DEUX MÉTHODES COLORIMÉTRIQUES SIMPLES
PERMETTANT D’APPRÉCIER LA TENEUR EN GLUCOSE ET EN FRUCTOSE DES MIELS
Zwei einfache kolorimetrische Methoden
zurBestimmung des Glukose-
und Fruktosegehaltes
vonHonigen.
Michel GONNET
Fernande PARIS Station
expérimentale d’Apiculture,
Centre de Recherches
agronomiques d’Avignon,
I. N. R.A.,
84140Montfavet
SUMMARY
TWO SIMPLE COLORIMETRIC METHODS TO ESTIMATE THE GLUCOSE AND FRUCTOSE CONTENT IN HONEYS
A titration method of
reducing
sugars inhoney
wasperfected.
This method can be used in thepractical
work conditions of abeekeeping cooperative.
Glucose is titred with a colorimetric method which uses the benzidine in acetic
medium;
the fructose titration is
accomplished
with a similarmethod,
whichrequires
the use of I3indolyl-acetic
acid inchlorhydric
medium. Reference titrations wereaccomplished
with gas-chromatography.
The results obtained are
satisfying
withregard
to the colorimetricanalysis
ofglucose,
alittle less accurate for the fructose. Nevertheless these methods
supply
agood
estimation of thereducing
sugars content(glucose
andfructose)
in anhoney.
This estimation isusually enough
for the routineanalysis
in thepractical field,
but cannot be taken into account as anofficial reference method.
RÉSUMÉ
L’auteur a mis au
point
une méthode dedosage
des sucres réducteurs dans lemiel;
cette méthode est utilisable dans les conditionspratiques
de travail d’unecoopérative apicole
parexemple.
Le
glucose
est dosé par une méthodecolorimétrique
utilisant la benzidine en milieu acé-tique;
ledosage
du fructose est effectué par une méthodeanalogue
nécessitantl’emploi
d’acidefi indolyl
-acétique
en milieuchlorhydrique.
Lesdosages
de référence ont été effectués parchromatographie_en phase
gazeuse.Les résultats obtenus sont satisfaisants en ce
qui
concernel’analyse colorimétrique
duglucose,
un peu moinsprécis
pour le fructose. Ces méthodes autorisent néanmoins une bonne estimation de la teneur en sucres réducteurs(glucose
etfructose)
dans un miel. Cette estimation suffit leplus
souvent dans le domainepratique
pour desanalyses
de routine, mais ne peut êtreprise
en considération comme méthode de référence ofHcielle.1. - INTRODUCTION
Le glucose
etle fructose
sontdeux monosaccharides réducteurs qui
entrent en
moyenne pour 70 % dans la composition d’un miel. La proportion
de l’un par rapport à l’autre
est assezvariable, mais le fructose
estle plus
souvent
dominant. Les moyennes calculées
sur490 miels américains de diffé-
rentes
provenances
sontde 38 % de fructose
et31 % de glucose. (W HITE J.
etal. 1962.)
En pratique, le rapport glucose/fructose
est assezdifficile à déterminer
avec
exactitude par l’analyse courante; différentes méthodes
ontcependant
été proposées dans
cebut. W HITE J.
etM AHER J., (1954) font
uneséparation
sur
colonne
enutilisant
unephase fixe, la poudre de charbon,
et unephase mobile,
unmélange éthanol /eau. Ils dosent ensuite les
sucresdans les fractions recueillies par les méthodes chimiques appropriées. Cette technique
estbonne,
sans
doute, mais l’analyse
estlongue
etde
cefait
nepeut
être retenuepour les
examens
de routine.
P
OURTALLIER J. (1967)
aadapté
auxmiels
uneméthode de dosage des
sucres
par chromatographie
enphase gazeuse. C’est
unetechnique très
sûreet
très complète mais là aussi la préparation de l’analyse exige beaucoup de
temps; de plus l’appareillage requis
estonéreux.
