Identification de biomarqueurs du statut nutritionnel dans le lait et étude nutrigénomique de la glande mammaire de vaches Holstein et Montbéliarde.

HAL Id: tel-03066398

https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-03066398

Submitted on 15 Dec 2020

HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from

L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d’enseignement et de

dans le lait et étude nutrigénomique de la glande mammaire de vaches Holstein et Montbéliarde.

Pierre-Alexis Billa

To cite this version:

Pierre-Alexis Billa. Identification de biomarqueurs du statut nutritionnel dans le lait et étude nu-

trigénomique de la glande mammaire de vaches Holstein et Montbéliarde.. Agronomie. Université

Clermont Auvergne [2017-2020], 2020. Français. �NNT : 2020CLFAC026�. �tel-03066398�

AGRONOMIE – ENVIRONNEMENT

THÈSE

Présentée pour obtenir le grade de

DOCTEUR D’UNIVERSITÉ

Spécialité : Génétique, Physiologie, Pathologie, Nutrition, Microbiologie, Santé, Innovation

Par Pierre-Alexis BILLA

Soutenue publiquement le 12 juin 2020

Identification de biomarqueurs du statut nutritionnel dans le lait et étude nutrigénomique de la glande

mammaire de vaches Holstein et Montbéliarde.

Rapporteurs Dr Rachel Rupp Directrice de Recherche, INRAE, Castanet Tolosan

Dr Patrice Martin Directeur de Recherche/Consultant, Excilone, Élancourt

Examinateurs Dr Amalia Trousson Maître de conférence, Université Clermont Auvergne, Clermont-Ferrand

Dr Karol Pawlowski Assistant professeur, Warsaw University of

Life Science, Warsaw

Une thèse dure 3 ans, soit environ les ¾ de la distance qu’a parcouru la lumière depuis l’étoile la plus proche, Alpha Centauri, jusqu’à nous. Pourquoi cette comparaison à l’astronomie, simplement car le thésard qui est au centre de son manuscrit et de son projet peut être comparé à une étoile en devenir.

Cependant, une étoile n’est qu’un point dans la galaxie de la biologie, la chimie, la physique, etc… et chaque galaxie n’est qu’un point dans l’univers que l’on appelle la science. Pourtant, à son échelle, l’étoile est rarement seule, beaucoup d’objets stellaires et planètes plus ou moins proches peuvent graviter autour. Ces objets et planètes, vous l’aurez deviné, font référence à des personnes que j’aimerais remercier d’avoir été autour de moi pendant ces 3 ans.

Il existe différents types d’étoiles, il faut donc juger leurs caractéristiques pour les définir. Je tiens donc à remercier les membres de mon jury de thèse : Rachel Rupp (INRAE UMR GenPhySE) et Patrice Martin (Excilone, Élancourt) d’avoir accepté d’être rapporteurs de ce manuscrit de thèse. Je remercie également Amalia Trousson (GReD, Clermont Ferrand) et Karol Pawłowski (University of Life Sciences, Warsaw) pour leurs fonctions d’examinateurs.

Une étoile ne peut naître à partir de rien, je remercie donc la Région Auvergne Rhône Alpes et le FEDER d’avoir financé ce projet de thèse.

Je remercie également les membres de mon comité de thèse : Fabienne Le Provost (INRAE, Jouy-

en-Josas), Jocelyne Flament (AgrocampusOuest, Rennes), Pierre Germon (INRAE, Tours-Nouzilly) et Claude

Beaudoin (Université Clermont-Auvergne, Clermont-Ferrand) pour avoir suivi mon travail et veillé au bon

remerciements « on n’est pas ici pour faire des remerciements, mais pour poublier ». En plus de ces 3 mousquetaires, d’autres personnes ont gravité autour de ma thèse. Un merci particulier à Sébastien Bes et Céline Boby, qui m’ont aidé en coulisse pour toute la partie technique de ma thèse, Martine Tourret, Sylvie Bardou-Valette et Sylvain Emery pour leur joie de vivre et les différentes soirées « resto » passées ensemble. Je remercie également toute l’équipe Biomarqueur pour l’accueil, l’ambiance, le soutien durant ces 3 ans.

Je voudrais remercier d’autres personnes que j’ai côtoyées dans ce système stellaire, Pascale Béraud de la planète « tu l’as vu ? », Cyril Labonne de la planète « je t’ai eu » et les autres habitants des planètes du système PERAQ, en particulier Didier Bany et Émilie Tixier. Je veux aussi remercier Jordann Domagalski de la planète « allez salut, bon week-end », Mélissa Vauris de la planète « c’est par où » et Vincent Largeau de la planète « Rougnou ».

D’autres étoiles étaient autour de moi durant ma formation, leurs rayonnements étaient toujours là pour m’éclairer. Un merci chaleureux à Jeanne Bazile, une de ces étoiles (bien qu’elle-même redoute les fortes lumières), son attitude positive était toujours là dans les moments de faiblesse et son extraordinaire capacité d’organisation de soirées diverses et variées pour nous détendre était toujours utilisée à bon escient. Merci aussi à Hélène Fougère, la maman des jeunes étoiles, toujours prête à aider de ses conseils avisés et Julien Soulat, le papi ou l’ancêtre, prêt à bercer son entourage avec une de ses histoires sans fin.

