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Suivi dynamique et quantitatif de réactions d’oxydation
dans les aliments modèles par RMN 2D ultrarapide
Amaël Morisse
To cite this version:
Amaël Morisse. Suivi dynamique et quantitatif de réactions d’oxydation dans les aliments modèles par RMN 2D ultrarapide. Ingénierie des aliments. 2015. �hal-02793807�
Université de Nantes
UFR Sciences et techniques
Suivi dynamique et quantitatif de réactions d’oxydation
dans les aliments modèles par RMN 2D ultrarapide
Rapport de stage
M1 A3M : Analyse, Molécules, Matériaux, Médicaments
Amaël MORISSE
CEISAM, Université de Nantes
PlateForme Exploration du Métabolisme, INRA de Theix, Saint-Gènes-Champanelle
Encadré par Jean-Marie BONNY, Patrick GIRAUDEAU, Estelle MARTINEAU, Guilhem PAGES
1
Remerciements
Ce stage a été effectué au sein de l’équipe QuaPA de l’INRA de Theix et au sein de l’équipe EBSI du laboratoire CEISAM.
Je remercie tout d’abord Patrick GIRAUDEAU pour avoir proposé ce stage très intéressant et très enrichissant, autant sur le plan théorique que pratique, pour m’avoir transmis ses connaissances sur la RMN ultrarapide et pour ses conseils.
Je remercie Estelle MARTINEAU pour m’avoir aidé à plusieurs reprises et pour ses conseils. Je remercie Virginie SILVESTRE et Benoît CHARRIER pour leurs astuces sur le spectromètre.
Enfin, je remercie également Guilhem PAGÈS, Jean-Marie BONNY et toute l’équipe pour m’avoir encadré lors de mon séjour à l’INRA de Theix, pour leurs conseils et leur bonne humeur.
2
Abréviations
AQ Acquisition time, ou durée de l’échantillonnage
CEISAM Chimie Et Interdisciplinarité, Synthèse, Analyse, Modélisation
COSY COrrelated SpectroscopY
DW Dwell-Time
FID Free Induced Decay
INRA Institut National de la Recherche Agronomique
RMN Résonance Magnétique Nucléaire
SW Spectral Width, ou largeur spectrale
3
Sommaire
Introduction ... 4
Partie bibliographique ... 5
1.1. La Résonance Magnétique Nucléaire à deux dimensions ... 5
1.1.1. Principes ... 5
1.1.2. Avantages et inconvénients ... 5
1.2. La Résonance Magnétique Nucléaire ultrarapide à deux dimensions ... 6
1.3. Méthodes hybrides basées sur la RMN ultrarapide ... 8
1.3.1. Limites de la RMN 2D ultrarapide ... 8
1.3.2. Multi-scan single shot (M3S) ... 9
1.3.3. La RMN 2D ultrarapide par entrelacement ... 10
1.3.3.1. Principe et intérêts ... 10
1.3.3.2. Limites de la RMN 2D ultrarapide par entrelacement ... 11
1.4. Suivi de réactions par RMN 2D ultrarapide ... 12
1.5. Objectif du stage ... 13
Matériels et méthodes ... 14
2.1. Préparation des échantillons ... 14
2.2. Analyses par RMN 1D et 2D UF ... 14
2.2.1. Description des spectromètres ... 14
2.2.2. Séquences utilisées ... 15
2.3. Paramètres utilisés dans les séquences ... 15
2.3.1. Paramètres d’acquisition ... 15
2.3.2. Paramètres de traitement ... 16
2.4. Intégration des signaux ... 16
Résultats et discussions ... 18
3.1. Acides aminés seuls ... 18
3.2. Insuline ... 19
3.3. Mélange de 7 acides aminés ... 20
3.4. Mélange de 3 acides aminés ... 21
Conclusion et perspectives ... 24
4
Introduction
La qualité de l’alimentation est un critère important du point de vue du consommateur. Les aliments sont susceptibles d’évoluer avec le temps, altérant ainsi leurs qualités sensorielles, nutritionnelles et sanitaires. Par exemple, l’oxydation des acides gras et des acides aminés est à l’origine du goût de rance dans les huiles ou le beurre, mais aussi dans la viande, et peut former des composés dangereux pour la santé du consommateur. Cette oxydation peut notamment être due à la présence de métaux dans l’aliment (fer, cuivre,…) qui, en contact avec l’oxygène de l’air ou d’autres dérivés, provoquent la formation de radicaux libres responsables de l’oxydation [1].
L’objectif du projet STABOXAL, initiant la collaboration entre l’équipe QuaPA à l’INRA de Theix et l’équipe EBSI au laboratoire CEISAM de Nantes, est d’améliorer et de conserver plus longtemps la qualité des aliments pour les consommateurs. Pour cela, il est nécessaire d’utiliser un outil capable d’analyser les propriétés physico-chimiques des composés présents dans les aliments, tout en suivant leur évolution, ici leur oxydation, au cours du temps. La RMN remplit ces critères : elle permet le suivi de réactions grâce aux données qualitatives et quantitatives qu’elle peut fournir sur les espèces présentes. Cependant, la plupart des réactions ont lieu en milieu complexe et la RMN 1D est alors rapidement limitée par le recouvrement entre les pics [2]. La RMN 2D permet un éclatement des massifs et facilite leur attribution [3-5]. Par ailleurs, ces réactions peuvent être rapides empêchant l’utilisation de la RMN 2D conventionnelle puisque celle-ci possède une durée d’expérience longue. Pour pallier ce problème, des méthodes rapides ont été proposées, telles que la RMN 2D ultrarapide ou la méthode M3S [6].
