Biotechnologies
AT17 DOSAGE ENZYMATIQUE DU
GLUCOSE
Méthode à la Glucose
Oxydase
PRINCIPE
AT17 DOSAGE ENZYMATIQUE
DU GLUCOSE
I-1- Réaction d’oxydation du glucose :
Le glucose est oxydé en acide gluconique par la GOD : Glucose Oxydase
Glucose + O2 ---> acide gluconique + H2O2
Malheureusement, aucun des substrats et des produits ne sont colorés et ils n’ont pas de pics caractéristiques au spectrophotomètre.
I- Le Principe (réactions biochimiques)
Il est donc nécessaire de faire appel à une autre réaction biochimique.
I-2- Réaction de Tinder (utilisant un chromogène) :
L’eau oxygénée formée dans la première réaction est dosée : Péroxydase
2 H2O2 + phénol + amino-4 antipyrine ---> quinonéimine + 4 H2O
incolore rose
I- Le Principe (réactions biochimiques)
L’amino-4 antipyrine est appelé « chromogène ». Par définition un chromogène est incolore et peut être à l’origine d’un composé coloré.
La quinonéimine est appelé « chromophore ». Par définition un chromophore est coloré. La quinonéimine est coloré en rose.
I-3- Bilan des deux réactions biochimiques :
Dans les conditions opératoires, la quantité de quinonéimine formée est proportionnelle à la quantité de glucose qu’il y avait dans le milieu.
I- Le Principe (réactions biochimiques)
D’après la loi de Beer-Lambert, et en respectant les conditions
opératoires (3 règles), l’intensité de la coloration rose obtenue est donc proportionnelle à la quantité de glucose qui était présente dans le
milieu.
Il est donc possible de faire un dosage spectrophotométrique du glucose.
I-4- Limites de détection analytique de cette m éthode :
Elle est déterminée à partir de dosages effectués sur d l’eau déminéralisée.
I- Le Principe (réactions biochimiques)
La limite de détection est inférieure ou égale à 0,07 mmol/L (0,013 g/L).
Linéarité :
Le réactif est linéaire jusqu’à 22,2 mmol/L (4,00 g/L).
I-5- Quelques définitions :
Lorsqu’il y un dosage nécessite plusieurs réactions biochimiques, on appelle :
I- Le Principe (réactions biochimiques)
Réaction principale :
Réaction dans laquelle on retrouve le composé dosé.
Réaction indicatrice :
Réaction aboutissant à la formation d’un produit coloré ou possédant un pic d’absorption caractéristique au spectrophotomètre.
Réaction intermédiaire(s) :
I-6- Quelques questions qui en découlent :
Dans le dosage du glucose par la GOD, on peut dire :
I- Le Principe (réactions biochimiques)
Que la réaction principale est ? :
La première réaction car on retrouve le glucose comme substrat.
Que la réaction indicatrice est ? :
La deuxième réaction car on retrouve la formation de la quinonéimine qui est un chromophore coloré en rose.
Que la(les) réaction(s) indicatrice(s) est(sont) ? : Il n’y en a pas dans ce dosage.
MODE
OPÉRATOIRE
AT17 DOSAGE ENZYMATIQUE
DU GLUCOSE
II-1- Le réactif (coffret BioMérieux® RTU) :
II- Mode Opératoire
On dispose aussi d’une solution étalon de glucose à 0,50 mol.L-1
II-2- Dilution du jus de pomme et du cidre :
II- Mode Opératoire
On dilue le jus de pomme et le cidre au 1/100ème .
On prélève 1 ml de jus de pomme avec une P1000 et un embout bleu que l’on place dans une fiole jaugée de 100 ml.
On complète au trait de jauge avec de l’eau déminéralisée.
On prélève 1 ml de cidre avec une P1000 et un embout bleu que l’on place dans une fiole jaugée de 100 ml.
On complète au trait de jauge avec de l’eau déminéralisée.
II-3- Manipulations :
II- Mode Opératoire
On dose le glucose du cidre et du jus de pomme avant et après hydrolyse (faite par la préparatrice) du saccharose.
Dans 5 micro-cuves Blanc
réactif
Étalon JP JP hydrolysé Cidre
Étalon (µl) 10
Jus de Pomme (µl) 10
Jus de Pomme hydrolysé (µl) 10
Cidre (µl) 10
Réactif (ml) 1 1 1 1 1
Homogénéiser puis photométrer après 20 minutes d’incubation à 37°C.
