Novel strategies to optimize topical skin bioavailability of low and high molecular weight drugs

Thesis

Reference

Novel strategies to optimize topical skin bioavailability of low and high molecular weight drugs

LAPTEVA, Maria

Abstract

Numerous drugs intended for dermatological use suffer from poor bioavailability. They are thus ineffective when administered topically and need oral or parenteral administration. The aim of this work was to find novel strategies to optimize topical skin bioavailability of already marketed and new, low and high molecular weight drugs in order to offer better therapeutic solutions to patients with dermatological conditions. Drugs such as tacrolimus, ciclosporin A, retinoic acid or imiquimod have been successfully delivered topically to skin in a targeted manner, often avoiding any undesired transdermal permeation. The developed formulations may answer an unmet need in the field of dermatology, bringing an improved management of skin diseases such as psoriasis, atopic dermatitis. Acne vulgaris or non-metastatic skin cancers. In the last study, it was possible to deliver topically to skin a drug as big as a 150 000 Da monoclonal antibody using a minimally-invasive laser poration technique.

LAPTEVA, Maria. Novel strategies to optimize topical skin bioavailability of low and high molecular weight drugs. Thèse de doctorat : Univ. Genève, 2015, no. Sc. 4859

URN : urn:nbn:ch:unige-809254

DOI : 10.13097/archive-ouverte/unige:80925

Available at:

http://archive-ouverte.unige.ch/unige:80925

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Section de Sciences Pharmaceutiques Laboratoire de Biochimie Pharmaceutique

Professeur Yogeshvar N. Kalia Professeur Leonardo Scapozza

Novel strategies to optimize topical skin

bioavailability of low and high molecular weight drugs

THÈSE

présentée à la Faculté des sciences de l’Université de Genève pour obtenir le grade de Docteur ès sciences, mention sciences pharmaceutiques

par

Maria Lapteva

de

Ornex (FRANCE)

These N°4859

Genève

Atelier de reproduction Repromail 2015

I was born not knowing and have had only a little time to change that here and there.

Richard P. Feynman

The true delight is in the finding out rather than in the knowing.

Isaac Asimov

Je souhaite dédier ce manuscrit au Dr. Oleg Kuznetsov, éminent astrophysicien et père aimant parti malheureusement trop tôt…

I want to dedicate this manuscript to Dr. Oleg Kuznetsov, a prominent astrophysicist and loving father gone unfortunately too soon...

Я хочу посвятить эту рукопись доктору наук Олегу Андреевичу Кузнецову, известному астрофизику и любящему отцу, преждевременно покинувшим нас...

Table of contents

TABLE OF CONTENTS 7

ABBREVIATIONS 19

RÉSUMÉ 21

SUMMARY 27

FOREWORD 33

CHAPTER I - POLYMERIC MICELLES IN DERMAL AND TRANSDERMAL

DELIVERY 41

Abstract 43

Introduction 44

1.

Polymeric micelles: formation, structure and theoretical considerations 44 2.

Polymeric excipients for micelle preparation 46

3.

Drug incorporation and micelle characterization 49

4.

4.1 Drug solubilization 49

4.2 Methods of preparation 50

Direct dissolution 50

4.2.1

Dialysis 51

4.2.2

Solvent evaporation 51

4.2.3

Oil-in-water emulsion 51

4.2.4

Solid dispersion (solution casting) 51

4.2.5

Freeze-drying 51

4.2.6

4.3 Typical characteristics of micelle formulations 52

Critical Micelle Concentration 52

4.3.1

Drug content 52

4.3.2

Micelles as nano-sized drug carriers 53

4.3.3

Micelle morphology 53

4.3.4

Conclusion 61 6.

References 62

7.

CHAPTER II - POLYMERIC MICELLE NANOCARRIERS FOR THE

CUTANEOUS DELIVERY OF TACROLIMUS: A TARGETED APPROACH FOR

THE TREATMENT OF PSORIASIS 67

Abstract 69

Introduction 71

1.

Materials and Methods 73

2.

2.1 Materials 73

2.2 Analytical methods 74

Quantification of TAC by HPLC-UV 74

2.2.1

Quantification of TAC by UHPLC-MS/MS 74

2.2.2

2.3 Preparation of the micelle formulation 75

Synthesis of MPEG-dihexPLA and NL-MPEG-dihexPLA copolymers 75

2.3.1

Preparation of TAC loaded micelles 76

2.3.2

Preparation of fluorescent micelles 77

2.3.3

2.4 Characterization of micelle formulations 77

Size determination 77

2.4.1

Morphology observation 77

2.4.2

Determination of TAC content in the micelles 77

2.4.3

2.5 Evaluation of the stability of the micelle formulations 78

2.6 Skin preparation 78

2.7 Evaluation of TAC skin delivery in vitro 78

Optimization of the formulation application time 79

2.7.1

Investigation of TAC biodistribution profile in human skin 79

2.7.2

Visualization of micelle penetration pathways 79

2.7.3

2.8 Data analysis 80

Results 80

3.

3.1 Synthesis of MPEG-dihexPLA and NR-dihexPLA copolymers 80

3.2 Development and characterization of micelle formulations 80

Choice of optimal formulation 80

3.2.1

3.3 Evaluation of TAC delivery in vitro 84

Optimization of the application time 84

3.3.1

Comparison of TAC delivery into porcine and human skin 85

3.3.2

Biodistribution of TAC in human skin 85

3.3.3

3.4 Visualization of micelle penetration pathways 86

CLSM investigation of DiO and fluorescein skin delivery using fluorescent micelles 86 3.4.1

Visualization of micelle penetration into hair follicles 88

3.4.2

Discussion 89

4.

4.1 Development and characterization of micelle formulations 89

Choice of optimal formulation 89

4.1.1

Development of a 0.1% micelle formulation – equivalent to Protopic^® (0.1 %) 89 4.1.2

4.2 TAC delivery in vitro 90

4.3 Visualization of micelle penetration pathways 93

Conclusion 94

5.

Supporting information 95

6.

