3. Résultats supplémentaires (non publiés) Au cours de cette thèse, d’autres expériences ont été initiées pour mieux comprendre le rôle joué par la protéine IpaD dans la virulence de Shigella

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3. Résultats supplémentaires (non publiés)

Au cours de cette thèse, d’autres expériences ont été initiées pour mieux comprendre le rôle joué par la protéine IpaD dans la virulence de Shigella et par les anticorps anti-IpaD dans sa neutralisation.

Il s’agit de résultats préliminaires qui doivent être finalisés pour pouvoir être publiés. La

reprend les souches, plasmides et oligonucléotides utilisés.

82 3.1. Domaine N-terminal d’IpaD

En analysant la construction du mutant ipaD

(ipaD

) (Ménard et al., 1993), nous avons remarqué que la cassette aphA-3 (résistance à la kanamycine) avait été insérée après la séquence codant pour les résidus 1-129, correspondant au domaine N-terminal d’IpaD. La présence de ce domaine "résiduel" n’a pu être vérifiée puisque les anticorps anti-IpaD utilisés ont été générés contre les résidus 130-332 (Ménard et al., 1993). Puisque des données récentes suggèrent un rôle du domaine N-terminal dans la régulation du SST3 (Roehrich et al., 2013), nous nous sommes dès lors demandés si le mutant ipaD

exprimait ce domaine et s’il pouvait impacter la régulation de la sécrétion dans ce mutant et ses dérivés. Nous avons construit un nouveau plasmide suicide (pSL113) en enlevant la séquence codant pour les résidus 31-110 et en remplaçant la cassette aphA-3 par la cassette ble (zéocine) (Meghraoui et al., 2014). Le mutant généré (ipaD

) a été vérifié par PCR (cassette ble) et pour l’absence d’effet polaire via la vérification de la production par Western blot de la protéine IpaA (en aval) (résultats non montrés). La comparaison des phénotypes de sécrétion et d’invasion des deux mutants ipaD

n’a cependant permis de distinguer aucune différence (Fig. 21A-C). D’autre part, nous avons généré des anticorps polyclonaux dirigés contre le domaine N-terminal en injectant des souris Swiss avec la protéine His-IpaD

. L’anticorps testé a ensuite permis de montrer la sécrétion du domaine N- terminal par la souche ipaD

(Fig. 21D).

A première vue, le domaine N-terminal produit par la souche ipaD

n’affecte pas la régulation de la sécrétion du SST3. Néanmoins, il semble soit plus prudent d’utiliser une souche qui en est dépourvue pour de futures expériences, soit nécessaire de vérifier si les nouveaux phénotypes observés (variants

"précoces" ou voir point suivant) sont affectés ou non par la présence de ce domaine.

83

Enfin, la détermination de la structure d’IpaD suppose que son domaine N-terminal agisse comme un auto-chaperon en empêchant des interactions cytoplasmiques, comme IpaD-IpaD (oligomérisation) ou IpaD-MxiH (localisation) (Johnson et al., 2007). Nous avons confirmé cette hypothèse en montrant l’interaction avec MxiH et IpaD uniquement lorsque ce domaine est absent (Meghraoui et al., en préparation). Nous avons également montré cette oligomérisation en purifiant la protéine IpaDHis

130

(étiquette interne de 10xHis situé entre les résidus 180-181) et en la faisant migrer en native PAGE comme décrit dans Gébus et al. (2008) (Fig. 22). Ces données confirment donc l’hypothèse d’un rôle d’auto-chaperon pour ce domaine. La construction de mutants ponctuels d’IpaDHis

devrait

.

84

permettre de mieux comprendre l’assemblage du complexe d’extrémité et faire l’objet d’une publication. Le dépliement réversible du domaine N-terminal suite à des variations de température et l’amélioration des techniques de purification d’IpaB (Espina et al., 2006a, Martinez-Becerra et al., 2012) pourraient permettre de reconstituer in vitro le complexe d’extrémité et d’en déterminer la composition et la structure par chromatographie d’exclusion et cryomicroscopie électronique.

3.1. Protéines IpaD étiquettées

Les premières expériences de cette thèse sur IpaD ont été effectuées à partir du gène ipaD caractérisé par une séquence interne, ajoutée par PCR d’assemblage et codant pour une étiquette histidine interne (non montré). Cependant, celle-ci ne complémente que partiellement la sécrétion (Fig.

23), et ne nous a pas permis de mettre en évidence le phénotype des variants "précoces" (résultats non

montrés). D’autres protéines étiquettées en N- et en C-terminal ont également été testées. L’expression de la protéine IpaD-His (C-terminal) dans la souche ipaD

permet de restaurer le contrôle de sécrétion.

Cependant, ce mutant n’est plus inductible au Rouge Congo (Fig. 23).

Il est intéressant de constater que cet effet est dominant puisque la co-expression de celle-ci avec la

protéine IpaD (souche sauvage, M90T) provoque le même phénotype (Fig.24). Nous avons donc

décidé de déterminer quel domaine pouvait en être responsable. Nous avons généré plusieurs délétions

dans cette protéine (domaine N-terminal, hélice α3 ou α7 du domaine coiled-coil et domaine central) et

n’avons observé plus aucun effet sur l’induction de la sécrétion au RC (Fig. 24). En considérant la

régulation allostérique de la sécrétion, ces données suggèrent donc que l’étiquette en C-terminal

interfère avec l’activation de la sécrétion, en imposant soit une conformation OFF à l’aiguille ou en

85

empêchant la transmission du signal du complexe d’extrémité à l’aiguille, en supposant que la protéine tagguée prenne bien place au niveau à l’extrémité du SST3.

D’autre part, la protéine His-IpaD (étiquettée en N-terminal) ne complémente pas la souche ipaD

pour le contrôle de sécrétion mais reste inductible au Rouge Congo (Fig. 23). Lorsque celle-ci est co- exprimée avec la protéine IpaD (M90T), elle provoque toujours cette dérégulation (effet dominant). En générant ces mêmes délétions, nous avons observé le maintien de cette dérégulation uniquement lorsque l’hélice α7 du domaine coiled-coil est délétée (Fig. 25). Ainsi, cet effet ne semble pas dépendre de sa localisation à l’extrémité de l’aiguille. En effet, la délétion des résidus 31-130 n’affecte pas la localisation contrairement aux délétions touchant les résidus 271 à 332 (Schiavolin et al. 2013, Meghraoui et al., en préparation). Ces données suggèrent donc que soit elle empêche la formation du complexe d’extrémité par la protéine sauvage, soit elle joue un rôle dans la régulation de la sécrétion à partir du cytoplasme de la bactérie, en restant sous-forme monomérique (Δ271-332) ou via son domaine N-terminal (Δ31-130), comme c’est le cas pour les homologues LcrG et PcrG de ce domaine chez Yersinia et P. aeruginosa (DeBord et al., 2001, Lee et al., 2010).

En conclusion, les parties N- et C-terminales d’IpaD sont respectivement importantes pour la

régulation cytoplasmique et l’activation de la sécrétion à partir de l’extrémité de l’aiguille. Des études

86

complémentaires par l’adjonction d’autres mutations sur ces variants d’IpaD ou la co-expression de mutants des autres acteurs de la régulation sont nécessaires pour compléter cette partie.

3.2. Interactions entre les translocateurs

La localisation d’IpaB et d’IpaC à l’extrémité de l’aiguille et leur mise en place dans la membrane sont dépendants d’IpaD, ce qui suggère une interaction directe entre IpaD et au moins un des deux translocateurs (Picking et al., 2005, Olive et al., 2007, Veenendaal et al., 2007). Les translocateurs IpaB et IpaC sont instables et dégradés en l’absence de leur chaperon IpgC (Ménard et al., 1994b).