Dans un premier temps, à l’INRA, une étude préliminaire est effectuée sur des échantillons composés d’un seul acide aminé pour déterminer si le suivi d’oxydation est possible par RMN 1D. Cette étude est ensuite transposée à un peptide : la chaîne B de l’insuline. Ensuite, au laboratoire CEISAM, plusieurs expériences sont menées : le suivi d’oxydation du peptide et le suivi d’oxydation d’acides aminés dans des mélanges de complexité variable. Ces deux suivis sont effectués à l’aide de la RMN 2D ultrarapide pour acquérir le plus d’informations sur la réaction, et ainsi obtenir des données cinétiques sur des systèmes modèles qui pourront être utilisées pour mieux comprendre les mécanismes d’oxydation.
5
Partie bibliographique
1.1.
La Résonance Magnétique Nucléaire à deux dimensions
1.1.1. Principes
La RMN à deux dimensions est proposée en 1971 par J. Jeener [7]. Cette idée est alors exploitée par R. R. Ernst qui concrétise le principe de la RMN 2D [8]. Une expérience de RMN à deux dimensions est composée de 4 périodes (Fig. 1) : la période de relaxation et de préparation, la période d’évolution, la période de mélange et la période d’acquisition. Tout d’abord, lors de la période de relaxation, les noyaux, retournent à l’équilibre. Puis la période de préparation permet d’exciter le noyau concerné. L’aimantation est basculée à 90° par rapport à B0 à l’aide d’une impulsion. Lors de la période d’évolution, le noyau évolue sous l’effet des déplacements chimiques et/ou des couplages. La période de mélange permet un transfert d’aimantation entre deux noyaux. Enfin la période d’acquisition, où le signal est détecté, permet l’obtention d’un FID à une dimension.
Cet ensemble de périodes est répété N fois, permettant d’obtenir N FID à une dimension. De cet ensemble de FID à une dimension résulte un FID à deux dimensions qui par transformation de Fourier permet d’obtenir un spectre à deux dimensions.
Fig. 1 Représentation schématique des quatre étapes d’une expérience de RMN 2D. La séquence est répétée N fois et une incrémentation est effectuée lors de chaque répétition sur le t1 de la période d’évolution[9].
1.1.2. Avantages et inconvénients
La RMN 2D possède certains avantages par rapport à la RMN 1D. Par exemple, lors de l’étude de milieux complexes, elle permet de s’affranchir du chevauchement des signaux obtenus en RMN 1D grâce à un étalement des données dans les deux dimensions spectrales (Fig. 2). Par conséquent, la RMN 2D peut être plus efficace pour des études quantitatives en milieux complexes [3-5].
La RMN 2D permet également d’obtenir des taches de corrélation entre les différents noyaux d’une même espèce, et donc d’en déduire des informations structurales sur les molécules étudiées, notamment sur l’enchainement des groupements de noyaux au sein d’une molécule ou leur position relative. De plus, lors de l’étude de mélanges complexes, l’utilisation de la RMN 2D peut faciliter l’attribution des signaux pour chacun des composés du mélange (Fig. 2).
6 Fig. 2 Comparaison entre deux expériences de RMN 1D et 2D d’un même mélange de métabolites. (a) spectre RMN 1D avec une présaturation sur le pic de l’eau et (b) spectre RMN 2D TOCSY d’un mélange à 50 mmol.L-1 sur un spectromètre 400 MHz. Le passage à deux dimensions permet une attribution plus aisée des différents signaux d’intérêt, et d’envisager la quantification
des différents composés [2].
Cependant, la RMN 2D présente quelques inconvénients majeurs. Le premier concerne les temps d’expérience : ceux-ci peuvent être très longs, entre quelques minutes et plusieurs heures, du fait de la construction de la période d’évolution à partir des N incréments. Par conséquent, les instabilités de l’appareillage se manifestent et aboutissent à l’apparition de traînées de bruit t1 dans la dimension indirecte du spectre [10].
Par ailleurs, pour l’aspect quantitatif, une espèce de concentration connue doit être utilisée en tant qu’étalon interne car la RMN 2D n’est pas une technique quantitative primaire, puisque le coefficient de proportionnalité entre le volume des pics et la concentration dépend des constantes de couplage et des temps de relaxation [11].
Pour contrecarrer les longues durées d’expérience de la RMN 2D conventionnelle, plusieurs méthodes rapides ont été développées [6]. Une de ces méthodes propose une durée d’expérience extrêmement courte avec les mêmes informations que la RMN 2D conventionnelle : la RMN 2D ultrarapide.
1.2.
La Résonance Magnétique Nucléaire ultrarapide à deux dimensions
La RMN 2D ultrarapide (UF) a été proposée en 2002 par L. Frydman et al. [12]. Les expériences qui en découlent sont constituées des mêmes périodes que les expériences de RMN 2D conventionnelle (Fig. 1), mais la période d’évolution est modifiée afin d’obtenir un FID à deux dimensions en un seul scan, i-e. avec un seul incrément. Pour ce faire, un gradient nommé « gradient d’excitation » (noté Ge) est appliqué sur l’ensemble du tube et crée une dispersion de fréquences linéaire sur la hauteur de la zone sensible. Une impulsion « chirp », à balayage continu en fréquence, excite progressivement les noyaux considérés dans l’ensemble du tube en fonction de leur position Z (Fig. 3).
(b)
7 Fig. 3 Représentation d’un tube RMN excité progressivement grâce à l’impulsion « chirp ». Les noyaux sont excités
progressivement selon la hauteur du tube. (a) Le tube RMN possède différents niveaux d’excitation grâce au gradient d’excitation. (b) Motif d’excitation continue [13].
