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Relation plante-hôte / Frankia dans les symbioses actinorhiziennes : cas particulier des souches
non-isolables capables de sporuler in-planta
Laetitia Cotin-Galvan
To cite this version:
Laetitia Cotin-Galvan. Relation plante-hôte / Frankia dans les symbioses actinorhiziennes : cas parti- culier des souches non-isolables capables de sporuler in-planta. Ecologie, Environnement. Université Claude Bernard - Lyon I, 2014. Français. �NNT : 2014LYO10183�. �tel-01132324�
N° d’ordre : 183-2014 Année 2014
THESE DE L‘UNIVERSITE DE LYON Délivrée par
L’UNIVERSITE CLAUDE BERNARD LYON 1
ECOLE DOCTORALE : Evolution, Ecosystèmes, Microbiologie, Modélisation (E2M2)
DIPLOME DE DOCTORAT
(Arrêté du 7 août 2006)
Soutenue publiquement le 29/09/2014 par Mme COTIN-GALVAN Laetitia, Janine
Relation plante-hôte/Frankia dans les symbioses actinorhiziennes : cas particulier des souches non-isolables capables de sporuler
in-planta
Directeur de thèse : Pr. FERNANDEZ Maria
Encadrant de thèse : Dr. HERRERA-BELAROUSSI Aude
JURY :
Mme V. HOCHER CR1, IRD, Université de Montpellier 1 Rapporteur M. C. BERTRAND MdC Université de Perpignan Rapporteur M. M. GTARI Pr. Université de Tunis El-Manar Rapporteur M. G. COMTE Pr. Université Lyon 1 Examinateur Mme M. FERNANDEZ Pr. Université Lyon 1 Examinateur Mme A. HERRERA-BELAROUSSI MdC Université Lyon 1 Examinateur
UNIVERSITE CLAUDE BERNARD - LYON 1
Président de l’Université
Vice-président du Conseil d’Administration
Vice-président du Conseil des Etudes et de la Vie Universitaire
Vice-président du Conseil Scientifique Directeur Général des Services
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COMPOSANTES SANTE
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Institut des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques Institut des Sciences et Techniques de la Réadaptation Département de formation et Centre de Recherche en Biologie Humaine
Directeur : M. le Professeur J. ETIENNE Directeur : Mme la Professeure C. BURILLON Directeur : M. le Professeur D. BOURGEOIS Directeur : Mme la Professeure C.
VINCIGUERRA
Directeur : M. le Professeur Y. MATILLON Directeur : Mme. la Professeure A-M. SCHOTT
COMPOSANTES ET DEPARTEMENTS DE SCIENCES ET TECHNOLOGIE
Faculté des Sciences et Technologies Département Biologie
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UFR Sciences et Techniques des Activités Physiques et Sportives
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Directeur : M. A. MOUGNIOTTE Directeur : M. N. LEBOISNE
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RESUME
La sporulation est un phénomène présent chez de nombreux microorganismes, généralement impliqué dans les mécanismes de dispersion et/ou résistance en conditions environnementales défavorables. La sporulation observée chez certaines souches de Frankia (genre actinobactérien fixateur d’azote) lors de leur interaction symbiotique avec les plantes actinorhiziennes est donc paradoxale dans un contexte où la bactérie bénéficie d’une niche écologique favorable à son développement. Ces souches particulières de Frankia, dites Sp+, représentent un modèle unique de symbiote capable de sporulation au sein même des cellules de son hôte. Le rôle écologique et le sens évolutif de cette sporulation in-planta reste à ce jour peu élucidé. Les deux principaux objectifs de ce travail de thèse visent donc à (i) comprendre l’influence de la sporulation in-planta sur les capacités symbiotiques des souches Sp+, en termes d’infectivité et de compétitivité et (ii) appréhender l’impact de cette sporulation sur le fonctionnement du complexe symbiotique par une méthode de profilage métabolique. Ces travaux ont permis de confirmer les particularités symbiotiques des souches Sp+ (infectivité et compétitivité accrues) et de montrer des différences significatives dans le métabolisme primaire et secondaire du complexe symbiotique associées à la présence de spores de Frankia.
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TITRE en anglais : Frankia/host-plant relationship in actinorhizal symbiosis : particular case of non-isolable strains capable of in-planta sporulation
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RESUME en anglais
Sporulation is a phenomenon present in many microorganisms, usually involved in the mechanisms of dispersion and/or resistance to unfavorable environmental conditions.
Sporulation occurs in some Frankia strains (a diazotrophic actinobacteria) during their symbiotic interaction with actinorhizal plants, which is paradoxical in a context where the bacterium has a favorable ecological niche for its development. These particular Frankia strains, called Sp+, represent a unique model of symbiont capable of sporulation within the host cells. The ecological role and the evolutionary meanings of this in-planta sporulation still remain understood. The two main objectives of this thesis aimed to (i) understand the influence of in-planta sporulation on the symbiotic capacity of Sp+ strains in terms of infectivity and competitiveness and (ii) understand the impact of this sporulation on the functioning of the symbiotic complex by a metabolic profiling approach. These studies have confirmed the symbiotic characteristics of Sp+ strains (greater infectivity and competitiveness) and have shown significant differences in the primary and secondary metabolism of the symbiotic complex associated with the presence of Frankia spores.
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DISCIPLINE : Ecologie Microbienne
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MOTS-CLES
Sporulation in-planta, symbiose actinorhizienne Frankia-Alnus, nodosité, Sp+, Sp-, infectivité, compétitivité, profilage métabolique
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INTITULE ET ADRESSE DE L'U.F.R. OU DU LABORATOIRE :
UMR 5557 CNRS UCBL Laboratoire d’Ecologie Microbienne, 43 bd du 11 novembre 1918, Villeurbanne
Remerciements
Je remercie François-Noël Gilly, président de l’Université Lyon 1 pour avoir accepté que je réalise cette thèse au sein de l’université ainsi qu’Yvan Moënne-Loccoz, directeur de l’UMR 5557 d’Ecologie microbienne pour son accueil au sein du laboratoire.
Je tiens à remercier Maria, pour avoir accepté de diriger ma thèse et m’avoir accordé sa confiance pour la réalisation de ce sujet. Mes remerciements vont également à Aude, pour son encadrement tout au long de ces 4 années et pour sa disponibilité face aux épreuves de la thèse.
Je tiens à remercier tout particulièrement les membres du jury pour avoir accepté d’évaluer mon travail de thèse.
Je remercie également la plateforme IBIO (Audrey et Danis) pour leurs connaissances en statistiques, ainsi que la plateforme serre (Denis, Elise et Franck) pour avoir accueillis mes innombrables aulnes pendant ces 3 années et de m’avoir aidé.
Je remercie l’ensemble des personnes du 5557 pour leur gentillesse et leurs aides distribuées au cours de discussion diverses.
Je remercie l’ensemble des anciens et présents membres de l’équipe Symbiose Actinorhizienne pour les diverses discussions scientifiques, leurs conseils, leur aide, pour la bonne humeur autour des pauses café, … et surtout Anne-Emmanuelle pour son implication dans la partie métabolomique.
Je tiens à remercier les membres de l’équipe Rhizosphère pour leur accueil pendant mon M2 recherche et tout particulièrement Claire Prigent-Combaret et Daniel Muller pour leur encadrement tout au long de mon stage.
Je remercie l’ensemble de mes stagiaires (Guillaume, Elise, Nelly, Anh, Antoine) pour leur aide dans mes analyses et pour leur patience dans le « sacrifice » des plantes pendant les longs mois de juillet. Je les remercie également pour les moments sympathiques que nous avons partagés.
Je remercie Adrien, pour sa disponibilité et son écoute, pour son sens critique de l’analyse et pour sa persévérance dans l’organisation de notre salle de manip !
Je remercie l’ensemble de mes collègues devenus des ami(e)s (Benjamin, Adrien, Hugo, Elise, Imen, Lorena, Guillaume, …) pour les longues discussions, pour les repas partagés ensemble et les franches rigolades.