Nous nous sommes donc posés la question de l’effet de l’inactivation d’ipgC sur la stabilité d’IpaD, sachant que ces deux protéines n’interagissent pas ensemble (Zhang et al., 2007). Nous avons donc préparé par sonication des lysats bactériens des souches M90T et ipgC

qui ont ensuite été « coatés » sur une plaque ELISA. L’utilisation d’anticorps polyclonaux spécifiques nous ont permis de montrer une diminution de la quantité des trois translocateurs en solution dans la souche ipgC

, suggérant une interaction entre IpaD et l’un des deux translocateurs (Fig. 26A). Bien que peu probable, le remplacement du gène ipgC par la cassette aphA-3 peut provoquer une diminution de la production d’IpaD (située en aval de l’opéron ipgCipaBCDA) par effet polaire. Nous avons donc décidé de complémenter la souche ipgC

avec le pHI1 exprimant His-IpgC (Page et al., 1999), ce qui restaure la quantité d’IpaD soluble dans la souche ipgC

complémentée (Fig. 26B) et infirme cette hypothèse.

Au vu du rôle d’IpaB dans la régulation de la sécrétion, sa déstabilisation dans le mutant ipgC

pourrait augmenter la sécrétion des translocateurs, dont IpaD, et diminuer sa concentration

intracellulaire. Afin de tester cette hypothèse, nous avons construit un vecteur d’expression contenant

l’opéron ipgC-ipaBCD (pCBCD), lequel a été transformé dans une souche d’E. coli. La production

87

d’IpgC et IpaBCD a ensuite été vérifiée par Western blot (Fig. 27A). Dans un deuxième temps, nous avons délété le gène ipgC (pBCD) et transformé une souche dépourvue des gènes ipa afin de vérifier la fonctionnalité des gènes codés par le plasmide (au moins pour IpaB et IpaD) en sécrétion induite (Fig.

27B). Nous avons observé par ELISA une diminution de la quantité d’IpaD en solution dans la souche

d’E. coli n’exprimant pas le chaperon, ce qui confirme la déstabilisation d’IpaD par IpaB et/ou IpaC (Fig. 27C). Enfin, nous avons délété le gène ipaB ou ipaC sur ces deux vecteurs (pCBCD/pBCD) afin de déterminer quelle protéine est responsable de la déstabilisation d’IpaD.

Ces données permettent d’élargir la fonction de chaperon d’IpgC à la prévention de l’interaction cytoplasmique entre IpaD et IpaB et/ou IpaC. L’identification du (des) translocateur(s) impliqué(s) et les domaines/résidus des différents protagonistes améliorera notre compréhension des interactions prenant place lors de l’insertion du translocon et/ou lors de l’assemblage du complexe d’extrémité.

3.3. Contact cellulaire & résidus 211-250

Au vu des résultats obtenus pour les variants IpaD

à IpaD

et l’hypothèse d’un défaut

d’interaction avec la membrane cellulaire, nous avons décidé de co-exprimer ces différents variants

avec l’adhésine afimbriaire AfaE des E. coli uropathogènes qui permet d’augmenter l’invasion

cellulaire (Labigne-Roussel et al., 1984, Clerc & Sansonetti, 1987). Nous avons généré ces délétions

sur un vecteur compatible qui exprime IpaD (pSL60, pSU18::ipaD). Nous avons vérifié que ces

différents variants présentent également un phénotype intermédiaire dans l’insertion du translocon

(Fig. 28A). Aucune différence n’a cependant pu être observée en hémolyse (Fig. 28B), ce qui suggère

que faciliter le rapprochement bactérie/membrane cellulaire ne suffit pas à restaurer l’hémolyse.

88

D’autre part, les translocateurs IpaBCD sont connus pour interagir avec l’intégrine α5β1 pour promouvoir l’invasion (Watarai et al., 1996). D’autres pathogènes, comme Mycobacterium avium ou Orienta tsutsugamushi, exploitent la fibronectine (ligand de l’intégrine α5β1) pour favoriser leur attachement aux cellules (Zhao et al., 1999, Lee et al., 2008). Chez O. tsutsugamushi, celui-ci dépend de l’interaction entre la fibronectine et les résidus 243 à 349 de l’antigène majeur 56 (Lee et al., 2008).

L’alignement des résidus 211-250 d’IpaD et plusieurs séquences de l’AgM56 (Duong et al., 2013)

nous a permis de mettre en évidence toute une série de résidus similaires ou identiques (Fig. 29). Ces

données suggèrent donc que ces résidus pourraient intervenir dans une interaction avec des récepteurs

membranaires ce qui pourrait en partie expliquer que leur absence altère l’invasion cellulaire.

89 3.4. Anticorps dirigés contre IpaD

Nous avons poursuivi la caractérisation des anticorps monoclonaux anti-IpaD en tentant d’expliquer

leur effet sur la mise en place du translocon via leur capacité à se fixer au complexe d’extrémité. Nous

observons sur la

différentes, IpaD à la surface de la bactérie.

90

D’autre part, ces anticorps ont également été testés in vitro dans un test d’échappement aux macrophages à l’aide de la gentamicine. Dans ce test, la quantité de bactéries est inversement proportionnelle à leur capacité à échapper à la vacuole. Ainsi, nous observons sur la

diminution du nombre de bactéries au cours du temps pour la souche M90T. Etant capable de lyser la vacuole, la souche M90T induit la pyroptose du macrophage et se retrouve dans le milieu extracellulaire où elle est tuée par la gentamicine. Par contre, la souche ipaD

, connue pour être hyper- adhérente (Ménard et al., 1993), est internalisée en plus grand nombre. Cependant, étant incapable de quitter la vacuole et d’induire la pyroptose, elle s’y multiplie dans un premier temps (Fig. 31). Il est intéressant de constater que, d’une part, tous les anticorps sont incapables d’empêcher l’échappement à la vacuole et la pyroptose (temps tardifs vs. précoces) et, d’autre part, les anticorps B8-2 et H15-15 (IgG2a), mais pas l’anticorps A5-3 (IgG2b), favorisent la phagocytose (Fig. 31). Ces résultats montrent donc que ces anticorps ne sont pas forcément efficaces d’un type cellulaire à l’autre.

Enfin, nous avons généré 3 anticorps polyclonaux en souris à partir des protéines GST-IpaD

,

GST-IpaD

(épitope du groupe I) et GST-IpaD

(épitope du groupe II) (Schiavolin et al.,

2013 et résultats non montrés). Ceux-ci pourront par la suite être utilisés afin de comparer l’efficacité

de ces différents antigènes dans la neutralisation du SST3.

91

Discussion

« On ne fait jamais attention à ce qui a été fait ; on ne voit que ce qui reste à faire » Marie Curie

92

93

1. Modèle de la régulation allostérique de la sécrétion

Le modèle de régulation de la sécrétion le plus abouti est le modèle allostérique où des changements conformationnels sont transmis par les sous-unités de l’aiguille (MxiH) de l’extrémité (complexe IpaBD) à la base (MxiC) du SST3 (Blocker et al., 2008, Martinez-Argudo & Blocker, 2010).

Cependant, celui-ci présente certaines lacunes telles que le lien existant entre MxiH et MxiC et le mode de fonctionnement du complexe d’extrémité. En effet, toutes les données concernant IpaB et IpaD ne font qu’appuyer le modèle du bouchon caractérisé par le maintien d’IpaB et/ou IpaD (sécrétion « OFF ») ou leur perte (sécrétion « ON ») au niveau de l’extrémité de l’aiguille.

Notre travail sur les protéines IpaD, MxiC et MxiI a permis d’étoffer et étayer l’existence du modèle allostérique. En effet, la mise en évidence de l’interaction MxiI-MxiC, ainsi que l’effet des mutations ponctuelles MxiI

et MxiC

sur celle-ci, nous ont permis de montrer la nécessité d’une continuité physique pour la transmission du signal de sécrétion entre l’extrémité et la base du SST3 (Cherradi et al., 2013b). D’autre part, l’observation d’une sécrétion exclusive des translocateurs et des effecteurs précoces à l’aide de délétions ou de mutations de la protéine IpaD, et ce, sans affecter la localisation des protéines IpaB/IpaD, affaiblit le modèle du bouchon (Schiavolin et al., 2013, Meghraoui et al., 2014).