LECTURE DES RÉSULTATS
AT17 DOSAGE ENZYMATIQUE
DU GLUCOSE
III-1- Lecture des absorbances :
III- Lecture des Résultats
On passe les micro-cuves au spectrophotomètre contre le blanc à 550 nm :
III-1- Lecture des absorbances :
III- Lecture des Résultats
On passe les micro-cuves au spectrophotomètre contre le blanc à 550 nm :
Blanc réactif
Étalon JP JP hydrolysé Cidre
Étalon (µl) 10
Jus de Pomme (µl) 10
Jus de Pomme hydrolysé (µl) 10
Cidre (µl) 10
Réactif (ml) 1 1 1 1 1
ABSORBANCES 0,000 0,378 0,077 0,062 0,004
ANALYSE DES RÉSULTATS
AT17 DOSAGE ENZYMATIQUE
DU GLUCOSE
Équation aux grandeurs :
c(glucose, jus de pomme dilué) = [ A(jus de pomme dilué) / A(étalon) ] x c(glucose, étalon)
Équation aux unités :
c [mol.L-1] = ( A [s.u.] / A [s.u.] ) x c [mol.L-1]
IV- Analyse des Résultats
IV-2- Calculs de la concentration en quantité de glucose du jus de pomme non-hydrolysé dilué :
Équation aux grandeurs pour le jus de pomme non-hydrolysé : c(glucose, jus de pomme dilué) = [ A(jus de pomme dilué) / A(étalon) ] x c(glucose, étalon)
IV- Analyse des Résultats
Équation aux valeurs pour le jus de pomme non-hydrolysé : c(glucose, jus de pomme dilué) = [ 0,077 / 0,378 ] x 5,5.10-3
c(glucose, jus de pomme dilué) = 1,12.10-3 mol.L-1
IV-2- Calculs de la concentration en quantité de glucose du jus de pomme non-hydrolysé dilué :
Équation aux grandeurs pour le jus de pomme non-hydrolysé : c(glucose, jus de pomme) = c(glucose, jus de pomme dilué) x f(facteur de dilution)
IV- Analyse des Résultats
Équation aux valeurs pour le jus de pomme non-hydrolysé : c(glucose, jus de pomme) = 1,12.10-3 x 100
c(glucose, jus de pomme) = 1,12.10-1 mol.L-1
IV-2- Calculs de la concentration en quantité de glucose du jus de pomme non-hydrolysé :
Équation aux grandeurs pour le jus de pomme non-hydrolysé : 𝞺(glucose, jus de pomme) = c(glucose, jus de pomme) x M(masse molaire du glucose)
IV- Analyse des Résultats
Équation aux valeurs pour le jus de pomme non-hydrolysé : 𝞺(glucose, jus de pomme) = 1,12.10-1 x 180
𝞺(glucose, jus de pomme) = 201,6.10-1
𝞺(glucose, jus de pomme) = 2,02.10+1 g.L-1
IV-2- Calculs de la concentration en masse de glucose du jus de pomme non-hydrolysé :
Équation aux grandeurs :
c(glucose, jp hydrolysé dilué) = [ A(jus de pomme hydrolysé dilué) / A(étalon) ] x c(glucose, étalon)
Équation aux unités :
c [mol.L-1] = ( A [s.u.] / A [s.u.] ) x c [mol.L-1]
IV- Analyse des Résultats
IV-3- Calculs de la concentration en quantité de glucose du jus de pomme hydrolysé dilué :
Équation aux grandeurs pour le jus de pomme hydrolysé dilué :
c(glucose, jp hydrolysé dilué) = [ A(jus de pomme hydrolysé dilué) / A(étalon) ] x c(glucose, étalon)
IV- Analyse des Résultats
Équation aux valeurs pour le jus de pomme hydrolysé dilué : c(glucose, jus de pomme hydrolysé dilué) = [ 0,062 / 0,378 ] x 5,5.10-3
c(glucose, jus de pomme hydrolysé) = 9,02.10-4 mol.L-1
IV-3- Calculs de la concentration en quantité de glucose du jus de pomme hydrolysé dilué :
Équation aux grandeurs pour le jus de pomme hydrolysé :
c(glucose, jus de pomme hydrolysé dilué) = c(glucose, jus de pomme hydrolysé dilué) x f(facteur de dilution)
IV- Analyse des Résultats
Équation aux valeurs pour le jus de pomme hydrolysé : c(glucose, jus de pomme hydrolysé) = 9,02.10-4 x 100
c(saccharose, jus de pomme hydrolysé) = 9,02.10-2 mol.L-1
IV-3- Calculs de la concentration en quantité de glucose du jus de pomme hydrolysé :
Équation aux grandeurs pour le jus de pomme hydrolysé :
𝞺(glucose, jus de pomme hydrolysé) = c(gluc, jus de pomme hydrolysé) x M(masse molaire du glucose)
IV- Analyse des Résultats
Équation aux valeurs pour le jus de pomme hydrolysé : 𝞺(glucose, jus de pomme hydrolysé) = 9,02.10-2 x 180
