles r6sultatsobtenus avec unmilieuISTddpourvud'acide llpoTque etlacourbeblllustrantlacrolssance

decettesoucheapr&sadditionaumilieuISTd'aclde llpoTqued uneconcentrationde0,01 mg/l.

Lafigure7nrrantreI'effetdelaspermidine surlacroissancedeProteusmirabilis.

a

reprteentelesr^ultets obtenusaveclemilieuIST ddpourvu

de

sperntidine etblacroissanceobtenueaprteadditionde0,25 mg/l despermidine.

45

La

figure

8

illustreI'effetdel'oxaloac6tate d'6thylesurlacroissance

de

Staphyiocioocus saprophyticus.

a

reprdsentelacroissance obtenueavec unmilieuISTd6pourvud'oxaiac6tate d'dthyle, etbrepr^sentelesr6- sultetsobtenusavec 5mg/ld'oxalacdtetod'6thyle.

Lafigure9

repr^nte

i'effetdelasuppressiondu

Tween

80surlacroissance d'Enterococcusfaecalis.

Lacourbe arepr6sentelacroissanceobtenue avec unmilieu IST ddpourvude

Tween 80

etlacourbebles 50 r6sultetsapr6saddition10mg/lde

Tween

80.

Lafigure10 montreI'effetdei'acideL-mallquesurlacroissanced'Alcaligenesfaecalis. Lacourbeare- prdsentelacrolssanceobtenue aveclemilieuISTd^pourvud'acideL-maliqueetlacourbe bles r6sultetsaprds additiond'une concentrationde 500mg/ld'aclde L-mallque.

Lafigure 11IllustreI'effetdeI'acideL-mallque surlacrolssanoede

Pseudomonas

aeruginosa,lacourbe 55 aconrespondentdlacroissanceobtenueavecunmilieuIST d6pourvud'acldeL-mallqueetlacourbebaprSs

additiond'une concentrationde 500mg/ld'aclde L-malique.

Lesfigures12et13lllustrent lacompatibilltdkuneconcentration d^temiintedeI'acidefollqueavecI'ac- tlvltedecertains antlblotlques. Ellesmontrentlacrolssance d'Enterococcusfeecalisrespectlvement surleml-

4

EP0656421 A1

lieu1ST

de

TinventionetlemilieuMueller HIntonsansantiblotlque(courbesb)etenpr6senoe d'unantlblotique, letrim6thoprime

d

uneconcentration

de

0,25nng/i(court)esa).

Ces

figuresconfirmentI'lnhibition

de

lacrois-

sancedecettesouche,quelquesoit lemilieu,paruneconcentration

de

0,25 mg/l

de

trimdthoprime.

Lafigure14montreIWIuence de{'additiondupeptideAla-Gly-Ser-Gludanslemilieu1ST

de

I'lnvention 5 etlacomparaisonaveclesr6sultatsobtenusparI'ajoutd'acidesamineslibresoonstitutifs

de

cepeptide.1^

courbeacon^spond auxr6sultatsobtenus aveclemilieudeI'inventionsansadditiondupeptidepr§cit6, ni ajoutdes

addes

amineslibresoonstitutifs

de

oe^peptide.Lacourbe billustrelesrteultatsobtenusavecI'ad- ditiondesacidesamindsAla, Gly,Ser,

QLu

respectivementd desconcentrationsde11,9.12,5et17,5mg/l.

La courbec montreles r^sultatsobtenusavecTadditlondesacidesaminesAla,Gly, Ser,

GLu

respectivement 10 ddesconcentrations

de

22, 18,25et

35

^mg/l.Lacourbedcorresponddlacroissance bact6rienneobtenue

apr^

additionaumilieude 50mg/ldu peptide.Lacourt>e

e

illustrelesrfeuHatsobtenus aprteaddition

de

100nog/Ide oe

mdme

peptide.

Lafigure15illustrelacomparaisonentrelacroissanced'unesouche

de

S.agalactiaeaveclemilieu1ST deinvention (courbea) etlemilieu

de

I'artantdrieur (Mueller-Hinton)(courbeb).

IS Lafigure16dtablitlacomparaisondelacroissanced'unesouched'E.faeciumaveclemilieudeI'invention (courbea)etlemilieudeTartant^rieur(courbeb).

Lafigure17illustreI'influence

de

I'incorporationd'unextrait

de

boeufdanslemilieu 1ST.surlacroissance deStaphylococcussaprophytlcus.arepresentslacroissanceobtenueavecunmilieuISTd6pourvud'extrait

deboeuf, etb reprfeentelesr6sultatsobtenusavec 5g/ld'extraitdeboeuf.

20

Example

1 :

oomposKlon du

milieu

LemilieuselonI'inventionoomprend

des

acidesamines,unebasemin6rate,des vKamineset facteurs

de

crobsance,dessourcesdecarbone,des nuddosidesetuntampon.

25 Les

20

^acidesanriinds oonstitutifsdesprotSines,tous

de

lasdrieL,dI'exceptiondelaglycine,sontIndus danslacompositiondumilieu.

Laconcentrationde chequeacideamin6

a

6t6d6termin6e parr^fdrenceauxproportions relath^esen

ad-

des amines deE.coll,quiest I'espteebact6riennelamieuxoonnueetlaplussouventisol6e

en

dinique.Les proportions d'acidesamin6sont

M

^{estim6esd'unepartparI'analysechimique}d'un hydrolysat

de

protSine 30 (NeidhartF.C.(1988) Chemical composition ofEscherichiacdiinEscherichiacollandSalmonella typhlmu- rium,AmericanSocietyof Microbiology,Washington D.C.voi.1:3-8)etd'autre partparTanalysestatlstlque des codons desprot6lnesfortementexprim^es (ManoioG.,(1987)Origine et fonctiondu codeg6n6tiquechez

E. Coll:structuration

en

_{banque de}

donndes

etanalysestatlstlquedes sequencesnudtotldiques,thtee

de

Doctorat 6s-Sciences,Lyon).