6.1 Validation of HPLC-UV method 95

Specificity 95

6.1.1

Linearity 96

6.1.2

Limit of detection and limit of quantification 96

6.1.3

Precision and accuracy 96

6.1.4

6.2 Validation of UHPLC-MS/MS method 96

Specificity 96

6.2.1

Linearity 98

6.2.2

Limit of detection and limit of quantification 98

6.2.3

Precision and accuracy 98

6.2.4

6.3 Validation of skin extraction procedure 98

Validation of TAC extraction from total skin samples 99

6.3.1

Validation of TAC extraction from sliced skin samples 99

6.3.2

Acknowledgements 100

7.

References 100

8.

USING MICELLAR NANOCARRIERS AND THE POSSIBLE ROLE OF INTER- CLUSTER REGIONS AS MOLECULAR TRANSPORT PATHWAYS 105

Abstract 107

Introduction 109

1.

Materials and methods 111

2.

2.1 Materials 111

2.2 Synthesis and characterization of a fluorescent analogue of ciclosporin A (Fluo-CsA) 112 Synthesis of a fluorescent analogue of ciclosporin A (Fluo-CsA) 112 2.2.1

Structural comparison of CsA and Fluo-CsA 114

2.2.2

Determination of the distribution coefficient of CsA and Fluo-CsA 114 2.2.3

2.3 Analytical methods 114

Quantification of CsA 115

2.3.1

Quantification of Fluo-CsA 115

2.3.2

2.4 Micelle preparation 115

Preparation of CsA loaded micelles 115

2.4.1

Preparation of Fluo-CsA loaded micelles 115

2.4.2

2.5 Micelle formulation characterization 116

Size determination 116

2.5.1

Morphology determination 116

2.5.2

2.6 Micelle CsA and Fluo-CsA content determination 116

2.7 Skin preparation 116

2.8 In vitro delivery experiments 117

2.9 Data analysis 117

2.10 Visualization of micelle penetration pathways using Fluo-CsA loaded micelles 118

Results and Discussion 118

3.

3.1 Structural comparison of CsA and Fluo-CsA 118

3.2 CsA and Fluo-CsA log D determination 119

3.3 Micelle preparation and characterization 121

CsA loaded micelles 121

3.3.1

Fluo-CsA loaded micelles 122

3.3.2

3.4 In vitro delivery experiments 123

Influence of CsA content in micelle formulation on skin delivery 123 3.4.1

Kinetics of CsA skin deposition and validation in human skin 125 3.4.2

3.5 Visualization of micelle penetration pathways using Fluo-CsA loaded micelles 127

Supplementary data 129 5.

5.1 Synthesis of the fluorescent analogue of ciclosporin A (Fluo-CsA) 129

Synthesis of tert-butyl 4-vinylbenzylcarbamate 129

5.1.1

Synthesis of linked CsA 130

5.1.2

Deprotection of linked CsA 131

5.1.3

Labeling with NHS-Fluorescein 132

5.1.4

5.2 Validation of analytical methods 133

Validation of HPLC-UV method for the quantification of CsA 133

5.2.1

Validation of HPLC-Florescence method for the quantification of Fluo-CsA 134 5.2.2

5.3 Validation of CsA extraction from skin samples 136

5.4 Validation of the wash procedure 136

Acknowledgements 136

6.

References 136

7.

CHAPTER IV - SELF-ASSEMBLED POLYMERIC NANOCARRIERS FOR THE TARGETED DELIVERY OF RETINOIC ACID TO THE HAIR FOLLICLE 141

Abstract 143

Introduction 145

1.

Materials and methods 146

2.

2.1 Materials 146

2.2 Analytical methods 147

Separation of the retinoic acid isomers by HPLC-UV 147

2.2.1

Quantification of total retinoic acid by HPLC-UV 148

2.2.2

Quantification of total retinoic acid by UHPLC-MS/MS 148

2.2.3

2.3 Preparation of the micelle formulation 149

2.4 Characterization of micelle formulations 150

Size 150

2.4.1

Morphology 150

2.4.2

RA content 150

2.4.3

2.5 Evaluation of the physical stability of the micelle formulations 150 2.6 Evaluation of the photostability of TRN in the micelle formulations 151

2.7 Skin preparation 151

Investigation of RA skin delivery 152 2.8.1

Investigation of RA follicular delivery using punch biopsy 152

2.8.2

2.9 Data analysis 153

Results 154

3.

3.1 Characterization of micelle formulations 154

RA content 154

3.1.1

Size 154

3.1.2

3.2 Physical stability of micelle formulations 155

3.3 Photostabilization of RA in the micelle formulations 155

Selection of photoprotective agent 155

3.3.1

Kinetics of TRN photodegradation and the identification of side products 157 3.3.2

3.4 Development of a 0.005% micelle formulation 157

3.5 Retinoid delivery to porcine skin and human skin in vitro 158

Delivery to full thickness skin 158

3.5.1

Targeted delivery to hair follicles 159

3.5.2

Discussion 160

4.

4.1 Micelle formulation development 160

4.2 RA delivery to the skin and targeting of the hair follicle 161

Conclusion 164

5.

Supplementary information 164

6.

6.1 Validation of HPLC-UV method for quantification of RA in micelles 164

Specificity 164

6.1.1

Linearity 165

6.1.2

Limit of detection and limit of quantification 165

6.1.3

Precision and accuracy 165

6.1.4

6.2 Validation of UHPLC-MS/MS method for quantification of RA in skin samples 166

Specificity 166

6.2.1

Linearity 166

6.2.2

Limit of detection and limit of quantification 167

6.2.3

Precision and accuracy 167

6.2.4

6.3 Validation of skin extraction procedure 167

6.4 DLS supplementary characterization of micelles 168

References 168 8.

CHAPTER V - POLYMERIC SELF-ASSEMBLED NANOCARRIERS FOR THE

TARGETED DELIVERY OF IMIQUIMOD 171

Abstract 173

Introduction 175

1.

Materials and methods 176

2.