Je dédie ce travail à l’ensemble des membres de ma famille et je remercie tout particulièrement mes grands-parents, mes parents et mon mari pour leur soutien et leur patience durant ces 4 années.
Table des matières
ABREVIATIONS ... 1
INTRODUCTION GENERALE ... 3
PARTIE 1 : Synthèse bibliographique ...10
Introduction ...11
1. La sporulation chez les microorganismes : morphologie, physiologie et mécanismes génétiques ...12
1.1 Diversité morphologique de la sporulation ...12
1.1.1. Sporulation chez les champignons ...12
1.1.2. Sporulation chez les bactéries ...13
1.2. Rôle de la sporulation et impact sociétal ...16
1.2.1. Les spores : un élément de résistance ? ...16
1.2.2. Les spores : un élément de multiplication et de dispersion ? ...17
1.2.3. Impact de la sporulation pour l’homme, les animaux et les végétaux ...18
1.3. Physiologie de la sporulation et métabolisme cellulaire ...20
1.3.1. Étapes de la sporulation ...20
1.3.2. Germination de la spore...23
1.3.3. Métabolisme cellulaire ...23
1.4. Mécanismes génétiques ...25
1.4.1. Bactéries firmicutes ...25
1.4.2. Actinobactéries ...27
1.4.3. Champignons ...29
1.4.4. Et qu’en est-il pour Frankia ? ...30
2. La sporulation microbienne dans le cadre d’interactions plante-microorganisme ...31
2.1. Localisation de la sporulation ...32
2.1.1. Sporulation hors des cellules de la plante hôte ...32
2.1.2. Sporulation à l’intérieur des cellules de la plante hôte ...33
2.2. Facteurs influençant la sporulation ...34
2.2.1. Facteurs intrinsèques à la souche microbienne ...34
2.2.2. Facteurs externes ...35
2.3. Conséquences de la sporulation sur l’interaction microorganismes - plantes ...38
2.3.1. Effet sur la fitness et l’infectivité des souches ...38
2.3.2. Effet sur la plante hôte ...41
Conclusion générale ...43
PARTIE 2 : ...44
Impact de la sporulation in-planta sur l’infectivité et la compétitivité des souches Sp+ de
Frankia ...44
Introduction ...45
Chapitre 1 : Développement d’un protocole d’étude de compétitivité entre les souches Sp+ et Sp- de Frankia sur plante hôte Alnus glutinosa ...47
1. Contexte et objectifs ...48
2. Matériel et méthodes ...49
3. Résultats ...50
4. Discussion ...53
5. Conclusion ...55
Chapitre 2 : Article L. COTIN-GALVAN ...56
Abstract ...58
Introduction ...59
1. Material and Methods ...60
2. Results ...63
3. Discussion ...65
Acknowledgment ...69
References ...69
Conclusion ...74
Compétences symbiotiques des souches de Frankia capables de sporuler in-planta ...74
Partie 3 : ...79
Modifications du métabolisme nodulaire associées à la sporulation in-planta de Frankia par approche de profilage métabolique...79
Introduction ...80
Chapitre 1 ...83
Développement d’un protocole d’extraction des métabolites de nodosités d’aulne pour analyse en HPLC, LC-MS et GC-MS ...83
Introduction ...84
Matériels et méthodes ...86
Résultats & Discussion ...88
Conclusion ...89
Chapitre 2 ...91
Recherche de modifications du métabolisme nodulaire associées à la sporulation in-planta de Frankia par approche de profilage métabolique ...91
1. Introduction ...92
2. Matériels et méthodes ...92
3.Résultats ...95
4. Discussion ...97
Conclusion ... 101
DISCUSSION GENERALE - PERSPECTIVES... 103
ANNEXES ... 111
Annexe 1 : Article soumis A. Pozzi ... 112
Annexe 2 : Partie 3 - Chapitre 2 - Chromatogrammes complémentaires ... 128
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ... 130
ABREVIATIONS
AcOEt : Acétate d’Ethyl
ACP : Analyse en Composante Principale ADN : Acide DésoxyriboNucléique
ADNr : Acide DésoxyriboNucléique ribosomique ARN : Acide RiboNucléique
BAP (milieu) : Buffered mineral medium Added of Phosphatidylcholine BSA : Bovine Serum Albumin
ChCl3 : Chloroforme
C/N : rapport Carbone/Azote DAD : Diode-Array Detection DMSO : Diméthylsulfoxyde
dNTP : désoxyriboNucléotide TriPhosphate DPA : DiPicolinic Acid
ESI : Electrospray Ionization Source (ionisation par électronébuliseur) GC/MS : Gas Chromatography-Mass Spectrometry
GS, NADH-GOGAT : Glutamine Synthetase, Nicotinamide Adénine Dinucléotide-Glutamine OxoGlutarate AminoTransferase
HPLC : High Performance Liquid Chromatography (chromatographie en phase liquide à haute performance)
MALDI-SIMS : Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization- Secondary Ion Mass Spectrometry
MeOH : Méthanol min : minutes
MLSA : MultiLocus Sequence Analysis nm : nanomètre
Pb : Paire de bases
PCR : Polymerase Chain Reaction
pH : potentiel Hydrogène PVP : Poly Vinyl Pyrrolidone QC : Contrôle Qualité
QTOF : Quadrupole Time-Of-Flight
RMN : Résonnance Magnétique Nucléaire RNAseq : Ribonucleic acid sequencing
RT-PCRq : Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction quantitative SASPs : Acid Soluble Spore Proteins
Sp+ : Spore Positive Sp- : Spore Négative
Taq : AND polymerase thermostable de Thermus aquaticus TIC : Total Ion Chromatogram
Tm : melting Temperature U.V. : Ultra-Violet
%GC : Pourcentage en Guanine et Cytosine
INTRODUCTION GENERALE
Figure 1 : Généralités – rôle de la sporulation chez les microorganismes
Multiplic ation e t disper sion
Multiplic at ion e t disper sion
Non des tructi f Ch am pig n ons Actinobact éries Firmicut e s Spor e unique R ésis tance
Sacr ifice
Spor es mult iples Non des tructif Spor es mult iples
Frankia
La sporulation de nombreux organismes vivants est une stratégie adaptative facultative, qui consiste en une différenciation cellulaire conduisant de la cellule végétative, capable de se multiplier, à la cellule sporale, ayant un métabolisme inactif et étant incapable de multiplication (Gottlieb et al., 1973). Deux principales formes de sporulation sont retrouvées chez les organismes : la sporulation sexuée et la sporulation asexuée (multiplication végétative). Chez les organismes eucaryotes, même inférieurs comme les champignons, la sporulation peut suivre les deux types de mécanismes (reproduction sexuée ou non sexuée), les deux formes existant même souvent chez le même organisme.
Par contre, chez les bactéries, la sporulation est un processus optionnel basé uniquement sur la reproduction asexuée. Cette dernière, définie comme une différenciation cellulaire sans recombinaison méiotique, entraîne alors la production d’une forme de vie dormante, la spore, résistante aux agressions physiques et chimiques de l’environnement (Willey, 2013).
La sporulation asexuée permet la production de descendants résistants, réalisant une dispersion temporelle et spatiale de l’organisme, lui permettant de se développer plus tard et ailleurs plutôt qu’ici et maintenant (Solbreck, 1978).
Chez les champignons, la sporulation représente davantage un moyen de multiplication et de dispersion, en revanche chez les bactéries, elle serait plutôt impliquée dans la résistance à des conditions environnementales défavorables (Dworkin, 2010) (Figure 1). Notons que les bactéries n’ont pas développé uniquement la sporulation comme moyen de dormance, mais il existe aussi une autre forme de dormance n’impliquant pas une différenciation morphologique, comme les bactéries viables mais non cultivables (VBNC) ou les cellules persistantes (qui représentent également des états de vie ralentie voire inactif et dont les propriétés de résistances se rapprocheraient de celles des spores (Balaban, 2004 ; Lewis, 2007 ; Dworkin, 2010 ; Oliver, 2010).