𝞺(glucose, jus de pomme hydrolysé) = 1623,6.10-1
𝞺(glucose, jus de pomme hydrolysé) = 1,62.10+2 g.L-1
IV-3- Calculs de la concentration en masse de glucose du jus de pomme hydrolysé :
Nous savons que le l’hydrolyse à coupé le saccharose (dioside) en deux osides : le glucose (aldose) et le fructose (cétose) :
Hydrolase
C12H22O11 + H2O ---> C6H12O6 + C6H12O6
Saccharose Glucose Fructose
IV- Analyse des Résultats
Conclusion :
Une mole de saccharose donne une mole de glucose et une mole de IV-4- Calculs de la concentration en quantité de saccharose du jus de pomme :
Rappel :
c(glucose, jus de pomme hydrolysé) = 9,02.10-2 mol.L-1 c(glucose, jus de pomme hydrolysé) = c(saccharose, jus de pomme)
IV- Analyse des Résultats
IV-4- Calculs de la concentration en quantité de saccharose du jus de pomme :
Équation aux valeurs pour le jus de pomme :
c(saccharose, jus de pomme hydrolysé) = 9,02.10-2 mol.L-1
IV- Analyse des Résultats
IV-4- Calculs de la concentration en masse de saccharose du jus de pomme :
Équation aux grandeurs pour le jus de pomme :
𝞺(saccharose, jus de pomme) = c(saccharose, jus de pomme) x M(masse molaire du saccharose)
Équation aux valeurs pour le jus de pomme : 𝞺(saccharose, jus de pomme) = 9,02.10-2 x 342
𝞺(saccharose, jus de pomme) = 3084,84.10-2
Équation aux grandeurs pour le cidre :
c(glucose, cidre) = [ A(cidre) / A(étalon) ] x c(glucose, étalon)
IV- Analyse des Résultats
Équation aux valeurs pour le cidre : c(glucose, cidre) = [ 0,004 / 0,378 ] x 0,55 c(glucose, cidre) = 5,82.10-3 mol.L-1
IV-5- Calculs de la concentration en quantité de glucose du cidre :
Équation aux grandeurs pour le cidre:
𝞺(glucose, cidre) = c(glucose, cidre) x M(masse molaire du glucose)
IV- Analyse des Résultats
Équation aux valeurs pour le cidre :
𝞺(glucose, jus de pomme hydrolysé) = 5,82.10-3 x 180 𝞺(glucose, jus de pomme hydrolysé) = 1047,6.10-3
IV-5- Calculs de la concentration en masse de glucose du cidre :
BILAN DU DOSAGE
AT17 DOSAGE ENZYMATIQUE
DU GLUCOSE
V-1- Composition en glucose et saccharose du jus de pomme et du cidre :
V- Bilan du dosage par la GOD
Ces résultats confirment la conclusion de la CCM.
Jus de Pomme Cidre
Glucose (g/L) 20,20 1,05
Saccharose (g/L) 30,80 0,00
Nous avions dosé les sucres réducteurs par le 3,5-DNS.
Résultats trouvés lors de l’AT16 (dosage des sucres réducteurs par DNS) :
𝞺(sucres réducteurs, jus de pomme) = 108,30 g/L 𝞺(sucres réducteurs, cidre) = 1,78 g/L
V- Bilan du dosage par la GOD
Sachant que les sucres réducteurs sont constitués de glucose + fructose, il est possible maintenant de calculer la quantité de fructose.
V-2- Résultats obtenus lors des dosages du fructose :
Équation aux grandeurs :
𝞺(fructose, jus de pomme) = 𝞺(sucres réducteur par DNS, jus de pomme) - 𝞺(glucose par GOD, jus de pomme)
V- Bilan du dosage par la GOD
V-3- Calculs de la concentration en masse de fructose, jus de pomme :
Équation aux unités :
𝞺 [g.L-1] = 𝞺 [g.L-1] - 𝞺 [g.L-1]
Équation aux valeurs :
𝞺(fructose, jus de pomme) = 108,30 - 20,20
Équation aux grandeurs :
𝞺(fructose, cidre) = 𝞺(sucres réducteur par DNS, cidre) - 𝞺(glucose par GOD, cidre)
V- Bilan du dosage par la GOD
V-4- Calculs de la concentration en masse de fructose, cidre :
Équation aux unités :
𝞺 [g.L-1] = 𝞺 [g.L-1] - 𝞺 [g.L-1]
Équation aux valeurs :
𝞺(fructose, cidre) = 1,78 - 1,05
𝞺(fructose, jus de pomme) = 0,73 g.L-1
V-5- Composition en glucose et saccharose et fructose du jus de pomme et du cidre :
Jus de Pomme Cidre
Glucose (g/L) 20,20 1,05
Saccharose (g/L) 30,80 0,00
Fructose (g/L) 88,10 0,73
TOTAL (g/L) 139,10 1,78
V- Bilan du dosage par la GOD
Biotechnologies