1.1. L’aiguille et la tige interne

1.1.1. Transmission du signal de sécrétion par changement de conformation ?

L’activation de la sécrétion est donc transmise des parties externes du SST3 à la base par l’intermédiaire des sous-unités de l’aiguille (MxiH). Nous avons montré que la mutation mxiI

(tige interne) provoque un blocage de la sécrétion des effecteurs similaire à la mutation mxiH

, suggèrant que le signal de sécrétion passe également par la tige interne (Cherradi et al., 2013b). D’autre part, l’inactivation du gène mxiC dans le mutant mxiI

, tout comme dans mxiH

, permet de lever ce blocage (Martinez-Argudo & Blocker, 2010, Cherradi et al., 2013b). L’identification de l’interaction MxiC-MxiI et d’une mutation suppressive extragénique de MxiC (F206S) qui prévient cette interaction et lève ce blocage, suggère que cette interaction est nécessaire pour prévenir la sécrétion des effecteurs.

Conformément à ce modèle, nous n’avons pas observé de perte d’interaction entre MxiC et MxiI

. Enfin, nous n’avons pu détecter d’interaction MxiC-MxiH (Cherradi et al., 2013b), ce qui suggère que la mutation MxiH

provoque un effet sur la tige interne qui empêche la dissociation du "complexe"

MxiI-MxiC et la sécrétion de MxiC.

A l’heure actuelle, cet effet est supposé être un changement conformationnel. Cependant, les

tentatives de mettre en évidence de tels changements au niveau des sous-unités de l’aiguille ont échoué

94

(Cordes et al., 2005, Fujii et al., 2012). Malgré les avancées en microscopie et en cristallographie qui ont permis d’observer la structure atomique d’aiguilles isolées du SST3, celles-ci n’ont pu révéler de différences significatives de conformation pour des mutants de la protéine MxiH. Ainsi, soit ces changements ne peuvent être observés à cette résolution (7 Å), soit l’absence de la base du SST3 bloque l’aiguille dans une conformation unique, "ON" (Fujii et al., 2012). Nous pouvons également envisager que les mutations sélectionnées (Q51A/D73A) n’engendrent pas de changement conformationnel apparent.

La continuité du SST3 peut être assurée par des interactions directes entre les sous-unités de l’aiguille et de la tige interne ou par l’intermédiaire des anneaux membranaires formés par la sécrétine (Kosarewicz et al., 2012, Yang et al., 2013a). D’autre part, la structure de la base du SST3 n’est pas figée et possède une certaine flexibilité, observée lors de l’assemblage ou en fonction de l’épaisseur de la paroi bactérienne (Marlovits et al., 2004, Kudryashev et al., 2013). Sur base de ces observations, le signal de sécrétion peut donc directement être transmis de l’aiguille à la tige interne et/ou par l’intermédiaire des constituants membranaires du SST3 via des changements conformationnels.

Considérant le modèle allostérique, l’absence du complexe d’extrémité ou de MxiC bloque l’aiguille dans une conformation "ON" alors que leur présence conjuguée la maintient dans une conformation

"OFF" (Lee et al., 2010, Martinez-Argudo & Blocker, 2010). Dès lors, la séparation de l’aiguille (IpaBD-MxiH) de sa base (MxiI-MxiC-corps basal) peut altérer sa conformation et empêcher l’observation de changements conformationnels pour des mutants de la protéine MxiH.

La partie N-terminale des sous-unités MxiH/PrgI est moins conservée que leur partie C-terminale, responsable de la polymérisation (Deane et al., 2006, Loquet et al., 2012, Demers et al., 2013).

Certains résidus de la partie N-terminale sont néanmoins conservés et semblent être impliqués dans des

interactions « secondaires » entre sous-unités. Celles-ci ne pourraient-elles dès lors pas être à l’origine

du signal de sécrétion et de sa transmission ? En considérant les résultats de mutations ponctuelles de

l’extrémité N-terminale de MxiH, nous observons que les mutations W10A et L12A présentent un

phénotype similaire à la mutation K69A (MxiC/effecteurs non sécrétés) ainsi qu’une sécrétion réduite

des translocateurs (Kenjale et al., 2005). Or, ces résidus correspondent aux résidus W5 et L9 de PrgI

où le résidu tryptophane est impliqué dans l’interaction de l’extrémité N-terminale de PrgI

(résidu

orange/molécule rouge) avec la tête d’épingle de PrgI

(bleu/vert) et la zone d’interruption

(« cassure ») de l’hélice N-terminale de PrgI

(vert/bleu) (Fig. 32). Par conséquent, le blocage de

sécrétion de MxiC peut être lié à la perte d’un résidu polaire à l’intérieur du canal ou à une perte

d’interaction/stabilisation de conformation entre les sous-unités de l’aiguille.

95

Comme précisé plus haut, le complexe d’extrémité et le gatekeeper imposent probablement une

conformation "OFF" à l’aiguille. Or, ces interactions entre sous-unités ont été observées pour des

aiguilles isolées ce qui suggère qu’elles prennent place lorsque la sécrétion est active ("ON"). Les

substitutions W10A et L12A devraient donc empêcher ces interactions et placer l’aiguille dans une

situation inverse (sécrétion "OFF"), ce qui est le cas au vu des résultats de sécrétion (Kenjale et al.,

2005). D’autre part, la cassure observée pour PrgI/MxiH n’apparait pas pour les protéines

monomériques (Deane et al., 2006, Poyraz et al., 2010, Demers et al., 2013). L’hélice N-terminale

(externe) possédant une flexibilité importante en comparaison à l’hélice C-terminale (canal interne)

(Fricke et al., 2014), ces données suggèrent donc que la structure de l’hélice N-terminale pourrait

osciller entre ces deux états (cassé ou non). Comme nous le verrons plus loin, ce type de cassure est

96

également présent au niveau du domaine coiled-coil d’IpaD, l’interaction IpaD- désoxycholate (DOC) amplifiant celle-ci et activant la sécrétion (Pope et al., 1995, Barta et al., 2012b).

En conséquence, nous pouvons envisager que le signal de sécrétion soit le résultat de changements conformationnels (cassure) de l’hélice N-terminale, modifiant les interactions entre les sous-unités de l’aiguille, et qu’il soit transmis via l’extrémité N-terminale d’une sous-unité i à la tête d’épingle séparant les deux hélices d’une sous-unité i-11 (Fig. 32C).

Ainsi, les résidus C-terminaux précédemment sélectionnés pour la mise en évidence de changements conformationnels ne sont pas impliqués dans ces interactions (Cordes et al., 2005, Fujii et al., 2012), ce qui expliquerait qu’aucune différence n’a pu être observée.

1.1.2. Transmission du signal de sécrétion par protonation ?

Les mutations MxiH

et MxiH

provoque le même effet sur la sécrétion que la mutation MxiH

(Kenjale et al., 2005, Martinez-Argudo & Blocker, 2010). Sur base du modèle de l’aiguille de Salmonella (Loquet et al., 2012), nous pouvons observer que les fonctions amines des chaines latérales des résidus homologues de PrgI (K66, K69 et R80) ne sont pas impliquées dans des interactions entre sous-unités et sont localisées dans le canal de l’aiguille (Fig. 33A). De plus, celles-ci se répartissent le long de la structure de l’aiguille pour former un trajet hélicoïdal (Fig. 33B). Par conséquent, leurs chaines latérales ne pourraient-elles pas, via leurs fonctions amines, former une chaine neutre ou chargée positivement ?

La sécrétion des effecteurs du SST3 (SPI-2) de Salmonella est activée par la différence de pH existant entre la vacuole où réside la bactérie (pH ≈5.0) et le cytoplasme de la cellule (pH 7.2), alors que celle des translocateurs est active à pH 5 et diminue suite au changement de pH (Yu et al., 2010).