Cette excitation crée un déphasage des aimantations des noyaux d’une même fréquence de résonance en fonction de leur position dans le tube. Ce déphasage possède un terme quadratique qui empêche la refocalisation des aimantations, une autre impulsion « chirp » est alors utilisée en appliquant un gradient d’excitation de signe opposé dans le but d’annuler ce terme (Fig. 3 (b)) : une hélice est alors obtenue (Fig. 4). Cette période d’excitation est suivie d’une période de mélange similaire à celle composant une séquence RMN 2D conventionnelle. Enfin, lors de la phase d’acquisition, survenant après la période de mélange, une succession de gradients dits « gradients d’acquisition » (notés ±Ga) est appliquée. Ces gradients permettent la refocalisation des aimantations de chaque hélice. Un signal est obtenu lorsque ces aimantations sont en phase (Fig. 4 : Ω1 (c) ; Ω2 (e)).
Fig. 4 Evolution des aimantations des noyaux excités au cours de l’impulsion « chirp », créant une hélice propre à chaque fréquence de résonance. (a) Les aimantations sont au départ défocalisées, (b) le gradient d’acquisition (+G) refocalise progressivement les aimantations et (Ω1 (c)) un signal est obtenu lorsque les aimantations provenant des différentes tranches sont en phase. (Ω2 (b) à (d)) Comme les aimantations n’ont pas la même fréquence de résonance que Ω1celles-ci mettent, dans
ce cas, plus de temps à être refocalisées pour (Ω2 (e)) donner un signal. (Ω1 (d) ; Ω2 (f)) Puis après refocalisation les aimantations sont de nouveau défocalisées [14].
Les aimantations sont refocalisées une première fois par le gradient positif donnant un signal pour chaque fréquence de résonance (Fig. 4 (a) à (f)). Cet ensemble de signaux permet d’obtenir un spectre à une dimension sans transformation de Fourier. Ce spectre forme la dimension ultrarapide. Si la dispersion en fréquence induite par les gradients d’excitation est égale à la gamme de balayage des impulsions « chirp », la largeur spectrale de cette dimension ultrarapide peut être notée : SW∙ ∙ ∙
∙
(où γ représente le rapport gyromagnétique du noyau considéré, Ga la puissance du gradient d’acquisition, L la hauteur de l’échantillon, Ta la durée du gradient d’acquisition et Te la durée de l’encodage spatial) [15].
8 Un gradient de signe opposé est ensuite appliqué pour refocaliser à nouveau ces aimantations. Le chemin inverse est effectué (Fig. 4 (f) à (a)). Les signaux sont de nouveau détectés, mais le signal de Ω2 qui est apparu en dernier, apparait en premier sur le spectre 1D : l’ordre des signaux est inversé.
Pendant la série de gradients positifs et négatifs, les aimantations évoluent toujours sous l’effet de plusieurs paramètres comme l’évolution transversale (Fig. 5). Un pseudo-FID amorti peut alors être associé à chaque fréquence de résonance Ω.
Fig. 5 Ensemble de spectres 1D obtenus avec un ensemble de gradient de signes opposés. Les spins évoluent sous l’effet de paramètres conventionnels. Un pseudo-FID amorti apparait pour chacune des fréquences de résonance.
Ensuite, dans le cas de la Fig. 5, l’alternance de gradients positifs et négatifs provoque également une alternance de signaux entre les spectres pairs, associés aux gradients négatifs, et les spectres impairs, associés aux gradients positifs.
Après réarrangement des données, une transformation de Fourier est appliquée sur ces pseudo-FID amortis pour obtenir la deuxième dimension, appelée dimension conventionnelle et dont la largeur spectrale est notée SW=
∙ [15].
1.3.
Méthodes hybrides basées sur la RMN ultrarapide
1.3.1. Limites de la RMN 2D ultrarapide
Grâce à la durée d’expérience très réduite en RMN 2D UF, l’expression du bruit provenant des instabilités de l’appareillage est limitée dans les deux dimensions, contrairement aux expériences de RMN 2D conventionnelle. En effet, à cause des incrémentations présentes dans ces séquences pour obtenir la dimension dite indirecte, le bruit est fortement prononcé dans la dimension F1 du spectre. En revanche, les instabilités n’ont pas le temps de s’exprimer avec la RMN 2D ultrarapide puisqu’il n’y a pas d’incrément pour obtenir la première dimension (1.1.1 et 1.1.2). D’autre part, la RMN 2D ultrarapide permet d’obtenir les informations apportées par la 2D conventionnelle avec un temps d’expérience plus rapide qu’une séquence 1D.
Cependant, l’un des inconvénients majeurs de la RMN 2D ultrarapide est sa faible sensibilité : les espèces peu concentrées ne seront pas ou peu détectées. Pour contrebalancer cette faible sensibilité, il est nécessaire d’effectuer des accumulations d’expérience pouvant augmenter le temps d’expérience à celui d’une expérience de RMN 2D conventionnelle de 15 ou 20 minutes : ce type d’expérience est appelé M3S (Multi-scan single shot) [16].
9
1.3.2. Multi-scan single shot (M3S)
Avec la méthode M3S proposée par M. Pathan et al. [16], l’accumulation d’expériences a permis l’acquisition de spectres pour des mélanges complexes avec une trop faible concentration pour un seul scan. Cette méthode a été utilisée par A. Le Guennec et al. lors d’une étude sur des extraits cellulaires de lignées de cancer du sein [17]. Au cours de celle-ci, la variation du volume des pics de différents métabolites a été mesurée et est environ 5 fois plus faible (ca. 2%) qu’avec la RMN 2D conventionnelle (ca. 9-10%) (Fig. 6). Cette méthode est donc plus performante pour l’analyse quantitative de mélanges complexes.
Fig. 6 Comparaison de la répétabilité entre les expériences COSY ultrarapide longue et CT-COSY conventionnelle sur un mélange de métabolites de concentration 6 mmol.L-1 analysé sur un spectromètre 500 MHz disposant d’une cryosonde. Les coefficients de variation sont calculés à partir de la mesure du volume des pics sur trois séries de cinq spectres. Pour la COSY
ultrarapide le coefficient de variation est faible pour tous les métabolites, ce qui n’est pas le cas avec la COSY conventionnelle [17].
