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1 Pr : Nadia . Dakka
TD Immuno S5 2014-2015
• Anticorps monoclonaux
Population homogène d ’anticorps issus d ’un
« seul et unique » clone de cellules B
Les
anticorps monoclonauxsont des anticorps ne reconnaissant qu'un seul type d'épitope sur un antigène donné . Ils sont par définition tous identiques et produits par un seul clone de plasmocyte.
• Avantage
Spécificité Affinité
Production massive et constante
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5 Les Ac monoclonaux sont disponibles indéfiniment une fois les
hybridomes immortalisés.
La production des Ac monoclonaux nécessite moins d’animaux par rapport à la production desAc polyclonaux,
Les Ac polyclonaux peuvent être obtenus beaucoup plus rapidement, à moindre coût et avec moins de compétences techniques que pour produire des Ac monoclonaux.
Les Ac polyclonaux sont obtenus en 4 à 8 semaines, tandis que la productiond’Ac monoclonaux peut prendre 3 à 6 mois.
• Les partenaires de fusion
– cellules B extraites d ’organes lymphoïdes secondaires (rate, ganglions), des plasmocytes sécrétant des Ac.
– cellules myélomateuses de souris
• Méthode de fusion
– Chimique – Physique
• Sélection, clonage
in vitro d’un hybridome producteur d’Ac.
• Expansion
multiplicationde clones de l’hybridome, soit in vitro, soit in vivo, afin d’obtenir de grandes quantités d’Ac.
Principe de la production des anticorps
monoclonaux
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• L'immunisation
– Les sources d'antigènes degré de pureté : élimination des contaminants
– L'immunisation de l'animal
• dose et forme de l ’antigène
• adjuvants
• voie et nombre d ’injection
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9 Immunogène
Antigène n
Quantité de l’immunogène par injection et par animal.
Protéine protéine lyophilisée 2 - 50 µg
en solution 2 - 50 µg
Incluse dans un gel de polyacrylamide 1 - 10 µg
Haptène Peptide 1 - 10 µg
Nucléotide glucide
Substance chimique naturelle ou synthétique
Les animaux, souris ou rats, utilisés à la fois pour
l’immunisation en vue de la préparation du clone
d’hybridome et pour la production d’Ac monoclonaux
(production in vivo), doivent être de même souche
(syngéniques) pour des raisons d’histocompatibilité.
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11 César Milstein et Georges Köhler (1970)
+
UTILISATION DE
CELLULES MYELOMATEUSES OBTENTION DES LYMPHOCYTES OBTENTION DES LYMPHOCYTES SPECIFIQUES
SPECIFIQUES
OBTENTION DES CELLULES IMMORTELLES OBTENTION DES CELLULES IMMORTELLES
IMMUNISATION DE LA SOURIS AVEC L’ANTIGÈNE ÉTUDIÉ
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13 Les cellules de myélome utilisées dans les hybridomes n’ont pas
l’enzyme HGPRT (hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transférase) . Elles ont perdu la capacité de produire des immunoglobulines (mutants Ig-).
Les cellules de myélome n’apportent que leur propriété d’immortalité aux cellules résultant de la fusion.
L’autre partenaire de la fusion est une population de plasmocytes possédant l’enzyme: HGPRT et sécrétant les Ig.
Ces plasmocytes contribuent à la capacité des hybridomes à survivre dans le milieu de culture sélectif HAT (Hypoxanthine, Aminoptérine et Thymidine).
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On fusionne les
plasmocytessécrétant des anticorps dirigés spécifiquement contre l'antigène choisi, avec des cellules de tumeur :
myélomes(cellules immortelles) .
La fusion membranaire se fait grâce à l'addition de
polyéthylène glycol (PEG)et permet ainsi d'obtenir
des hybridomes.Les hybridomes
ont la capacité de se multiplier plus
rapidement que les plasmocytes productrices
d'anticorps et de développer indéfiniment des
anticorps spécifiques.