Merci pour le soutien de Lucille Rey-Cadilhac et Madeline Koczura, deux personnes aux oreilles attentives quel que soit le problème, professionnel ou personnel, toujours prêtes à en discuter autour d’un bon verre de vin. De même, merci à Pauline Denis, la petite nouvelle dans cet amas d’étoiles, qui nous fait rire avec son caractère candide. Je remercie également toutes les autres étoiles plus ou moins proches rencontrées durant ma formation.

Pour finir j’aimerais remercier ceux qui m’ont connu avant cette transformation en étoile, quand je

n’étais encore qu’une nébuleuse. Tout d’abord mes parents, Sylvie et Philippe, qui m’ont soutenu dans ce

projet, ainsi que pendant les 24 ans qui ont précédés cette transformation. Mon frère Matthieu,

notamment pour ces bons légumes du jardin et mes grands-parents pour leur soutien. Ma belle-famille au

complet pour tous les moments passés ensemble. Mes amis de l’école d’ingénieurs, Alice et Alex prêts à

venir jouer avec moi en ligne pour mes moments de détente. Émilie et son mari Nico pour ces moments

rire avec leurs histoires tout droit sorties d’un film. Mes amis de jeux/guilde, Thomas, Erwan et Salomé qui étaient là pour me changer les idées. Encore une fois merci à tous.

Il y a encore beaucoup d’autres personnes qui m’ont connu et encouragé mais j’aimerais finir par

une seule, celle qui m’accompagne depuis maintenant presque 6 ans. Solveig, l’étoile la plus proche de

moi, prête à m’éclairer dans les moments les plus sombres, à me supporter durant mes explosions

stellaires, je n’ai qu’un seul mot pour toi ici, MERCI.

Durant la lactation, et plus particulièrement à son début, les vaches peuvent subir un déficit énergétique conduisant à un déséquilibre métabolique. Ce dernier modifie la production et la composition du lait. À l’heure de l’élevage de précision, identifier des molécules faciles d’accès pour détecter précocement les animaux en bilan énergétique négatif est un point important. Le lait est un fluide qui contient un grand nombre de molécules parmi lesquelles les métabolites et les microARN, petits ARN non- codants connus pour réguler de nombreux processus biologiques y compris dans la glande mammaire, ont été récemment détectés. L’objectif de mon travail de thèse est d’identifier des biomarqueurs du statut nutritionnel et de caractériser l’impact d’une restriction alimentaire sur le miRNome de la glande mammaire chez la vache laitière. Pour ce faire, dix-neuf vaches en milieu de lactation (9 Holstein et 10 Montbéliarde) ont été restreintes pendant 6 jours à 50 % de leurs besoins énergétiques. Les effets de cette restriction sur la production et la composition fine du lait ont été déterminés. Son impact sur le fonctionnement de la glande mammaire a été étudié par des approches de nutrigénomique.

Les données de production laitière et les métabolites sanguins ont confirmé le déficit énergétique des vaches. Les teneurs de certains métabolites du lait (glucose, glutamate, glucose-6-phosphate, isocitrate, β-hydroxybutyrate, acide urique et acides aminés libres) et les profils en acides gras ont été modifiés par la restriction alimentaire. L’étude de leurs corrélations avec le bilan énergétique nous a conduit à proposer le glucose et le glutamate comme potentiels biomarqueurs non invasifs dans le lait. D’éventuelles différences entre races et des seuils critiques devront être définis sur un plus grand nombre d’animaux, et au cours de différents stades de lactation avant que ces métabolites ne soient utilisés en élevage.

La comparaison des miRNomes mammaires entre les vaches Holstein et Montbéliarde a permis d’identifier 22 miARN différentiellement exprimés entre les deux races. Des analyses bio-informatiques ont mis en évidence un rôle potentiel de ces miARN dans le développement mammaire, et l’étude approfondie des six miARN les plus exprimés parmi les 22 a révélé leurs potentiels rôles dans la synthèse lipidique. Ces deux résultats peuvent en partie expliquer les différences de production observées entre ces races.

La restriction alimentaire a affecté l’expression de 27 miARN et 374 ARNm chez les vaches Holstein.

Cependant aucun effet n’a été détecté sur les vaches Montbéliarde. L’analyse des positions génomiques des 27 miARN et l’analyse bibliographique des 8 miARN les plus exprimés révèlent une forte implication de ces miARN dans la synthèse lipidique et la prolifération cellulaire. L’intersection des 374 ARNm différentiels avec la liste des ARNm potentiellement cibles des 8 miARN les plus exprimés a mis en évidence 59 ARNm communs majoritairement impliqués dans la synthèse lipidique et le développement cellulaire.

Ces résultats suggèrent un rôle des miARN via la régulation des ARNm, dans les changements de profil d’acides gras ainsi que dans les pertes de production observées au cours d’une restriction alimentaire.