Les analyses chimiques
courantespermettent
uneévaluation du pourcen- tage des différents
sucres contenusdans
unesolution de miel. Le dosage iodo- métrique des aldoses, par exemple, (méthode de BouGAULT)
est uneanalyse simple, d’exécution rapide
etqui nécessite peu de matériel. On peut traduire facilement les résultats obtenus
englucose, mais de manière
assezapproxima-
tive
carcertains dissaccharides du miel réagissent
enpartie, de même d’ailleurs qu’une proportion
nonnégligeable du fructose
comme nousle confirmons dans
ce
travail. Néanmoins,
enl’absence d’autres méthodes,
onpeut dire que les résultats obtenus constituent
uneapproximation intéressante pour le technicien.
Les dosages réductimétriques (type F ELHING
ouB ERTRAND )
sontégale-
ment
applicables mais les résultats fournis
sontglobaux; ils révèlent l’ensemble
des
sucresréducteurs du miel. La polarimétrie, complément normal de
cetype
d’analyse pour définir les
tauxrespectifs de glucose
etde fructose
contenusdans
une
solution de
sucreinterverti,
estici inutilisable
carcertains
sucresmineurs du miel dévient fortement la lumière polarisée
etfaussent l’interprétation des
résultats.
Des méthodes de chromatographie
surpapier (M AURIZIO A., 1959)
etpar
chromatographie
surgel de silice (P OURTALLIER J., 1964)
ontété décrites.
Elles paraissent convenir
assezmal à des
examensde routine.
La préparation du miel pour la commercialisation dans les conditions actuelles exige des traitements particuliers qui doivent garantir la parfaite conservation du produit. La mise
en oeuvrede procédés technologiques impor-
tants
peut
êtrerequise à
ceteffet. Il
estalors nécessaire d’opérer
unchoix dans
les miels dont
ondispose si l’on
veutobtenir des lots de qualité
constante.Ce choix repose le plus
souvent surla connaissance de trois données essentielles : la
teneur englucose,
enfructose
et en eau.La cristallisation des miels
estd’une manière générale très liée
auxrapports
glucose /fructose
etglucose /eau. Pour les traitements à appliquer dans le
domaine de la cristallisation dirigée, par exemple, il faut tenir compte de
cesparamètres essentiels.
Mais il y
ad’autres opérations technologiques qui
nepeuvent pas être
conduites dans des conditions parfaites si l’on
neconnaît pas le
tauxde glucose
ou
celui de fructose dans le miel que l’on
veuttraiter : c’est le
caspour la pas- teurisation. Quand
onpasteurise
unmiel, c’est principalement pour détruire les cristaux de glucose
et assurerainsi le maintien du produit à l’état liquide;
il
estimportant dans
ce casde connaître la
teneur englucose
avantd’entre- prendre le traitement. Une pasteurisation pratiquée
sur unmiel ayant
unpourcentage de glucose élevé risque de s’avérer inutile
etmême néfaste,
carla recristallisation du produit
seragénéralement rapide
etla granulation très grossière. Une telle opération
estdonc à éviter.
Pour
cesraisons, il
estsouhaitable que quelques analyses simples puissent
être
pratiquées
surles lieux mêmes de conditionnement du miel. C’est pourquoi
nous avons
mis
aupoint deux méthodes d’analyse, l’une du glucose, l’autre du
fructose, suffisamment précises
etrapides pour qu’elles puissent
êtreutilisées
dans la pratique par le laboratoire d’une coopérative apicole
oud’un négociant
en
miel. L’appareillage requis pour
cesanalyses n’est pas très important; il
estd’ailleurs identique à celui qui
estemployé pour d’autres analyses classiques
de contrôle de la qualité des miels, tels que le dosage de l’HMF
oules détermi- nations de l’activité diastasique. De telles analyses
sont courammentpratiquées
dans
cetype de laboratoires de contrôles.
Les méthodes qui
ont retenu notreattention
etque
nous avonsadaptées
à l’analyse des miels
sontdes micro-méthodes colorimétriques. Nous
noussommes
inspirés pour le dosage du glucose d’une méthode décrite
en1954 par J
ONES
etP RIDHAM et, pour le dosage du fructose, d’une
autreméthode mise
au
point
en1956 par H EROVSKY . Ajoutons, que l’analyse colorimétrique appli- quée
auxdosages des
sucresdans le miel n’est fiable que lorsqu’elle
estconduite
dans des conditions expérimentales précises. Nous
nous sommesdonc attachés
tout
d’abord à définir
cesconditions
età
testerle degré de spécificité des mé-
thodes que
nous avonsmises
aupoint.