2.1 Materials 176

2.2 Analytical methods 176

Quantification of IMQ by HPLC-Fluorescence 176

2.2.1

Quantification of IMQ by UHPLC-MS/MS 177

2.2.2

2.3 Preparation of the micelle formulation 178

2.4 Characterization of micelle formulations 178

Visual evaluation and pH 178

2.4.1

Size and morphology characterization 178

2.4.2

Drug content determination 179

2.4.3

Physical stability 179

2.4.4

IMQ localization in the formulation 179

2.4.5

2.5 Gel formulation for IMQ using MPEG-dihexPLA micelles 180

Formulation of the gel 180

2.5.1

Characterization of the gel 180

2.5.2

2.6 Skin preparation 180

porcine skin 180

2.6.1

Human skin 180

2.6.2

2.7 Evaluation of IMQ skin delivery in vitro 181

2.8 Investigation of IMQ biodistribution profile in human skin 181

2.9 Data analysis 182

Results 182

3.

3.1 Micelle formulation characterization and optimization 182

Drug content and physical stability 182

3.1.1

Characterization of optimal IMQ micelle formulations 183

3.1.2

IMQ localization in the formulation 184

3.1.3

Formulation of an optimal micelle based hydrogel 186

3.1.4

Skin delivery to porcine and human skins 187 3.2.1

IMQ biodistribution in human skin 188

3.2.2

Discussion 189

4.

4.1 Formulation optimization 189

4.2 In vitro IMQ skin delivery 191

Conclusion 193

5.

Supplementary information 194

6.

6.1 Validation of HPLC-Fluo method 194

Specificity 194

6.1.1

Linearity 194

6.1.2

Limit of detection and limit of quantification 194

6.1.3

Precision and accuracy 194

6.1.4

6.2 Validation of UHPLC-MS/MS method 195

Specificity 195

6.2.1

Linearity 196

6.2.2

Limit of detection and limit of quantification 196

6.2.3

Precision and accuracy 196

6.2.4

6.3 Validation of skin extraction procedure 197

6.4 Residual solvent content 198

6.5 Verification of micelle integrity 198

In size exclusion chromatography column 198

6.5.1

In gel formulations 198

6.5.2

Acknowledgements 200

7.

References 200

8.

CHAPTER VI - MINIMALLY-INVASIVE LASER-ASSISTED TOPICAL DELIVERY OF A MONOCLONAL ANTIBODY FOR THE TREATMENT OF

PSORIASIS 203

Abstract 205

Introduction 206

1.

Materials and methods 211

2.

2.2 Analytical method: enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 211

Materials and reagents 211

2.2.1

Data analysis 212

2.2.2

Method validation 213

2.2.3

2.3 Skin source 214

2.4 Skin pre-treatment 214

2.5 Delivery experiments: experimental set up 214

2.6 Data analysis 215

2.7 Fluorescent labeling of OS-ab 215

Protein labeling 215

2.7.1

Protein purification 216

2.7.2

2.8 Confocal laser scanning microscopy visualization (CLSM) 217

Results and Discussion 218

3.

3.1 Skin delivery experiments 218

Effect of laser poration parameters at fixed donor concentration and fractional ablated area 218 3.1.1

Effect of different fractional ablated areas using 3ppp, and fixed donor concentration 219 3.1.2

Comparison of different donor concentrations, using 3ppp, 10% FAA 220 3.1.3

3.2 Confocal laser scanning microscopy visualization (CLSM) 221

Discussion: Clinical pertinence 224

4.

Conclusions 225

5.

Supplementary data 226

6.

6.1 Statistical analysis 226

Comparison of laser poration parameters at fixed donor concentration and FAA 226 6.1.1

Comparison of different fractional ablated area using 3ppp and 1 mg/ml donor 228 6.1.2

Comparison of different donor concentration using 3ppp, 10% FAA 229 6.1.3

6.2 OS-ab instability 229

Acknowledgements 231

7.

References 231

8.

CONCLUSIONS 233

FORMULATION OF MPEG-DIHEXPLA MICELLES: A FEASIBILITY STUDY 239

Abstract 241

Introduction 242

1.

Materials and methods 242

2.

2.1 Materials 242

2.2 Synthesis of MPEG-dihexPLA copolymer 243

Synthesis of MPEG-dihexPLA using ring opening polymerization (ROP) 244 2.2.1

Synthesis of MPEG-dihexPLA using melt polycondensation (MPC) 244 2.2.2

2.3 Characterization of MPEG-dihexPLA copolymers 244

2.4 Preparation of blank micelles 245

2.5 MPEG-dihexPLA micelles characterization 245

CMC determination 245

2.5.1

Size and morphology characterization 245

2.5.2

2.6 Micelle loading with IMQ 246

2.7 Skin preparation 246

2.8 Preparation of fluorescein loaded micelles and visualization of micelle penetration pathways 246

Preparation of fluorescent micelles 246

2.8.1

Visualization of micelle penetration pathways 246

2.8.2

2.9 Data analysis 247

Results and discussion 247

3.

3.1 Copolymer synthesis and characterization 247

3.2 Micelle characterization 248

CMC determination 248

3.2.1

Size and morphology 249

3.2.2

3.3 Drug incorporation 252

3.4 Visualization of skin delivery yielded by different polymeric micelles 253

Conclusions and perspectives 255

4.

Supplementary information 255

5.

References 256

6.

APPENDIX II - INDUSTRIAL COLLABORATIONS 259

Reviews 265 1.

Reseach papers 265

2.

APPENDIX IV - CONFERENCE PRESENTATIONS 307

Poster presentations 309

1.

Oral presentations 309

2.