Ainsi, l’insertion du translocon dans la membrane vacuolaire expose le SST3 au pH cytoplasmique et permet ce switch de sécrétion via la dégradation d’un complexe, contenant la protéine SsaL (MxiC), à la base du SST3. Ce switch peut survenir en absence des protéines formant le complexe d’extrémité et le translocon, suggérant que l’aiguille pourrait être le senseur ou permettre la formation d’un gradient de pH jusqu’à la base où serait ce senseur (Yu et al., 2010). D’autre part, puisque les résidus K69, K72 et R83 (KKR) de MxiH sont conservés chez leurs homologues, dont SsaG (SPI-2) (Fig. 33C), nous pouvons supposer que la fonction de ces résidus dans la régulation de la sécrétion est similaire. Le dénominateur commun à l’activation de la plupart des SST3 est le contact avec la membrane cellulaire.

La charge négative des phospholipides permet la mise en place d’un environnement plus riche en

protons. (van der Goot et al., 1991). Le pH joue d’ailleurs un rôle essentiel pour l’insertion

97

d’IpaB/IpaC et affecte la structure de MxiH et IpaD, et l’association de cette dernière avec la membrane (De Geyter et al., 1997, De Geyter et al., 2000, Barrett et al., 2008, Markham et al., 2008).

Sur base de ces données, l’activation de la sécrétion pourrait également dépendre de changements de charge (transfert de protons ?) au niveau du canal formé par l’aiguille et la tige interne jusqu’à la base pour permettre la sécrétion du « gatekeeper ».

Ces deux modèles d’activation pourraient être impliqués dans la hiérarchie de sécrétion ou être

complémentaires et assurés deux niveaux de contrôle de la sécrétion. Les changements de

98

conformation des sous-unités MxiH permettraient un repositionnement de ces résidus, pour former ("ON") ou non ("OFF") ce trajet hélicoïdal, indépendamment de leur protonation. Suite au contact avec une membrane, les protons pourraient être transmis à la base du SST3 et permettre la sécrétion.

Un tel mécanisme vient d’être décrit pour un transporteur membranaire de Lactococcus lactis où des changements conformationnels suite à la protonation de certains résidus acides via le gradient électrochimique de protons permet le transport du substrat vers l’extérieur et le transfert des protons dans le compartiment intracellulaire (Masureel et al., 2014). Sachant que la sécrétion de type III est dépendante de ce même gradient, ce type de mécanisme pourrait être à la fois à l’origine de l’activation et de la sécrétion par le SST3.

D’un autre point de vue, les résidus KKR pourraient simplement être impliqués dans la sécrétion de MxiC plutôt que dans la transmission du signal à proprement parler, ce qui expliquerait l’absence de sécrétion de MxiC et MxiC

dans ces variants (Martinez-Argudo & Blocker, 2010, Cherradi et al., 2013b). Un modèle théorique de répulsion électrostatique entre les sous-unités de l’aiguille et les substrats propose que celle-ci stimule leur sécrétion. Ce modèle est cependant basé sur une reconstruction de l’aiguille erronée où le domaine C-terminal de MxiH est exposé à la surface (Rathinavelan et al., 2010). Notons que la mutation de certains résidus de MxiI (ajout de charge) affecte la sécrétion de MxiC (Moussa et al., résultats non publiés), ce qui renforce l’hypothèse d’une sécrétion par force « électrostatique », qu’elle soit attractive ou répulsive. Une étude récente a mis en évidence une rotation de l’extrémité de l’aiguille du SST3 de P. aeruginosa dépendante de la force proton motrice, cette rotation étant nécessaire à la sécrétion (Ohgita et al., 2013a). En considérant l’aiguille comme un écrou et le substrat comme une vis, la rotation de l’aiguille (chargée) pourrait emmener le substrat vers son extrémité via ces forces électrostatiques. Encore reste-t-il à vérifier que ce mécanisme est conservé pour les différents SST3 et que le sens de rotation est approprié pour la sécrétion. Ce modèle n’explique cependant pas pourquoi la sécrétion des translocateurs et effecteurs se produit dans les mutants K69A ou R83A en absence de MxiC, à moins que les autres résidus tapissant le canal de l’aiguille soient impliqués dans la sécrétion des autres substrats et que celle-ci se produise indépendamment de la charge des résidus KKR.

1.1.3. L’activation de la sécrétion chez Shigella

L’activation de la sécrétion chez Shigella est mimée in vitro par l’ajout de Rouge Congo (RC)

(Bahrani et al., 1997). Des résultats précédents obtenus par l’équipe du Dr. Blocker ont révélé que des

mutants ipaD

et ipaB

sont incapables de sécréter l’effecteur IpgD en présence de RC, suggérant que

ce mutant y est insensible et que le complexe d’extrémité en est la cible (Veenendaal et al., 2007). Nos

résultats avec le mutant ipaD

montrent que la sécrétion est bloquée transitoirement et retardée lorsque

99

l’on compare la cinétique de sécrétion en condition induite ou non au RC (Schiavolin et al., 2013). Ces données suggèrent donc que l’aiguille réagit toujours à la présence de RC en absence du complexe d’extrémité, par une « réinitialisation » de la sécrétion, et donc que celui n’en est pas la cible. D’autre part, des données similaires ont été obtenues pour le mutant mxiC

avec un retard partiel de sécrétion des translocateurs (Cherradi et al., 2013b). Or, l’absence de MxiC n’affecte pas la composition du complexe d’extrémité (Martinez-Argudo & Blocker, 2010). Dès lors, la présence du complexe d’extrémité et de MxiC conditionne la réponse de l’aiguille au RC, pour qu’elle passe d’une position

"OFF" à "ON", comme proposé dans le modèle allostérique.

Nous avons observé que la surexpression de la protéine MxiH, qui provoque l’assemblage de longue aiguille (Veenendaal et al., 2007), augmente également la coloration du culot bactérien par le RC (résultats non montrés), suggérant que l’aiguille en est la cible. Pour Yersinia, il a également été proposé qu’YscF (MxiH) soit la cible du calcium, lequel prévient la sécrétion des substrats du SST3 (Torruellas et al., 2005). Enfin, certains mutants de mxiH, inductibles au RC, ne sont pas invasifs alors que des mutants d’ipaD ou ipaB, peu voir non inductibles, gardent toujours leur pouvoir invasif (Kenjale et al., 2005, Roehrich et al., 2010, Roehrich et al., 2013). Ainsi, l’absence de corrélation absolue entre inductibilité au RC et pouvoir invasif renforce l’idée que ces deux mécanismes d’activation (membrane via le complexe vs. RC via l’aiguille) ne sont pas complètement similaires.

1.2. Le complexe d’extrémité 1.2.1. La protéine IpaD

La fonction d’IpaD dans la régulation de la sécrétion passe par sa localisation à l’extrémité de

l’aiguille où elle forme avec IpaB le complexe d’extrémité. Plusieurs résidus des deux hélices de MxiH

sont impliqués dans l’interaction MxiH-IpaD et ces hélices peuvent être superposées avec celles du

domaine N-terminal d’IpaD (Zhang et al., 2007), ce qui suggère donc que la localisation d’IpaD à

l’extrémité de l’aiguille nécessite la partie inférieure des hélices α3 et α7 du domaine coiled-coil,

comme pour SipD (Rathinavelan et al., 2014). Sur base de nos résultats de délétion, seule une délétion

de la partie supérieure de l’hélice α7 n’a pas eu d’effet sur la localisation d’IpaD, contrairement aux

autres délétions du domaine coiled-coil (Schiavolin et al., 2013). La perte de localisation pour les

autres variants de la partie supérieure du domaine coiled-coil est sans nul doute liée à une

déstabilisation de sa structure. Notre étude par mutation ponctuelle n’a, quant à elle, pu montrer de

perte de localisation d’IpaD pour les treize mutants générés, même si six font face au domaine N-

terminal. Néanmoins, trois substitutions sur six (T161D, Q165L et I319D) affectent le contrôle de

100

sécrétion (Meghraoui et al., 2014). On peut dès lors supposer que leurs effets respectifs passent en partie par une modification de l’interaction IpaD-MxiH (Fig. 34A).