35 Lesr6sultatsobtenus par cesdeux approchessontr6sum6s dansletableau1d-dessous.Lesproportions portentsurdesconcentrationsmdalres,etsontdonndes enpourcentaged'acidesamines.

TABLEAU 1

40

Ala hra Asx cys GlX Gly His He ^Leu

(1) 9,6 5,5 9,0 ^{1,7 9,8 11,5 1,8 5,4 8,4.}

(2) 10,6 6,8 9,6 0,5 10,5 8,6 1,6 ^5,7 7,1

Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr val

(1) 6,4 2,9 3,5 4,1 4,0 4,7 2,6 7,9

(2) 7,8 2,3 3,1 3,2 4,2 5,5 0,5 2,6 8,8

(1) fait reference

¹¹

¹

^'

analyse Chimique d'un hydrolysat de protilnes.

(2) correspond & I'analyse statlstlque des codons des prot61nes fortement exprlnfies.

5

EP

0 656 421

A1

Asx

etGlxfontrespectivement rdTdrencedun melange

adde

glutamlque-glutamineetacide aspartique- asparagine.

Ladistinctionentrelesformesacideetamine de ces

addes

aminds a6t6 effectudeaveclamethods de Manoio.Lesproportionsrelativesdonn§es enpourcentage sentlessuivantes:Glu7,0

%,

Gin3,5%,

Asp

5,5 5 %.

Asn

4,1 %.

1^

proportions entre lesconcentrationsmolatresdesdiff6rentsacidesaminesretenues sent cellesquiont6t6d6termm6esparla

mSthode de

Neidhart,d('exceptiondesrapportsGlu/GinetAsp/Asn,qui sentrespectivement

de 2

et1 ,3,d^terminds parlam6thode deManoio.

Lesproportionsenpourcentagedesacidesamindsdumilieusurlabase desconcentrationsmolaires,sent r6sum6es dansleTableau

2

d-dessous.

io

TABLEAU 2

16

Ala Aig

Asn Asp

Cys Gin Glu Gly His lie

9,6 5.5 3.8 5,2 1,7 3.3 6.5 11.5 1.8 5,4

Leu Lys Met

Phe

Pro Ser Thr Trp Tyr Val

8.4 6.4 2.9 3.5 4.1 4.0 4.7 1,1 2.6 7.9

La compositionqualitativeet quantitativeen

addes

amines aensuite 6t6optimistepourlesdlff^ntes esp^ces,afind'obtenir

una

croissanceconforme

k

celleobtenueaveclemilieuMueller-Hintonder^forence.

En

particulier, laconcentrationenserinea6t6augmentdepourobtenir

une

concentrationfinalevolslnede 400mg/l,avantageusement 320mg/l,car cet

adde

amindest tr6srapidement assimll6 parlesSerratia,en

particulierlesesp^cesmarcescens,liquefaciensetfonticolaetlesesp^cesMorganellamorganii,Proteusmi- rabillsetYersiniaenterocolitica.L'am6iiorationdelacroissanceestobtenueen augmentantlaconcentration finaledeserine,notammentpourSenratiamarcescens,

comme

illustr6dlafigure1.

Comma

cela ressortde cettefigure,uneaugmentationd'un focteur10

de

laconcentrationens6rinepermetd'obtenirunecroissance bact^rienne voisine

de

celleobtenueaveclemilieuMueller-Hlnton.Les concentrationsfinalesenacides ami- nes ont6t6dSfinles,apr&savoirconstatsleurimportance surlablomassefinale,entenantcompte delabio-

masse

obtenuedanslemilieu Mueller-Hinton.Cette6tudeestnotammentblenillustrteavec

Pseudomonas

aeruginosa, dontlacroissanceetlabiomassefinalesdependentfortement

de

laconcentrationen

addes

ami-

n^, comme

montrddlafigure2.

La basemin^ralecomprend desionsm^talllques etdesselsdontlerdlea6t6dtoit parGottschailcG.

(Bacteriol.Metabolism,2ndEdition,page3,SpringVerlag.. Berlin (1988)).Lesions m^taliiquessontlebore, lecobalt,lecuivre,le fer, lemanganese,lemolybddne,lezinc,quijouentlerdledecofacteursenzymatlques.

Les concentrationschoisiespour cesionssontcelles d6finiespar Neidhart (Neidhart C.etal..Culture

Medium

forEnterobacteria,Journalof Bacteriology,

Sept Pages

736-747(1974)).Arexceptlondufer,lasuppression desautres oligo616mentsn'entratnepasd'effetslgnificatifsurla croissancedesbact^ries test^escarlesdo- sagesr6alis6sontmontr6queces6l6mentssont apport6sindlrsctement etenquantity suff isanteparlesau- tresconstituantsdumilieu disponiblescommercialement Blen entendu,dansI'hypoth&se

de

Tobtentlonde produits

commerdaux

deplusenplus pure,

on

pr6f6re maintenirunapportcontr6l6desionsmin^rauxafin d'assureruneconcentration

minimum

toujoureoompatibleaveclacroissancedesbact6ries.

Au

contraire,le fers'av6re 6treunconstituent additionnel indispensable,notammentpourlacroissancedecertainesespSces.

Laconcentrationduferdanslemilieu,qui est relativement 6lev6e,a6t6optlmisde poursatisfairelesexigences deP.aeruginosaetdesstaphylocoquessansinhiberlacroissancedesautres esp^ces.

A

titred'exemple,dif- fdrents selsdeferpeuventdtreIndusdanslemilieu, telsquelepyrophosphate

de

fer,lechloruredefer,le citratedefer etlesulfets

de

fer, inddpendamment ou encombinalson.