ACKNOWLEDGEMENTS 311

Abbreviations

4-VB 4-vinylaminobenzene

5PL five parameter logistic

ACN acetonitrile

ACT acitretin

ANOVA analysis of variance Boc di-tert-butyldicarbonate

BSA bovine serum albumin

CAM chorioallantoic membrane

CPP critical packing parameter CER committee for Ethics in Research CLSM confocal laser scanning microscopy CMC critical micelle concentration CMeC carboxymethyl cellulose CMT critical micelle temperature

CsA ciclosporin A

DCM dichloromethane

DLS dynamic light scattering

DoL degree of labeling

DOPE dioleoyl-phosphatidylethanolamine DSPE distearoyl-phosphatidylethanolamine

dn number-weighted diameter

dv volume-weighted diameter

EC50 half maximal effective concentration ELISA enzyme-linked immunosorbent assay Erbium:YAG erbium-doped yttrium aluminium garnet

EtOAc ethyl acetate

FA formic acid

FAA fractional ablated area FDA food and drug administration FFEM freeze fracture electron microscopy FITC-BSA FITC-labeled bovine serum albumin

Fluo fluorescent

Fluo-CsA fluorescein labeled CsA FSH; follicle stimulating hormone GPC gel permeation chromatography HEC hydroxyethyl cellulose

Hex hexane

hGH human growth hormone

HPLC -Fluo high performance liquid chromatography with fluorescent detection

HPLC -UV high performance liquid chromatography with UV detection

HRP horseradish peroxidase

IC50 half maximal inhibitory concentration ICH international conference of harmonisation

IgG immunoglobulin G

IMQ imiquimod

LOD limit of detection

LOQ limit of quantification Mabs monoclonal antibodies

MeOH methanol

Mn number-weighted molecular weight Mw weight-weighted molecular weight

MO monoolein

MPC melt polycondensation

MPEG-dihexPLA methoxy-poly(ethylene glycol)-dihexyl substituted polylactide

MPEG-hex PLA methoxy-poly(ethylene glycol)-hexyl substituted polylactide

MPEG-PLA methoxy-poly(ethylene glycol)- polylactide

MRM multiple reaction monitoring

MW molecular weight

NMR nuclear magnetic resonance

NR Nile red

NR-MPEG- dihexPLA

nile-red labeled methoxy-poly(ethylene glycol)-dihexyl substituted polylactide OPLS optimized Potentials for Liquid

Simulations

Os-ab OS-antibody

P.I. polydispersity index

P.L.E.A.S.E.^® Precise Laser EpidermAl SystEm PAA poly(alkylacrylic acid)

PASI psoriasis area severity index PBMC peripheral blood mononuclear cells PBS phosphate buffered saline PCL poly (ε-caprolactone)

PDB protein database

PEG poly(ethylene glycol)

PEO poly(ethylene oxide)

PG propylene glycol

PLA poly(lactic acid)

PLGA poly(lactic-co-glycolic acid) PMMA poly(methyl methacrylate) PNIPA poly(N-isopropylacrylamide)

ppp pulse per pore

PS polystyrene

PSU pilosebaceous unit

RA retinoic acid

RARs retinoic acid receptors RMSD root-mean-square deviation ROP ring-opening polymerisation

RP reverse phase

rpm revolution per minute

RSD relative standard deviation

RSQ resiquimod

RT room temperature

RXRs retinoid X receptors

SC stratum corneum

SEC size exclusion chromatography

SD standard deviation

SEM scanning electron microscopy

SIR sirolimus

SNK Student Newman Keuls

TAC tacrolimus

TBAHS tetrabutylammonium hydrogen sulphate

TEA triethylamine

TEM transmission electron microscopy TFA trifluoroacetic acid

TFP tetrafluorophenyl

TIC total ion current

TLR toll-like receptor

TMB 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine

TRN tretinoin

UHPLC-MS/MS ultra high performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry detection

UV ultra violet

Zav hydrodynamic diameter

Résumé

La formulation a acquis un rôle majeur dans le processus global du développement d'un produit pharmaceutique en commençant par les études précliniques jusqu'à l’autorisation de mise sur le marché du médicament par les autorités compétentes. En effet, la sélection des bons excipients peut conduire à une meilleure efficacité et sécurité du médicament.

L'application topique de substances médicamenteuses sur la peau remonte à l'antiquité égyptienne et gréco-romaine, cependant les premières études sur l'administration transdermique ont été initiées dans la seconde moitié du 20^e siècle. En 1979, le premier patch transdermique contenant de la scopolamine a été approuvé par la FDA (Food and Drug Administration) pour traiter le mal des transports. En effet la peau - en particulier, la couche cornée - est un obstacle redoutable à la pénétration des substances exogènes, ce qui rend difficile l'administration de principes actifs par cette voie. Toutefois, les avantages de cette administration ont encouragé les chercheurs à développer des systèmes d’administration de plus en plus novateurs menant à une administration transdermique et cutanée efficace. Parmi les différentes stratégies qui visent à optimiser la formulation, les nouveaux vecteurs colloïdaux de taille nanométrique sont considérés comme des systèmes d’administration prometteurs.

Le but de ce travail de thèse était de trouver de nouvelles stratégies pour optimiser la biodisponibilité cutanée de substances médicamenteuses nouvelles et déjà commercialisées; de faible et de haut poids moléculaire, afin d'offrir de meilleures solutions thérapeutiques aux patients atteints de maladies dermatologiques.

En guise d’introduction, le CHAPITRE I passe en revue la littérature afin d’élucider le rôle joué par les micelles polymériques comme nanovecteurs dans le domaine de l’administration cutanée et transdermique. Dans un premier temps les mécanismes de formation des micelles sont expliqués puis un aperçu des excipients, des méthodes de préparation et des techniques de caractérisation est présenté. La section finale résume le travail de recherche accompli à ce jour concernant l’utilisation de ces nanovecteurs dans le domaine de l’administration cutanée et transdermique puis commente leur potentiel. La revue de la littérature a révélé que, bien que les études ne soient pas nombreuses, les travaux effectués jusqu’à maintenant démontrent clairement que les micelles sont des systèmes d’administration efficaces pour une application cutanée. Plusieurs hypothèses concernant leur mécanisme d’action sont formulées. Toutefois, la question de savoir si oui ou non ces vecteurs peuvent traverser la couche cornée est encore à ce jour un sujet de controverse.

Par conséquent davantage d’études sur le potentiel de ces transporteurs devraient être menées, en particulier étant donné que nos connaissances en science des polymères sont en constante augmentation et l'utilisation de nombreux copolymères biocompatibles existants n'a pas encore été testée sur la peau.

Un copolymère de méthoxy-poly(éthylène glycol) et poly acide lactique substitué de chaines dihexyl (MPEG-dihexPLA) biodégradable et biocompatible a récemment été synthétisé et caractérisé par nos collègues de l’unité Galénique de l'Université de Genève. Ce dernier mène à la formation de micelles stables à de faibles concentrations qui peuvent encapsuler des quantités élevées de substances lipophiles.