La sporulation est donc un processus complexe, présent chez divers organismes vivants. Il peut résulter de différents mécanismes et les spores qui en résultent n’ont pas toutes le même rôle et la même morphologie selon les organismes étudiés. Cependant, ce processus semble toujours s’inscrire dans le cycle de vie de l’organisme concerné comme une forme de dispersion, multiplication et/ou résistance.
Dans ce contexte, mes travaux de thèse se sont focalisés sur un cas atypique de sporulation réalisé par des actinobactéries, fixatrices d’azote en symbiose, appartenant au genre Frankia. En effet, un phénomène de sporulation in-planta non attendu dans un contexte symbiotique, réalisé par certaines souches de Frankia, a été rapporté dans un contexte de symbiose plante-bactérie, les spores étant formées à l’intérieur même des cellules de l’hôte
végétal hébergeant le microsymbiote (VanDijk et Merkus, 1976 ; VanDijk, 1978). Ce cas de sporulation bactérienne est observé dans un environnement confiné, les nodosités et les cellules de l’hôte végétal, favorables au développement de la bactérie, et ne représente pas donc pas à priori un contexte où la dispersion et/ou la résistance s’avère nécessaire pour la bactérie. Ce processus soulève donc de nombreuses questions quant aux mécanismes impliqués et aux avantages évolutifs pour le symbiote bactérien et pour la plante hôte.
Cas unique de sporulation in-planta de certaines souches de Frankia en symbiose avec les plantes actinorhiziennes
Frankia est une actinobactérie filamenteuse fixatrice d’azote capable de s’associer avec des plantes dites actinorhiziennes afin de favoriser leur croissance par un apport d’azote dans des milieux de vie difficiles. En échange de l’azote fournit à la plante, les souches récupèrent divers éléments carbonés de la plante et trouvent au sein de la plante un lieu de vie et de multiplication (Benson et Silvester, 1993). Cette association est nommée symbiose (sensu stricto) à bénéfices réciproques, et entraîne la mise en place d’un nouvel organe végétal : la nodosité. Plusieurs types de symbioses nodulaires avec des bactéries diazotrophes existent : la symbiose entre Rhizobium et les plantes légumineuses, qui est un modèle largement étudié (Freiberg et al., 1997 ; Long, 1989) et la symbiose Frankia/plantes actinorhiziennes bien moins étudiée, en particulier du fait des difficultés de mise en culture du symbiote et de sa croissance lente. Toutes les souches de Frankia sont capables de sporuler en culture pure mais une fois en symbiose avec une plante-hôte compatible, seules certaines souches conservent cette capacité à sporuler in-planta, formant de nombreux sporanges au sein même des cellules végétales de la nodosité (VanDijk et Merkus, 1976).
Ces études ont amené à reconnaître l’existence de deux types de souches (« Two-strain concept » de VanDijk en 1978), les souches sporulantes in-planta (Sp+ pour Spores positives), et les souches ne sporulant pas en symbiose (Sp- pour Spores négatives) (Schwintzer, 1990). Ce phénomène de sporulation au sein des cellules végétales est à notre connaissance un cas unique chez les microorganismes.
Les souches Sp+ sont actuellement décrites chez 9 des 25 genres de plantes actinorhiziennes (Alnus, Comptonia, Myrica, Ceanothus, Elaeagnus, Hippophae, Casuarina, Purshia et Dryas) (Torrey, 1987 ; Schwintzer, 1990). Dans le cadre de ces travaux, notre choix s’est porté sur le genre Alnus de la famille des Bétulacées pour plusieurs raisons (i) une grande distribution des souches Sp+ au sein du genre Alnus, (ii) la répartition géographique mondiale du genre Alnus est très importante, ainsi que sa diversité en termes d’espèces et sous-espèces (Navarro et al., 2003 ; Chen et Li, 2004 ; Ren et al., 2010), (iii)
Tableau 1 : Descriptif des génomes séquencés de Frankia Souche Frankia CladeTaille génome% GCNb de gènes Gènes ARNrGènes ARNtNuméro d'accessionRéférences ACN14aI 7,497,93472.836795 6 46 CT573213Normand et al. 2007 CcI3 I 5,433,62870.084621 6 46 CP000249.1 Normand et al. 2007 QA3 I 7,590,85372.596546 4 46 CM001489.1 Sen et al. 2013 Dg1 II 5,323,33670.044579 6 44 CP002801 Persson et al. 2011 EAN1pec III 8,982,04271.15 7250 9 47 CP000820.1 Normand et al. 2007 ; Beauchemin et al. 2012 EUN1fIII 9,322,17370.827833 9 47 NC014666 Beauchemin et al. 2012 BMG5.12 III 7,589,31371.676342 5 51 ARFH0100000 Nouioui et al. 2013 BCU110501 III 7,891,71172.396839 8 47 ARDT0100000 Wall et al. 2013 EuI1c IV8,815,781 72.317262 9 46 CP002299.1 Beauchemin et al. 2012 CN3IV9,978,592 71.728412 5 68 AGJN0100000 Ghodhbane-Gtari et al. 2013 DC12 IV6,884,33671.925858 9 46 Tisa, unpublished D’après Tisa et al., 2013
les aulnes sont cultivables au laboratoire dans différentes conditions et de nombreuses études ont déjà été réalisées sur ce modèle (iv) c’est le genre le plus étudié en ce qui concerne la sporulation in-planta (Schwintzer, 1990). Dans notre étude nous nous proposons de reprendre ces travaux à la lumière des nouvelles approches moléculaires qui n’étaient pas disponibles auparavant sur ce modèle (VanDijk, 1978 ; Wheeler et al., 1981 ; Weber, 1986 Holman et Schwintzer, 1987 ; Kurdali et al., 1988, Kurdali et al., 1990 ; Markham, 2008).
Complexité et limites du modèle Frankia/Alnus pour l’étude de la sporulation in-planta
Alors que la propriété fixatrice d’azote des souches de Frankia a largement été étudiée pour son rôle fondamental dans le fonctionnement de la symbiose (Burggraaf et Shipton, 1983 ; Reddell et Bowen, 1985 ; Sellstedt et al., 1986), d’autres caractéristiques du symbiote, comme sa capacité à sporuler en symbiose sont peu référencées. Très peu de données sont disponibles sur la sporulation chez Frankia, ce qui s’explique en partie par la complexité de ce modèle microbien.
En effet, les souches Sp+ de Frankia ne sont à ce jour pas isolées et cultivées au laboratoire (Torrey, 1987; Schwintzer, 1990), malgré de multiples tentatives réalisées, et à ce jour, seules des cultures pures de souches Sp- sont disponibles en laboratoire (VandenBosch et Torrey, 1984 ; Baker et al., 1979 ; Normand et al., 1982 ; Quispel et Tak, 1978) et parmi les 11 génomes de Frankia séquencés disponibles actuellement, dont une souche isolée d’Alnus, tous sont Sp- (Tableau 1). De façon plus large aucun système de transformation ou de mutation dirigée n’est disponible sur Frankia (Normand et al., 2007) limitant de façon importante toute étude de génétique ou d’écologie fonctionnelle. Du fait de ces limitations technologiques la majorité des travaux concernant la sporulation in-planta sont anciens et peu extrapolables car limités à quelques modèles.
Hypothèses et objectifs des travaux de thèse
La non-cultivabilité des souches Sp+ de Frankia rend complexe la compréhension du phénomène de sporulation in-planta, qui peut être sous l’influence de plusieurs facteurs : la bactérie elle-même, la plante hôte et l’environnement. Il a été montré que la capacité à sporuler in-planta était une caractéristique stable, sous le contrôle de la bactérie, et que les souches Sp+ et Sp- étaient différentiables génétiquement. (VanDijk, 1978 ; VandenBosch et Torrey, 1985 ; Schwintzer, 1990 ; Simonet et al., 1994). Cependant d’autres travaux ont également suggéré une l’influence de la plante-hôte sur la capacité de sporulation des souches, notamment en fonction de son génotype, de son âge et de la périodicité
saisonnière mais aussi de l’influence des conditions environnementales (climat, latitude, composition du sol et son pH, …) qui pourraient influencer la distribution des souches Sp+
(Schwintzer, 1990). On peut donc en déduire que le génotype de la souche détermine la capacité de sporulation in-planta mais que la plante et l’environnement aurait une influence en modulant son expression. De récents travaux de l’équipe ont également montré dans le cadre d’une étude phylogénétique incluant un large échantillonnage de souches Sp+ (i) que les souches Sp+ sont réparties en plusieurs clades phylogénétiques en fonction de leur phénotype Sp+ ou Sp- (ii) que leur répartition est fonction de la plante-hôte d’origine et que (iii) l’effet géographique dans cette phylogénie n’est pas un facteur explicatif de la répartition des souches (Pozzi et al., soumis).