De

pr6f6rence,ieconstituantdeI'in-

vention estleseldepyrophosphate.

Lesoufreestessentiellementapportd par

Hon

sulfete,quirepr6sente

45 %

dusoufre

pr^nt

danslemi- lieu, malecertaines bact6ries, qui ontperdu leurcapadt^ dr§dulre I'lon sulfate, pourront utillserd*autres

compost

r^duitspresentsdanslemilieu,notammentlacysteine etlamethionine.

De

preference,I'ionsulfate dumilieudeI'inventionestlesulfets

de

potassium.Laconcentrationensulfete choisieestcelled6finiepar Neidhart

Lasourceprincipale

de

potassium(70%)etde phosphore (100%)estapportee parlephosphatedepo- tassiumdibasique. Laconcentration

de

phosphateaetedetenmineeafin d'^viterlaformation

de

predpites aveclesionscaidumet

magnesium

affectentlaqualiteoptiquedumilieu etmodifiantlesconcentrationsde cesdeuxions.Laconcentrationchoisie estcelled6finieparNeidhart

L'ion

ammonium

constitueunesource d'azoteutilisesparlamajoritedesbacteries.Laconcentrationen

EP

0656 421

A1

ions

ammonium

a6t6d§finieentenantcompte desconcentratbnsenacides amines,quisont6galementuti- lisdes

oomme

sourced'azoteparles bact6ries.1^ formedilorure est pr6f6r6e,

notamment

parrapportaux formesptiospliatd,

oed

afind'6viterunapport suppidmentaired'bnsptiosphate.

Lesionscalciumet

magnesium

sontlescofacteursde nombreuses

enzymes

etsontconnuspour modifier 5 la sensibility^certains antlbiotlques,notammentlesaminosides vis-^visdePseudonrtonas(ChristeM.etal.

(1982)Susceptibilitydu

Pseudomonas

aeruginosaauxaminosides: influencedu

caidum

etdu magnesium, Schweizerische Medizinische Wochenschrift,112, 4, 241).Les teneursenions

caidum

et

magn^siumdu

milieu deI'inventioncorrespondentauxnormesprteonisdespour I'antibiogramme parle

NCCLS

(NattonalCommit- teeforClinicallaboratory Standards,1990,Methodsfor dilutionantimicrobial, susceptibility testsforbacteria 10 thatgrowaerobically.Approvedstandard publicationM7-A2: 10-11 Vlllanova

Pa

USA). Les concentrations pond6rafesenions

caidum

et

magnesium

sont respectivementde 25et12,5mg/l. fomieschlorurede

caidum

etchlorurede

magnesium

sontavantageusementchoisiesdanslesconstituantsdumilieudeI'inven- tion.

Lechlorurede sodiumrepr6sentelasourceprincipaie d'ionssodiumetchlorure.Laconcentrationen NaCI

IS

a

6t6optimis6een tenantcomptedesfortesexigences ensodium deProteusmirabiliset

de

Vibrioparahae- molyticus,

comma

montr^ auxfigures3et4.

Lesvitaminesetfacteursdecroissance sontdesconstituantsimportants pourlesm6tabolismes desbao- t^ries.Ler6ledesvitaminesB1,B2, B5, B6. B12,

H

et

PP

danslem61abolismebact6rfen est pr6cis6dans plusieursouvrages,dontie'ManualofMethodsforGeneralBacteriology"deGuirardet Snell(Biochemistry 20 FadorsInGrowth, chapter7(1981)).LemSsolnositol.lacholineetlegtyc^rolsontdespr^curseursdeslipides cellulairesdontlesphospholipidesmembranaires(voirKlig L.S. etal. (1990)PhosphdipidbiosysthesisinCan- didaalbicans: regulationbythe precursorsinositolandchdine.J.

BacL

178(8):4407-4414).Lesconcentra- tionsen

adde

folique,acldelipdTque,spermidine, oxaloao6tated'6thyle et

Tween 80

ont

M

particulidrement bien6tudi6espouriemilieudei'invention.

25 L'acidefdiqueestun

coenzyme

dontimportancepourlacroissancedesent^rocoques,

notamment

pour lesdiff§rentessouchesd'E.faecalis,E.

faedum

etE. hiraea6t6 d6nrK>ntr6e,

comme

d^critci-aprte.IIestpar ailleursoonnupouraffecterractlvit6desantlbiotlquesdelafamilledessutfamidesetdutrimdthoprime (Then R.etal.,MScanismemol6culairedelabactSricldie;sulfennides ettrimdthoprlme. Bad6ricldie 1990,Editions Maioine,Paris).Laconcentrationen

adde

fdique

a

6t6d6temiin6e poursatisfairelesexigencesdes souches 30 test6es etpoursacompatlbilitdavecI'adhritddesantlbiotlques,connneIilustr6auxfigures12et13.

La concentration

en

acldelipoTquea6t6d^termln^econmielaconcentration

minimum

permettantd'amd- liorerau

maximum

lacroissancedesent6rocoquesetdesstreptocoques

du

groupsB.Lafigure6lllustreTeffet deracidelipoiiquesurlacroissance d'Enterococcusfaecalis.

Lespoiyamines sont prdsentesdanslescelluleseucaryotesetprocaryoteset participant

k de

nombreuses 35 r6adionsbiologiquesdontla

synth^

des

addes

nud^lquesetdesprot^ines(voirTabor C.W.

and

TaborH.

(1985) PoiyaminesinMicroorganisms, Microbid. Rev.49:81-99).Laputrescine,laspermineetlaspermidine ont6t6 test^es.l-aspermidinea6t6 choisieenfonctiondesr6sultats,

notamment

pourlacroissancedesPro- teus,Morganelia,ProvidenciaetSenratiad uneconcentrationpr6f6rentielle

de

0,75mg/l.Lafigure7lllustre I'effetdelaspermidine surlacroissance

de

Proteusmirabilis.