Des affections cutanées telles que la dermatite atopique et le psoriasis sont causées par une réponse immunitaire topique déréglée. Ces maladies affectent des millions de personnes dans le monde et sont considérées comme des besoins thérapeutiques urgents et non satisfaits dans le domaine dermatologique. Bien que des médicaments puissants soient disponibles pour le traitement de ces maladies, leur administration topique est un défi. Par conséquent dans le CHAPITRE II, nous étudions la capacité des micelles de MPEG-dihexPLA à encapsuler et à ameliorer l’administration cutanée du tacrolimus, un puissant mais très lipophile inhibiteur de la calcineurine. Les résultats ont démontré que des micelles de 10 à 50 nm peuvent encapsuler efficacement le tacrolimus permettant l'élaboration d'une formulation micellaire stable avec une teneur à 0.1%. Cette formulation a conduit à une déposition cutanée de tacrolimus significativement plus grande (1.50 ± 0.59 µg/cm²) que Protopic^® , une pommade disponible dans le commerce également à 0.1% (0.47 ± 0.20 µg/cm²) ainsi qu’à une perméation transdermique indétectable. Le profil de biodistribution cutanée du tacrolimus dans la peau a montré une augmentation des taux de médicament dans la couche cornée, l'épiderme et la partie supérieure du derme, cette dernière couche étant le site d’administration cible pour le tacrolimus. Enfin la localisation des micelles sur la peau et les voies de pénétration moléculaires ont été visualisées par microscopie confocale à balayage laser en utilisant un copolymère marqué (NR- MPEG-dihexPLA) et des marqueurs fluorescents. L'étude microscopique a indiqué que le copolymère a été incapable de traverser la couche cornée et que la libération de la « charge » contenue dans la micelle dépendait des propriétés moléculaires de la «cargaison» comme en témoigne les comportements des différents marqueurs utilisés. Une déposition des micelles dans le follicule pileux a également été observée.

La ciclosporine A est un autre inhibiteur de la calcineurine utilisé dans le traitement du psoriasis et de la dermatite atopique, disponible seulement en traitement oral. Encouragés par les résultats prometteurs dans le cas des micelles chargées de tacrolimus, dans le CHAPITRE III, nous

effectuons plusieurs formulations de micelles de ciclosporine A, afin d'étudier l'effet de la composition de la formulation sur l’administration topique. De nouveau les micelles se sont révélées être de taille petite (Zav 25-52 nm) et homogène ainsi que de morphologie sphérique.

L’administration cutanée de la ciclosporine A à partir des formulations micellaires a pu être modulée d’une part par la teneur en copolymère et d’autre part par le taux de charge des micelles. La formulation à 5 mg/ml de copolymère a été optimale en termes d'activité thermodynamique et a ainsi mené à la déposition de quantités supra-thérapeutiques de ciclosporine A dans la peau humaine (1.4 ± 0.6 µg/cm²) après une application d’une heure seulement et sans perméation transdermique concomitante. Les voies de pénétration des micelles et du médicament ont ensuite été visualisées par microscopie confocale à balayage laser. Tout comme dans le CHAPITRE II, généralement les études de visualisation utilisent des marqueurs fluorescents en tant que «médicaments modèles»;

cependant, ceux-ci peuvent avoir des propriétés physico-chimiques très différentes de la molécule d’intérêt. Par conséquent, dans cette étude, il a été décidé de modifier chimiquement la ciclosporine A (CsA) en lui ajoutant un marqueur fluorescent (la fluorescéine) et d'utiliser cet analogue structurellement similaire afin de visualiser les voies de transport moléculaire. Ainsi la Fluo-CsA a été synthétisée et caractérisée. Des techniques de modélisation moléculaire et la mesure expérimentale du log D ont été utilisées pour démonter la similitude entre la CsA et son analogue fluorescent. Finalement la Fluo-CsA a été incorporée dans des micelles fluorescentes contenant du NR-MPEG-dihexPLA. Il a été démontré que ni la conformation de la CsA ni son log D (pH de 4 à 8) n'a été modifié par l'addition de la fluorescéine. Les images de microscopie ont indiqué de manière inédite que les micelles ont pu être préférentiellement déposées entre les cornéocytes et dans les régions inter-cluster (c’est à dire entre les groupements de cornéocytes). La pénétration cutanée de la Fluo-CsA était en effet plus profonde au niveau de ces structures, ce qui suggère que l’administration via les régions inter-cluster est probablement une voie de transport préférentielle responsable de la déposition cutanée accrue de la ciclosporine A.

Les études antérieures ont dénoté une interaction préférentielle des micelles avec le follicule pileux.

Ainsi, l'objectif du CHAPITRE IV a été de tirer parti de ce constat et d'enquêter d’avantage sur potentiel des formulations micellaires à administrer les médicaments de manière ciblée au niveau de cette annexe cutanée. L'acide rétinoïque est un médicament largement utilisé pour le traitement de l’acné vulgaire, une affection très répandue de l'unité pilo-sébacée. L’incapacité de la formulation à cibler l'unité pilo-sébacée mène à une mauvaise efficacité du traitement et une incidence accrue des effets secondaires locaux.

Le but de ce travail était donc de concevoir une formulation micellaire d’acide rétinoïque stable physiquement et chimiquement et d'évaluer sa capacité à administrer ce dernier dans la peau. Une méthode novatrice de prélèvement d'échantillons par micro-biopsie a été développée pour quantifier sélectivement l’administration folliculaire. Il a été demontré que les micelles étaient en mesure d’administrer l’acide rétinoïque plus efficacement qu’un gel à base de microsphères (Retin-A^® Micro 0.04%) et cela malgré une réduction significative de la teneur en acide rétinoïque à 0.005%. Les micelles polymériques et Retin-A^® Micro (0.04%) ont affiché une deposition accrue au niveau de l'unité pilo-sébacée (2 fois plus qu’au niveau des echantillons exempts de cette dernière). Ce phénomène n’a pas été observé après l’application d’une solution éthanolique non vectorisée (Effederm^® 0.05%) menant à penser que la présence de vecteurs est une condition nécessaire pour le ciblage de l’annexe. En outre, la formulation de micelles a surpassé Retin-A^® Micro en terme d'efficacité d’administration à l'unité pilo-sébacée, en présentant une déposition dans la peau humaine de 10.4 ± 3.2% de la dose appliquée contre seulement 0.6 ± 0.2% pour Retin-A^® Micro. Les résultats indiquent que la formulation de micelles polymèriques a permis un apport accru et ciblé d’acide rétinoïque au niveau de l'unité pilo-sébacée, ce qui pourrait mener à une prise en charge plus sûre et plus efficace de l'acné.