Très peu d’études se sont attachées à élucider le phénomène de sporulation in-planta, le sens évolutif de ce trait et ses conséquences sur le fonctionnement de la symbiose. Ce phénomène entraine de nombreuses questions sur l’impact de la sporulation sur la symbiose et sur chacun de ses partenaires.
Plusieurs auteurs ont suggérés que les souches Sp+ avaient une infectivité accrue pour les plantes-hôtes grâce aux nombreuses spores produites qui représentent autant de particules infectieuses (Markham, 2008 ; Houwers et Akkermans, 1981 ; Van Dijk, 1984 ; Wheeler et al., Kurdali et al., 1988 ) et une meilleure compétitivité à infecter les racines dans un contexte où Sp+ et Sp- cohabitent dans la rhizosphère (Kurdali et al., 1990). Cependant, les conclusions de ces études peuvent être biaisées par la faible diversité des nodosités utilisées (en termes d’espèces de plantes-hôtes et d’origines géographique), par le manque de données sur la diversité génétique des souches Sp+ et parfois aussi par l’hétérogénéité des inocula utilisés (culture pure pour les souches Sp- vs broyat de nodosités pour les souches Sp+). De plus, les observations phénotypiques de coupes de nodosités réalisées dans l’ensemble de ces études ne sont pas des analyses fiables pour déterminer la souche présente dans les nodosités, car il n’est pas possible d’exclure les faux Sp- (dans le cas où la souche Sp+ n’ait pas encore sporulé) ou de détecter une co-existante Sp+/Sp-.
En conséquent, les principaux objectifs de cette étude ont été de réexaminer le rôle de la sporulation in-planta de Frankia dans l’infectivité et le spectre d’hôte des souches Sp+ et dans leur capacité compétitive pour l’infection des racines. Les souches Sp+ testées dans l’étude seront représentatives des différentes lignées phylogénétiques décrites par Pozzi et al., (soumis), et les souches présentes au sein des nodosités seront caractérisées moléculairement pour confirmer l’identité de la souche et relever d’éventuelle(s) co- infection(s).
Du point de vue évolutif, la sporulation in-planta de Frankia, alors que l’endophyte est dans un contexte favorable de symbioses avec son hôte, est un phénomène paradoxal. Certains auteurs suggèrent alors un comportement tricheur des souches Sp+. En effet, certains résultats, suggérant une moindre contribution de ces souches à la symbiose (fixation d’azote moindre par rapport aux souches Sp-) (Van Dijk, 1978 ; VandenBosch et Torrey, 1984 ; Sellstedt et al., 1986 ; Wheeler et al., 1986 ; Schwintzer, 1990), concluent qu’elles seraient moins mutualistes que les souches Sp- (Markham, 2008). Comme plusieurs études sur la symbiose Rhizobium/légumineuses l’ont montré, la plante pourrait être capable de détecter la présence de ces souches tricheuses et les sanctionner (Niehaus et al., 1993 ; Kiers et al., 2003 ; Heath et Tiffin, 2009 ; Sachs et al., 2010 ; Oono et al., 2011). Dans ce cas, la sporulation pourrait influencer le métabolome des nodosités. Le second objectif de la thèse a donc été de développer une méthode expérimentale afin de comparer le métabolome nodulaire des souches Sp+ et Sp- et d’identifier d’éventuelles molécules « signatures » d’un fonctionnement métabolique différent au sein des nodosités Sp+.
Plan du manuscrit de thèse
Dans un premier temps, une synthèse bibliographique sera détaillée sur le principe, les mécanismes et les différents rôles de la sporulation chez les microorganismes. L’objectif de cette étude bibliographique est de pouvoir comparer la sporulation chez les modèles eucaryotes et procaryotes connus à la sporulation des souches de Frankia. Le modèle bactérien d’étude de la sporulation est Bacillus mais Frankia en est plutôt éloigné physiologiquement parlant. En effet, les souches de Frankia sporuleraient plus comme des champignons que comme les bactéries unicellulaires. Nous devons donc trouver un modèle plus proche de notre modèle d’étude, c’est pourquoi notre choix se portera davantage sur une autre actinobactérie : Streptomyces. Le modèle Streptomyces est plus étudié pour sa capacité à produire divers antibiotiques mais des études ont été menées afin de comprendre les facteurs impliqués dans la sporulation, ce qui nous procurera une base de données prometteuse pour la recherche de gènes et de protéines analogues dans la sporulation chez Frankia.
Dans la seconde partie détaillée en 2 chapitres, nous chercherons à comprendre l’avantage apporté par la sporulation sur la capacité infective et compétitive des souches Sp+ pour l’infection d’une plante-hôte. Le premier chapitre décrira le développement d’un protocole pour la détection génétique des souches Sp+ et Sp- sélectionnées pour l’étude. Le second chapitre se détaillera sous la forme d’un article scientifique portant sur l’étude du pouvoir infectif et la capacité compétitive des souches Sp+ face aux souches Sp-.
Enfin, dans une troisième partie, nous testerons l’hypothèse selon laquelle la sporulation in- planta des souches de Frankia modifierait le fonctionnement du métabolisme au sein des nodosités sera développée. Pour cela, une méthode d’analyse descriptive globale sera mise au point (détaillée dans le premier chapitre) et une comparaison des métabolites primaires (sucres, acides organiques et acides aminés) et secondaires présents dans les nodules Sp+
et Sp-, et leurs racines associées sera présentée dans le second chapitre.
PARTIE 1 : Synthèse bibliographique
La sporulation chez les microorganismes :
Principe, mécanismes et rôles
- Cas particulier des souches sporulantes
in-planta de Frankia –
Figure 1. Morphologie de Frankia en culture pure (A) et en symbiose avec une souche Spore positive (B)
A : Structure hyphale de Frankia (barre d’échelle : 20μm). B : Coupes fines (0,8PPm) de nodule d’Alnus incana (barre d’échelle : 25μm). S : sporanges multiloculaires, V :
vésicules, H : hyphes et CV : cellule végétale
A
B S
H V
CV
H V
S
Introduction
La sporulation est un phénomène présent chez de nombreux organismes vivants (microorganismes eucaryotes et procaryotes, organismes végétaux). Elle se définit communément comme une stratégie adaptative facultative, qui consiste en une différenciation cellulaire conduisant de la cellule végétative, capable de se multiplier, à la cellule sporale, ayant un métabolisme inactif et étant incapable de multiplication (Gottlieb et al., 1973). La sporulation est donc un processus de formation et de libération des spores, contenues le plus souvent dans des sporanges, et résistantes aux agressions physiques et chimiques de l’environnement (Willey et al., 2013). La sporulation est alors définie comme un état de dormance, à savoir une phase périodique du cycle de vie d’un organisme au cours de laquelle la croissance, le développement, la reproduction et le métabolisme sont supprimés ou fortement diminués (Danks, 1987). A contrario, le phénomène de levée de la dormance, afin de revenir à une cellule végétative, est appelé la germination de la spore.
Cette germination entraine une perte irréversible des propriétés spécifique de la spore, notamment sa résistance (Gould, 1970).