40 L'oxaloac6tata d'6thyle estd6critpoursoneffetstimulateur surlacroissancede nombreuses espdces (Pd- czarM.J. etBrownJ.H.(1951)Synthetic culturemediaforreferenceuseindairy bacteriology,J. MilkFood Techno!., 14:90-91et 97).

Son

influencesurlacroissancedessouches

de

staphyloooquesa6t6mise enEvi- dence,

comme

montr§

d

lafigure6,etlaconcentration retenueestcellepermettantd'ann6llorerlacroissance desstaphyloooquessansinhiber celledesautresespdces.

45 Le

Tween

80estunagent 6mulsifiantetdispersantnpeutremplacerlabiotine

comme

montr6parGretler A.C.etal.(Vitaminenutritionofthestaphyiococdwithspedalreference totheir biotinrequirements (1954)J.

Bact70: 44-49).IIjouedgalement unr51ed^toxifiantetprotecteurenabsorfoant les6ventuels

dements me-

tabolitestoxiquesdumilieu(voirKleinR.D.etal.(SimplifiedmediaforgrowthofhaemophilusInfluenzaefor clinicalandnonnalflorasources. Journal of GeneralMicrobiology. 113:409-411(1979)).

Comme

montr^

d

la 50 figure_{9, la}suppression

de Tween 80

danslemilieuentrafheunediminutiondecroissancedesdiff^ntes

espdcesbad^riennes.

Lessourcesde carbone dumilieu

de

I'inventionsont representeesmajoritairementparunsucre,depre- ference D-glucoseetunaclde organique,enparticullerTacideL-malique.LeD-glucoseaeteretenu,compte tenude sonutilisationparungrandnombred'espdcesbact6riennes

d

metabolismsfermentatifounon(Stanier 55 R.Y.etal.(1966)

The

aerobicPseudomonas:

a

taxonomlcstudy.J.Gen.Microbid.

43

:159-271).

Sa

concen-

trationdanslemilieudeI'invention

a

6t6determin6e pouratteindreune blomasseproche

de

celleobtenue aveclemilieuMudler-Hlntondereference. L'acideL-maliqueestn6cessaire

k

lacroissancedes especes non gludddytiques,tellesqu'Alcaligenesfaecalis,

comme

montredlafigure 10, et

Pseudomonas

addovorans.II

7

EP0656421 A1

am^lioredgalement lacroissanoede

Pseudomonas

aeruginosaqui Tutilise pr6f§rentiell8inentau glucose

comme

source

de

carbone,

oomme

montr6klafigure 11.Lesconcentrations respectlvesenD-gluooseeten L-malique ont 6t6 d6termin6es pour rdpondreauxquaiitSsduMueller-Hinton.

Lesbasespuriquesetpyrimidlquespeuvent6treapport6essousplusieursformes,c'est-d-diresous forme 5 depr^curseurs,de basesllbres,de

nud^ides

oudenud^otkles.Les 6tudessurlemilieudei'inventlonont montrdqueI'apportdes deuxprtoirseurshypoxanthineeturadlenesatisfaitpaslasexigencesen base des ent6rocoques.Parailleurs,lesnud6otidesentrafhentunediminutiondelacroissancede nombreuses espdces bactdriennes.

Des

amdiioratlonssignificativesont6t6obtanuesaveclesnud6osides.enI'absence

de

lathy- midineoomptetenude sonincompatibilityavecl'activi(6des sulfamidesetdutrim^thoprime.

1^

proportions 10 entre purines etpyrimidines ont6t6d§finiesparrapportdcelles d^critespouriasynthtee

de TARN

parNei- dhart(Neidtiartetal.(1990) Physiologyofthebacterialcell.

A

molecular approach. Sinauerassociates,inc.

USA),entenantcompte

de

I'absence

de

thymidine,c'est-d-direpurines/pyrimidlnesdans unrapportcompris entre 1,5 et2,2etavantageusement

de

1,8.Lesconcentrationsfinalesont 6t6ensulteoptimls6esessentiel- lementpoursatisfairelacroissancedesstaphylocoquesetdesentirocoques.

IS Letampon a6t6 choisipour rdpondreauxexigences

de

qualityoptiquedumilieuetdepH,le

pH

7,4Stant adapts^I'antibiogrammeet

k

lacroissancedesbactSries.La forme

adde

estapportSe parletampon

MOPS,

quia6t6particuiidrement choisienraison

de

son

pKa

de_7,2 20''C)prochedu

pH

dumilieu.Laconcentration du tampon

MOPS a

6t6d6fInledefagon

&

assurerunpouvoirtampon6quh/alent

d

celuldumilieuMueller- HintonsansdSpasserlaconcentratbnde

BOmM,

au-delddelaquelledesInhibitionsdecroissance bactSrienne 20 ont6t6 dScritespar NeidhartL.aformebasiqueparticuliSrementretenueestletamponTris,quia6t6prSfSrS kune baseforte

comme

I'hydroxydedesodium,afind'6vlterunapport suppi6mentaired'ions.Laconcentration danslemilieu

de

I'lnvention

a

6t6dSfInieenIbnction

de

celiedutampon

MOPS

etdu

pH

finalsouhaltS.

La

Demanderesse

aparailleursd6montr6quei'additlondepeptidesdanslemilieu

de

^Hnventionavaitun

effststimulateur,

notamment

pourlacroissancedesentSrocoques.Parmilespeptidestestes,seulsceuxpr6>

25 sentantunetaillelnf§rieureou6gale^15 acldesaminesentralhent

une

forteameliorationdeiacroissance.