Le CHAPITRE V propose une étude sur la formulation et l’administration de l'imiquimod, un agoniste du TLR 7 utilisé dans le traitement des cancers de la peau. L'imiquimod est disponible sur le marché sous la forme d’une crème à 5%. Cependant les véhicules conventionnels pour application topique peuvent souffrir d'un manque d'efficacité d’administration. Les micelles de MPEG-dihexPLA ont déjà procuré une efficacité d’administration cutanée accrue à un large éventail de molécules lipophiles et peu solubles dans l’eau. Compte tenu de la solubilité et du caractère lipophile de l’imiquimod, il a été décidé d'étudier le potentiel de micelles polymériques pour l’administration cutanée de cette molécule. Des micelles chargées d’imiquimod ont été formulées et caractérisées. En outre, l'utilisation novatrice de la chromatographie d'exclusion de taille a permis la localisation exacte de la molecule à l'intérieur de la formulation; ainsi il est apparu que l’inévitable utilisation d'acide acétique pour la solubilisation de l’imiquimod a conduit à une localisation d’imiquimod majoritairement à l’extérieur de la micelle. Malgré cela les micelles ont été incluses dans une formulation de gel à base de carboxyméthylcellulose contenant 0.05% d’imiquimod. L’application in vitro de cette formulation sur la peau porcine et humaine a conduit à des résultats prometteurs. Le gel optimal à 0.05% a produit une déposition cutanée de 1.4 ± 0.4 µg/cm² dans la peau humaine et a limité la perméation transdermique à 79 ± 19 ng/cm². Ce dernier a également montré une meilleure efficacité d’administration que la crème Aldara^® sur la peau humaine (2.85 ± 0.74% vs 0.04 ± 0.01%

de la dose appliquée). Malgré le fait que l’imiquimod n'a été que partiellement incorporé dans les

micelles, le profil de biodistribution a montré que le gel optimal à 0.05% a délivré jusqu'à 518.2 ± 173.3 ng/cm² (1.04 ± 0.35% de la dose appliquée) à l'épiderme et 236.4 ± 88.2 ng/cm² (0.47 ± 0.18%

de la dose appliquée) à la partie supérieure du derme, couches où les cellules présentatrices d'antigène (cellules cibles) résident. Au contraire pour la crème Aldara^® l’efficacité d’administration dans ces couches était inférieure à 0.02%. Le gel optimal à 0.05% a ainsi permis d'atteindre des taux thérapeutiques de médicaments dans les tissus cibles, malgré une réduction de 100 fois de la dose appliquée.

Le dernier chapitre (CHAPITRE VI) quitte le domaine des nanovecteurs colloïdaux et examine l'administration topique de molécules plus grandes: les anticorps monoclonaux. Pour le traitement des cas sévères de psoriasis, les anticorps ciblant les cytokines doivent être administrés par voie parenterale. Cependant, ceci conduit à une forte exposition systémique au médicament biologique, alors que seule une petite fraction des molécules actives atteint le site cible qui est la peau. Cette étude examine la faisabilité d’administrer un anticorps monoclonal (OS-ab) localememt en utilisant une technique de poration au laser minimalement invasive. Tout d'abord, l'effet d'un large éventail de conditions de poration sur la déposition dans la peau et la perméation à travers celle-ci de l’OS-ab a été testé in vitro pour déterminer les paramètres optimaux. Ensuite la microscopie confocale a été utilisée pour visualiser la distribution de l’OS-ab marqué dans la peau. Les résultats ont démontré que l’administration locale et transdermique de l’OS-ab est possible. L’utilisation de fluences de 35.3 J / cm² et plus, produit une déposition et une perméation statistiquement supérieures à celles obtenues par diffusion passive de l’anticorps à travers une peau intacte. La deposition cutanée peut atteindre jusqu'à 3.7 ± 1.2 µg/cm² aux conditions les plus agressives. Le ciblage de la peau était également possible puisqu’au moins 70% de la quantité totale du principe actif délivré a été déposée localement dans la peau. Des perméations de l’ordre du nanogramme par centimètre carré on pu etre observés : ces quantités sont considérées comme provoquant une exposition systémique très négligeable. La déposition de l’Os-ab marqué de fluoresceine s’est trouvé être localisée à proximité et en-dessous des pores et était nettement supérieure à la déposition dans la peau intacte. L'augmentation de la fluence a également provoqué une intensification de la fluorescence dans les régions avoisinant les pores, confirmant ainsi les données quantitatives. Enfin, l'observation des follicules pileux n'a pas révélé une contribution majeure de la voie transfoliculaire dans l’administration cutanée, ce qui signifie que la diffusion à travers les pores semble être la seule voie de pénétration de l'anticorps dans la peau.

Pour conclure, de nouvelles stratégies pour améliorer la biodisponibilité cutanée de principes actifs de petit et haut poids moléculaire ont été développées avec succès. L'encapsulation du tacrolimus, de la ciclosporine A, de l'acide rétinoïque et l'imiquimod dans des vecteurs colloïdaux de taille

nanométrique, à savoir des micelles polymèriques de MPEG-dihexPLA a conduit à des formulations innovantes et biocompatibles capables d’administrer efficacement les substances actives à leurs sites d’action respectifs, tout en limitant la perméation transdermique. Plusieurs mécanismes d'interaction des micelles avec la peau ont pu être observés. D'une part il est clairement apparu qu'il existe une forte interaction entre les micelles et les unités pilo-sébacées encourageant leur utilisation pour le traitement des maladies de ces annexes telles que l'acné vulgaire. D'autre part, il a été supposé que des micelles doivent une partie de leur efficacité d’administration à leur interaction privilegiée avec les régions inter-cluster, où la couche cornée semble être plus mince. Enfin, l’administration topique ciblée d'un anticorps de 150000 Da a été faisable à l’aide d’une technique de poration laser minimalement invasive.