• Fusion chimique
: Poly Ethylène Glycol (PEG) – fusion des membranes cytoplasmiques – rendement de fusion élevé– DMSO renforce la viabilité cellulaire
• Fusion physique
: Electrofusion– Ouverture de pores dans la cellule par des pulses électriques – technique onéreuse
– moins destructrice
Méthodes de fusion
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17 Par méthode chimique
Par méthode physique
SELECTION
+
FUSION DES MEMBRANES
CELLULAIRES AVEC DU PEG (poly éthylène glycol)
FUSION DES MEMBRANES CELLULAIRES PAR ELECTROPORATION
• Sélection sur milieu sélectif HAT
– Hypoxanthine Aminopterine Thymidine
– facteurs de croissance : IL6β mercaptoethanol – sérum de veau fœtal
– fibroblastes
– sous atmosphère CO2
– seuls les hybridomes se développent – 1 x 105cellules/ml
Sélection, clonage
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19 Après fusion des hybridomes, les cellules sont réparties dans
des plaques multipuits de telle sorte qu'il n'y ait qu'une cellule par puits. le mélange de toutes ces cellules (hybrides et cellules parentales) est placé sur un milieu de culture sélectif : HAT (Hypoxanthine, Aminoptérine et Thymidine) .
Les plasmocytes non fusionnés meurent rapidement et les cellules myélomateuses utilisées ayant un gène non fonctionnel pour une enzyme intervenant dans la synthèse des nucléotides (HGRPT) sont incapable de survivre dans un milieu HAT.
La sélection par le milieu HAT dépend du fait que les cellules de mammifères peuvent synthétiser les nucléotides par deux voies différentes :
La voie de novo et la voie de récupération en incorporant directement les purines et les pyrimidines dans les nucléotides nécessaires à la synthèse de l’ADN et de l’ ARN.
Les enzymes qui catalysent la voie de récupération
incluent HGPRT et TK. Une mutation de l’un ou
l’autre de ces deux enzymes bloque la capacité de la
cellule à utiliser la voie de récupération et entraîne
sa mort dans le milieu HAT .
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21 Culture sur milieu HAT
Hypoxanthine Aminoptérine Thymidine
Cellule myélomateuse HGPRT- Lymphocyte B
MORT CELLULAIRE Impossibilité de se diviser
MORT CELLULAIRE disparition après quelques divisions HYBRIDOME
SELECTIONNE
+
Sur milieu gélosé Par dilution limite
Une colonie = une cellule initiale Une ou zéro cellules par puit
+
Dès que la croissance est suffisante, il faut propager les cultures d'hybridomes productrices de l'anticorps désiré, les conserver et les cloner. Deux méthodes sont utilisées pour obtenir un clone à partir d'une cellule :
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• Sélection d ’une seule cellule et mise en culture.
Clonage dans l’Agar, dans l’Agarose
on visualise directement les colonies cellulaires dans l ’agar, que l ’on remet en culture après dilution.
Clonage par dilution limite
la plus utilisée dans les laboratoires.
Réalisée directement dans une plaque de microtitration peu onéreuse
Longue.
• Immuno précipitation
– Ouchterlony, Mancini
• Radio immunologie (RIA)
– radio isotope
• Immuno enzymologie (EIA)
– enzyme (ELISA)
• Compteur de cellules (Cell sorter)
• Western Blot
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25 TEST SUR LE SURNAGEANT DE CHAQUE PUIT
• DE LA PRESENCE DES ANTICORPS MONOCLONAUX PAR LA METHODE ELISA
• DU TYPE D’ANTICORPS PRODUIT
PAR DES METHODES D’IMMUNOPRECIPITATION
+
• 2 techniques ELISA
– Compétition
– Sandwich : la plus utilisée pour ce propos
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ELISA sandwich
Ac de capture
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• Au bout d'une dizaine de jours, on recherche dans chaque puits la présence d'anticorps dirigés contre l'antigène utilisé pour immuniser la souris.
• On peut alors multiplier les clones positifs
(producteurs de l’Ac d’intérêt) soit en continuant de
les cultiver in vitro, soit en utilisant l’animal immunisé
pour une production in vivo.
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• Avantages
– Concentration élevée en Ac Mo
– Pas d’intermédiaire industriels
• Inconvénients
– Utilisation de l’animal – Présence de protéines
murines
– Contaminants – Stress de la souris
Amplification des hybridomes Production par cultures cellulaires
Production dans les liquides d'ascites
+
OBTENTION DES
ANTICORPS MONOCLONAUX
CONSERVATION DES HYBRIDOMES
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• Injection des hybridomes dans le péritoine de souris
• Développement d ’une tumeur : ascite
• Prélèvement des anticorps par ponction de liquide d ’ascite
• Rendement élevé 20 g/l
• C’est la souris qui régule les conditions de culture !