Le résultat ci-dessus est dû au fait que les instabilités de l’appareillage ne s’expriment pas autant que dans une expérience de RMN 2D conventionnelle. Le niveau de bruit est comparable dans les deux dimensions du spectre obtenu avec la méthode M3S (Fig. 7).
Fig. 7 (a) Spectre COSY conventionnel et (b) spectre COSY ultrarapide d’un mélange de métabolites à une concentration de 5 mmol.L-1, obtenus en 34 min sur un spectromètre 500 MHz équipé d’une cryosonde. Le spectre (a) possède un bruit F1 fortement prononcé. Sur le spectre (b), le niveau de bruit est similaire dans les deux dimensions et n’est pas aussi exprimé que
pour la COSY conventionnelle [16]. (a) (b)
10 Malgré ces avantages, les méthodes précitées (RMN ultrarapide et M3S) possèdent une fenêtre spectrale limitée dans les deux dimensions, en raison d’un compromis nécessaire entre la résolution dans la dimension ultrarapide (ΔνUF) et les largeurs spectrales (SW) :
γ ∙ G∙ L = 2 ∙SW∙ SW ∆ν
Ces largeurs spectrales se limitent à quelques ppm et sont d’autant plus petites que le champ magnétique du spectromètre augmente. Pour agrandir cette fenêtre réduite, une méthode a été mise en place : la RMN 2D UF par entrelacement [18].
1.3.3. La RMN 2D ultrarapide par entrelacement
1.3.3.1.Principe et intérêts
Cette méthode est similaire à la RMN 2D UF classique, mais elle est basée sur la répétition de la séquence ultrarapide avec un incrément sur le délai de pré-acquisition (dénommé τ) (Fig. 8).
Fig. 8 Schéma d’une séquence d’impulsion COSY ultrarapide par entrelacement. Un incrément τ est ajouté sur le délai de préacquisition à chaque répétition de la séquence. Cette incrémentation permet d’augmenter la largeur spectrale, améliorer la
résolution ou encore de diminuer la puissance des gradients [19].
L’entrelacement permet tout d’abord d’augmenter la largeur spectrale dans la dimension conventionnelle : l’entrelacement des jeux de données ainsi générés permet en effet d’obtenir un dwell time (temps entre deux points du FID, noté DW1) plus petit dans la dimension conventionnelle :
SW= [20]
Cette technique permet d’élargir les gammes spectrales qui étaient limitées sur les spectres COSY UF sans entrelacement tout en gardant les corrélations entre les pics. La plupart des informations recueillies avec la RMN 2D conventionnelle, qui possède une grande gamme spectrale, sont ainsi obtenues par RMN 2D ultrarapide avec entrelacement mais avec un gain de temps non négligeable. Cette approche peut également être utilisée pour agrandir la gamme spectrale dans la dimension ultrarapide, en modifiant la puissance du gradient d’acquisition Ga dans la relation (α) ou le nombre de boucles L3 (i-e. le nombre de couples de gradients positif et négatif) dans la relation (β) :
(α) SW= ∙ ∙ ∙ ∙ (β) T= ∙ ∙ # − d6 d6
11 Dans ces relations, TD représente le nombre de points, DW la durée d’intervalle entre deux points d’acquisition et d6 le délai entre deux gradients d’acquisition (Fig. 8).
La dimension conventionnelle, quant à elle, peut être modifiée soit en ajustant le nombre d’entrelacements ni dans l’équation SW=
'
∙ , soit grâce au paramètre L3 dans la relation (β).
Par ailleurs, l’entrelacement permet d’utiliser une même séquence sur une même gamme spectrale en réduisant la puissance des gradients.
Les données de chaque entrelacement sont acquises les unes après les autres, c’est-à-dire que toutes les données du premier entrelacement sont enregistrées, puis celles du deuxième, jusqu’au dernier entrelacement. Il faut donc réorganiser ces données lors du traitement (Fig. 9).
Fig. 9 Schéma représentatif d’une réorganisation de données pour le traitement d’une expérience RMN 2D avec entrelacement pour ni = 2 [20].
Ces données sont réorganisées selon le schéma suivant : grad1 (acq1), grad1 (acq2), grad2 (acq1), et ainsi de suite.
1.3.3.2.Limites de la RMN 2D ultrarapide par entrelacement
Avec la méthode des entrelacements, certains problèmes peuvent survenir lors de l’acquisition, comme par exemple l’apparition d’artéfacts qu’il faut alors corriger [18]. Ces artefacts apparaissent pour plusieurs raisons ; la plus importante est une imperfection qui peut être présente dans le délai de pré-acquisition d2 ou les délais d’acquisition avec des décalages dans le système électronique créant ainsi des discontinuités d’amplitude ou de phase. Pour diminuer, voire même supprimer la présence de ces artéfacts, plusieurs techniques sont disponibles. Par exemple, la symétrisation (qui consiste à définir la diagonale du spectre puis à comparer les intensités de chaque paire de pics) supprime totalement les artéfacts, mais elle rend le spectre non quantitatif. Une autre solution, la soustraction, consiste à prendre un artéfact en référence et son intensité est alors soustraite à tous les pics d’intérêt.
12
1.4.