Parailleurs,la

Demanderesse

amontr6queTadditiondesacidesaminesllbresconstitutifsdespeptides,ap- portSsenconcentration ^uivalente,ne permet pas dereproduireI'effetstimulateur,

comme

iliustrS

d

lafigure 14.Enpartlculier, letStrapeptide Ala-Gly-Ser-<3iu entraiheuneameliorationconsiderable

de

iacroissance

de

differentessouchesd'Enteroooccushiraeetd'Enterococcus faechjm,d'autrespeptidestelsqueGlu-Asp-Arg- 30 Pro-Pro-Leu-Phe-Gly-Gln-Gly-Thr-ValetAla-Ser-Asp-Ala-Lys-Ala-Tyr-Asp-Thr-Glu-ValdonnantdesrSsuItats

interessantspourd'autressouchesd'enteroooques.

Exemple

2:Preparation

du

mliieu

de

rinventlon.

35 Lemilieuseionrinvention peut-etre prepare, par exemple.epartb*desixsolutionsmeresconcentrees quisontobtenuesdirectementepartlrdesconstituantscommeroiaux enpoudre, referencesdanslecatalogue delasociete

SIGMA,

diluesavec unequantiterequised'eaudlstiliee.Les^solutionssontensuitesterilisees parfiitratbnetrdfrigereessousformeliquideoucongeieese-20''C.Lassolutionsmeres,quisontrespecti- vement dessolutionsdelabaseminerale(5Xconcentree),desoligo-ei6ments (10

OOOX

concentree),desaci- 40 des amines (3Xconcentree),des nudeosides (8Xconcentree),desvitamines hydrosolubles(700X concen-

tree),desvitaminesllposolubles(2000Xconcentrees),sontensuitemeiangeesentreelles,puisdilueesavec unequantiterequised'eaudistilieeetadditionneesauxglucose,

adde

L-maliqueetphosphatedepotassium dibaslque(constituants

commerdalses

parlasodete SIGMA).Sinecessairele

pH

est ajusteparadditionde soude oud'acidechlorhydrique pourobtenirunevaleurvoisinede7,4.L'ordredanslequelsontmelangesles 45 differentsconstituants n'estpascritique.

Exemple

3:

comparaison des

resultatsobtenua aveclemilieu

de

rinventlon etlemflleuMueller-Hin- ton

de

reference.

50

En

vuedeiadeterminationdelasenslbiliteauxantibiotiques,

une

suspension

de

0,5

MF (Mac

Fariand) dansdei'eauphysidogique

a

et6prepar6eepartirdecoloniesbacteriennes preievees surboitesdePetri, la lectureetanteffectuee surundensitometre

ATB

1550commeroialise parlasociete

BIOMERIEUX

(ATB

marque

de commerce). Lasuspensionobtenue arespecth^ementete dilueeau 1/100eme danslemilieudeI'inventlon etlemilieu Mueller-Hinton.

Des

cartes

VITEK

(VITEK marque de commerce)contenantdifferents antibiotiques 55 e10 concentrations ont ete rempliessousvidedans unapparell

VITEK

commerdaliseparlasodete

BiOME-

RIEUX-VITEIC Lescartes ont eteIncubeespendant12 heuresdans unincubateur/lecteur

VITEK

commercia-

liseparlasociete

BiOMERIEUX-VITEK.

Lesdnetiques

de

croissance ontetevisuailsees, interpretees etune

CMI

equh^ienteaetedeterminee(CMIequlvalente: concentrationminlmaledinhlbition equivalente, c'est-d-

EP 0

656 421

A1

dire lapluspetiteconcentrationpourlaquelleaucunecroissance bact6riennen*estd6tBGl6e par rappareiQ.

I^sr6sultatsont6t6pr§8ent6sdanslestableaux

3

et4ct-aprte.

1STfaitr6f6renceaumilieudeI'lnventlonet

MH

signlfiemilieu Mueller-Hinton.

5

TABLEAU ³

R&,^uitata

aur

Ifts

hact6ries

ft

Gram

^(-)

30

so

CMI

6quivalente

CatdgoHe NCCLS

antibtotiQues souches

conconu

auwii ICT _•vin 1ST

MH

en

mo/I

f. coif

CDC 2008 < Q,QO ^ ^A

^Afi

c ^c

CDC 2254

^{#\c 1}

c 9 ^e

CeiXaZiaiinB

ft91*

CDC 2102 ^C s

CDC 2162 ^{c w} s

CDC 2240 ^U«D

^{- 1 1}

e s

PmaefuginosB

AP 9 R

APIS

^*»A

^{C s w}

CDC 2275

^«tA

e 9 s

•

ATCC ²⁷⁸⁵³

¹

^{e w}

K*poBUfnoniso

o o

CDC 2174 ^o O Q Q o

CDC 2182 16

¹¹

AP 14 64 256

^{11 ri}

piperaCiiiine

[1

-> 2561* CDC 2021 z Q w

CDC 2162 > 2oO > ZOD D

t\

D

_W\

P. aeruoiftoso

APS ^{4 4 s s}

AP 13 8- 16 16 s s

5. cloacae

CDC 2013

64/2 128/2 ¹

R

CDC 2129

2/2 2/2

s S

ticarcilline acide 5.co/i

clavulanlque

CDC 2084

^{4/2-8/2 8/2}

s S

(1/2

->

256/21

CDC

²¹¹

1

32/2-64/2 32/2-64/2 1 1

CDC ^{2259 256/2} > 256/2 R R

P, aeruginosa

CDC 2099

128/2 128/2

R R

APS

^{8/1-16/2 16/2}

^{S S}

AP 13

^{64/2 128/2}

S S

/T.