La sporulation est un phénomène présent chez les organismes végétaux, comme chez les bryophytes (algues vertes, mousses et sphaignes) ou encore chez certaines plantes vasculaires ne produisant pas de fleurs (fougères) où la dispersion des spores est réalisée par l’air et dans un but de se reproduire ailleurs et à un autre temps. Le phénomène de sporulation est cependant plus largement représenté chez les microorganismes eucaryotes (comme chez les champignons) et procaryotes (bactéries). Chez les microorganismes procaryotes, 80% des études visant à décrire le phénomène de sporulation sont réalisées chez les bactéries firmicutes (Bacillus et Clostridium) ou chez les Actinobactéries (Streptomyces). Cependant, cette forme de dormance est encore très peu étudiée chez les microorganismes complexes et/ou ayant un intérêt limité pour l’homme (Evans et Dennehy, 2005), comme chez notre modèle d’étude, Frankia.
Frankia est une Actinobactérie filamenteuse fixatrice d’azote, qui se caractérise en culture pure par la présence d’hyphes septés et ramifiés, de vésicules (lieu de la fixation d’azote) (Tjepkema et al., 1980) et de sporanges multiloculaires contenant de nombreuses spores (Lechevalier, 1984) (Figure 1). Elle est capable de s’associer avec des plantes dites actinorhiziennes, leur permettant ainsi d’améliorer leur croissance par un apport en azote (Benson et Silvester, 1993). Cette association est une symbiose qui se met en place au sein d’un nouvel organe racinaire, la nodosité, où un phénomène unique de sporulation in-planta est décrit (VanDijk et Merkus, 1976). En effet, toutes les souches de Frankia sont capables de sporuler en culture pure mais une fois en symbiose avec leur plante-hôte, seules
certaines souches conservent cette capacité à sporuler dans des sporanges, au sein même des cellules végétales (VanDijk et Merkus, 1976). Ces souches sporulantes in-planta sont définies comme souches spore positive (Sp+), et les souches non sporulantes sont nommées par opposition spore négative (Sp-) (VanDijk et Merkus, 1976, VanDijk, 1978) (Figure 1).
La sporulation chez Frankia, comme chez les champignons et la plupart des Actinobactéries, n’entraîne pas le sacrifice de la cellule mère. Les spores produites sont multiples et sont pressenties pour être une voie de dispersion et de survie de Frankia (Krumholz et al., 2003).
La particularité des souches de Frankia à sporuler tant à l’état libre qu’au sein même des cellules végétales dans les nodosités est à ce jour, selon nos connaissances, un cas unique chez les organismes vivants.
La sporulation chez Frankia en culture pure est peu référencée mais le nombre d’étude est encore moins important sur la sporulation in-planta. Par conséquent, l’objectif principal de ce travail bibliographique vise à mieux définir la sporulation au sein du monde microbien afin d’améliorer la compréhension de ce processus chez les souches Sp+ de Frankia. Nous nous attacherons tout d’abord à décrire la sporulation au niveau morphologique, physiologique et génétique chez des microorganismes proches taxonomiquement et/ou morphologiquement de Frankia en ce qui concerne sa sporulation. Enfin, nous aborderons l’étude de la sporulation microbienne dans un contexte de relation plantes-microorganismes afin d’envisager les principaux facteurs influençant la sporulation in-planta et les conséquences de cette sporulation sur l’interaction plante-microorganismes.
1. La sporulation chez les microorganismes : morphologie, physiologie et mécanismes génétiques
1.1 Diversité morphologique de la sporulation
Au sein du monde microbien, une grande diversité existe en termes de morphologie des spores, de processus de sporulation, du nombre de spores produites, ou encore du positionnement des spores en fonction du microorganisme étudié.
1.1.1. Sporulation chez les champignons
Les champignons se caractérisent par la présence d’un appareil végétatif appelé thalle, qui peut être levuriforme, avec multiplication par bourgeonnement ou filamenteux (= hyphe) avec multiplication par division de l’extrémité apicale.
Chez la plupart des champignons, deux modes de reproduction se distinguent : la reproduction sexuée donnant lieu à une méiose pour la formation des spores (Deacon, 2005)
Figure 2 : Diversité des mitospores fongiques
Sources :
http://esmisab.univ-brest.fr/scientifique/Mycologie/Les+fiches+pratiques/absicorym http://www.visualphotos.com/image/1x8803417/basidiomycota_sem
http://enfo.agt.bme.hu/drupal/en/node/9589
http://www.mycology.adelaide.edu.au/Fungal_Descriptions/Hyphomycetes_(hyaline)/Geotric hum
Champignons inférieurs Mitospore endogène sur
sporocyste : sporocystospores
Champignons supérieurs : Basidiomycètes Mitospore exogène
sur conidiophore : conidies
Champignons supérieurs : Ascomycètes Mitospore exogène
sur conidiophore : blastoconidies
Champignons supérieurs : Ascomycètes Mitospore exogène
sur conidiophore : arthroconidies
et la reproduction asexuée (ou multiplication végétative) par bourgeonnement, fission binaire, fragmentation, ou par formation de spores (Alexopoulos et al., 1996). La reproduction asexuée représente le mode le plus prolifique de multiplication des champignons par dispersion du génome mais ne crée que peu de diversité génétique contrairement à la reproduction sexuée, bien plus complexe. Le processus de reproduction sexuée ne sera toutefois pas développé dans cette synthèse du fait de son absence chez les organismes procaryotes, qui ne présentent que la multiplication végétative.
La reproduction asexuée chez les champignons permet la production de spores suite à une mitose et sont désignées sous le terme de mitospores. Elles peuvent être immobiles ou mobiles et sont produites à partir de cellules spécialisées lors de la sporogenèse.
Une grande diversité de mitospores chez les champignons est décrite en fonction des groupes taxonomiques (Figure 2) :
- Les mitospores endogènes, au sein de l’ancien embranchement des Zygomycètes.
La formation des spores a lieu au sein des sporocystes, filaments dressés et renflés à leur extrémité où des mitoses successives se réalisent et des parois entourent les noyaux. Les sporocystospores seront libérés par éclatement du sporocyste.
- Les mitospores exogènes, chez les Dikarya (Ascomycota et Basidiomycota) où il y aura formation de nombreuses conidies.
- Conidiogenèse thallique où la désarticulation du mycélium existant entraîne la formation d’arthroconidies (Ascomycota, Geotrichum candidum)
- Conidiogenèse blastique où les spores sont néoformées à l’extérieur du mycélium par mitose d’une phialide pour donner des blastoconidies (Ascomycota, Aspergillus)
1.1.2. Sporulation chez les bactéries
Au sein des Procaryotes, le processus de sporulation ainsi que son rôle peuvent être très divers d’un organisme à un autre. Les bactéries capables de sporuler sont présentes dans deux grands phyla : (i) les firmicutes (bacilles à Gram positive, génome à faible pourcentage GC) et (ii) les Actinobactéries (bactéries filamenteuses, à Gram positive et à haut pourcentage GC). Quelques exemples de sporulation sont cependant retrouvés ponctuellement chez des protéobactéries (α, γ et δ-protéobactéries).
Chez les firmicutes, les principales espèces bactériennes décrites comme étant capables de sporuler ont une paroi de type Gram positive et appartiennent aux genres : Acetonema, Alicyclobacillus, Aneurinibacillus, Bacillus, Brevibacillus, Clostridium, Dendrosporobacter, Desulfotomaculum, Geobacillus, Paenibacillus, Sporobacter, Sporolactobacillus, Sporomusa, Sporosarcina, Sporotomaculum, Syntrophospora, Thermoactinomyces, Ureibacillus,
Figure 3 : Positionnements des spores bactériennes
A : Spores ovales de Clostridium difficile, terminales et déformantes
(http://www.cdiff-support.co.uk/)
B : Spores ovales de Bacillus cereus, centrales et non déformantes
(http://bacteriabacilluscereus.blogspot.fr/)
C : Spores ovoïdes, subterminales et déformantes de Clostridium thermopalmarium
(http://garciajeanlouis9051.perso.neuf.fr/aaBXIV1_O1_1.html)
D : Spores ovales, subterminales et déformantes de Bacillus polymyxa
(http://fdanieau.free.fr/cours/bts/A1/microbiologie/chapitre5/chap5_spores.php
A
C
B
D
Virgibacillus(Thèse Caudrillier, 2008). Cependant, les études se portent principalement sur 2 modèles bactériens : les genres Clostridium et Bacillus.