Suivi de réactions par RMN 2D ultrarapide
Le suivi de réactions couplé à une technique d’analyse est intéressant pour obtenir plus d’informations sur les espèces présentes lors d’une réaction, comme par exemple des données structurales, cinétiques ou physico-chimiques [21]. Généralement, le suivi de réaction concerne le plus souvent des mélanges complexes : la RMN 2D est alors nécessaire pour limiter des superpositions de signaux trop importantes sur les spectres. Cependant, comme la plupart des réactions sont rapides, la RMN 2D conventionnelle ne peut être adaptée pour ce genre de suivis. Par conséquent, les méthodes de RMN 2D rapides sont nécessaires pour recueillir suffisamment d’informations à exploiter. R. Boisseau et al. ont utilisé la RMN 2D ultrarapide pour le suivi d’une oxydation en temps réel du 9-chloroanthracène (Fig. 10).
Fig. 10 Suivi d’oxydation du 9-chloroanthracène par RMN 2D ultrarapide sur un spectromètre de 700MHz. Des électrodes reliées à un potentiostat sont incorporées dans le tube RMN pour réaliser la réaction d’oxydation. Les espèces intermédiaires ont
ainsi pu être identifiées en temps réel [22].
Une autre expérience, menée par A. Herrera et al. sur un suivi de mécanisme de réaction, a été effectuée avec la RMN 2D ultrarapide. Grâce à celle-ci, l’apparition ou la disparition des espèces chimiques lors de ce mécanisme a pu être observée. Cette étude met en avant l’utilité de la RMN 2D ultrarapide avec sa courte durée d’expérience pour le suivi de réactions rapides (Fig. 11).
Fig. 11 Mécanisme réactionnel de la pentan-3-one en présence d’anhydride trifluorométhanesulfonique (Tf2O). Une séquence TOCSY de RMN 2D ultrarapide sur un spectromètre 500MHz a permis d’observer les intermédiaires réactionnels [23].
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1.5.
Objectif du stage
Le projet STABOXAL, regroupant l’UR QuaPA et l’UMR CEISAM, a pour but d’obtenir une approche générique permettant de suivre et de quantifier in situ des réactants et des produits d’oxydation tout en déterminant leurs constantes cinétiques. Dans le cadre de ce stage, le réactif de Fenton sera utilisée pour simuler une oxydation dans un milieu biologique : cette oxydation est réalisée en présence de FeSO4 et de H2O2 et sert d’initiateur avec la production du radical •OH qui attaquera ensuite l’espèce oxydable [24] :
Fe2+(aq) + H2O2 → Fe3+(aq) + OH-(aq) + •OH
La RMN 2D ultrarapide sera utilisée pour ces réactions rapides dans des mélanges complexes. L’objectif de ce stage est de suivre l’oxydation de métabolites modèles par RMN 2D ultrarapide pour, in fine, mesurer les constantes cinétiques des analytes présents en solution et déterminer si celles-ci sont les mêmes lorsque l’analyte est seul ou en mélange. Plusieurs modèles seront utilisés : un peptide composé de 30 acides aminés (la chaîne B de l’insuline bovine) ainsi que des mélanges d’acides aminés de complexité variable.
14
Matériels et méthodes
2.1.
Préparation des échantillons
Les différents échantillons analysés sont solubilisés dans deux solutions tampon phosphate préparées dans un solvant deutéré (D2O) : elles sont soit à pH = 3 et à une concentration de 40 mmol.L-1 (en NaH2PO4), soit à pH = 7,4 et à une concentration de 76 mmol.L-1 pour Na2HPO4 et de 24 mmol.L-1 pour NaH2PO4.
Dans un premier temps, la solution tampon à pH = 3 est utilisée pour préparer une série d’échantillons composés d’un seul acide aminé (arginine, histidine ou thréonine) à une concentration de 30 mmol.L-1, ainsi qu’un échantillon composé de la chaîne B de l’insuline à une concentration de 1,3 mmol.L-1.
Dans un second temps, des échantillons composés de différents mélanges d’acides aminés (3 ou 7) sont préparés à l’aide de la solution tampon à pH = 7,4. Leurs concentrations sont répertoriées dans le Tableau I :
Tableau I – Concentration en mmol.L-1 des composés dans les mélanges d’acides aminés.
Ala Arg His Lys Phe Pro Thr Mélange 1 29,52 29,19 30,42 29,65 30,15 29,23 29,84
Mélange 2 22,11 16,98 17,64 15,60 15,18 15,59 15,49
Mélange 3 15,80 – 15,39 – – – 14,86
Après préparation des échantillons dans le tampon phosphate, le FeSO4 est ajouté en quantité catalytique. Une fois que les mélanges sont mis en tube, l’eau oxygéné H2O2 est ajoutée en quantité stœchiométrique pour démarrer la réaction.
À noter que le FeSO4 doit être préparé juste avant de réaliser les expériences RMN. En effet, il a une durée de vie de 1 à 2 h avant qu’il ne soit totalement oxydé en Fe3+ par l’oxygène dissous dans le solvant ou par l’oxygène présent dans l’atmosphère, devenant alors inutile pour la réaction.
2.2.
Analyses par RMN 1D et 2D UF
2.2.1. Description des spectromètres
Dans un premier temps, à l’INRA, les expériences effectuées sur les acides aminés seuls sont réalisées sur un spectromètre Bruker Avance III Ascend 400 MHz WB (Wide Bore) équipé d’une sonde BBO-5mm. Les analyses sont réalisées à 303 K.
15 Dans un second temps, les expériences menées sur l’insuline et les mélanges d’acides aminés RMN sont réalisées sur un spectromètre Bruker Avance III 700 MHz équipé d’une cryosonde inverse 1H. Les analyses sont réalisées à 310 K.
2.2.2. Séquences utilisées
Les séquences utilisées pendant ce stage sont la COSY ultrarapide par entrelacement (Fig. 8, page 10) et la séquence proton 1D. Dans les deux cas, une présaturation continue du signal de l’eau est appliquée pendant le délai de récupération.
2.3.