pneumoniae

CDC 2177

0.5 0.25

S S

CDC 2249 8 8

^{1 1}

CDC 2279 4 4 s s

gentamicine ^P. aeruginosa

10.125

->

641 ^•

CDC 2009 16-32 32 R R

CDC 2239 2 2 S S

CDC 2257 0,5-1

0.5

S s

9

EP0656

421

A1

5

10

K,

pneumoniae

CDC 2279

0,25 0,25

S S

API

88.03.111 1 1

S S

ofloxacine API

88.08.056

⁴

4

^{1 1}

10.125

->

₃₂₁ ^• 5. marcescens

API 81.45.111

4

2 1

S

AR 81.47.110 16 8 R R

£. coff

UA 200

<0,25/4.75 <0, 25/4,75

S S

tfimdthopfifne ^-i- API

84.03.115 128/2432 128/2432 R R

sulfam6thoxazote K.

pneumoniae

(0.25^-

4,75 -> CDC 2174

<0,25/4.75 <0,25/4.75

S S

128

/

2432]

^*

CDC 2280

1

28/2432

1

28/2432 R R

15

20

25

30

35

40

46

SO

EP 0656421 A1

R6sultats sur

lea

bact^rles h Gram

1

+

1

CMI

^quivalenta Cat6gorie

NCCLS

antibiotiques souches

4/1

isnmo/I

1ST Win ^tLMU

5.aureus

ATCC 29213 < u,uo < U,UD Q o

IS

tfifn^thonrifna 4- gliifannAihmfayftlft

CDC 2215 CDC 2194

0,12

< 0,06

All

< 0,06

c o

s s

£0,06/1.14

•>

S^epsdermidis

CDC 2024 CDC 2234

< O,0o lo

< o,ud S D n

o K

CDC 2105

0,25 0.25

s S

5. aureus

20

ATCC 29213

2 ^•J

2 c

o

CDC 2215

2 1

S s

CDC

21

94 z

1

c o o

25

[0,5

->

321 ^•

eoid&fnkfis

CDC 2024 CDC 2234

4 4

2

S e 9

s

CDC 2105 4 2 S S

8 16

¹

1 1-2

s s

30

CDC 2225

^A

c

S*aureus

ATCC 29213

0,5 0,25

s s

CDC 2215

0,5 0,5

s s

CDC 2194 > 32 > 32 R R

35 ^rythronnidne 10,06

->

321 ^•

S. epidermidis

CDC 2024 CDC 2234

0,5

> 32

0,25

> 32

S R

S R

CDC 2105

0,25 0,25

S S

£. faecah's

40

CDC 2073

CDC 2230

16 4

16 4

R

1

R

1

S.aureus

ATCC 29213 <

0,5

<

0,5

S S

CDC 2215

1

<

0,5

s S

oxaciltine

CDC 2194

¹

<

0f5

s S

45 [0,5

->

161 • _5. epidermidis

CDC 2234 ² 4 s R

* Une gamme de concentration, de raison 2, a §t4 testae pour chaque antibiotique dans chacune des fourchettes de concentration precitees.

S J

^et

R

signif lentrespectivement"sensibles", 'intenmddiaires'et"r6sistant8s"enr6fdrenceauxconcen- trationscritiquesddfiniesparle

NCCLS

(NationalCommitteeforainicalLaboratory Standards).

CIX::CenterDiseaseControl (Atlanta, Eiats-Unis).

UAet AP

:Collectionde souches dtottesparFandrolsJ.P.etal.'Antlbiogramme automatlsd" (1988) idre 11

EP 0

656 421

A1

6ditbn.Waiter

Coussement

^-Bnixelles.

ATCC

:American TypeCulture Collection(USA).

API:souchier

BIOMERIEUX.

Comme

cela ressortdestableauxcndessus,IIexisteune concordance desr^sultatsdplusou nwlns une

dilutionpr^, cequid^montrer^quivalencedes deuxmilieuxencequiconoernel'6tudedesantiblotiques.

Parailleurs,lesrdsultatsmontrent

que

lemilieu

de

I'inventionpermet

de

d6tecterdes souchesquipr^sentent uncaract^rederesistanceauxantiblotiques.

Example 4

_:

comparaison

antrala

mDiau da

I'invantfon atlamilieudderit

dans

labravatEP-0 019054.

Lemilieu antdrieura6t6 initialement febriqu^ suivantlaprocedured^criteparHall (HallM.J. etal.,

Roche

susceptibility test(RST) medium,

a

definedformulation for susceptibility testingII,Manufacturestability

and

use. Journal ofMicrobiologicalMethod

2

:215-220(1984)).Leproc6d6a cependant dOdtrel^g^rement

mo-

dif 16oomptetenu

de

laprecipitation

de

lasolutionoontenantlesacides amines,le

magndshim

glycerophos- phateet lecalciumgluconate.

Comparaison delacrotssance bactdrienne

:

Lessouchesrespectlvementtest6essontdesenterobact§ries,

Pseudomonas

aeruginosa,desstaphylo- coques,desent6rocoquesetdesstreptoooquesde groupeB.

A

partlrdecolonies Isoldessurg^lose,unesuspensionaet6pr^par^e,ajust6ek0,5

MF

dans de Teau physlologique(densitomdtre

ATB

1550).Lasuspensionaetediluteau 1/10§me dans deI'eauphysiologique, puis redllueeau 1/10emerespectlvementdanslemilieu

RST

etlemilieu1STderinvention,pr6alablementr6- partisd 1ml par cuvettedanslescassettes

de

I'appareil

MS2

(commercialism parlasocl6t6

ABBOTT).

Les cassettes ont6t6incub^espendant 10heurssetunelecturea6t6effectutetoutesles5minutes.

Comme

illustr6

k

lafigure_{1 5«}on observe unecroissanceplus rapldedesstreptocoquesdu groupe

B

avec

lemilieude('Inventionen comparaison aveclemilieuRST,cequi bienentendu permet unelecturedeI'anti-

biogrammeapr&s5heuresd'incubationpar analysecln6tiquedelacroissance,centre environ

9

heures

avec

lemilieuant^eur.