• Purification du liquide d ’ascite nécessaire
• Préparation de l’échantillon
• Purification principale – Chromatographie
d’affinité
• Affinité
immunologiques – spécifique du Fc.
– spécifique de l’antigène.
Ligand Analyte
Impuretés
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Fixation Elution
Elution par déplacement avec l’antigène libre
Elution par déplacement avec un analogue
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• Avantages
– Pas d’utilisation d ’animal – Production de grandes
quantité d’anticorps – Pas de personnel
d’animalerie
– Pas de contaminant
• Inconvénients
– Nécessite l’utilisation de sérum de veau fœtal – Contamination par les
hybridomes morts
– Ac de plus faible affinité – Plus chère pour de petites
production
• Basé sur la technologie des fibres creuses.
• Diminution des coûts, du temps.
• Augmentation de la production 3 à 5 g/l, de la pureté
• Pas ou peu de contaminant (6 x moins)
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• Spécificité
– Reconnaissance d ’un seul motif épitopique – Réactions croisées, non-spécifiques.
– Maintient de l ’activité après modification chimique
• L'affinité – Élevée
– Constante et contrôlée
• Avantages de ce type de production – Constante
– reproductible
Tout anticorps est caractérisé par deux propriétés :
- capacité de lier spécifiquement un ou plusieurs ligands - participation à une ou plusieurs fonctions effectrices
(activation du complément, stimulation de la phagocytose…)
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Premières applications thérapeutiques des Ac Mo en 1981 avec le muromonab utilisé dans le traitement des épisodes de rejet aigu en transplantation d'organes.
Inconvénients des premiers anticorps monoclonaux produits par des hybridomes murins:
- une demi-vie courte -immunogènes.
Les progrès de la biologie moléculaire, au cours des années 1980, ont permis la production d'abord d'anticorps chimériques, puis d'anticorps humanisés et enfin d’anticorps totalement humains.
Depuis, le développement et l'utilisation clinique de ces anticorps monoclonaux ont connu un essor spectaculaire.
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43 Ac monoclonal
de souris
100% souris
Ac monoclonal humanisé 90 % homme
10% souris Ac monoclonal
chimérique
75% homme 25% souris
Ac monoclonal humain
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45 La chimérisation et l'humanisation permettent de varier les
isotypes des anticorps donc de manipuler les fonctions potentielles de l'anticorps (par exemple, la fixation du complément).
Un autre avantage: augmentation de la demi-vie de l'anticorps, qui passe de moins de 20 heures avec les anticorps murins à plusieurs jours, s'approchant des 21 jours des IgG humaines endogènes.
Ceci permet une meilleure utilisation de ces Ac comme agents thérapeutiques.
ANTICORPS ENTIEREMENT HUMAINS:
Des anticorps entièrement humains et biocompatibles sont cependant de plus en plus recherchés pour l'immunothérapie passive.
Trois grands types de technologies ont été mis au point pour les obtenir:
-Techniques d'hybridomes, -Phage display,
-Souris transgénique.
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Les anticorps monoclonaux utilisés comme médicaments ont tous une nomenclature se terminant par « mab », acronyme de
« monoclonal antibody » comme par exemple le rituximab.
Ils sont utilisés dans les tests de grossesse, dans de nombreux domaines de la recherche en biologie et par de nombreuses techniques (cytométrie en flux, western blots.), dans les tests d'immuno-hématologie.
Les anticorps monoclonaux, en monothérapie ou en association avec une chimiothérapie, ont pris place aujourd’hui dans le traitement standard de nombreuses formes de cancers.
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49 Herceptin (Anticorps humanisé)
Biotechnologie Recherche
Cytométrie en flux, Immunohistochimie Etude des lignées cellulaires
Etude des marqueurs des cellules non lymphocytaire Etudes des cellules pathologiques
Purification d’antigènes Diagnostic Recherche d’Ac ou d’Ag
Immunodétection (ELISA, RIA) Imagerie (immunoscintigraphie)
Thérapeutique ≈20 Ac monoclonaux utilisées en thérapeutique + 70 Ac monoclonaux en essais cliniques
traitement immunosuppresseur
(Maladies auto-immunes et inflammatoires, rejet de greffe) traitement anticancéreux (élimination des cellules cancéreuses) cardiologie (traitement anti-thrombotique)
infectiologie (prophylaxie antivirale) allergologie (traitement asthme)
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