Paramètres utilisés dans les séquences
2.3.1. Paramètres d’acquisition
Les expériences de RMN 2D ultrarapide par entrelacement sont acquises avec deux gammes différentes : de 1 à 5 ppm d’une part (zone aliphatique) et de 6 à 9 ppm d’autre part (zone aromatique). Deux gammes sont nécessaires car l’entrelacement sur une seule et même gamme n’était pas envisageable en raison d’un nombre d’artéfacts trop important. Les paramètres d’acquisition sont répertoriés dans le Tableau II, le Tableau III et le Tableau IV :
Tableau II – Paramètres d’acquisition communs pour l’acquisition des deux zones spectrales par RMN 2D UF.
NS L4 TD1 (= ni) TD2 D1 L3 SWUF·SWconv Ge Ga AQ Durée
8 1 4 128k 10 s 64 5x5 ppm ± 2,1% ± 80% 0,072 s 5 min 34 s NS : nombre de scans ; L4 : nombre de dummy scans (1 par défaut dans la séquence) ; TD1 : nombre d’entrelacements ; TD2 : nombre de points total du FID avant séparation des données ; D1 : délai de récupération ; AQ : temps d’échantillonnage ; Ge : gradient utilisé pour le codage spatial ; Ga : gradient
utilisé pour la détection
Tableau III – Paramètres d’acquisition propres à chacune des deux zones spectrales obtenues par RMN 2D UF.
Zone D25 D24 GPZ25 GPZ24 O1
aliphatique 666 µs 0 µs -30% 0% 2,57 ppm aromatique 500 µs 500 µs -20% -20% 7,503 ppm
D25 : temps d’application du gradient de pré-acquisition ; D24 : temps d’application du gradient de mélange ; GPZ25 : puissance du gradient de pré-acquisition ; GPZ24 : puissance du gradient de
mélange ; O1 : centre de la fenêtre spectrale
Tableau IV –Paramètres d’acquisition pour les expériences en RMN 1D.
NS DS TD D1 O1 SW AQ Durée
64 2 53762 10 s 4,7 ppm 12,8 ppm 3 s 14 min 20 s
Pour toutes les expériences, le signal de l’eau, situé à 4,7 ppm environ, est présaturé par une onde continue à 10-6 W.
16
2.3.2. Paramètres de traitement
Après acquisition des données, celles-ci sont traitées à l’aide du logiciel TopSpin 3.1. Les paramètres de traitement sont listés dans le Tableau V :
Tableau V – Paramètres de traitement pour les expériences en RMN 2D UF et RMN 1D.
Dimension SI WDW SSB LB GB 2D UF F2 2048 GM 0 -170 0,5
F1 1024 SINE 0 0 0
1D – 65536 EM 0 0,3 0
SI : nombre de points dans le spectre réel ; WDW : fonction d’apodisation ; SSB : décalage de la fonction sinusoïdale ; LB : facteur de décroissance en Hz ; GB : position du maximum de la fonction Gaussienne
Le traitement d’une expérience de RMN 2D ultrarapide est effectué à l’aide d’une automation qui lance une série d’opérations :
− Lecture des paramètres d’acquisition
− Séparation des pseudo-FID pairs et impairs, création de deux séries de données indépendantes
− Transformation de Fourier des deux jeux de données dans la dimension conventionnelle
− Calcul des deux spectres en mode valeur absolue
− Inversion du jeu de données correspondant aux gradients positifs
− Recalage puis addition des deux jeux de données
− Obtention du spectre 2D
2.4.
Intégration des signaux
L’intégration des signaux a été effectuée à l’aide de TopSpin 3.1. Un fichier d’intégration est créé pour ensuite l’appliquer sur tous les spectres (Fig. 12). Cependant, il est parfois nécessaire de déplacer les zones d’intégration pour tenir compte d’une éventuelle dérive des signaux liée à une variation de pH au cours de la réaction. L’ensemble des valeurs est ensuite reporté dans un tableau Excel pour créer les graphiques de suivi de réaction. Ces valeurs sont normalisées par rapport à la référence : l’alanine.
Les correspondances des acides aminés aux numéros d’intégration qui leurs sont associés dans la Fig. 12, sont répertoriées dans le Tableau VI :
Tableau VI – Correspondance des acides aminés et des taches d’intégration pour la Fig. 12.
Zone aliphatique Zone aromatique
1 2 3 4 5 6 1 2 3
alanine thréonine thréonine lysine arginine proline histidine histidine produit oxydation
17 Fig. 12 Spectres COSY ultrarapide avec entrelacements obtenus sur un spectromètre 700 MHz. (a) zone aliphatique et (b) zone
18
Résultats et discussions
3.1.
Acides aminés seuls
Dans un premier temps, à l’INRA, des échantillons composés d’un seul acide aminé ont été préparés dans le but de pouvoir identifier une éventuelle réaction d’oxydation. Au préalable, la concentration en FeSO4 a été optimisée : car celui-ci provoque un élargissement des signaux. Cette augmentation de la largeur à mi-hauteur est due aux propriétés paramagnétiques du FeSO4. Une concentration avoisinant les 100 µmol.L-1 est alors utilisée, offrant un compromis optimal entre vitesse de la réaction et élargissement des pics. De plus, l’eau oxygénée (H2O2) est utilisée en quantité stœchiométrique pour que l’acide aminé présent en solution soit totalement oxydé.
Les acides aminés étudiés lors de ces expériences sont : l’arginine, l’histidine et la thréonine.
Fig. 13 Spectres RMN 1D de l’histidine obtenus sur un spectromètre Bruker Ascend 400 MHz WB (a) avant oxydation et (b) après oxydation de l’histidine à une concentration de 30 mmol.L-1. Les pics de l’histidine situés dans la zone aromatique
(entourés en vert) permettent une exploitation aisée en RMN 1D.