II. - DESCRIPTION DES
MÉTHODES
A. -Préparation
d’une solution de sucres témoinsa.
Principe
Il
s’agit
d’une solution de référence de titre connu; elle sert d’étalon pour les deuxtypes
de
dosages.
Elle contient les sucresréducteurs, glucose
etfructose,
enquantités égales;
elle estsensiblement
comparable
à une solution de mieléquivalente.
b.
Réactifs
- Acide
chlorhydrique
concentré pur.- Saccharose
chimiquement
pur.c. Mode
opératoire
On
pèse 1,900
g de saccharose que l’on met en solution dans 45 ml d’eau distillée. Sur cette solution onpratique
une intervention du typeC LERGET ,
c’est-à-dire que l’onajoute
à la solu-tion de sucre 5 ml d’HCL. On chauffe lentement le
mélange
au bain marie de manière à atteindre 72° C en 10 minutes. On laisse refroidirspontanément
et on amène à 100 ml en fiolejaugée.
Cette solution mère contient exactement 20 mg de sucres réducteurs par ml. On en
prélève
avecprécision
2 ml que l’on amène à 100 ml avec de l’eau distillée. On utilise cette seconde dilutioncomme témoin pour les deux types
d’analyses.
B. - Recherche du
glucose
a.
Principe
Dans les conditions
expérimentales
décritesci-dessous,
on faitréagir
leglucose
contenudans une solution de miel avec de la benzidine en milieu
acétique
concentré. On obtient unecoloration
jaune-orangée
d’une intensitéproportionnelle
à la concentration duglucose
dans lemilieu.
b.
Réactifs
On
prépare
une solution de benzidine à0,2 %
dans de l’acideacétique
pur; lemélange
esthomogénéisé
paragitation magnétique pendant
2 minutes environ. Onajoute
alors 0,1%
dechlorure d’étain
broyé
au mortier et l’onpoursuit
encorel’agitation pendant
5 minutesaprès l’apparition
d’un trouble dans la solution. On filtre lemélange.
Le réactif doit êtrelimpide;
il est renouvelé
journellement.
c. Mode
opératoire
On
prépare
une solution à 2%
de miel dans de l’eau distillée. De cette solution onprélève
avec
précision
2 ml que l’on amène à 100 ml en fiolejaugée.
Cette dernière dilution est à 400 [ig de miel par ml.- Dans un tube à essai on
prélève 0,75
ml de la solution de sucre de référence(soit
150 [ig deglucose);
oncomplète
à 1 ml avec de l’eau distillée. Dans un autre tube on écoule 1 ml de la solution diluée de miel(soit
400!tg).
Un témoin à blanc est réalisé avec 1 ml d’eau distillée.On utilise pour tous ces
prélèvements
deprécision,
despipettes
étalons de 1 mlgraduées
par0,05
ml.-
Chaque prise
d’essai est faite en double et onajoute
dans tous les tubes 5 ml du réactifacétique. Après mélange,
les tubes sont bouchés par un tampon d’ouate oumieux par
un bou-chon de verre si l’on
dispose
de tubes à cols rodés. Ils sont ensuitedisposés
dans unportoir, lequel
estplongé
dans un bain-marie bouillant. On maintient l’ébullition lente etrégulière pendant
30 minutes. Leportoir
contenant les tubes est alorsdéposé
dans un bain d’eau cou- rantefroide,
la réaction est ainsistoppée
par un refoidissement trèsrapide.
-
Après
un derniermélange,
les lectures s’effectuent au colorimètre en cuves carrées de 10 mm de côté. On choisit un filtre transmettant sous unelongueur
d’onde de 410 n. m. Le témoin blanc permet derégler
le zéro del’appareil.
d.
Expression
des résultatsElle se fait en pourcentage de
glucose
dans le miel soit :où Pl =
poids
duglucose
dans laprise
d’essai du témoin sucres réducteurs(en !.g).
P
l =
poids
du miel dans laprise
d’essai miel(en !,g).
E
l = lecture au colorimètre pour la
prise
d’essai du témoin sucres réducteurs(en D°)
E
l= lecture au colorimètre pour la
prise
d’essai miel(en D°).