Tout comme les substitutions T161D et Q165L précitées, les mutations Y153A et Y276A provoquent un phénotype particulier caractérisé par une sécrétion sélective des translocateurs et des effecteurs précoces (mutants Evv) sans induction au RC (Meghraoui et al., 2014). Ces deux derniers résidus pourraient, quant à eux, être impliqués dans des interactions intra- ou intermoléculaires (Fig.

34A). Nous avons obtenu des résultats similaires avec les variants "précoces" par délétion au niveau de

la région supérieure de la structure (IpaD

à IpaD

et IpaD

), ainsi qu’avec une large délétion du domaine central (IpaD

) (Fig. 34C) (Schiavolin et al., 2013). La répartition des résidus/domaines impliqués et l’observation d’un tel phénotype à l’aide de larges délétions allant jusqu’à 50 acides aminés supposent que celui-ci apparaît suite à des changements conformationnels.

Un même phénotype de sécrétion a été précédemment observé suite à l’ajout de DOC à la culture

bactérienne. En effet, celui-ci augmente la sécrétion des translocateurs et effecteurs de manière

similaire. La sécrétion des effecteurs tardifs n’a, quant à elle, pas été vérifiée (Pope et al., 1995). Les

études de l’équipe du Pr. Picking qui lui ont succédées ne se sont cependant pas intéressées à tous les

substrats sécrétés. L’une d’entre elles a notamment pointé IpaD comme étant la cible du DOC

101

(Stensrud et al., 2008). La résolution de la structure cristallographique IpaD-DOC a révélé un changement conformationnel consistant principalement en un mouvement de l’hélice α7 et une exacerbation de la cassure de l’hélice α3 (Fig. 34D) (Barta et al., 2012b). Comme nous l’avons vu plus haut, une cassure interrompant l’hélice N-terminale des sous-unités de l’aiguille MxiH/PrgJ a également été mise en évidence. Or, le modèle d’interaction IpaD-MxiH propose que l’hélice N- terminale de MxiH interagisse avec l’hélice α3 d’IpaD (Zhang et al., 2007), ce qui suggère fortement que ces cassures soient associées à une activation de la sécrétion.

Enfin, nous avons montré qu’une étiquette histidine situé à l’extrémité C-terminale d’IpaD empêche l’activation de la sécrétion, même en présence de la protéine IpaD sauvage (effet dominant) (voir Fig.

23). Des résultats similaires ont été obtenus pour LcrV (Yersinia), où l’ajout de résidus

supplémentaires au niveau de son extrémité C-terminale provoque une perte d’inductibilité du SST3 en absence de calcium. Cet effet est également dominant sur la protéine LcrV sauvage (Ligtenberg et al., 2013). D’autre part, en réalisant un screening sur IpaD à l’aide de mutations aléatoires, l’équipe du Dr.

Blocker a également montré que plusieurs mutations (N186Y, N273I, Q277L et K291I) dont trois situées au niveau de l’hélice α7 empêchent l’activation de la sécrétion (Fig. 34B), confirmant ainsi l’implication du domaine coiled-coil d’IpaD dans l’activation de la sécrétion (Roehrich et al., 2013).

Dès lors, nous pouvons proposer que l’activation de la sécrétion au niveau du complexe d’extrémité passe par un changement de conformation/position des hélices du domaine coiled-coil d’IpaD qui est au moins transmis à l’hélice N-terminale de MxiH.

Enfin, l’ajout de DOC permet également à la bactérie de multiplier son pouvoir invasif de trois à quatre fois (Pope et al., 1995, Epler et al., 2009). L’étude des variants par délétion n’a pas permis de lier cette sécrétion accrue à une augmentation du pouvoir invasif (Schiavolin et al., 2013). Par contre, les mutations ponctuelles précitées (mutants Evv), qui constitue une approche de mutagénèse

« structurellement moins sévère », ont révélé une augmentation de l’invasion (Meghraoui et al., 2014).

Par conséquent, les mutants Evv pourraient mimer l’effet du DOC sur la structure d’IpaD.

1.2.2. La protéine IpaB

La régulation de la sécrétion dépend également de la protéine IpaB qui forme le complexe

d’extrémité avec IpaD et dont la localisation dépend de cette dernière. Cependant, ces études ont

montré, pour l’une, que la localisation d’IpaB est constitutive (Veenendaal et al., 2007) et, pour

l’autre, qu’elle résulte de l’interaction IpaD-DOC (Olive et al., 2007, Stensrud et al., 2008). Nos

résultats montrent que la localisation d’IpaB ne nécessite pas l’ajout de DOC. De plus, puisque les

mutants Evv présentent un phénotype similaire à celui observé en présence de DOC, nous devrions

102

observer une modification du signal pour IpaB. Or, ce n’est pas le cas (Schiavolin et al., 2013, Meghraoui et al., 2014). Ces différences peuvent s’expliquer par des conditions de croissance différentes (milieu de culture) ou encore par l’utilisation d’anticorps reconnaissant différents épitopes.

Ainsi, l’équipe du Dr. Blocker utilise un anticorps monoclonal (H16) reconnaissant un épitope compris entre les résidus 118-216 d’IpaB (Barzu et al., 1993) alors que l’équipe du Pr. Picking utilise des anticorps de spécificité non documentée (Stensrud et al., 2008), mais qui pourrait reconnaître un épitope non exposé (Oaks & Turbyfill, 1992). Dans notre cas, nous avons généré des anticorps polyclonaux dirigés contre la protéine IpaB entière (Schiavolin et al., 2013), ce qui augmente les chances de cibler un épitope exposé et de ne pas observer de changements subtils de conformation.

D’autre part, nous avons montré que les variants par délétions (précoces) et mutations (Evv) ne sécrètent pas les effecteurs tardifs en absence d’induction au RC contrairement aux variants ipaD

et ipaD

(Schiavolin et al., 2013, Meghraoui et al., 2014). La différence entre ces variants réside dans la localisation d’IpaB. Ainsi, celle-ci est partiellement altérée pour ipaD

et perdue pour ipaD

, tout comme le contrôle de la sécrétion des effecteurs tardifs et l’inductibilité au RC (Schiavolin et al., 2013). Ces données suggèrent donc que la présence d’IpaB, d’une part, maintient l’aiguille dans une conformation telle qu’elle puisse répondre au RC et, d’autre part, régule la sécrétion des effecteurs tardifs. De plus, elles renforcent l’idée que le complexe d’extrémité agit sur la structure de l’aiguille.

Cependant, les données obtenues pour les mutants ponctuels montrent que, même en présence de la protéine IpaB, la sécrétion des effecteurs tardifs peut être constitutive (ipaD

et ipaD

) (Meghraoui et al., 2014). Il est donc possible que des changements conformationnels et/ou de positionnements d’IpaB et IpaD, non détectés par FACS à l’aide d’anticorps polyclonaux, provoquent ce phénotype. Enfin, la plupart des mutations bloquant l’activation de la sécrétion, citées au point précédent, sont situées au niveau du domaine coiled-coil et de la partie supérieure d’IpaD (Roehrich et al., 2010). Il en va de même pour la substitution Y276A qui provoque une sécrétion précoce (Meghraoui et al., 2014). Ces résidus se situent donc au niveau des régions responsables de la localisation d’IpaB (IpaD

et IpaD

) (Fig. 34B-C) (Schiavolin et al., 2013), ce qui suggère que les propriétés d’interaction IpaB-IpaD régulent le blocage et le déclenchement de la sécrétion.

Par conséquent, l’activation et le blocage de la sécrétion par le complexe d’extrémité -1- dépendent probablement de la conformation/position de la protéine IpaB et -2- sont transmis à l’aiguille par l’intermédiaire de la protéine IpaD.