Summary

During the development of a pharmaceutical product, optimization of the formulation has acquired a major role in the overall process from preclinical studies up to final drug approval by the competent authorities since the selection of the right excipients may lead to a better efficacy or safety of a drug.

Topical application of medicines to skin goes back to Egyptian and Greco-Roman antiquity whereas the first investigations into the principles behind the transdermal administration of drugs to the systemic circulation started in the second half of the 20th century. In 1979 the first transdermal patch containing scopolamine was approved by the FDA to treat motion sickness. Indeed the skin – in particular, the stratum corneum - has long been recognized as a formidable barrier against the entry of drugs into the body rendering the administration of active principles via this route challenging.

However, the potential advantages of this administration have encouraged researchers to develop innovative delivery systems that allow efficient dermal and transdermal delivery. Among the different strategies that aim to optimize the formulation, novel nano-sized colloidal carriers are considered as promising delivery systems.

The aim of this thesis work was to find novel strategies to optimize topical skin bioavailability of already marketed and new, low and high molecular weight drugs in order to offer better therapeutic solutions to patients with dermatological conditions.

CHAPTER I reviews the literature in order to understand the role played by polymeric micelles as nanocarriers in the field of dermal and transdermal delivery. First, the mechanisms of micelle formation are explained. An overview of excipients, preparation methods and characterization techniques is then presented. The final section summarizes the work done to-date using polymeric micelles as dermal and transdermal drug carriers and comments on their potential as drug delivery systems. The literature survey revealed that although studies into the ability of polymeric micelles to enhance dermal and transdermal drug delivery were not numerous, the work to-date clearly demonstrates that micelles are efficient drug delivery systems for cutaneous application and several hypotheses concerning the enhancement mechanism are formulated. However, the question of whether or not these nano-sized drug carriers can cross the stratum corneum has been and is still a matter for debate. Therefore, more investigations on the potential of these remarkable carriers should be conducted especially as knowledge in polymer science is constantly growing and the use of many existing biocompatible copolymers has not yet been tested on skin.

The biodegradable and biocompatible methoxy-poly(ethylene glycol)-dihexyl substituted polylactide (MPEG-dihexPLA) diblock copolymer recently synthesized and characterized by our colleagues from the University of Geneva enables the formation of stable micelles at low concentrations and the encapsulation of appreciable amounts of lipophilic drugs.

Skin conditions such as psoriasis and atopic dermatitis are caused by a deregulated topical immune response and affect millions of people worldwide. Their effective treatment is considered to be an urgent unmet need in the dermatological field. Although potent drugs are available for the treatment of these diseases, their topical delivery is challenging. Therefore, in CHAPTER II we investigate the ability of MPEG-dihexPLA micelles to encapsulate and to deliver tacrolimus, a potent lipophilic calcineurin inhibitor, to skin. The results demonstrated that 10 to 50 nm micelles could efficiently encapsulate tacrolimus allowing the formulation of a stable 0.1% formulation. This formulation resulted in significantly greater tacrolimus deposition in skin than Protopic^® (0.1% w/w marketed ointment), (1.50 ± 0.59 and 0.47 ± 0.20 µg/cm², respectively) together with an undetectable transdermal permeation. The cutaneous biodistribution profile of tacrolimus in the upper 400 µm of skin demonstrated that the increase in cutaneous drug levels was due to improved tacrolimus deposition in the stratum corneum, viable epidermis and upper dermis, namely the target skin layers for tacrolimus therapy. Finally, micelle distribution and molecular penetration pathways were subsequently visualized with confocal laser scanning microscopy (CLSM) using fluorescently labeled copolymer and fluorescent dyes. The CLSM study indicated that the copolymer was unable to cross the stratum corneum and that release of the micelle “payload” was dependent on the molecular properties of the “cargo” as evidenced by the different behavior of DiO and fluorescein. A preferential deposition of micelles into the hair follicle was also observed by CLSM.

Ciclosporin A is another calcineurin inhibitor that is used in the treatment of psoriasis and atopic dermatitis but is available only as oral treatment. Encouraged by the promising results yielded by tacrolimus loaded micelles, in CHAPTER III we formulate several micelle formualtions of ciclosporin A in order to investigate the effect of the formulation composition on topical skin delivery. Again micelles proved to be spherical homogeneous and nanometre-scale size (with Zav from 25 to 52 nm). CsA delivery from the micelle formulations into the skin could be fine-tuned by modulating either the copolymer content or the drug loading. The 5 mg/ml copolymer formulation seemed to be optimal in terms of thermodynamic activity thus yielded supra-therapeutic amounts of CsA in human skin (1.4 ± 0.6 µg/cm²) after application of the formulation for only 1 h without concomitant transdermal permeation.

Micelle and drug penetration pathways were subsequently visualized with confocal laser scanning microscopy (CLSM). Similarly to what was done in CHAPTER II, visualization studies typically use fluorescent dyes as “model drugs”; however, these may have different physicochemical properties to the drug molecule under investigation. Therefore, in this study it was decided to chemically modify CsA and to use this structurally similar fluorescent analogue to visualize molecular distribution and transport pathways. Molecular modelling techniques and experimental determination of log D served as molecular scale and macroscopic methods to compare the lipophilicity of CsA and Fluo-CsA.

Fluo-CsA was successfully synthesized, characterized and incorporated into fluorescent NR-MPEG- dihexPLA micelles; its conformation was not modified by the addition of fluorescein and its log D, measured from pH 4 to 8, was equivalent to that of CsA. Fluo-CsA and NR-MPEG-dihexPLA copolymer were subsequently visualized in skin by CLSM. The images indicated that micelles were preferentially deposited between corneocytes and in the inter-cluster regions (i.e. between the clusters of corneocytes). Fluo-CsA skin penetration was deeper in these structures, suggesting that inter- cluster penetration is probably the preferred transport pathway responsible for the increased cutaneous delivery of CsA.

