Le turnover des cellules dans la glande mammaire évalué par immunohistochimie, comme indicateur de la production de lait
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Texte intégral
(2) Le turnover des cellules dans la glande mammaire évalué par immunohistochimie, indicateur de la production de lait Sandra WIART, Marion Boutinaud Equipe Physiologie de la Lactation et Synthèse du lait. XXVIème Congrès AFH Rennes le 13 Juin 2013. 1.
(3) PLAN * STRUCTURE DE LA GLANDE MAMMAIRE * PRINCIPES DES MARQUAGES EN IMMUNOHISTOLOGIE * TRAITEMENT D’IMAGE * ETUDE SUR DES ANIMAUX * RÉSULTATS DE L’ÉTUDE * CONCLUSION XXVIème Congrès AFH Rennes le 13 Juin 2013. 2.
(4) Glande mammaire – Immunohistologie - Traitement d’image - Etude sur animaux – Résultats - Conclusion. LA GLANDE MAMMAIRE CHEZ LES RUMINANTS LAITIERS. XXVIème Congrès AFH Rennes le 13 Juin 2013. 3.
(5) Glande mammaire – Immunohistologie - Traitement d’image - Etude sur animaux – Résultats - Conclusion. La glande mammaire:. l’organe central lié à la fonction de lactation Lobe Lobule. Cellule épithéliale mammaire Cellule Adipocyte (CEM) myoépithéliale. Alvéoles. Tissu conjonctif. Canaux Citerne. Trayon. XXVIème Congrès AFH Rennes le 13 Juin 2013. Vaisseau sanguin Fibroblaste 4 (D’après Delouis et Richard, 1991).
(6) Glande mammaire – Immunohistologie - Traitement d’image - Etude sur animaux – Résultats - Conclusion. La synthèse du lait . Les cellules épithéliales mammaires sont responsables de la synthèse du lait. Le potentiel de production des mamelles des ruminants laitiers dépend du nombre et de l’activité métabolique des CEM. Les CEM possèdent une machinerie nécessaire à la sécrétion des constituants du lait : - Caséines et protéines solubles - Globules gras - Lactose XXVIème Congrès AFH Rennes le 13 Juin 2013. 5.
(7) Glande mammaire – Immunohistologie - Traitement d’image - Etude sur animaux – Résultats - Conclusion. Le turnover des CEM CEM Prolifération. Mort cellulaire. Le turnover ou renouvellement cellulaire dépend de deux phénomènes cellulaires qui sont la prolifération et mort cellulaire. Pendant la lactation, les CEM prolifèrent et meurent par apoptose. XXVIème Congrès AFH Rennes le 13 Juin 2013. 6.
(8) Glande mammaire – Immunohistologie - Traitement d’image - Etude sur animaux – Résultats - Conclusion. IMMUNOHISTOLOGIE MARQUAGES SUR DES COUPES CONGELÉES DE TISSUS MAMMAIRES OBTENUS APRÈS PRÉLÈVEMENTS SUR LES ANIMAUX.. XXVIème Congrès AFH Rennes le 13 Juin 2013. 7.
(9) Glande mammaire – Immunohistologie - Traitement d’image - Etude sur animaux – Résultats - Conclusion. Coupes de glande mammaire. Bleu = noyaux des cellules. Rouge = membrane des cellules épithéliales structure du tissu mammaire en alvéoles. XXVIème Congrès AFH Rennes le 13 Juin 2013. 8.
(10) Glande mammaire – Immunohistologie - Traitement d’image - Etude sur animaux – Résultats - Conclusion. Marquage du noyau de toutes les cellules. Tous les noyaux des cellules sont marqués avec du DAPI (4',6'-diamidino-2phénylindole). Le DAPI est une molécule fluorescente capable de se lier fortement aux bases adénine (A) et thymine (T) de l'ADN. XXVIème Congrès AFH Rennes le 13 Juin 2013. 9.
(11) Glande mammaire – Immunohistologie - Traitement d’image - Etude sur animaux – Résultats - Conclusion. Marquage de la prolifération cellulaire. La prolifération cellulaire est mise en évidence par le marquage PCNA (Prolifération Cell Nuclear Antigen). Cette protéine est exprimée dans la phase S de la mitose correspondant à la phase de réplication de l’ADN. XXVIème Congrès AFH Rennes le 13 Juin 2013. 10.
(12) Glande mammaire – Immunohistologie - Traitement d’image - Etude sur animaux – Résultats - Conclusion. Marquage de la mort cellulaire ou Apoptose (mort cellulaire programmée).. Une cellule morte en apoptose va avoir son ADN qui se fragmente. La mort cellulaire est mise en évidence par le marquage TUNEL Un nucléotide marqué est fixé par une enzyme aux extrémités OH de l’ADN. XXVIème Congrès AFH Rennes le 13 Juin 2013. 11.
(13) Glande mammaire – Immunohistologie - Traitement d’image - Etude sur animaux – Résultats - Conclusion. TRAITEMENT D’IMAGE IMAGE J. XXVIème Congrès AFH Rennes le 13 Juin 2013. 12.