103 1.3. Régulation intracellulaire

Nos résultats pour les variants "précoces" et les mutants Evv montrent une augmentation de la sécrétion des translocateurs et des effecteurs précoces, mais pas d’OspD1 ni des effecteurs tardifs (Schiavolin et al., 2013, Meghraoui et al., 2014). Or comme les effecteurs précoces, OspD1 est stocké dans le cytoplasme en association avec son chaperon Spa15 où il séquestre MxiE qui active l’expression des effecteurs tardifs. Suite à l’activation du SST3 par le RC, la sécrétion d’OspD1 libère MxiE ce qui permet leur expression (Parsot et al., 2005). Par conséquent, nos résultats dévoilent l’existence d’une discrimination intracellulaire entre la sécrétion des effecteurs précoces et OspD1 ainsi que l’existence de deux signaux de sécrétion, l’un pour la sécrétion des translocateurs et des effecteurs précoces et l’autre pour OspD1.

La régulation intracellulaire de la sécrétion étant dépendante de MxiC (Botteaux et al., 2009, Martinez-Argudo & Blocker, 2010), il est envisageable qu’elle joue un rôle dans cette discrimination.

Les résultats pour les variants "précoces" et Evv montrent que MxiC est moins sécrétée que pour le mutant ipaD

(Schiavolin et al., 2013, Meghraoui et al., 2014), ce qui suggère qu’elle pourrait encore prévenir intracellulairement la sécrétion d’OspD1. Un autre candidat pourrait être IpaD puisqu’elle régule intracellulairement la sécrétion (Roehrich et al., 2013). D’autre part, IpaC forme un pool à la base du SST3, lequel est « déplacé » au niveau du complexe d’extrémité lors du contact cellulaire (Jaumouillé et al., 2008, Epler et al., 2009). Sa localisation pourrait donc jouer un rôle dans cette discrimination en libérant un site de « docking ». Néanmoins, l’expression des effecteurs tardifs est détectée lors de l’invasion cellulaire mais aucune donnée ne montre si celle-ci survient suite à la sécrétion des translocateurs lors de ce contact (Ménard et al., 1994a, Campbell-Valois et al., 2014).

1.3.1. Le gatekeeper MxiC

La première fonction de MxiC est la prévention de la sécrétion des effecteurs en absence

d’activation de la sécrétion (Botteaux et al., 2009). La mutation MxiH

semble empêcher la

transmission du signal d’activation (Martinez-Argudo & Blocker, 2010), ou simplement la sécrétion de

MxiC (voir

(tige interne) prévient

également sa sécrétion. Cet effet semble de plus dépendre de l’interaction MxiI-MxiC puisque la

mutation MxiC

empêche à la fois cette interaction et l’effet des mutations MxiI

/MxiH

sur

sa sécrétion (Cherradi et al., 2013b). D’autre part, la première étude sur MxiC a soulevé l’importance

de son signal de sécrétion (résidus N-terminaux), et donc de son adressage à la base du SST3, pour sa

fonction (Botteaux et al., 2009). Nos résultats suggèrent que la sécrétion de MxiC n’est, quant à elle,

pas indispensable. En effet, MxiC

ne semble pas devoir être sécrétée pour lever le blocage de la

104

sécrétion dans les mutants mxiH

et mxiI

(Cherradi et al., 2013b). Par conséquent, la sécrétion de MxiC observée en condition sauvage pourrait être plutôt liée à une fonction effectrice, comme mis en évidence pour ses homologues CopN et HrpJ (Crabill et al., 2012, Nawrotek et al., 2014).

Nous avons montré que cette interaction était conservée pour les SST3 de Yersinia et Salmonella (SPI-1) (Cherradi et al., 2013b). Les homologues InvE (Salmonella SPI-1), SsaL (SPI-2) et SepL (EPEC) de MxiC ne sont pas sécrétés par leur SST3 respectif. Les études sur ces trois protéines montrent que leur localisation est à la fois membranaire et cytosolique, probablement à la base du SST3 (Kubori & Galán, 2002, Deng et al., 2005, Yu et al., 2010). Sur base de la structure du SST3, l’interaction MxiI-MxiC suggère une localisation membranaire pour MxiC. Or, seule une localisation cytoplasmique a été observée (Martinez-Argudo & Blocker, 2010). Comme suggéré par les auteurs, la préparation des échantillons pourrait provoquer la dissociation entre MxiC et la base du SST3 si leur interaction est peu stable. Enfin, l’étude de la structure du SST3 de Salmonella par cryo-EM a mis en évidence un « atrium » d’un diamètre de 40 Å situé à la base de la tige interne (Radics et al., 2014).

Cet atrium présente donc un volume d’environ 33500 ų, lequel pourrait facilement contenir une partie de la protéine MxiC dont les résidus 73-355 occupent, sur base de la structure cristallographique, un volume de 39700 ų (http://vadar.wishartlab.com/).

Le second rôle de la protéine MxiC est de favoriser la sécrétion des translocateurs lors de l’activation du SST3 (Martinez-Argudo & Blocker, 2010). Nos résultats sur le complexe Spa47-MxiC- IpgC propose des pistes pour sa compréhension. Nous avons montré que l’interaction MxiC-IpgC prévient l’interaction avec Spa47, alors que l’expression de MxiC dans Shigella, où IpgC est en complexe avec un translocateur, augmente cette interaction (Cherradi et al., 2013b). Dès lors, MxiC pourrait catalyser l’adressage ou permettre l’interaction préférentielle du complexe IpgC-translocateur à la base du SST3 pour permettre la sécrétion. Cette hypothèse est renforcée par l’observation d’un défaut de recrutement des translocateurs au niveau de la plateforme de tri du SST3 de Salmonella en absence de la protéine InvE (Lara-Tejero et al., 2011). Suite à l’activation du SST3, les translocateurs sont sécrétés, le complexe « apo » Spa47-MxiC-IpgC se dissocie, probablement de manière ATP- dépendante, MxiC-IpgC n’interagit plus avec Spa47, laissant l’ATPase libre pour l’interaction avec un nouveau complexe. Ces interactions pourraient donc permettre un recyclage spécifique du chaperon des translocateurs puis libérer la base du SST3 de MxiC pour permettre la sécrétion des effecteurs.

Nous avons également montré que la protéine MxiC

facilite toujours la sécrétion des

translocateurs et interagit avec IpgC, ce qui suggère que l’interaction MxiI-MxiC n’est pas nécessaire

pour cette fonction (Cherradi et al., 2013b). Il est cependant difficile de concevoir spatialement qu’une

même molécule de MxiC prévienne à la fois la sécrétion des effecteurs au niveau de la tige interne et

105

facilite la sécrétion des translocateurs au niveau de l’ATPase, à moins que ces fonctions soient dépendantes respectivement de ses extrémités N- (X-bundle 1) et C-terminales (X-bundle 3). Des résultats non publiés montrent que l’interaction IpgC-MxiC dépend justement du dernier X-bundle (Botteaux et al., résultats non publiés). La sécrétion des substrats du SST3 commençant par leur extrémité N-terminale (Dohlich et al., 2014, Radics et al., 2014), le X-bundle 1 pourrait se replier dans l’atrium (cité plus haut) et interagir avec MxiI. Par conséquent, une même molécule de MxiC pourrait remplir ces deux fonctions. Cependant, cela suppose que soit l’appareil d’exportation accommode deux substrats dépliés, soit MxiC « rebrousse » chemin, avec IpgC, lors de la sécrétion des translocateurs. Ces deux fonctions pourraient cependant être séparées temporellement ou remplies par deux pools indépendants de MxiC.

Par conséquent, la protéine MxiC est responsable de la hiérarchie de sécrétion entre translocateurs et effecteurs précoces en favorisant et prévenant leur sécrétion respective, et ce probablement via ses interactions avec MxiI et IpgC-Spa47.