Les perspectives de ce travail à court terme sont de valider ces résultats sur une population plus large, et d’étudier les profils en miARN dans les globules gras du lait. À plus long terme, il faudra s’attacher à mettre en place des méthodes de dosages applicables en ferme afin de permettre à l’éleveur de piloter les rations et les animaux de manière précoce.

Mot clé : MiARN, métabolites du lait, restriction alimentaire, vache laitière

During early lactation, cows can experience from negative energy deficit and metabolic imbalance that affect milk production and composition. At this age of precision husbandry, it is important to identify easily accessible molecules for early detection of animals suffering from extreme negative energy balance and metabolic disorders. Milk contains a large number of molecules including metabolites and microRNA;

small non-coding RNA known to regulate many biological processes, including in the mammary gland development and function. The objective of my thesis was to identify biomarkers of nutritional status and to characterize the effects of feed restriction on the mammary gland miRNome in dairy cows. Nineteen mid-lactation cows (9 Holstein and 10 Montbéliarde) were feed-restricted to 50% of their energy requirements for 6 days. The effects of this restriction on milk production and milk composition were determined. Its effects on mammary gland function was studied using nutrigenomic approaches.

Milk production and blood metabolites data confirmed the energy deficit of the cows in response to the feed restriction model. The concentration of selected milk metabolites (glucose, glutamate, glucose- 6-phosphate, isocitrate, β-hydroxybutyrate, uric acid and free amino acids) and fatty acids were modified by feed restriction. The study of their correlations with energy balance led us to propose glucose and glutamate as potential non-invasive biomarkers in milk. Possible differences between breeds and critical thresholds will have to be defined in a larger number of animals and during different lactation stages before these metabolites are used as on-farm indicators.

Twenty-two microRNA were differentially expressed between Holstein and Montbéliarde cows.

Bioinformatic analyses highlight a potential role of these miRNAs in mammary development. The 6 most expressed miRNAs among the 22 that differentially expressed are involved in lipid synthesis. These results may partly explain the breed production differences.

Feed restriction affected the expression of 27 miRNA and 374 mRNA in Holstein cows, but not in

Montbéliarde. The analysis of the genomic positions of the 27 miRNAs and the literature review of the

8 most expressed miRNA reveal their roles in lipid synthesis and cell proliferation. The comparison of the

374 differentially express mRNA with the list of potential target mRNAs of the 8 most expressed miRNA

show 59 common mRNA that are mainly involved in lipid synthesis and cell development. These results

suggest a role of miRNA, due to mRNA regulation, in the modulation of fatty acids profile and production

during feed restriction.

I- A Articles rédigés

Billa P.A, Faulconnier Y., Ye. T, Chervet. M, Le Provost. F, Pires. J.A.A, and Leroux C. 2019. Deep RNA- Seq reveals miRNome differences in mammary tissue of lactating Holstein and Montbéliarde cows. BMC Genomics. doi:10.1186/s12864-019-5987-4.

Billa P.A, Faulconnier. Y, Larsen. T, Leroux. C, and Pires. J.A.A. 2020. Milk metabolites as noninvasive indicators of nutritional status of mid-lactation Holstein and Montbéliarde cows. Journal of Dairy Science.

doi:10.3168/jds.2019-17466.

Billa P.A, Faulconnier Y., Ye. T, Bourdon. C, Pires. J.A.A, and Leroux C. Nutrigenomic analyses revealed miRNAs and mRNAs affected by feed restriction in mammary gland of midlactation dairy cows.

Révisé pour Plos One

II- C Communications scientifiques

II-1. Communications orales

Billa P.A, Faulconnier Y., Ye. T, Pires. J.A.A, and Leroux C. Feed restriction modifies mammary miRNome of mid lactation cows. 10th International Symposium on the Nutrition of Herbivores (ISNH). 2-6 septembre 2018. Clermont-Ferrand, France.

Billa P.A, Faulconnier. Y, Ye. T, Bes S., Pires. J.A.A and Leroux. C. Deep RNA-Seq reveals genetics and nutritional regulation of miRNomes in mammary gland of lactating Holstein and Montbéliarde cows.

American Dairy Science Association (ADSA). 23-26 juin 2019. Cincinnati, Ohio, USA.

Billa P.A, Faulconnier Y., Ye. T, Pires. J.A.A, and Leroux C. Feed restriction modifies mammary miRNome of mid lactation cows. 10th International Symposium on the Nutrition of Herbivores (ISNH). 2-6 septembre 2018. Clermont-Ferrand, France.

Pawlowski. K, Billa P.A, Faulconnier. Y, Bes. S, Boby. C, Pires. J.A.A and Leroux. C. Comparison of miRNome from cow milk fat fraction and mammary gland tissue. 10th International Symposium on the Nutrition of Herbivores (ISNH). 2-6 septembre 2018. Clermont-Ferrand, France.

Billa P.A, Faulconnier. Y, Bes S., Ye. T, Chervet. M, Pires. J.A.A and Leroux. C. Deep RNA-Seq reveals miRNome differences in mammary tissue of Holstein and Montbéliarde lactating cows. International Milk Genomics Consortium (IMGC). 13-15 novembre 2018. Sacramento, California, USA.