(14) Glande mammaire – Immunohistologie - Traitement d’image - Etude sur animaux – Résultats - Conclusion. Traitement d’image : Utilisation du logiciel libre Image J Détermination du nombre de noyaux sur coupes histologiques de GM 1/ Passage d’une photo en couleur à une photo noire et blanche. 2/ Ajustement du seuil entre le noir et le blanc pour identifier correctement les noyaux. 3/ Création d’une photo avec des particules noires (= noyaux )sur fond blanc. 4/ Analyse de ces particules en ayant définir certains critères (aire et circularité). 5/ Comptage automatique, visualisation de toutes les particules comptées. 6/ Exportation du résultat obtenu vers un fichier excel. XXVIème Congrès AFH Rennes le 13 Juin 2013. 13.
(15) Glande mammaire – Immunohistologie - Traitement d’image - Etude sur animaux – Résultats - Conclusion. Traitement d’image : Calcul du taux par exemple celui de la prolifération. Nbre 733. 20 µm. Nbre 142. 20 µm. XXVIème Congrès AFH Rennes le 13 Juin 2013. Taux = 19.3 % 14.
(16) Glande mammaire – Immunohistologie - Traitement d’image - Etude sur animaux – Résultats - Conclusion. ETUDE DU TURNOVER SUR DES CHÈVRES EN LACTATION. XXVIème Congrès AFH Rennes le 13 Juin 2013. 15.
(17) Glande mammaire – Immunohistologie - Traitement d’image - Etude sur animaux – Résultats - Conclusion. Y a-t-il un lien entre le turnover et la quantité de lait produit ? Nbre CEM ?. Prolifération ?. Mort cellulaire ?. Quantité de lait ? XXVIème Congrès AFH Rennes le 13 Juin 2013. 16.
(18) Glande mammaire – Immunohistologie - Traitement d’image - Etude sur animaux – Résultats - Conclusion. Matériel et Méthode (1/5). Mamelle traite toutes les 12 h. Mamelle avec 36h d’accumulation du lait. 8 chèvres en lactation : Mamelle gauche accumulation de lait pendant 12h (soit 2 traites/jour) Mamelle droite accumulation de lait pendant 36h (début de tarissement) XXVIème Congrès AFH Rennes le 13 Juin 2013. 17.
(19) Glande mammaire – Immunohistologie - Traitement d’image - Etude sur animaux – Résultats - Conclusion. Matériel et Méthode (2/5). Mamelle traite toutes les 12 h. Mamelle avec 36h d’accumulation du lait. Mesures : - Mesure de production de lait par demi-mamelle. - Prélèvement de la glande mammaire par biopsie. XXVIème Congrès AFH Rennes le 13 Juin 2013. 18.
(20) Glande mammaire – Immunohistologie - Traitement d’image - Etude sur animaux – Résultats - Conclusion. Matériel et Méthode (3/5) * Biopsies : Prélèvements de tissus mammaires par biopsie à l’aide d’un pistolet automatique sur animal vigile en lactation.. Une biopsie : Longueur = 1 cm Largueur = 2 mm Poids = 20 mg. XXVIème Congrès AFH Rennes le 13 Juin 2013. 19.
(21) Glande mammaire – Immunohistologie - Traitement d’image - Etude sur animaux – Résultats - Conclusion. Matériel et Méthode (4/5) Fixation Fixation dans du paraformaldehyde 4% (2h) puis 24 h à 0.4%. Cryoconservation par imprégnation dans du sucrose (72h). . Congélation La biopsie est enrobée dans du tissu teck* puis plongée dans un bain d’isopentane refroidi avec de l’azote liquide . . Conservation des échantillons à -80°C. *Colle solide à T°basse. XXVIème Congrès AFH Rennes le 13 Juin 2013. 20.
(22) Glande mammaire – Immunohistologie - Traitement d’image - Etude sur animaux – Résultats - Conclusion. . Coupes. Matériel et Méthode (5/5) Découpe des biopsies à l’aide d’un cryotome réfrigéré à -30°C. Coupes de 7 µm déposées sur des lames 3 puits préalablement coatées.. 1 à 5 lames par biopsie 1 à 3 coupes par puits Echantillon Contrôle -. XXVIème Congrès AFH Rennes le 13 Juin 2013. 21.
(23) Glande mammaire – Immunohistologie - Traitement d’image - Etude sur animaux – Résultats - Conclusion. Exemple de marquage (PCNA) Marquage : 1. Perméabilisation du tissu avec H2O2 et un détergeant. 2. Saturation du tissu avec du PBS-BSA. 3. Réaction antigène-anticorps Anticorps primaire monoclonal (anti-PCNA fait chez la souris) Anticorps secondaire lapin (anti-souris IgG conjugué à Alexa). 4. Lavages 5. Coloration au DAPI 6. Rinçage, séchage et montage des lames. Observation : Observation des coupes au microscope en fluorescence . Capture d’images sur différentes zones de la coupe à un grossissement x200.. XXVIème Congrès AFH Rennes le 13 Juin 2013. 22.