Chez toutes ces espèces, la spore bactérienne est visualisable comme un espace clair très réfringent et limité par un contour net et régulier. Elle peut être en position centrale, subterminale ou terminale dans la cellule (Figure 3). Bien que généralement rondes ou ovoïdes et de diamètre compris entre 0,2 et 2 μm, les spores peuvent présenter diverses morphologies et sont souvent nommées différemment en fonction de la souche (Tableau 1):
- Endospores : ce sont les spores les plus communément observées et étudiées chez Bacillus et Clostridium. Il y a en général production d’une spore unique par cellule qui présente des enveloppes épaisses.
- Exospores : 1 à 4 spores groupées par cellule, résultant d’un bourgeonnement de l’extrémité des cellules végétatives chez Methylosinus (α-protéobactérie).
- Cystes : une spore unique par cellule chez Azotobacter, Methylococcus, Methylobacter, Methylomonas, (γ-protéobactéries) …
- Myxospores : nom donné aux spores uniques des Myxobactéries (δ-protéobactéries).
Comme chez les bactéries firmicutes, le groupe des Actinobactéries présente une grande diversité morphologique des spores. Longtemps affilié au règne fongique tant son aspect morphologique (croissance sous forme de filaments ramifiés, mode de sporulation…) s’en rapproche, ce n’est que par les techniques de microscopie que les Actinobactéries ont été rattachées aux Eubactéries grâce à la visualisation de l’absence de noyau. Quelques études existent concernant la sporulation chez Mycobacterium, un pathogène humain formant des endospores proches de celles de Bacillus et chez Geodermatophilus, Actinobactérie colonisant la surface des pierres, tolérante aux facteurs environnementaux extrêmes (Gorbushina, 2007) et produisant des spores mobiles (Normand, 2006). Ce dernier modèle est particulièrement intéressant, dans la mesure où le genre Geodermatophilus a été montré comme le plus proche voisin phylogénétique du genre Frankia, cependant, le phénomène de sporulation a été très peu étudié chez ce genre. De même, très peu de travaux étant réalisés sur la sporulation de Frankia, des analogies seront proposées avec l’Actinobactérie Streptomyces où les études sont plus nombreuses.
Chez Streptomyces, le développement des souches est beaucoup plus complexe que celui d’une bactérie unicellulaire (Goodfellow, 1984). Elles sont constituées d’hyphes végétatifs contenant peu de parois transversales. Avant la mise en place de la sporulation, il y a émergence d’hyphes aériens, possédant des septa de façon régulière et synchrone. La division de ces hyphes aériens en compartiments uni-génomiques puis leur désarticulation permet la mise en place des précurseurs des spores. La production de structures différenciées permet donc la production de structures spécialisées dans la sporulation, ceux
Tableau 1 : Diversité morphologique et rôles des spores bactériennes NomBactériesNombre par cellule bactérienneRôleComposition Corps central (cellule végétative) avec une enveloppe (exosporium et exine)Résistance forte à la dessicationSpore uniqueAzotobacter, Methylococcus, Methylobacter, Methylomonas, …Cystes Cellule végétative s'entourant d'une épaisse enveloppeRésistance forte à la dessication, moyenne aux radiationsSpore uniqueMyxobactériesMyxospores EndosporesBacillus, Clostridium, …Spore uniqueThermorésistance hauteEnveloppes épaisses (cortex, tunique, exosporium, acide dipicolinique) Résultat du bourgeonnement de l'extrémité des cellules végétativesThermorésistance modérée1 à 4 par spore par celluleMethylosinus, ...Exospores
qui serait en lien avec l’expression de gènes spécifiques à la sporulation. Cet aspect sera ainsi abordé au niveau des mécanismes génétiques de la sporulation (1.4).
En ce qui concernent la morphologie des spores chez les Actinobactéries, certaines sont mobiles, d’autres peuvent posséder des ornementations ou être lisses, elles peuvent être sphériques ou ovoïdes, … (Locci, 2001). Chez Streptomyces, la forme la plus répandue est appelée arthrospores, en référence aux arthroconidies des champignons qui résultent également d’une désarticulation des hyphes. Elles sont produites sous forme de chaînette par les bactéries du genre Nocardia, Thermobifida ou encore Streptomyces. Leur survie à la chaleur (65°C pendant 10 min en moyenne) et à l’acidité est modérée mais meilleure que celle des hyphes (Locci, 2001).
En opposition, chez Frankia, les spores sont contenues dans des sporanges multiloculaires, structures terminales ou intercalaires des hyphes (Newcomb et al., 1979 ; Lechevalier, 1984), qui varient considérablement en taille (de 2 à 50 μm), forme (globuleux, cylindrique, tubulaire, …) et nombre de spores. Les spores sont quant à elles de forme irrégulière lorsqu’elles sont jeunes mais sphériques ou ovoïdes une fois mature (1 à 5 μm de diamètre).
En conclusion, en ce qui concerne le phénomène de sporulation, peu de différences sont observées au sein des bactéries firmicutes alors qu’une grande diversité existe au sein des organismes filamenteux, Actinobactéries et champignons. La sporulation chez Frankia et chez les Actinobactéries, dont Streptomyces, se rapproche en plusieurs points de celle des champignons plutôt que celle des bactéries unicellulaires. Tout d’abord, les spores bactériennes sont produites la plupart du temps à l’intérieur de la cellule bactérienne (endospores), et non à l’extérieur comme c’est le cas notamment chez Frankia. De plus, elles ne sont produites que lors de conditions environnementales défavorables, afin d’assurer la survie et de redonner une nouvelle cellule végétative quand les conditions seront redevenues favorables. Une unique spore étant produite chez les bactéries unicellulaires, elles ne sont pas considérées comme des éléments de multiplication et de dissémination comme cela est le cas chez les champignons et les Actinobactéries, mais plutôt comme des formes de résistance. Enfin, la sporulation des bactéries firmicutes entraine la destruction de la cellule mère, ce qui n’est pas le cas chez les Actinobactéries et chez les champignons.
Pour conclure, si la morphologie des spores et les stratégies de sporulation divergent entre microorganismes, la sporulation pourrait avoir plusieurs rôles écologiques, ce qui sera abordé par la suite.
1.2. Rôle de la sporulation et impact sociétal
Deux rôles essentiels de la sporulation chez les microorganismes peuvent être envisagés : la résistance (survie dans le temps = dispersion temporelle) ou la dissémination (dispersion spatiale). De plus, étant donnée la capacité de résistance et de dissémination que la sporulation peut conférer aux microorganismes, il est important de considérer l’impact d’un tel trait microbien, sur l’homme, les animaux et les végétaux, particulièrement dans le cas de souches microbiennes en interactions avec des organismes supérieurs
1.2.1. Les spores : un élément de résistance ?
La sporulation bactérienne est considérée par certains comme le sommet de l’évolution pour la résistance aux environnements extrêmes (Nicholson et al., 2002).
Chez les bactéries, hormis les Actinobactéries dont la sporulation rappelle les formes de multiplication végétatives des champignons, la formation de spores permet de résister en conditions défavorables. En cas de conditions limitantes (nutriments, eau, …), le programme génétique de développement de la cellule bactérienne change. Tout d’abord, les bactéries cherchent à obtenir des nutriments à partir des organismes voisins en produisant des antibiotiques et des enzymes extracellulaires de dégradation. Si les conditions de privation persistent, la cellule bactérienne sporulera (Fisher, 1999). La capacité de résistance des spores est toutefois très variable entre espèces et souches (Nicholson et al., 2002 ; Pedraza- Reyes et al., 2012).
Chez les firmicutes, les spores sont résistantes à la chaleur humide et sèche (thermorésistance variable selon les espèces, en moyenne 10 min à 70-80°C), à la dessiccation, à de nombreux éléments chimiques (désinfectants, antiseptiques, antibiotiques, acides, bases) ou physiques (radiations ioniques, 20 à 50 fois plus résistante aux radiations UV et gamma que les cellules végétatives, pression) (Pedraza-Reyes et al., 2012). Cette grande capacité de résistance, variable en fonction des souches étudiées, peut conférer une grande longévité (plusieurs milliers d’années pour certaines espèces de Bacillus) (Pedraza-Reyes et al., 2012 ; Horneck et al., 1994).