Billa P.A, Faulconnier. Y, Larsen. T, Leroux. C, and Pires. J.A.A. Les métabolites du lait comme indicateurs non invasifs du statut nutritionnel chez les vaches Holstein et Montbéliarde en milieu de lactation. Rencontre Recherche Ruminant (3R). 5-6 décembre 2018. Paris, France

Billa P.A, Faulconnier. Y, Larsen. T, Leroux. C, and Pires. J.A.A. Milk metabolites as noninvasive

indicators of nutritional status of midlactation Holstein and Montbéliarde cows. American Dairy Science

Association (ADSA). 23-26 juin 2019, Cincinnati, Ohio, USA.

CONTEXTE ... 1

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE ... 3

I- Période péripartum et déficit énergétique ... 3

II- La glande mammaire ... 6

II-1. Anatomie de la glande mammaire ... 6

II-2. Cycle de développement de la glande mammaire ... 8

II-2.1. Mammogenèse ... 9

II-2.2. Lactogenèse ... 10

II-2.3. Galactopoïèse ... 10

II-2.4. Involution ... 10

III- Le lait, ses constituants, leur synthèse et sécrétion ... 11

III-1. La composition du lait ... 11

III-1.1. La matière grasse ... 12

III-1.1.1. Les globules gras ... 12

III-1.1.2. La composition en acide gras ... 13

III-1.2. Les protéines du lait ... 14

III-1.3. Les glucides et autres constituants en moindre quantité ... 15

III-1.3.1. Les glucides, minéraux et vitamines ... 15

III-1.3.2. Les métabolites du lait ... 16

III-1.3.3. L’ADN, les ARN et les miARN dans les fractions du lait ... 17

III-2. Synthèse et sécrétion des constituants du lait ... 18

III-2.1. Synthèse et sécrétion de la matière grasse ... 18

III-2.1.1. La synthèse de novo des acides gras à chaînes courtes et moyennes ... 18

III-2.1.2. Absorption des acides gras à chaînes longues ... 19

III-2.1.3. Désaturation des acides gras ... 19

III-2.1.4. Synthèse des triglycérides ... 20

III-2.1.5. Sécrétion des lipides du lait ... 20

III-2.2. Synthèse et sécrétion des protéines du lait ... 21

IV-1.1. Le facteur génétique ... 23

IV-1.2. Stade et nombre de lactation ... 24

IV-2. Un facteur environnemental : la nutrition ... 25

V- Les miARN ... 27

V-1. Découverte et caractéristiques des miARN ... 28

V-1.1. La nomenclature des miARN ... 28

V-1.2. Quelques chiffres sur les miARN ... 29

V-1.3. Localisation génomique des gènes des miARN ... 29

V-2. Biogenèse et régulation des miARN ... 30

V-2.1. Biogenèse ... 30

V-2.1.1. La transcription des miARN... 31

V-2.1.2. La maturation des pri-miARN en pré-miARN ... 32

V-2.1.3. Transport du pré-miARN du noyau vers le cytoplasme ... 33

V-2.1.4. La maturation des pré-miARN en miARN matures ... 33

V-2.1.5. Formation du complexe RISC ... 34

V-2.2. Régulation ... 35

V-2.2.1. Régulation transcriptionelle des miARN ... 35

V-2.2.2. Régulation lors de l’étape de maturation des miARN ... 36

V-2.2.3. Stabilité et dégradation des miARN ... 36

V-3. Mode d’action des miARN ... 37

V-3.1. Principe de l’interaction miARN/ARNm ... 37

V-3.2. Répression de la traduction ... 37

V-3.3. Dégradation des ARNm cibles ... 38

V-3.4. Activation de la traduction des ARNm cibles ... 38

III- Effets de la restriction alimentaire sur l'expression des ARNm et des miARN de la glande mammaire

chez les vaches Holstein et Montbéliarde en milieu de lactation ... 72

D DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES ... 101

I- Le choix des stratégies et méthodes utilisées ...101

I-1. Choix d’un modèle expérimental : une restriction forte en milieu de lactation ... 101

I-2. Méthodes de dosages et d’analyses ... 102

I-2.1. Une approche ciblée d’étude des métabolites du lait ... 102

I-2.2. Les différentes méthodes de quantification des ARN ... 103

II- Discussion des principales conclusions ...104

II-1. L’identification de miARN différentiels entre les vaches de races Holstein et Montbéliarde ... 104

II-2. L’effet d’une sous-nutrition sur la vache en lactation et sur le fonctionnement de la glande mammaire 106 II-3. Identification de potentiels biomarqueurs du déficit énergétique dans le lait ... 107

III- Les perspectives ...108

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES... 110

ANNEXE ... 128

I- Annexe 1 : Figures supplémentaires de l’article 1 ...128

II- Annexe 2 : Tableaux et figures supplémentaires de l’article 2 ...139

III- Annexe 3 : Figure supplémentaire de l’article 3. ...142

IV- Annexe 4 : Communications et posters présentés lors des congrès. ...148

Figure 1 : Cycle de lactation et de gestation dans les élevages laitiers. ... 5 Figure 2 : Énergie apportée et nécessaire durant le cycle de lactation. La zone en rouge correspond à la période de déficit énergétique, et la zone en vert la période où la vache reconstruit ses réserves.