Les tests préliminaires permettent de montrer que chaque acide aminé utilisé dans ces échantillons est oxydable, comme le montre l’évolution des signaux sur les spectres RMN (cf. exemple de l’histidine, Fig. 13). Les spectres ont permis d’identifier les zones spectrales d’intérêt pour une expérience
(a)
19 plus approfondie avec plusieurs acides aminés voire avec des peptides. L’identification des produits d’oxydation n’a pas été abordée au cours de ce stage et fera l’objet d’une étude ultérieure.
3.2.
Insuline
Nous avons ensuite décidé d’étudier l’oxydation d’un petit peptide (l’insuline) contenant les acides aminés étudiés précédemment. Il s’agit d’un peptide composé de deux chaînes peptidiques, A et B, totalisant 51 acides aminés. Seule la chaîne B, composée de 30 acides aminés (Fig. 14) [25], est étudiée. Un peptide a été choisi afin d’éviter d’éventuelles réactions de polymérisation multiples qui pourraient survenir entre des acides aminés libres en solution.
Fig. 14 Représentation de la chaîne B de l’insuline. Six acides aminés différents sont oxydables (en gras et soulignés). Certains sont présents plusieurs fois dans la chaîne comptabilisant un total de 11 acides aminés oxydables [25].
Le suivi d’oxydation est réalisé sur cette chaîne qui est composée de 6 acides aminés oxydables différents (arginine, histidine, lysine, phénylalanine, proline, thréonine, tyrosine) (Fig. 14). De plus cette expérience est effectuée à pH = 3, car cette espèce n’est pas soluble à pH = 7,4. Une étude par RMN 1D est tout d’abord effectuée, mettant en évidence un très grand nombre de pics et justifiant ainsi l’intérêt de la RMN 2D. Seul un pic est exploitable en RMN 1D (Fig. 15) en raison des recouvrements entre les pics.
Fig. 15 Spectre 1D de la chaîne B de l’insuline à une concentration de 1,3 mmol.L-1 obtenu sur un spectromètre 700 MHz. Cette expérience relève l’incompatibilité de la RMN 1D avec des mélanges complexes. Seul le pic indiqué par une flèche peut
être exploité en RMN 1D, car c’est le seul pic qui varie lors de la réaction d’oxydation.
Une étude par RMN 2D a alors été initiée au laboratoire CEISAM, mais à cause d’une trop faible concentration (1,3 mmol.L-1, solubilité maximale de l’insuline dans le D2O) combinée à la présence de FeSO4 dans le mélange, l’intensité des pics est trop faible pour obtenir des résultats, aussi bien en RMN
20 2D ultrarapide qu’en RMN 2D conventionnelle. Nous avons alors décidé de nous tourner vers un mélange d’acides aminés libres pour nous approcher au mieux des conditions d’oxydation de la chaîne B de l’insuline sans toutefois être limités par la concentration.
3.3.
Mélange de 7 acides aminés
Après une absence de résultat avec l’insuline, un mélange se rapprochant de celle-ci avec uniquement des acides aminés oxydables (arginine, histidine, lysine, phénylalanine, proline, thréonine, tryptophane et tyrosine) et un non-oxydable (alanine) a été préparé. Dans un premier temps, tous les acides aminés cités précédemment ont été utilisés, mais comme la tyrosine et le tryptophane possèdent une solubilité très faible dans le D2O, ils ont été retirés. La concentration de chacun des acides aminés est répertoriée dans le Tableau I, page 14. L’alanine est utilisée dans ce mélange en tant que référence car elle est non-oxydable.
Pour le mélange 1 (Tableau I), l’eau oxygénée utilisée en quantité stœchiométrique a créé une formation trop importante de bulles. Cette formation de bulles a provoqué une instabilité du niveau des shims et seule une exploitation partielle des résultats a pu être possible. Il a été décidé de préparer un échantillon avec ces mêmes acides aminés mais à une concentration plus faible pour limiter cette formation importante de bulles (Tableau I : mélange 2, page 14).
Les pics qui ont été intégrés sont représentés sur les spectres de la Fig. 16. La plupart des signaux de la majorité des acides aminés sont exploitables. Seule la phénylalanine ne peut pas être exploitée car ses signaux sont superposés à ceux de l’histidine dans la gamme aliphatique. Les signaux de la phénylalanine situés dans la gamme aromatique sont, quant à eux, superposés à un grand nombre de signaux provenant des produits d’oxydation.
Fig. 16 Spectres COSY ultrarapide avec entrelacement obtenus sur un spectromètre 700 MHz (a) de la zone aliphatique et (b) de la zone aromatique d’un mélange de 7 acides aminés à une concentration de 15 mmol.L-1 environ.
Les signaux intégrés sont mis en évidence.
Dans la partie aliphatique, la thréonine, la lysine et l’arginine décroissent au cours du temps alors que le deuxième signal de la thréonine et celui de la proline n’évoluent pas, ou très peu (Fig. 17). Dans la partie aromatique, les signaux de l’histidine ont pu être intégrés, une décroissance pour chacun de ces pics
21 peut être notée. Un signal correspondant à un produit d’oxydation a également pu être intégré, et celui-ci augmente au cours du temps proportionnellement à la décroissance des signaux de l’histidine.
Fig. 17 Graphique d’intégrations du volume des pics de la zone aliphatique pour un mélange de 7 acides aminés. Les valeurs sont normalisées par rapport à celles de l’alanine.
Une décroissance du volume des pics peut être observée pour certaines espèces.
Fig. 18 Graphique d’intégrations du volume des pics de la zone aromatique pour un mélange de 7 acides aminés. Les valeurs sont normalisées par rapport à celles de l’alanine. Une formation d’un produit d’oxydation peut être observée. Cette
formation semble proportionnelle à la décroissance des signaux de l’histidine.
3.4.