De m§me,

ladnStique

de

croissancedesent6rocoquesaveclemilieudei'inventionpenmetderendre

un

r^sultatd'antibiogrammeenenviron

5

heures,ces

m§mes

bact6riespoussantdiffIcilementaveclemilieude Tartantdrieur.Ceci estbienillustrftklafigure 16, quidonne

une

comparaison delacroissance d'unesouche d'E.

feedum

aveclesmilieux1STetRST.

Ravandications

1)Milieunutritifpourlaculturedemlcroorganlsmes,caract§ris6en cequ'ilcomprend7-70 mg/ld'alanine.

8-80mg/l d'arginine,5-50 mg/ld'asparaglne.6-60 mg/ld'acide aspartique,2-20_mg/l

de

cyst6lne,4-40 mg/l

de

glutamine,6-80 mg/ld'acide glutamique.7-70 mg/ldeglycine.2,5-25 mg/ld'histidine.6-60 mg/ld'lsoleu- clne,9-90 mg/l

de

leucine, 9-90 mg/ldelysine,4-40 mg/ldemethionine, 5-50 mg/ldephenylalanine,4-40 mg/ldeproline,4-400mg/ldes6rine,5-50 mg/ldethreonine,2-20mg/ldetryptophane.4-40mg/ldetyrosine, 8-80mg/l

de

valine,0,01-0,2mg/ldeblotlne,0,01-0,3mg/ldepantothenate

de

calcium,0.001-0.01mg/l d'ad- defolique.0,01-0.5mg/ld'inositd.0.04-0,2mg/ldevitamine PP,0,02-0,3mg/ldevitamineB6,0.01-0.1mg/l

de

chlorure

de

thiamine. 0.005-0,05 mg/l d'acidelipoTque,0,1-5mg/ldechdine, 1-10 mg/ld'oxalo-acetate d'ethyle,0,1-1mg/ldespermidine. 5-50 mg/l

de Tween

80,des nudeosldespurlquesetpyrimidiquesdans un rapportdespremiersaux secondscomprls entre1,5et2,2,lesnudeosidespurlquesconsistant

en

I'adenoslne etlaguanosine,dans unrapportdelapremiereklasecondecomprls entreenviron 0.8et 1,2,lesnudeosides pyrimidiquesconsistentenlacytidine etI'uridine,dans unrapportdelapremiereelasecondecompris entre

1 et3,100-10000mg/ldeglucose,100-10000mg/l d'acide malique,0.020-0.583 mg/ldefer,49,3-493 mg/l

de

potassium.1.2-12mg/lde magnesium,2,7-27,2mg/I

de

calcium,1,18-3,15

de

sodium,1820-5000mg/l

en

chlorure,17,8-178,3 mg/lenionphosphate, 33,6-336,0nng/1enion

ammonium,

2000-20000mg/l d'un

tampon

acide, et1000-10000mg/l d'untamponbasique.

2) Milieuselonlarevendicatlon1,caracteriseen cequ'ilcomprend5-50 mg/l d'adenoslne, 3-30 mg/l

de

cytidine, 6-60 mg/ldeguanosine, 1-10 mg/ld'urldlne.0,2-5mg/ldepyrophosphateferrique,100-1000mg/l

de

phosphatedepotassium_dlbaslque, 10-110 mg/ldechlorurede magnesium,10-100 mg/ldechlorure

de

caldum, 100-1000mg/ldechlorured'ammonium, 3000-6000mg/ldechloruredesodium.

3) Milieuselon1ou 2caracteriseen cequ'ilcomprend enoutrejusqu'e0.022nrg/\de molybdene,jusqu'd 0,010 mg/ldecobalt,jusqu'e0,027 mg/l

de

manganese,Jusqu'e 0,007 mg/ldezinc,jusqu'e 0,128 mg/l

de

cui- vre,Jusqu'e0,088 mg/l

de

bore. Jusqu'e18.4 mg/ld'lonsulfate.Jusqu'e 0.1mg/lderiboflavlne.Jusqu'e0,005

EP

0656 421

A1

mg/l

de

cyancxx>balamine,Jusqu'd 0,1 mg/l

de

m6nadione,Jusqu'd0,5 mg/ld'acideborique et/ou Jusqu'd

5

mg/ldeglyc6rol.

4) Milieueelonlarevendication3,caract6ris6en

ce

qu'iloomprendJusqiTd 0,04 mg/ldemolybdated'anv monlum,Jusqu'd 0,04mg/idechloruredecobait,jusqu'd0,1 mg/idechlorurede manganese,jusqu'S 0.03 mg/l

de

sulfate

de

zinc,jusqu'd 0,5mg/ldesulfetedecuivre,et/oujusqu'ii100mg/ldesulfete

de

potassium.

5)MilieuselonI'unequelconquedesrevendicattons pr6c6dentes,caract6ris6en cequ'iicomprend0,0005- 0.005 mg/l

de

cyanocobalamine,_0,01-0,1mg/l

de

menadione,0,01-0,5mg/ldem6nosltol, 0,01-0,1mg/lde

riboflavine,0,1-5 mg/ldeglyc6rol,0,0004-0,04 mg/lde

mdybdate

d'ammonium,0.0004-0,04mg/idechlorure decobalt,0,001-0,1mg/ldechloruredemanganese,0,0003-0,03 mg/ldesulfatedezinc.2000-20000mg/l de tampon

MOPS,

1000-10000mg/lde

tampon

Tris.