D’après Strucken et al. (2015). ... 5 Figure 3 : Représentation de la relation entre le métabolisme lipidique dans le tissu adipeux, le foie et la glande mammaire. Adapté de Drackley (1999) et Keshri et al. (2019). AGNE : Acides Gras Non Estérifiés, AA : Acides Aminés, VLDL : very low density lipoprotein. ... 6

Figure 4 : Schéma de la glande mammaire de vache et de la structure d’une alvéole mammaire.

D’après Husvéth (2011). ... 8 Figure 5 : Les différentes étapes du développement de la glande mammaire. Adaptée de Jammes et Djiane (1988). ... 9 Figure 6 : Structure de la membrane du globule gras. D’après Lopez (2011)... 13 Figure 7 : Les voies métaboliques du glucose-6-phosphate, de la glutamine, du glutamate et de l’isocitrate avec la voie de synthèse de novo des acides gras comme exemple de voie d’utilisation du NADPH. ... 17

Figure 8 : Schéma de synthèse et sécrétion des acides gras du lait. ... 21 Figure 9 : Production de lait pour différentes races françaises sur une lactation (lactation corrigée sur 305 jours, http://www.web-agri.fr/conduite-elevage/genetique-race/article/les-chiffres-cles-et- resultats-de-controle-laitier-de-2017-1175-136895.html). ... 24

Figure 10 : Exemple de la structure d’un précurseur de miARN (pré-miARN) chez l’homme donnant

naissance au miARN 5 et 3p. Issue de http://atlasgeneticsoncology.org/Genes/GC_MIR146B.html. ... 29

du complexe RISC. A : clivage du pré-miARN par DICER pour former le miARN mature qui se dissocie puis

se réassocie à DICER dans une position différente. TRBP positionne le miARN pour permettre la sélection

du brin et le chargement dans Argonaute. B : le chargement dans Argonaute est médié par la protéine

HSP90 et des co-chaperonnes, qui hydrolysent de l’ATP pour maintenir Argonaute en configuration

ouverte. Après le chargement, le brin passager est libéré et Argonaute passe en formation fermée avec le

miARN mature. D’après Meister, (2013). ... 35

Tableau 1 : Nombre et localisation des glandes mammaires chez différentes espèces en fonction du

nombre de petits. D’après Bouichou (2009). ... 7

Tableau 2 : Composition du lait chez différentes espèces. D’après Jenness (1986). ... 11

Tableau 3 : Concentration moyenne des 15 acides gras majoritaires du lait de vache. D’après Jensen

(2002) et Chilliard (2006). ... 14

Tableau 4 : Les différents types d’ARN non codants. D’après Esteller, (2011). ... 27

A

AA ... Acides Aminés ACC ... Acétyl-CoA Carboxylase ADN ... Acide Désoxyribonucléique AG ... Acides Gras AGNE ... Acides Gras Non Estérifiés AGO ... Argonaute AGPAT ... Acylglycérol-3-Phosphate Acyltransférase AGV ... Acides Gras Volatils ARN ... Acide Ribonucléique ARNm ... ARN messager

B

BE ... Bilan Énergétique BEN ... Bilan Énergétique Négatif BHB ... β-hydroxybutyrate

C

CD36 ... Cluster of Differentiation 36 CEM ... Cellules Épithéliales Mammaires CoA ... Coenzyme A

D

DGAT ... Diacylglycérol Acyltransférase DGCR8 ... DiGeorge Syndrome Critical Region gene 8

E

EXP5 ... Exportine 5 Ran

F

FAS ... Fatty Acid Synthase FATP6 ... Fatty Acid Binding Protein 6

G

G6P ... Glucose-6-Phosphate GG ...Globules Gras GM ...Glande Mammaire GPAT ... Glycérol-3-Phosphate Acyltransférase

H

Hsp90 ... Heat Shock Protein 90

L

lncARN ... ARN long non codant LPL ... Lipoprotéine Lipase

P

PCR ... Polymerase Chain Reaction

Q

QTL ... Quantitative Trait Loci

R

RISC ... RNA-induced silencing complex

RLC ... RISC loading complexe

RMN ... Résonance Magnétique Nucléaire

RT-qPCR... Real-Time Quantitative PCR

SCD ... Stéroyl-CoA Désaturase SNP ... Single Nucleotide Polymophysme

T

TG ... Triglycérides

V

VLDL ... Very Low Density Lipoprotein

X

XPO5 ... Exportine 5 Ran

C

Contexte

La filière laitière représente en France 56 979 exploitations (chiffre de 2017, CNIEL, 2019) réparties sur tout le territoire pour un total de 23,9 milliards de litres de lait collectés (chiffre de 2018, CNIEL, 2019).

En Europe, la filière laitière française se situe au deuxième rang, derrière l'Allemagne. Dans le contexte agro-alimentaire, environ 90 % de la production est transformée (yaourts, desserts lactés, fromages, beurre, crème, …) et seulement 10 % est consommée en lait brut (chiffre de 2018, CNIEL, 2019). La consommation de lait dans les ménages, en France, a quant à elle, diminué de 11 % entre 2014 et 2018 (CNIEL, 2019).