Mélange de 3 acides aminés
Un mélange de 3 acides aminés est préparé dans le but de comparer ses résultats avec ceux du mélange de 7 acides aminés. Le but est de vérifier si les vitesses d’oxydation dépendent du nombre d’acides aminés en présence et de vérifier si l’alanine ne s’oxyde pas.
Les acides aminés utilisés sont l’alanine, l’histidine et la thréonine chacun avoisinant une concentration de 15 mmol.L-1 (Tableau I : mélange 3, page 14).
22 Après avoir intégré les signaux des trois acides aminés (Fig. 19), leurs courbes d’évolution ont pu être tracées (Fig. 20 et Fig. 21). Le signal de l’alanine n’évolue pas, comme pour le mélange de 7 acides aminés. Il est donc utilisé comme référence pour la normalisation. Les résultats sont différents du mélange de 7 acides aminés. En effet, pour ce dernier, un palier semblait être atteint au bout de 7 h de réaction (visible notamment pour l’histidine, Fig. 18). En revanche, pour le mélange de 3 acides aminés, la décroissance n’est pas terminée au bout de 14h de réaction (Fig. 20 et Fig. 21).
Fig. 19 Spectres COSY ultrarapide avec entrelacement sur un 700 MHz (a) de la partie aliphatique et (b) de la partie aromatique d’un mélange de 3 acides aminés à une concentration de 15 mmol.L-1 environ.
Les signaux intégrés sont mis en évidence.
Fig. 20 Graphique d’intégrations de la zone aliphatique du mélange de 3 acides aminés normalisées par rapport à l’alanine. Une décroissance générale du volume des pics de l’histidine peut être relevée.
23 Fig. 21 Graphique d’intégrations de la zone aromatique du mélange de 3 acides aminés normalisées par rapport à l’alanine.
Une décroissance générale du volume des pics de l’histidine peut être relevée. L’apparition progressive de pics de produits d’oxydation est également observable.
Les deux mélanges n’ont pas la même évolution. Cela veut dire que les constantes cinétiques sont différentes dans chacun des mélanges. Celles-ci seront calculées dans la suite du stage dans le but de déterminer si une relation existe entre le milieu réactionnel et les constantes cinétiques.
24
Conclusion et perspectives
Les travaux réalisés au cours de ce stage montrent que la RMN 2D ultrarapide avec entrelacements permet un suivi en temps réel de réactions d’oxydation multiples dans un mélange complexe. L’étude préliminaire sur les échantillons d’acides aminés seuls a permis de définir les zones d’intérêt en RMN 2D avec entrelacements.
L’étude sur la chaîne B de l’insuline est possible en RMN 1D mais un seul pic peut être observé, ce qui limite grandement l’acquisition de données sur le plus grand nombre d’acides aminés. La RMN 2D, pouvant faciliter l’observation de mélange complexe, n’est pas adaptée à cause de la faible intensité des signaux. Cette faible intensité est expliquée par la faible concentration de l’échantillon combinée avec les propriétés paramagnétiques du FeSO4.
Une solution alternative a consisté à préparer des mélanges d’acides aminés se rapprochant au maximum de cette chaîne B avec des acides aminés oxydables. Le suivi de l’oxydation de ces acides aminés par RMN 2D ultrarapide entrelacée permet de suivre l’évolution du volume des pics 2D au cours de la réaction.
La suite du stage consistera à calculer les constantes cinétiques pour les deux mélanges composés de 3 ou 7 acides aminés, en développant un modèle d’ajustement des courbes obtenues ci-dessus. Cet ajustement n’a pas pu être réalisé dans le cadre de ce mémoire, car une discussion préalable avec les partenaires du projet STABOXAL est nécessaire afin de définir les modèles les plus pertinents. Cette discussion aura lieu à Reims les 23 et 24 juin 2015, lors d’une Workshop au cours de laquelle je présenterai ces travaux. Les constantes cinétiques seront ensuite comparées entre chaque mélange pour déterminer si les cinétiques d’oxydation dépendent bien du nombre d’acides aminés en présence. Une fois ces constantes calculées, les mélanges permettront probablement de générer des données pouvant aboutir à une meilleure compréhension des mécanismes d’oxydation. Ces données permettront notamment d’alimenter le programme Simulox permettant de simuler les réactions d’oxydation au sein des aliments modèles.
25
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[24] C. C. Winterbourn, Toxicology Letters, 82/83, 969 (1995).
Suivi dynamique et quantitatif de réactions d’oxydation dans les
aliments modèles par RMN 2D ultrarapide
Le suivi de réactions par RMN permet d’obtenir des informations précieuses sur les propriétés physico-chimiques d’espèces présentes en solution. Cependant, la plupart du temps, la complexité du milieu empêche l’exploitation des données obtenues par RMN 1D en raison de la superposition des pics. L’utilisation de la RMN 2D est alors préférable, mais celle-ci n’est souvent pas adaptée pour le suivi de réactions en temps réel car leur évolution est trop rapide. L’utilisation de méthodes hybrides basées sur la RMN 2D ultrarapide est alors nécessaire.
Ce stage se situe dans le cadre du projet Staboxal, visant à mieux comprendre les mécanismes d’oxydation au sein de modèles mimant la composition de matrices alimentaires. Le but de cette étude est de développer une méthode de suivi par RMN de l’oxydation d’acides aminés en mélange. Dans un premier temps, des expériences préliminaires en RMN 1D sur des acides aminés seuls en solution ont été effectuées pour identifier les zones d’intérêt avant de suivre en temps réel la réaction d’oxydation de mélanges complexes. Des mélanges d’acides aminés de complexité variable ont ensuite été préparés, la plupart des signaux de la majorité des acides aminés présents dans le milieu ont pu être exploités permettant l’obtention de données tout au long de la réaction. L’approche développée permet le suivi de réactions d’oxydation multiples dans un mélange complexe.