Lorsque
Pl = 150 yg et P’ = 400 {.I.g on a :e. Précautions à
prendre
Toute la verrerie utilisée et notamment les tubes à
essais,
doit êtreparfaitement
pro- pre, rincée à l’eau distillée et àl’alcool,
séchée en étuve. Les tubes à essais sont enPyrex
ouautre
qualité
de verre résistant aux chocsthermiques provoqués
par le passage du bain bouillantau bain froid.
Le
pipetage
du réactifacétique
au moment dumélange
est réalisé à l’aide d’unepipette automatique.
Nous recommandons d’effectuer toutes lesmanipulations
avec des gants pour seprotéger
de la solution corrosive et sipossible
de travailler sous hotte ventilée afin d’éviterune inhalation trop
importante
de la benzidine en milieuacétique.
Enfin lesparois
extérieures des cuves sontsoigneusement essuyées
avant la lecture au colorimètre.L’analyse
seprête
bien au travail ensérie;
il convientcependant
de réaliser au minimum deux témoins de sucres réducteurs danschaque
série.C. - Recherche
du fructose
a.
Principe
On fait
réagir
le fructose contenu dans une solution de miel avecl’acide 13 indolyl-acé- tique (A.
B. I.A.)
en milieuchlorhydrique
concentré. Dans les conditionsexpérimentales
décrites
ci-dessous,
on obtient une coloration violetteproportionnelle
à la concentration enfructose du milieu.
b.
Réactifs
- 1 solution
éthanolique
à0,5 % d’acide 13 indolyl-acétique.
- 2 acide
chlorhydrique
pur concentré.c. Mode
opératoire
On
prélève
à lamicropipette 0,15
ml de la solution de référence de sucresréducteurs,
soit30 yg de fructose dans la
prise
d’essai. De la même manière on écoule0,20
ml de la solution de mielpréparée
pour ledosage précédent,
soit 80 yg de miel dans laprise
d’essai. Un témoin à blanc est réalisé avec0,20
ml d’eau distillée.Chaque prise
d’essai est effectuée en double et onajoute
dans les tubes successivement0,20
ml de la solutiond’acide 13 indolyl-acétique, puis
8 ml d’acidechlorhydrique. Après mélange
les tubes sontbouchés, placés
dans unportoir qui
estplongé
dans un bain thermos-tatique
à 37 Cpendant
une heure. Ce temps écoulé leportoir
contenant les tubes estdéposé
sans délai dans un bain d’eau courante
froide,
où il demeurependant
5 minutes.Après
un derniermélange
les lectures s’effectuent au colorimètre en cuves carrées(10
x10
mm).
On choisit un filtre transmettant sous unelongueur
d’ondes de 520 nm.d.
Expression
des résultatsComme pour le
dosage précédent,
elle se fait en pourcentage de fructose contenu dans le miel soit :e.
Remarques
Elles sont
identiques
à cellesqui
concernent la recherche duglucose.
1. Ce
qui
constitue uneapproximation
des teneurs moyennes englucose
et en fructose pour unmiel;
dans ces conditions les chiffres obtenus par E’ et E2sont
généralement
voisins.III. -
RÉSULTATS
Afin de
testerla fiabilité de la méthode
nous avonsréalisé
uncertain nombre d’expériences de contrôle. En comparaison
avecles deux
sucrestémoins (le glucose pour l’analyse à la benzidine
etle fructose pour l’analyse à l’acide (3 indolyl acétique),
nous avonsfait réagir successivement
età différentes
concen-trations quelques-uns des principaux
sucresque l’on
trouvedans les miels. Les résultats figurent
auxtableaux 1
et2.
L’analyse à la benzidine révèle
outrele glucose,
untrès faible pourcentage de fructose, 10 % environ du maltose, ainsi que quelques polysaccharides qui réagissent partiellement mais dont la proportion totale dans le miel excède
rarement
2 à 3 %. Comme élément de comparaison,
nous avonsintroduit dans
cette
étude le dosage chimique du glucose par l’iode. Au
coursde
cetteanalyse
le glucose réagit normalement; mais réagissent aussi 6 % environ du fructose témoin ainsi qu’un quart du maltose qui
est enrègle générale le disaccharide le plus abondant dans le miel (de 4 à 7 %
enmoyenne).