Le lait est un enjeu nutritionnel important car il est le premier aliment reçu par le nouveau-né, lui fournissant tous les nutriments essentiels. Le premier lait secrété après la parturition, le colostrum, apporte notamment une protection immunitaire fondamentale au nouveau-né, grâce à sa richesse en anticorps, et notamment chez les ruminants en raison des particularités de leur placenta qui font que les anticorps ne franchissent pas la barrière placentaire (Gabriël et al., 2005). Le lait contient des protéines, de la matière grasse, du lactose, des minéraux (dont le calcium) et différents autres constituants mineurs.

Ces constituants et leurs structures conditionnent les propriétés physico-chimiques du lait, jouant un rôle sur les propriétés nutritionnelles, sensorielles et technologiques. Les consommateurs recherchent des produits de qualité (à la fois qualité nutritionnelle et qualité sensorielle), il est donc important que la composition du lait réponde à la qualité recherchée. De nos jours, les éleveurs se tournent vers l’élevage de précision pour pouvoir adapter leur gestion des troupeaux et de chaque animal individuellement, et ceci en temps réel pour maintenir la qualité recherchée. Il est donc primordial d’identifier des molécules indicatrices d’un statut particulier (nutrition, maladie, stress thermique, …) et le lait constitue une source non invasive facile d’accès.

Dans ce contexte, étudier les mécanismes de sécrétion associés aux différents constituants du lait est un enjeu important pour pouvoir comprendre les variations de composition et mieux les prévenir.

Différents facteurs modulent la composition du lait comme la fréquence de traite, la génétique,

l’alimentation ou encore l’état sanitaire des animaux. L’alimentation joue un rôle important car elle

permet un changement rapide de la composition du lait. De plus, durant la période de début de lactation,

l’ingestion d’aliments par les vaches laitières ne suit pas l’augmentation des besoins pour la production

laitière, entraînant un déficit d’énergie, de protéines et de minéraux majeurs. Cette période de Bilan

aux nombreuses études effectuées sur cette période. Les effets d’un BEN ont également été étudiés en utilisant des modèles de restriction alimentaire entraînant un déficit énergétique au cours des différents stades de lactation pour minimiser les effets confondus avec ceux de la parturition. Par ailleurs, du fait du contexte de changement climatique actuel et de son impact sur les cultures, les élevages peuvent venir à manquer d’aliment, notamment de fourrage, pour leurs animaux. Par exemple, en 2018, le gouvernement a dû aider les éleveurs financièrement pour permettre l’achat de fourrage suite à une forte sécheresse (https://agriculture.gouv.fr). Ce manque de fourrage peut entraîner des déficits énergétiques y compris en dehors des périodes de début de lactation. De ce fait, les modèles de restriction en milieu de lactation utilisés en recherche contribuent à apporter des éléments de réponse sur les impacts d’un déficit énergétique sur la production et la composition fine du lait. Il est important de poursuivre ces recherches pour mieux connaitre les mécanismes associés aux changements de production et de composition du lait, et ainsi de pouvoir améliorer la détection de déficit nutritionnel des vaches. Ces améliorations pourront permettre un suivi des vaches dans les exploitations pour éviter les pertes de production et assurer leur bien-être.

Dans ce contexte, l’objectif de cette thèse est d’identifier de nouveaux indicateurs d’un déficit

nutritionnel et d’étudier les mécanismes mammaires sous-jacents à une restriction alimentaire en milieu

de lactation. Pour ce faire, la composition fine du lait a été étudiée (composition classique, profils d’Acides

Gras (AG) et métabolites) afin de déterminer leurs variations au cours d’un déficit énergétique. Les

mécanismes de régulation de la synthèse des constituants du lait ont été étudiés au travers de l’expression

de microARN ou miARN (petits ARN dégradant ou inhibant la traduction des ARN messagers) dans la

Glande Mammaire (GM). L’objectif final est d’identifier des biomarqueurs d’un déficit énergétique via les

molécules présentes dans le lait pouvant varier rapidement et précocement lors de ces événements. Ces

molécules pourraient potentiellement être utilisées à l’avenir pour améliorer la détection d’un déficit

énergétique dans un contexte d’élevage de précision.

S

Synthèse bibliographique

I- Période péripartum et déficit énergétique

Au cours de leur carrière, les vaches laitières passent par des périodes cycliques de reproduction (Figure 1). La lactation qui dure environ 10 mois en élevage, est déclenchée par la parturition (ou mise- bas). La période de transition du statut de gestation à celui de lactation est une période importante physiologiquement, appelée « période péripartum ». Cette période est définie comme la période comprise entre les 3 semaines avant la mise-bas et les 3 premières semaines de début de lactation. Durant cette période, une diminution graduelle de l’ingestion est observable avec une chute durant la dernière semaine de gestation (environ 30 % de moins ; Grummer, 1995). La diminution brutale de l’ingestion au cours des sept derniers jours avant mise-bas entraîne un déséquilibre énergétique qui s’aggrave après la parturition.