Previous studies pointed to a preferential interaction of the micelles with the hair follicle. Therefore, the aim of CHAPTER IV was to leverage this finding and to further investigate the potential of micelle formulations in delivering the drug to that appendage in a targeted manner. Retinoic acid (also known as all-trans retinoic acid or tretinoin) is a widely used drug in another dermatological unmet need: Acne vulgaris, a highly prevalent affection of the pilosebaceous unit (PSU). A lack of targeted drug delivery to the PSU results in poor treatment efficacy and the incidence of local side- effects. The aim of this work was to prepare physically and chemically stable retinoic acid loaded polymeric micelles and to evaluate their ability to deliver RA to skin. An innovative punch biopsy sample preparation method was developed to selectively quantify follicular delivery. It was shown that micelles were able to deliver RA to porcine and human skins more efficiently than Retin-A^® Micro (0.04%), a marketed gel containing RA loaded microspheres, (7.1 ± 1.1% vs 0.4 ± 0.1% and 7.5 ± 0.8% vs 0.8 ± 0.1% of the applied dose, respectively). In contrast to a non-colloidal RA solution, Effederm^® (0.05%), both the RA loaded MPEG-dihexPLA polymeric micelles (0.005%) and Retin-A^® Micro (0.04%) displayed selectivity for delivery to the PSU with 2-fold higher delivery to PSU containing samples than to control samples. Moreover, the micelle formulation outperformed Retin-A^® Micro in terms of delivery efficiency to PSU presenting human skin (10.4 ± 3.2% vs 0.6 ± 0.2% respectively). The results indicate that the polymeric micelle formulation enabled an increased and targeted delivery of RA to the PSU, potentially translating to a safer and more efficient clinical management of acne.

CHAPTER V proposes a study into the formulation of imiquimod (IMQ), a TLR 7 agonist used in the treatment of non-melanoma skin cancers. IMQ is available on the market as a 5 % cream;

however, conventional vehicles for topical application may suffer from poor delivery efficiency.

MPEG-dihexPLA micelles have shown their ability to deliver a wide range of lipophilic poorly soluble molecules to skin with increased delivery efficiency. Given the poor water solubility and lipophilic character of IMQ, it was decided to investigate the potential of MPEG-dihexPLA polymeric micelles as a drug delivery system. Nanosized (dn of 27 nm) IMQ micelles were formulated and characterized. Moreover, the innovative use of size exclusion chromatography allowed the exact drug localization inside the formulation; it appeared that the use of acetic acid for the solubilization of IMQ led to a higher drug content outside the micelle than inside. Nevertheless, micelles were incorporated in gel formulations leading to an optimal carboxymethyl cellulose gel containing 0.05% of IMQ. In vitro application of this formulation to porcine and human skin led to promising delivery results. The gel produced a 1.4 ± 0.4 µg/cm² deposition in human skin and a limited 79 ± 19 ng/cm² transdermal permeation. The optimal 0.05% gel also outperformed the 5%

Aldara^® commercial formulation in terms of delivery efficiency to human skin (2.85 ± 0.74 % vs 0.04

± 0.01%). Despite the fact that IMQ was only partially incorporated in the micelles, the biodistribution profile showed that the optimal 0.05% gel delivered as much as 518.2 ± 173.3 ng/cm² (1.04 ± 0.35% of the applied dose) to the viable epidermis and 236.4 ± 88.2 ng/cm² (0.47 ± 0.18% of the applied dose) to the upper dermis where the target antigen presenting cells reside. In contrast, for Aldara^® cream the delivery efficiencies in those layers were less than 0.02%. The optimal 0.05% gel thus allowed to achieve therapeutically relevant drug levels in target tissues despite a 100-fold dose reduction.

The final CHAPTER VI leaves the field of colloidal nanocarriers and deals with the topical delivery of significantly larger molecules: monoclonal antibodies. Monoclonal antibodies targeting cytokines are administered systemically for the treatment of severe psoriasis cases. However, this leads to a high systemic exposure to the biological drug, whereas only a small fraction of the active molecules reach the target site which is the skin. This study examines the feasibility of delivering a monoclonal antibody (OS-ab) topically to skin using a minimally-invasive laser-assisted poration technique, with apotential clinical applicationof the targeted topical therapy of recalcitrant psoriasis plaques. First, the effect of a wide range of poration conditions on skin permeation and deposition was tested in vitro to determine optimal parameters. Subsequently confocal microscopy was employed to visualize the distribution of a labeled OS-ab in skin. The results demonstrated that delivery of OS-ab into and across skin was feasible. Above fluences of 35.3 J/cm² skin deposition and permeation were statistically superior to passive delivery reaching values up to 3.7 ± 1.2 µg/cm² at the most aggressive

condition. Selective skin targeting was also possible since at least 70 % of the total active delivered, was delivered locally to the skin. Nanogram amounts per square centimeter could permeate across skin; however, those quantities were believed to lead only to a negligible systemic exposure. The diffusion of fluorescently labeled OS-ab into the skin in the surroundings of the pores and beneath was clearly higher than in intact skin. Increasing the fluence also resulted in stronger fluorescence in the pore regions, confirming the quantitative data. Finally, the CLSM observation of hair follicles did not reveal a transfollicular pathway, meaning that diffusion through the pores is the only penetration pathway for the antibody to skin.

To conclude, novel strategies to enhance the topical skin bioavailability of drugs of various molecular weights have been successfully developed. Encapsulation in colloidal nanometer-size polymeric micelles of tacrolimus, ciclosporin A, retinoic acid and imiquimod led to innovative biocompatible formulations able to efficiently deliver the actives to their respective target sites with limited undesired transdermal permeation. Several mechanisms of micelle interaction with skin have been observed. On one hand it has clearly appeared that there is a strong interaction between the micelles and the pilosebaceous units encouraging their use for the treatment of skin diseases like Acne vulgaris. On the other hand it is thought that micelles partially owe their enhanced delivery efficiency to their interaction with inter-cluster regions, where the stratum corneum is thought to be thinner than in plain skin. Finally, a targeted topical delivery of a 150000 Da antibody has been shown to be possible with the use of a minimally-invasive laser-assisted poration technique.