6) Milieuseloniarevendication 1,caract^risdencequ'iioomprend

au

moins65 mg/ld'alanine,73mg/l d'arglnine. 43mg/id'asparagine,53mg/l d'acideaspartique,16mg/ldecysteine,37mg/l

de

glutamine, 73 mg/id'acide glutamique,

66

mg/l

de

glycine,

22

mg/ld'histidine,54mg/ld'isoleucine,

84

mg/i

de

leucine,

89

mg/l

de

lysine,

33

mg/idemethionine,44mg/ldephenylalanine.36mg/ldeproline.320mg/ldeserine,43 mg/ldethreonine. 17mg/ldetryptophane,36mg/l

de

tyrosine.70nr^ldevaline.0,03 mg/ldebiotine,0,03 mg/i

de

pantothenatedecalcium.0.0008 mg/ldecyancK^balamine, 0.005 nr^ld'addefolique,0,05 mg/lde menadione. 0,15mg/idemesoinositol,0,15 mg/ldevitamine PP. 0,15 mg/l

de

vitamlneB6, 0.03 mg/l

de

ribo- flavine.0.03 mg/ldechloruredethiamine. 0,01mg/id'acidelipoTque,1,5mg/ldecholine, 2,5mg/ldeglycerol.

5mg/ld'oxaloacetated'ethyle,0,75 mg/l

de

spermidine.10mg/lde

Tween

80,15 mg/l d'adenosine, 10mg/l decytldlne.20mg/ldeguanoslne,

6

mg/ld'uridine,750mg/ldeglucose,500mg/ld'acidemalique, 0,004 mg/l demolybdated'ammonium,0.004 mg/idechlorure

de

cobalt,0.016 mg/ldechlorurede manganese. 0.003 mg/ldesulfatedezinc,1 ,8mg/ldepyrophosphateferrique,0.25 mg/ldesulfatedecuivre,0,025 mg/ld'acide borique.50mg/idesulfatedepotassium.

230

mg/ide phosphate depotassiumdibaslque,100mg/ldechlorure de magnesium,

90

mg/ldechlorure

de

calcium,500mg/l

de

chlorured'ammonium,

7500

mg/l

de

chlorure

de

sodium, 15000mg/ldetampon

MOPS,

7000mg/ide

tampon

Tris.

7) Milieu seionI'unedesrevendicatbns precedentes.caracteriseen cequ'iicomprend deplusaumoins unpeptidee

une

concentrationcomprise entre

50

et100mg/lou un melange depeptidesduneconcentration comprise entre50et1000mg/l, lesditspeptides presentantunelongueur comprise entre

4

et15acides ami- nes.

8) Milieuseloniarevendication7,caracteriseen ce

que

lepeptideest choisiparmilespeptides presentant lessequencesd'acidesaminessulvantes:

Ala-GIy-Ser-Glu,

Glu-Asp-Arg-Pro-Pro-Leu-Phe-Gly^n-Gly-Thr-Val, et

Ala-Ser-Asp-Ala-Lys-Ala-Tyr-Asp-Thr-Glu-Val.

9) MilieuseionI'unedesrevendicationspr^:edentes,caracteriseen cequ'iioomprend enoutreunextralt

de

boeuf,en

une

concentration preferentieliementcompriseentre2et10g/l.

10) Milieuseloni'unedesrevendicationsprecedentes,caracteriseen cequ'llcomprend un agentgeiiflent,

enparticuiierdei'agarose,e uneconcentrationd'environ10000mg/l.

11)Utilisationdumilieutel

que

defini

dans

I'unequelconque desrevendicationsprecedentesdanslade- terminationdeI'actMted'unesubstance therapeutiquementactivecentreunmicroorganlsmeinfectieux.

13

EP

0656 421

A1

I

—

^{I i 1 -|}

r

100 200 300 400 500 600

FIG 2

14

EP

0656 421

A1

EP

0656 421

A1

9 ^{0 656421 A1}

0.8.

0.6-

0.4.

0.2-

FIGS

— ^r"

100 —

^I

—

200

-1

3oa — ^T"

400 500 600

0,8.

0,6-

FIG9

0.*

0,»

100 2ob ^"953 43o i3o eSo

1.0.

0.8.

0.6-

0,4.

0.2-

FIG 10

260 IBo" _40b

_5(*)

_60b

17

EP

0656 421

A1

18

EP

0656421

A1

19

20

EP

0 656 421

A1

Office

dcsbrevets

RAPPORT DE RECHERCHE EUROPEENNE

EP 94 42 0339

DOCUMENTS _CONSIDERES COMME PERTINENTS

Calceorie

A A A

D.A

CkMiondu

*»nrttes|iinbuunij

EP-A-0 019 054

(F.

TOFFMAHN-LA RKHE &C0.) US-A-4 906 573

(M. C.

BARNEY ET AL.) EP-A-0 283 942

(W. R.

GRACE & CO.) EP-A-0 220 379 (PFRINMER &

CO.

PHARMAZEUTISCHE WERKE ERLANGEN GMBH &

CO.

KG)

DATABASE WPI

Section

Ch.

Week 8528,

Oerwent Publications Ltd., London,

GB;

Class B04. AN 85-168898

& JP-60 098 982 (NAGASE SEIKAGAKU

KO) 1

Juin 1985

*

abreg^

^*

J.

MILK FOOD TECHMOL., vol.14, 1951

pages 90-91

^-

97

M. J.

PELCZAR ET

AL.

'SYNTHETIC CULTURE MEDIA FOR REFERENCE USE IN DAIRY

BACTERIOLOGY'

ruppwt etecCbMpoor

CLASSEMENTDELA PEMAWPE

ObLCLC)

C12Q1/04 //C12Q1/18

DOMAINES TECHNIQUES KECHEBOIES(bLCLQ

C12Q

LA HAVE

27

F6vrier 1995 Cartagena y Abel

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CATEGOUE DES DOCUMENTSCITES

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