L’ingestion devient insuffisante pour couvrir les besoins pour la production de lait (Grummer, 1995;

Drackley, 1999). Le BEN qui s’ensuit entraîne une mobilisation des réserves de la vache laitière, qui seront reconstruites en fin de lactation, et lors du tarissement (Figure 2 ;(Moyes et al., 2009; Gross et al., 2011a;

Strucken et al., 2015). Cette période de diminution de l’ingestion entraîne une diminution de l’absorption par le rumen des Acides Gras Volatils (AGV ; acétate, propionate et butyrate principalement) produits au cours de la fermentation ruminale des aliments. Les AGV représentent de 50 à 70 % de l’énergie absorbée chez les ruminants. Le reste de l’énergie (glucose de 3 à 15 %, acides aminée de 15 à 25 % et lipides de 5 à 15 % de l’énergie absorbée) est absorbé au niveau intestinal (Chilliard, 1987). Le propionate produit dans le rumen est transformé en glucose dans le foie, ce qui compense la faible absorption de ce nutriment indispensable au métabolisme de l’animal (Chilliard, 1987). Le butyrate (transformé en β-hydroxybutyrate (BHB) dans l’épithélium ruminal) et l’acétate servent de substrat oxydatif pour différents organes, ou encore de sources de carbone et de NADPH (via le cycle de Krebs) pour la lipogenèse, notamment dans les tissus adipeux et la GM (Chilliard, 1987; Bell et Bauman, 1997).

La période péripartum est accompagnée par des changements hormonaux et métaboliques rendant

les vaches plus sensibles aux maladies et aux désordres métaboliques (Drackley, 1999), deux points

critiques pour la production. Lors de cette période, une diminution de la concentration de l’insuline et une

augmentation de la concentration en hormone de croissance sont constatées autour du vêlage (Bell,

1995), ainsi qu’un changement de la réponse des tissus cibles de ces hormones. Ces changements

mobilisation des tissus adipeux. En effet, pour supporter le déficit et maintenir le niveau de lactation, les vaches vont puiser dans leurs réserves lipidiques. Les Acides Gras Non Estérifiés (AGNE) issus de la lipomobilisation des tissus adipeux sont en partie absorbés par le foie, puis convertis en Acétyl-CoA par β- oxydation pour produire de l’énergie, ou bien sont estérifiés en Triglycérides (TG). Une partie de ces TG est empaquetée dans des Very Low Density Lipoprotein (VLDL) pour être transportée vers la GM. Lors de la lactation, celle-ci augmente l’absorption de TG pour synthétiser et sécréter les AG (Bell, 1995 ; Figure 3). Du fait de l’importante mobilisation en AGNE, il se produit une augmentation de la formation de corps cétoniques (comme le BHB) dans le foie, et leur trop forte quantité (supérieure à 1,2 mM) entraîne une cétose sub-clinique (LeBlanc et al., 2005). L’augmentation de la demande en énergie de la GM entraîne une diminution du glucose plasmatique malgré une augmentation de la néoglucogenèse dans le foie (Bell, 1995). Cependant, cette dernière peut être en partie inhibée par l’accumulation de TG et la cétose du foie (Drackley, 1999).

Cette période de début de lactation correspond aussi à une augmentation de la synthèse protéique par la GM, ce qui diminue les teneurs en Acides Aminés (AA) libres circulant dans le plasma. Ces AA proviennent en partie du catabolisme protéique dans les muscles (Bell, 1995; Meijer et al., 1995). Tous ces changements se traduisent en partie par des modifications des teneurs en certains intermédiaires des voies métaboliques présents dans le lait, notamment une augmentation du BHB (Nielsen et al., 2003).

Enfin, le profil en AG du lait est aussi modifié durant cette période de mobilisation des réserves (Gross et

al., 2011b; Pires et al., 2013). Des études ont été, et sont encore, menées afin d’accroître les connaissances

de ces variations de la composition fine du lait et permettre leur utilisation pour déterminer le statut

métabolique des vaches laitières. Ainsi, des études ont utilisé des restrictions alimentaires pour augmenter

ou simuler le déficit énergétique, et caractériser les effets d’un déficit nutritionnel sur des variables

zootechniques de production et physiologiques. Des études utilisant des restrictions en milieu de lactation

ont montré que les réponses des indicateurs plasmatiques de la mobilisation des réserves (par exemple

Figure 1 : Cycle de lactation et de gestation dans les élevages laitiers.

Figure 2 : Énergie apportée et nécessaire durant le cycle de lactation. La zone en rouge correspond à la période de déficit énergétique, et la zone en vert la période où la vache reconstruit ses réserves.

D’après Strucken et al. (2015).

Figure 3 : Représentation de la relation entre le métabolisme lipidique dans le tissu adipeux, le foie et la glande mammaire. Adapté de Drackley (1999) et Keshri et al. (2019). AGNE : Acides Gras Non Estérifiés, AA : Acides Aminés, VLDL : very low density lipoprotein.