L’hétérogénéité des propriétés de résistance des spores peut être liée à deux facteurs principaux: (i) les différences d’environnement auxquelles sont exposées les cellules d’une population lorsqu’elles sporulent (facteurs extrinsèques) et (ii) la stochasticité dans l’expression des gènes (facteurs intrinsèques) (Setlow et al., 2012).
Plusieurs facteurs déterminent par exemple le niveau de résistance à la chaleur humide chez les spores bactériennes (Setlow et al., 2012 ; Pedraza-Reyes et al., 2012). En effet, la température de sporulation et/ou de croissance de la souche ou encore la présence d’une architecture complexe de la spore avec de multiples enveloppes empêchant la réhydratation
Tableau 2 : Différences entre la cellule végétative et la spore d’une bactérie firmicute
Caractéristiques Cellules végétatives Spores
Structure Cellule Gram positive typique Spore avec cortex, tunique et exosporium
Observation au microscope Non-réfringente Réfringente
Concentration en calcium Faible Forte
Concentration en eau Forte (80 %) Faible (10-20%)
pH du cytoplasme pH 7 pH 5,5-6
Acide dipicolinique Absent Présent
Protéines SASPs Absentes Présentes
Activité enzymatique Forte Faible ou absente
Métabolisme (absorption
d'O2) Fort Faible ou absent
Synthèse de
macromolécules Présent Absent
ARNm Présent Absent
Résistance à la chaleur Faible Forte (70-80°C, 10 min)
Résistance aux radiations Faible Forte
Résistances aux éléments
chimiques et les acides Faible Forte
Résistance aux lysozymes Sensible Résistant
Coloration Coloration possible Colorants spécifiques (vert de Malachite)
du corps central peuvent influencer la capacité de résistance de la spore. Il existe également des protéines SASPs (Acid-Soluble Spore Proteins) qui, en se complexant à l’ADN, le rendent moins sensible à la chaleur et aux agents génotoxiques. La présence à hauteur de 5 à 15 % du poids total de la spore d’acide dipicolinique (DPA), stabilisé par le calcium et formant ainsi le dipicolinate de calcium, permet une augmentation de la thermorésistance en favorisant une baisse de la quantité d’eau de la spore lors de sa formation. Le dipicolinate de calcium permet également une meilleure résistance de l’ADN de la spore aux rayons U.V.
Enfin, le facteur le plus important, une faible teneur en eau du cytoplasme (10 à 15% contre 80% dans la cellule végétative) permet une augmentation de la thermorésistance de la cellule sporale (Setlow et al., 2012 ; Pedraza-Reyes et al., 2012) (Tableau 2).
Comme chez les bactéries firmicutes, la sensibilité des spores d’Actinobactéries aux stress est variable selon les souches et notamment face aux métaux lourds (Valagurova et al., 2001). Les Actinobactéries produisent cependant des spores peu résistantes aux perturbations environnementales en comparaison aux spores des firmicutes, mais ces spores sont tout de même plus résistantes à la chaleur (65°C 10 min), l’acidité, la sonication, la dessiccation et survivent plus longtemps que les hyphes (Chae et al., 2009). La résistance à la chaleur chez les firmicutes est essentiellement due à la présence d’acide dipicolinique, absent chez la plupart des spores des Actinobactéries sauf chez Thermoactinomyces(Locci, 2001).
Enfin, les spores fongiques peuvent également être perçues comme des structures de résistance mais cette fonction est bien moins développée que chez les spores bactériennes.
Peu de structures de résistances sont mises en place par le champignon au niveau des spores, mises à part un épaississement et une mélanisation de la paroi ainsi qu’une importante déshydratation de la spore, ce dernier point étant commun à toutes les spores des microorganismes. Chez Frankia, il a également été observé que les spores présentaient un niveau faible de respiration endogène, environ 10 fois moins important que dans les cellules végétatives (Krumholz et al., 2003).
Les spores asexuées provenant des champignons et des Actinobactéries ne présentant pas de structures particulières de résistance à l’environnement, ce qui pose la question de comprendre quelle est la fonction principale de ces spores produites en grandes quantités par ces organismes.
1.2.2. Les spores : un élément de multiplication et de dispersion ? Chez les champignons, les spores représentent des unités de multiplication et de dispersion du génome du champignon grâce à la production d’un très grand nombre de spores par
Figure 4. Photographies de sporanges contenant de multiples spores chez Frankia alni Sources :
Photo 1 : Y. Prin, LSTM Montpellier (communication personnelle) Photo 2 : P. Normand, UMR 5557 Lyon (communication personnelle)
Microscopie à balayage d'un
sporange de Frankia alni Sporange visualisable dans une culture pure de Frankia alni
cellule végétative. La dispersion des spores se fait par éjection forcée des structures reproductrices, déclenchée par les variations des conditions météorologiques ou par une action mécanique (compression sous l’influence des animaux et des insectes). La structure de certains asques et l’accumulation d’osmolytes dans les fluides qu’ils contiennent contribuent à une véritable décharge explosive sous forme de bioaérosol des ascospores dans l’air. La dispersion des spores est réalisée par l’air, l’eau, les insectes, les invertébrés ou encore dans le pelage ou les plumes des animaux (Ingold, 1971) parfois sur de très longues distances, que ce soit au sein d’une région, d’un pays ou même entre continents.
Chez les Actinobactéries et plus particulièrement chez Frankia, plusieurs dizaines voire milliers de spores, regroupées dans des sporanges multilobés, peuvent être produites (VanDijk et Merkus, 1976) Figure 4. Cette constatation suggère que les spores des Actinobactéries et de Frankia seraient davantage une forme de dissémination et de multiplication du génome qu’une forme de résistance, tout comme chez les champignons.
Cette hypothèse est également soutenue par l’absence de fortes résistances des spores chez Frankia, notamment à la température (Tzean et Torrey, 1989 ; Sayed et al., 1997 ; Krumholz et al., 2003).
1.2.3. Impact de la sporulation pour l’homme, les animaux et les végétaux
Au sein du large spectre de microorganismes sporulant, nombreux sont ceux qui sont pathogènes. Les spores peuvent par exemple constituer des agents infectieux dans certaines maladies humaines et animales mais surtout des voies de dispersion et de persistance des bactéries dans les industries alimentaires et de la santé. Le passage sous forme de spores peut en effet permettre à certains pathogènes de constituer des réservoirs, dans leurs hôtes par exemple, où en l’absence d’indicateurs de maladie, leur présence ne sera pas détectée (Chao et Rubin, 2010 ; Singh et al., 2010). La sporulation des microorganismes impacte également les structures de santé publique par dissémination des spores sur le matériel médical et de diagnostic. Par altération des denrées alimentaires, elles entraînent des défauts de fabrication de certains aliments (fromages, charcuteries, …), et provoquent des intoxinations et des toxi-infections alimentaires par production d’entérotoxines (Setlow et Johnson, 2007 ; Doyle et Beuchat, 2007).
Certaines spores de firmicutes sont responsables d’épidémiologies chez l’homme et l’animal : le botulisme par Clostridium botulinum, le tétanos par C. tetani, le charbon bactéridien par Bacillus anthracis, le charbon symptomatique par C. septicum, C. chauvei ou encore la gangrène gazeuse par C. perfringens.
Certaines spores peuvent également être la cause d’allergies dites professionnelles comme par exemple chez les agriculteurs quotidiennement exposés aux spores de certaines espèces d’Actinobactéries se développant dans les fourrages humides (Locci, 2001).
Les spores fongiques, reconnues comme des polluants biologiques de l’air intérieur sont responsables d’allergies. Ces spores fongiques posent un problème important dans l’éradication des champignons pathogènes au sein des établissements de santé, des habitations, des établissements agricoles, des industries agroalimentaires et de santé.