Nous ne pouvons cependant pas exclure que l’interaction MxiC-MxiI n’intervienne pas dans la transmission du signal de sécrétion. Des résultats récents obtenus chez P. aeruginosa pour PopN (X bundles 1-2) et son chaperon Pcr1 (X bundle 3) suggère que leur fonction dans la régulation de la sécrétion des effecteurs passe par une interaction avec le domaine cytoplasmique de PcrD (MxiA) (Lee et al., 2014). Si tel était le cas pour MxiC, sa fonction dans la sécrétion des translocateurs et des effecteurs serait remplie par une même protéine, ce qui est en accord avec une localisation cytoplasmique. L’interaction MxiC-MxiI pourrait être un point de contrôle additionnel permettant de bloquer la sécrétion en cas d’une dérégulation interne de la sécrétion en l’absence de signaux extérieurs, ou lors du « rechargement » du pool d’effecteurs après l’activation du SST3, voire encore en cas de cisaillement de l’aiguille. Cette interaction ne se produirait pas pour le mutant mxiC

qui n’interagit plus avec MxiI. L’interaction avec MxiI

serait, quant à elle, tellement forte qu’elle empêcherait sa sécrétion et celle des effecteurs. Enfin, la sécrétion constitutive du mutant mxiC

pourrait résulter d’une perte d’interaction avec MxiA, laquelle n’a pas encore été documentée.

1.3.2. La protéine IpaD

Une étude récente a mis en évidence l’implication d’IpaD dans la régulation de la sécrétion à partir

du cytoplasme. En effet, la mutation ipaD

provoque une sécrétion partielle des

translocateurs/effecteurs et empêche la sécrétion d’IpaD suite à l’activation de la sécrétion. Ce même

phénotype apparait d’ailleurs pour le mutant de mxiC

. De plus, en absence de mxiC, la

sécrétion précoce des translocateurs par la souche ipaD

est bloquée, ce qui suggère que cet effet est

106

MxiC-dépendant (Roehrich et al., 2013). Une étude précédente avait montré que, dans un double mutant mxiC ipaBΔ3, la sécrétion des translocateurs est réduite (MxiC-dépendante) alors que pour les mutants mxiC ipaD et mxiC ipaB, cette sécrétion est constitutive, et donc MxiC-indépendante. Or, la sécrétion des simples mutants ipaB, ipaD et ipaBΔ3 est similaire (constitutive). Par conséquent, l’une de ces deux protéines réprime la sécrétion des translocateurs avant l’induction de la sécrétion, et cette fonction est maintenue pour la souche mxiC ipaBΔ3 (Martinez-Argudo & Blocker, 2010). Sur base des résultats pour ipaD

, les auteurs suggèrent qu’IpaD réprime la sécrétion des translocateurs avant la réception du signal de sécrétion ou facilite leur sécrétion avec MxiC (Roehrich et al., 2013).

Nos résultats concernant la protéine His-IpaD montrent un défaut de complémentation du mutant ipaD en condition non induite (voir

légère de la sécrétion d’IpaD en présence de RC (voir Fig. 23A), bien que ceci reste à confirmer par Western blot. D’autre part, cet effet est dominant lorsque His-IpaD est co-exprimée avec la protéine sauvage et la délétion de l’hélice α7 provoque toujours cette dérégulation (voir Fig. 24). Puisque cette hélice est impliquée dans l’assemblage du complexe d’extrémité (Schiavolin et al., 2013), ces données suggèrent qu’His-IpaD n’affecte pas la sécrétion au niveau de l’extrémité de l’aiguille et qu’IpaD jouerait un rôle dans la régulation de la sécrétion à partir du cytoplasme. Enfin, nous avons montré qu’une faible expression d’IpaD augmente le pouvoir invasif de Shigella sans affecter la régulation de la sécrétion et la localisation d’IpaD (Schiavolin et al., 2013). Par conséquent, seul le pool d’IpaD intracellulaire devrait être diminué et donc la répression qu’il exerce sur les translocateurs réduite, ce qui peut expliquer l’augmentation de l’invasion cellulaire.

1.4. Perspectives

Le complexe d’extrémité est donc le senseur des conditions environnementales (DOC/membrane) et

transmet ces informations à la base du SST3 via l’aiguille et la tige interne. L’identification du

mécanisme par lequel ces structures transmettent le signal d’activation est primordiale pour

comprendre et exploiter/neutraliser ce système. Notamment, la mutagénèse des résidus formant la

cassure aux niveaux des hélices d’IpaD et MxiH, pour renforcer ou empêcher celle-ci (Wilman et al.,

2014), permettrait d’évaluer leur implication dans la transmission du signal de sécrétion. De même,

l’évaluation de l’effet du RC, du pH ou des modifications de charge des résidus KKR ainsi que des

autres résidus tapissant l’intérieur du canal de l’aiguille sur l’ultrastructure du SST3 et la sécrétion

pourrait nous permettre de comprendre l’activation de la sécrétion. D’autre part, la construction de

sondes protéique ou peptidique sensibles au pH (Gera et al., 2012), capables de lier spécifiquement la

forme chargée de MxiH/MxiI et couplées à la GFP par un "spacer" dépliable par l’appareil

107

d’exportation pourrait permettre de mettre en évidence et étudier ce processus. Notons qu’il n’est pas impossible que MxiC interagisse avec MxiH, une fois ses résidus KKR chargés.

Les données sur la sécrétion des substrats par les variants "précoces", Evv et Civ, pour lesquels la composition du complexe d’extrémité n’est pas altérée, et les données sur le blocage de l’activation de la sécrétion par des mutants d’ipaD confortent l’hypothèse d’une régulation allostérique. Cependant, elles n’excluent pas pour autant le modèle du bouchon. Nous pouvons imaginer que l’ouverture du bouchon soit partielle ("précoces", Evv), complète (Civ), ou encore bloquée. Seule l’identification de mutations d’IpaD bloquant la sécrétion en l’absence d’IpaB pourrait porter « un coup fatal » à ce modèle. D’autre part, la détermination des différents états conformationnels du complexe d’extrémité à l’aide de ces mutants pourrait permettre de comprendre son fonctionnement. Cette étude devrait être étendue à l’aiguille et aux autres mutants des différents acteurs de la régulation de la sécrétion afin d’aborder le fonctionnement du SST3 dans son ensemble. Des mises au point sont d’ailleurs en cours pour étudier par microscopie cryoélectronique des SST3 complets (aiguilles + bases) purifiés (Cheung et al., 2013). Enfin, l’identification de mutants d’autres acteurs de la régulation présentant un phénotype similaire (comme nous l’avons montré pour les mutants mxiH

et mxiI

) et l’expression des nouveaux mutants d’IpaD/MxiC identifiés dans différents background de mxiC/ipaD, mxiH et/ou mxiI pourront éprouver/compléter le modèle de régulation allostérique. Il en va de même pour la génération de double mutants, comme par exemple les mutations Civ et celles bloquant l’activation de la sécrétion pour IpaD.

Le rôle de l’interaction MxiI-MxiC, la localisation de MxiC et sa sécrétion sont autant de questions soulevées par notre travail. Ainsi, si cette interaction ne sert que de point de contrôle, MxiC devrait recevoir le signal de sécrétion à partir d’un autre constituant du SST3. Son identification et l’étude de mutation ayant un effet sur les mutants de mxiH/mxiI permettront de compléter la cascade de la régulation. Le candidat en tête de liste serait MxiA, au vu des résultats présentés pour le SST3 de P.

aeruginosa (Lee et al., 2014). De plus, cette étude a également révélé que la protéine PcrG (domaine N-terminal d’IpaD) interagit et coopère avec PopN/Pcr1 (MxiC) pour réguler la sécrétion, comme semble le faire IpaD et MxiC. De plus, PcrG module l’activité de l’appareil d’exportation (FPM) avec PscO (Spa13) (Roehrich et al., 2013, Lee et al., 2014). Par conséquent, le rôle d’IpaD dans la régulation intracellulaire de la sécrétion devrait être étudié dans ce sens.