(24) Glande mammaire – Immunohistologie - Traitement d’image - Etude sur animaux – Résultats - Conclusion. Acquisition des images pour le PCNA Pour un échantillon de biopsie. 8 images en bleu Environ 800 noyaux par image soit 6400 cellules marquées. 8 images en vert Environ 152 noyaux par image soit 1216 cellules marquées. 20µm. Une chèvre. 2 biopsies (1 par demi-mamelle). 32 images (16 bleu, 16 vert). Pour le marquage PCNA sur 8 chèvres, 256 images ont été traitées. XXVIème Congrès AFH Rennes le 13 Juin 2013. 23.
(25) Glande mammaire – Immunohistologie - Traitement d’image - Etude sur animaux – Résultats - Conclusion. RESULTATS. XXVIème Congrès AFH Rennes le 13 Juin 2013. 24.
(26) Glande mammaire – Immunohistologie - Traitement d’image - Etude sur animaux – Résultats - Conclusion. Quantité de lait produit (en kg). Production de lait par demi-mamelle 3 2.5 2 1.5 1. 2.5 1.3. 0.5 0 12h. 36h. On observe une baisse de la production de lait avec 2.5 kg dans les demimamelles traites tous les 12h et 1.3 kg de lait pour les demi-mamelles qui ont subi une accumulation de 36h. XXVIème Congrès AFH Rennes le 13 Juin 2013. 25.
(27) Glande mammaire – Immunohistologie - Traitement d’image - Etude sur animaux – Résultats - Conclusion. Taux de prolifération cellulaire dans la glande mammaire 36h. 12h. 30. 20 20 µm. 20 µm. 10. 19.8 9.34. 0. 12h 36h. On observe une diminution du taux de cellules en prolifération dans le tissu mammaire après 36h d’accumulation de lait, comparé à 12h d’accumulation. Soit 19.8 contre 9.3% (p<0.01). XXVIème Congrès AFH Rennes le 13 Juin 2013. 26.
(28) Glande mammaire – Immunohistologie - Traitement d’image - Etude sur animaux – Résultats - Conclusion. Taux de mort cellulaire dans la glande mammaire 12h. 36h. 1.00 0.80 0.60 20 µm. 0.40. 0.63. 20 µm. 0.20. 0.15 0.00. 12h 36h. On observe une augmentation du taux de cellules mortes par apoptose dans le tissu mammaire après 36h d’accumulation de lait, comparé à 12h d’accumulation. Soit 0.63 contre 0.15% ( p<0.001) XXVIème Congrès AFH Rennes le 13 Juin 2013. 27.
(29) Glande mammaire – Immunohistologie - Traitement d’image - Etude sur animaux – Résultats - Conclusion. Conclusion de l’étude 36h d’accumulation de lait : CEM. Prolifération. Mort cellulaire. Quantité de lait XXVIème Congrès AFH Rennes le 13 Juin 2013. 28.
(30) Glande mammaire – Immunohistologie - Traitement d’image - Etude sur animaux – Résultats - Conclusion. CONCLUSION. XXVIème Congrès AFH Rennes le 13 Juin 2013. 29.
(31) Glande mammaire – Immunohistologie - Traitement d’image - Etude sur animaux – Résultats - Conclusion. Il existe bien une relation entre le turnover des cellules mammaires et la production du lait.. XXVIème Congrès AFH Rennes le 13 Juin 2013. 30.
(32) Glande mammaire – Immunohistologie - Traitement d’image - Etude sur animaux – Résultats - Conclusion. La quantité de lait produit peut être modifiée par d’autres facteurs: Perméabilité de l’épithélium, en lien avec les jonctions serrées. Hormones : Prolactine,….. Fréquence de traite Nous avons mis en place des essais sur animaux pour étudier les effets de ces facteurs sur le turnover. XXVIème Congrès AFH Rennes le 13 Juin 2013. 31.
(33) Glande mammaire – Immunohistologie - Traitement d’image - Etude sur animaux – Résultats - Conclusion. Relation entre turnover et production du lait Induction de l’ouverture des jonctions serrées chez la chèvre.. Inhibition de la libération de Prolactine. (Boutinaud et al. JDS 2012). (Ben Cheldy et al. JDS 2010). Monotraite chez la vache. (Boutinaud, Galio et al. Soumis BMC Genomics). Ces facteurs ont entrainé une baisse de production du lait. Nous avons retrouvé une diminution de la prolifération associée à une augmentation de la mort cellulaire dans la glande mammaire. XXVIème Congrès AFH Rennes le 13 Juin 2013. 32.
(34) Merci de votre attention XXVIème Congrès AFH Rennes le 13 Juin 2013. 33.
(35) Marquage Tunel . 1- Décongélation. 2- Perméabilisation du tissu par du citrate de sodium et un détergeant à chaud. 3- Perméabilisation avec de la protéinase K à chaud. 4-fixation du nucléotide à l’aide de l’enzyme 1h à 37°C 5- Blocage et arrêt de la réaction 6- Lavages 7- coloration au Dapi 8- Rinçage, séchage et montage des lames. XXVIème Congrès AFH Rennes le 13 Juin 2013. 34.
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