Toutes les infections microbiennes préalablement citées reposent principalement sur la spore qui survit en milieux extérieurs et qui peut ainsi recontaminer l’homme, les animaux, les aliments ou le matériel. L’abondance des spores microbiennes produites dans les sols et dans l’eau, et/ou l’impossibilité de les détruire, selon les microorganismes, explique la prophylaxie de ces infections.
En réponse à la dispersion des spores, un effort très important a été mis en place afin de développer des méthodes appropriées pour les détruire, par éclatement de leurs enveloppes de résistances. La technique la plus couramment utilisée est l’autoclavage (cycle de 20 min à 120°C) pour le matériel dans les laboratoires, les industries et les établissements de santé publique. La tyndallisation est utilisée pour les éléments sensibles ne pouvant pas subir l’autoclavage, comme certains produits alimentaires : elle consiste en un chauffage à 60°C afin de détruire les cellules végétatives puis un retour à une température ambiante afin de favoriser la germination des spores et enfin de nouveau l’application d’une température de 60°C qui entraînera la destruction des nouvelles cellules végétatives. Les rayons ionisants à haute énergie (gamma ou bêta) et des produits chimiques sporicides comme le formol (ou formaldéhyde CH2O), l’oxyde d’éthylène (C2H4O) et le β-propiolactone (C3H4O2) sont également utilisés.
Cependant, les spores microbiennes n’ont pas que des inconvénients pour l’homme.
Certaines souches de Bacillus sont désormais utilisées sous leur forme de spores comme des probiotiques afin de prévenir des problèmes gastro-intestinaux dans l’alimentation humaine et animale. L’utilisation de spores favorise le stockage des probiotiques à plus long terme et facilite leur commercialisation (Hong et al., 2005). L’Actinobactérie Streptomyces kasugaensis est utilisée à des fins agronomiques comme biocide microbien car elle produit naturellement un pesticide. Les industriels cherchent à obtenir un taux important de sporulation afin de favoriser le stockage à long terme, ce qui permet une meilleure gestion de sa commercialisation et de sa conservation (Chae et al., 2009). Les spores des champignons ayant un intérêt en agroalimentaire et en agronomie sont également utilisées pour la facilité de stockage et de conservation de certaines espèces fongiques.
1.3. Physiologie de la sporulation et métabolisme cellulaire 1.3.1. Étapes de la sporulation
x Microorganismes unicellulaires
La sporulation bactérienne se met en place lors de conditions défavorables dans l’environnement, comme l’épuisement du milieu en substrat nutritif. Des conditions plus particulières doivent être présentes dans certains cas, comme l’absence totale d’O2 dans le milieu pour Clostridium, ou à contrario la présence obligatoire d’O2 pour la sporulation de Bacillus anthracis. La sporulation débute à la fin de la phase exponentielle de croissance des bactéries et se détaille en 6 phases principales chez Bacillus, Clostridium, qui durent entre 8 et 10 heures (Robleto et al., 2012).
A la fin du cycle de sporulation, une spore composée d’un cortex, d’une tunique et d’un exosporium (facultatif) est obtenue. Cette spore présente une accumulation d’acide dipicolinique (DPA) complexé au calcium et l’ADN sporal est protégé par une accumulation de protéines SASPs (small acid soluble spore proteins) (Robleto et al., 2012). Le cytoplasme de la spore mûre est de texture homogène, riche en cation divalents Ca2+, mais très pauvres en ARN, enzymes et ne contient que 25% d’eau. Cette déshydratation est un point essentiel pour la résistance de la spore et sa survie à long terme (Gerhardt et Marquis, 1989).
Le coût métabolique de la sporulation n’est pas réellement connu mais il demande de nombreux bouleversements du fonctionnement de la cellule. Pendant la sporulation, il y a possibilité de synthèse de différentes substances comme des antibiotiques ou des toxines.
x Microorganismes filamenteux : champignons et Actinobactéries
La sporulation se met en place chez les champignons et chez les Actinobactéries, dont Streptomyces, en réponse à divers facteurs environnementaux comme la carence en éléments nutritifs.
- Les champignons
Plusieurs paramètres influencent la production des spores chez les champignons, notamment chez les espèces d’Aspergillus, comme la température, le pH, les facteurs nutritifs (carbone, azote, …) (Feng et Leonard, 1998 ; Cotty, 1988 ; Keller et Hohn, 1997). Le processus de sporulation nécessite la mise en place d’hyphes aériens au centre de la colonie et, uniquement au contact de l’air, certains se différencieront en conidiophores (inhibition de la sporulation en culture liquide).
Il se passe entre 6 et 8 heures entre la formation des premiers hyphes aériens et la formation des premières spores asexuées. Trois étapes essentielles sont décrites pour le processus de multiplication végétative des Dikarya (Oliver et Schweizer, 1999) : (1) une
Figure 5 : Mise en place d’un conidiophore chez Aspergillus
A- Croissance de la tige du conidiophore par élongation apicale d’un hyphe aérien B- Gonflement de la pointe de la tige pour former la vésicule du conidiophore.
C- Formation et alignement autour de la vésicule de plusieurs noyaux qui subiront plusieurs divisions.
Production de bourgeons (métule) possédant un noyau unique à la surface de la vésicule: chaque tête de conidiophore contient une soixantaine de métules.
D- Développement des phialides: les bourgeons des métules produisent une couche d’environ 120 stérigmates (petits tubes creux supportant la spore)uninucléaires : les phialides.
E- Production par les phialides de chaînes de spores uninucléées: les conidies. Une centaine de conidies sont produites par phialide. Un conidiophore peut donc permettre la production de plus de 10000 spores.
D’après Adams et al., 1998
phase de croissance du champignon, où les cellules acquièrent une capacité à répondre à des signaux d’induction, (2) développement des hyphes aériens, (3) sporulation à partir des hyphes aériens et production de conidiophores.
Les conidiophores sont des structures complexes, qui nécessitent eux-mêmes plusieurs étapes pour être formés (Gow, 1995 ; Oliver, 1972) (Figures 5). A la fin du processus de sporulation, les conidiophores mis en place vont permettre la production de plus de 10000 spores.
- Les Actinobactéries
La sporulation chez les Actinobactéries se met également en place suite à divers facteurs environnementaux. Plus précisément, il a été montré chez Streptomyces qu’un milieu pauvre en composés organiques azotés (Mikulik et al., 1975 ; Thomas, 1947) ou en éléments phosphorés (Doskocil, et al., 1959) favorisent la sporulation. A contrario, des teneurs élevées en matières organiques retardent la sporulation (Gottlieb, 1953).
Tout comme chez les champignons, la plupart des Actinobactéries forme des spores à partir d’hyphes aériens. Leurs spores sont alors le résultat de la septation ou de la désarticulation (fragmentation) d’hyphes préexistants (Locci, 2001).
Chez Streptomyces, la sporulation est programmée pour avoir lieu environ 10 à 12 heures après la germination de la spore. La mise en place du mycélium aérien peut être affectée par de nombreux paramètres, comme la composition du milieu de culture, la température, la présence de certains composés ou facteurs de croissance (Kalakoutski et Agre, 1976). Les hyphes aériens ont pour caractéristiques d’être moins ramifiés et plus hydrophobes que le mycélium au contact du milieu de culture (Srinivasan et al., 1991). La formation des hyphes aériens cesse avec le début de la sporulation.
Diverses origines existent pour la formation de la paroi des spores chez Streptomyces. En effet, la paroi des spores peut résulter de couches appartenant à la paroi des hyphes parentaux (développement holothallique), elle peut être mise en place à partir de nouvelles couches déposées entre la membrane cytoplasmique et la paroi de l’hyphe parental (développement entérothallique) ou encore par synthèse de nouvelles couches autour d’une portion du protoplasme (développement d’une vraie endospore comme les spores de Thermoactinomyces, similaires à celles retrouvées chez Bacillus et Clostridium).
Les spores sont produites seules ou en chaines de 2 à 50 unités et parfois au sein de sporanges, comme chez notre modèle d’étude Frankia.
x Et la sporulation chez Frankia ?