L’analyse colorimétrique à l’acide (3 indolyl acétique permet de révéler le fructose; cependant quelques
tracesde glucose, moins de 5 % du maltose
et50 % du saccharose réagissent. Mais exception faite pour 2
ou3 types de miels, le produit de l’abeille contient très peu de saccharose (1 à 1,5 %
enmoyenne).
Au tableau 3,
nousprésentons des résultats traduits
enpourcentage de
glucose, de fructose
etde
sucresréducteurs;
cesrésultats
sontobtenus par différentes méthodes d’analyses. Si
nousconsidérons
commeanalyse de réfé-
rence
le dosage par chromatographie
enphase gazeuse,
nouspouvons faire les quelques observations suivantes.
En
cequi
concernele glucose, les résultats obtenus par colorimétrie
sont assezvoisins de la référence, sauf pour le miellat. Par
contrele dosage chimique
révèle toujours
unpourcentage de glucose exagéré. Les résultats de l’analyse colorimétrique du fructose
sesituent à des
tauxsupérieurs à
ceuxdu témoin
de référence. Enfin, les résultats, exprimés
en sucresréducteurs, obtenus
enadditionnant le glucose
etle fructose révélés par les analyses colorimétriques
sont
très voisins des résultats d’un dosage réductimétrique classique (type B
ERTRAND
). Les écarts
avecles résultats obtenus par chromatographie, sont,
ici
encorerelativement importants.
IV. - DISCUSSION
En conclusion, les méthodes d’analyses que
nousdécrivons autorisent
uneestimation beaucoup plus qu’un dosage précis des deux principaux
sucresréducteurs du miel. Toutefois,
cetteestimation
estbien meilleure que celle obtenue par d’autres méthodes de chimie courante, principalement pour la recherche du glucose. Avec
cedernier
sucre,d’ailleurs,
etpar la méthode colo-
rimétrique que
nousdécrivons ici, le pourcentage de l’erreur commise dans les
dosages que
nous avonseffectués varie
entre0
et2 %
enplus, ceci par rapport à l’analyse de référence. Cet excès
estdû à la réaction partielle de quelques polysaccharides
contenusdans le miel. La réaction d’un faible pourcentage de fructose
commele prouve l’analyse
autableau 1
nefausse pas les résultats
carelle
estcompensée par l’utilisation d’un témoin
contenantglucose
etfructose
pour parts égales.
L’estimation que
nouspouvons faire de la
teneur enfructose du miel
estmoins précise que la précédente
etcependant les principaux
sucres autresque le fructose
neréagissent pas,
outrès faiblement, lors du dosage. Pour
cetteanalyse la marge d’erreur que
nousobservons
sesitue
entre2 à 5 %
enexcès
par rapport à la référence. C’est
uneconstatation que
nousn’expliquons pas
etsur
laquelle
nous nepouvons formuler qu’une hypothèse. Il
estpossible que le fructose témoin, produit de l’intervertion chimique du saccharose, réagisse
avecl’acide B indolyl acétique de manière sensiblement différente du fructose du miel qui est, pour partie, le produit de l’intervertion biochimique due à la gluco-invertase sécrétée par l’abeille. Nous
avonsfait
untémoin de référence
avec
du saccharose interverti par voie biochimique;
nousdisposions pour cela d’une préparation d’invertase du
commerce.Dans
ce casles résultats
ontété
identiques à
ceuxobtenus par l’intervertion chimique. Nous
avonsfinalement
retenu cette
dernière technique
carelle
estplus simple à utiliser.
Enfin, si
nouscomparons les résultats des deux estimations colorimé-
triques groupées, ils correspondent
auxrésultats obtenus par
undosage réduc- timétrique
courammentutilisé pour les analyses de miel. Dans
cedomaine, donc, la précision relative des analyses colorimétriques
estéquivalente à celle
d’un dosage chimique classique.