La localisation de MxiC pourrait être vérifiée dans une souche bloquant sa sécrétion (mxiH

) en

préparant les différents compartiments cellulaires, en fusionnant sa partie C-terminale à un nœud

peptidique ou à la GFP, non dépliables par l’appareil d’exportation (Jaumouillé et al., 2008, Dohlich et

al., 2014). Enfin, la nécessité de la sécrétion de MxiC pourrait être vérifiée via la protéine MxiC

108

fusionnée à ce nœud dans le fond génétique sauvage et mxiH

. Enfin, il est également nécessaire d’investiguer la dynamique des interactions « MxiC-Spa47-IpgC ± translocateur » ainsi que les éventuels liens avec le rôle de MxiC dans le blocage de la sécrétion des effecteurs pour mieux comprendre le mécanisme d’activation de la sécrétion.

2. Modèle du complexe d’extrémité

Les données concernant la structure du complexe d’extrémité sont limitées. Celui-ci a été observé la première fois chez Yersinia et est formé par un pentamère de la protéine LcrV (Mueller et al., 2005, Broz et al., 2007). La différence majeure avec Shigella est donc l’absence de participation du translocateur majeur (YopB) dans la formation du complexe ainsi que dans la régulation de la sécrétion (Hakansson et al., 1996, Mueller et al., 2005). Au vu des données de localisation d’IpaB, il existe deux modèles de complexe pentamérique chez Shigella, l’un formé par quatre copies d’IpaD et une d’IpaB, et l’autre, par cinq copies « allongées » d’IpaD (voir Fig. 18B) (Blocker et al., 2008, Epler et al., 2012). Le premier modèle (théorique) est basé sur la régulation de la sécrétion par IpaD et IpaB, et leur localisation à l’extrémité de l’aiguille du SST3 dans une stœchiométrie ≈ 1:6 alors que le second (empirique) est basé sur une reconstruction de l’extrémité de l’aiguille à partir d’images en TEM (Ménard et al., 1994a, Veenendaal et al., 2007, Epler et al., 2012).

2.1. Modèle allongé ou court ?

Plusieurs données obtenues dans ce travail fragilisent le second modèle (homopentamère).

Premièrement, l’absence d’IpaB dans ce modèle conforte l’idée qu’IpaB ne localise pas à l’extrémité en absence de DOC (Epler et al., 2012). Or tout comme l’équipe du Dr. Blocker, nous avons montré qu’IpaB localise constitutivement à l’extrémité de l’aiguille (Schiavolin et al., 2013, Meghraoui et al., 2014). Son absence pourrait s’expliquer par le fait que les aiguilles isolées utilisées en TEM sont séparées de leur base et ne possèdent donc plus la conformation OFF (Fujii et al., 2012). Les changements conformationnels associés pourraient être transmis au complexe d’extrémité et provoquer l’apparition de molécules d’IpaD allongées.

D’autre part, nos résultats obtenus à l’aide des anticorps monoclonaux ne sont pas non plus en

accord avec ce modèle. Nous avons montré que les anticorps des groupes I et II reconnaissent des

épitopes au niveau du domaine central d’IpaD, lient IpaD à l’extrémité de l’aiguille et interfèrent avec

la mise en place du pore de translocation (voir

modèle allongé et ce même modèle où le domaine central reste accolé au domaine coiled-coil, comme

pour la protéine en solution, la région contenant l’épitope reconnu par les anticorps du groupe I ne

présente pas la même conformation (Fig. 35).

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De plus, contrairement à la protéine IpaD repliée, les anticorps du groupe II n’ont pas accès à leur épitope sous cette forme allongée (Fig. 36). Puisque ces anticorps lient à la fois la protéine en solution et exposée à la surface de la bactérie, la structure allongée ne semble pas être celle retrouvée à l’extrémité de l’aiguille lors de la culture en condition normale.

Enfin, nous avons également montré que plusieurs résidus de la protéine IpaD ne sont pas conservés entre les sérotypes, certaines de ces substitutions interférant avec la liaison des anticorps sur IpaD (voir point 2 Résultats). Ce polymorphisme permet donc aux différents sérotypes d’échapper au système immunitaire et suggère une exposition à la surface. Il en va de même pour l’hélice N- terminale de MxiH, exposée à la surface et moins conservée entre homologues (ainsi qu’entre sérotypes), alors que l’hélice C-terminale est orientée vers le canal de l’aiguille et conservée (Demers et al., 2013). Or, tous les résidus polymorphes d’IpaD sont enfouis dans la structure du modèle allongé, contrairement au modèle replié (Fig. 36).

Par conséquent, le pentamère allongé d’IpaD n’apparaît probablement pas à l’extrémité de l’aiguille au "repos", donc avant tout contact cellulaire.

Notons qu’il existe un troisième modèle, proposé pour Salmonella, basé sur la structure de la

protéine de fusion PrgI-SipD

qui adopte une position ouverte, pouvant correspondre à un état

d’activation (Lunelli et al., 2011). Cependant, celui-ci suppose une orientation de PrgI différente de

celle observée pour la structure atomique de l’aiguille (Loquet et al., 2012). La réorientation correcte

de PrgI selon ce modèle provoque un encombrement stérique massif. Ces auteurs proposent d’ailleurs

l’existence d’un complexe pentamérique non allongé où SipD s’imbrique entre deux molécules de PrgI

(Rathinavelan et al., 2014). Enfin, les changements conformationnels générés par le complexe PrgI-

SipD

sont stabilisés par l’interaction entre les résidus S148 et W234 d’une même molécule, et dont

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les substitutions réduisent l’invasion (Lunelli et al., 2011). Or, nous avons montré que la mutation en

alanine du résidu W226, homologue à ce résidu W234, n’a aucun effet sur la fonction d’IpaD

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(Meghraoui et al., 2014). Enfin, si nous considérons que l’aiguille isolée est bloquée dans une conformation "ON" (activée) (Lee et al., 2010, Fujii et al., 2012), la structure du complexe observé par Epler et al. (2012) devrait être similaire, or ce n’est pas le cas. Il est donc peu probable que cette structure prenne place au niveau du complexe d’extrémité.

2.2. Modèle homo- / hétéro-pentamérique ou héxamérique ?

La mise en évidence de la localisation exacte d’IpaB est cruciale pour pouvoir déterminer lequel de ces modèles s’applique au complexe d’extrémité de Shigella. Nous avons montré que la région d’IpaD nécessaire pour la localisation correcte d’IpaB est située entre les résidus 271-290 (hélice α7 du domaine coiled-coil) (Schiavolin et al., 2013). L’alignement de ces résidus pour les 13 séquences d’IpaD disponibles, couvrant les 4 clusters identifiés (voir

parfaite conservation de l’hélice α7 (non montré), suggérant que cette région n’est pas exposée et/ou n’est pas la cible d’anticorps neutralisant. L’assemblage des constituants du complexe hétéro- pentamérique dissimule cette région. Par contre, celle-ci est exposée pour l’homo-pentamère, qu’il soit allongé ou non (Fig.

immunitaire, ce qui permet de proposer que le canal formé par l’homo-pentamère court (replié) soit

« comblé » par la protéine IpaB, formant dès lors un hétéro-hexamère (Fig. 38B).

La localisation d’IpaB et IpaD, ainsi que la polymérisation de MxiH, nécessitent leurs résidus C-

terminaux respectifs (Kenjale et al., 2005, Espina et al., 2006a, Roehrich et al., 2010), suggérant que

toutes les interactions impliquées soient du même type et engagent une ou plusieurs partie(s) de leur

domaine coiled-coil, lequel serait formé pour IpaB par les résidus 110-170 et 514-580 (Shen et al.,

2010). Ces informations soutiennent donc le modèle hétéro-pentamérique qui se base sur le

remplacement de la dernière molécule d’IpaD par IpaB. Si IpaD interagit avec MxiH comme le fait