Sur le plan de l’utilisation pratique des résultats l’approximation obtenue
par
cesméthodes colorimétriques apparaît généralement suffisante. Ajoutons
encore comme
élément positif que
cesanalyses peuvent être réalisées
enséries
et
que les colorations obtenues
sontrelativement stables
aumoins pendant le
temps des lectures. Il
estpréférable cependant de
nepas utiliser
cestechniques
pour l’analyse des
sucresréducteurs dans les miellats de sapin. Ces derniers
peuvent contenir de 15 à 20 % de polysaccharides et,
comme nousl’avons
montré, certains de
ces sucresréagissent
enpartie
etfaussent les résultats. Par contre,
nousconseillons
cetype d’analyse
commetechnique d’utilisation
cou-rante, particulièrement
en cequi
concernela recherche du glucose dans les
miels
en vuede la préparation des opérations de conditionnement du miel.
Dans
tousles
casoù l’on
aurabesoin de résultats très précis la chromato-
graphie
enphase gazeuse restera, bien entendu, la méthode de référence.
Reçu
pourpublication
en novembre 1972.Eingegangen
im November 1972.REMERCIEMENTS
Nous tenons à remercier M.
P OURTALLIER , Ingénieur
chimiste au Laboratoire de Recher- chesApicoles
deNice, qui
a réalisé pour nous lesdosages
parchromatographie
enphase
gazeuse.ZUSAMMENFASSUNG
Das Kristallisieren des
Honigs
sowie seinegewerbliche Behandlung,
die daraufabzielt,
seine einwandfreie
Erhaltung
zugewährleisten,
stellenProbleme,
derenLösung
zum grossen Teil von der Beschaffenheit des Produktes und ganz besonders von seinem Gehalt an Glukose und Fruktoseabhängt.
Ziel dieser Arbeit ist es,praktische
und schnelleAnalysen-Methoden aufzuzeigen,
die eserlauben,
denprozentualen Anteil jedes
dieser beiden reduzierenden Zucker unter denArbeitsbedingungen
im Labor einerImkergenossenschaft
oder eines bedeutendenHonighändlers
zu bestimmen.Die
Bestimmung
desGlukosegehaltes erfolgt
durch eine kolorimetrischeMethode,
die Benzidin in saurem Milieubenutzt,
während der Fruktose-Anteil durch eine andere kolorime- trische Methodefestgestellt
wird : hierbei wird dieAnalyse
in einem Milieu von konzentrierter Salzsäure in Anwesenheit vonβ-Indolyl-Essigsäure durchgeführt.
Zur Kontrolle wird eineentsprechende Bestimmung
von Glukose und Fruktose mittelsGas-Chromatographie durchge-
führt
(Tab. 3).
Die
Ergebnisse
sind inbezug
auf die kolorimetrischeBestimmung
der Glukose zufrieden-stellend;
imVergleich
zur Kontrollmethodezeigen
sie nur einen leichtenÜberschuss,
der aufdie Teilreaktionen
einiger
imHonig
vorhandenerPolysaccharide
zurückzuführen ist(Tab. 1).
Bei der
Analyse
der Fruktose sind dieErgebnisse weniger
genau. Das Abweichen von der Kontrolle besteht in einem wesentlich höherenÜberschuss
als im vorangegangenenVersuch,
obwohl die
hauptsächlichen begleitenden
Zuckerwenig reagieren (Tab. 2). Auf jeden
Fall aberist die
Genauigkeit
deraufgezeichneten
Resultate identisch mit oder besser als die der klassi- schen chemischenAnalysen
zurQualitätskontrolle
desHonigs (Tab. 3).
Die in dieser Arbeit beschriebenen
Analysen-Methoden gewährleisten
eine sichere Be-stimmung
des Gehalts an den reduzierenden Zuckern Fruktose und vor allem Glukose imHonig.
Doch dieGas-Chromatographie
bleibt die besteMethode,
wenn eine grosseGenauigkeit
erforderlich
ist,
was in derRegel
beiForschungsarbeiten
oder beim Erstellen von Gutachten zutrifft.Dagegen
dürften in derPraxis,
wenn es darumgeht,
die handelsüblichenEigenschaften
eines
Honigs
zukontrollieren,
die Werte genau genugsein,
um dem für dieBehandlung
desHonigs
Verantwortlichen dienotwendigen
Aufschlüsse zugeben.
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