III- La glande mammaire

La GM est un organe sécrétoire spécifique au mammifère qui sécrète du lait pour nourrir et offrir

une protection immunitaire au jeune. La fonction de lactation ou de la production de lait est liée à un long

processus de développement et de différentiation des tissus mammaires. La GM se développe

progressivement dès la vie fœtale et juvénile, puis au rythme des cycles de gestation et de lactation de la

posséder une citerne permettant de stocker le lait entre les tétées ou les traites comme tous les ruminants d’élevage, contrairement à d’autres espèces où la GM est composée de plusieurs lobes simples (Figure 4).

Deux types de tissus sont présents dans la GM : l’épithélium, composé de canaux et d’alvéoles (ou acini), et le stroma, appelé aussi tissu conjonctif ou coussinet adipeux mammaire, qui assure le soutien des tissus producteurs. Ces tissus sont constitués de différents types cellulaires. L’épithélium est divisé en lobes, eux même divisés en lobules formés d’acini ou alvéoles. La fonction sécrétrice des acini est assurée par une monocouche de cellules épithéliales luminales qui sont les cellules sécrétrices polarisées. Selon leur localisation, ces cellules se différencient de deux façons : en cellules luminales canalaires le long des canaux, ou en cellules productrices et sécrétrices de lait au niveau des alvéoles. Les acini sont bordés par des capillaires sanguins permettant l’apport d’éléments essentiels à la production du lait (glucose, AA, minéraux …), et par des cellules myoépithéliales qui permettent, par leurs contractions, l’évacuation du lait dans les canaux qui finissent par se rejoindre dans la citerne.

Tableau 1 : Nombre et localisation des glandes mammaires chez différentes espèces en fonction du nombre de petits. D’après Bouichou (2009).

Espèces

Nombre de glandes mammaires

Localisation

Nombre d'ouvertures

par trayon

Nombre moyen de petit(s) vivant(s) par

portée Région

thoracique

Région abdominale

Région inguinale

Vache 4 - - 4 1 1

Chèvre

Mouton 2 - - 2 1 1,5

Jument 2 - - 2 2 1

Truie 12-14 6 6 4 2 13,6

Chatte 8 4 2 2 4-8 6

Chienne 10 4 4 2 8-22 5

Rate 12 6 2 4 1 7

Souris 10 6 - 4 1 8

Cochon d'Inde 2 - - 2 1 3

Figure 4 : Schéma de la glande mammaire de vache et de la structure d’une alvéole mammaire.

D’après Husvéth (2011).

II-2. Cycle de développement de la glande mammaire

De la vie fœtale à la première lactation, le développement de la GM se déroule en plusieurs étapes

(Figure 5) : 1- La mammogenèse, qui commence dès la vie fœtale et se poursuit jusqu’au dernier tiers de

Figure 5 : Les différentes étapes du développement de la glande mammaire. Adaptée de Jammes et Djiane (1988).

II-2.1. Mammogenèse

La mammogenèse se déroule en plusieurs phases depuis la vie fœtale jusqu’à la lactogenèse. Chez le bovin (durée de gestation de 280 jours), des rudiments de mamelles d’origine ectodermique sont visibles au 32

jour de gestation sur la face ventrale de l’embryon. Au-delà du 32

jour, la prolifération cellulaire donne naissance à un cordon cellulaire correspondant au canal primaire puis rapidement celui- ci s’arborise pour donner des canaux secondaires, les futurs canaux lobulaires. La partie distale du canal primaire se creuse formant l’ébauche de la citerne. En parallèle, le mésoderme génère les vaisseaux sanguins et les tissus adipeux et conjonctifs.

De la naissance jusqu’au dernier tiers de la gestation les canaux mammaires se développent, se

ramifient, et le tissu lobulo-alvéolaire apparait. À la naissance, la GM est rudimentaire : quelques canaux

sont présents mais ne sont pas reliés à la citerne. De la naissance à la puberté, la GM débute une croissance

allométrique, c’est-à-dire plus rapide que celles des autres parties du corps (Geiger, 2019), avec une

croissance du tissu parenchymal (Capuco et Akers, 2010). Après la puberté la GM reprend une croissance

isométrique, c’est-à-dire proportionnelle à la croissance de l’individu, et ce jusqu’à la gestation. Dès le

début de la gestation, la croissance de la GM redevient allométrique avec une augmentation des canaux

jusqu’au 150

jour de gestation chez la vache. Le système lobulo-alvéolaire se met alors en place,

remplaçant progressivement le tissu adipeux. Enfin, l’épithélium monocouche se met également en place.

II-2.2. Lactogenèse

La lactogenèse est une phase de différentiation cellulaire et d’acquisition des activités de synthèse et de sécrétion du lait qui a lieu juste avant la parturition. Dans les 10 derniers jours de gestation, les Cellules Épithéliales Mammaires (CEM) s’hypertrophient et acquièrent les structures spécifiques à la synthèse et à la sécrétion : un noyau en position basal, un réticulum endoplasmique très développé, un appareil de Golgi associé à de nombreuses vésicules destinées à la sécrétion, et un grand nombre de mitochondries (Jammes et Djiane, 1988).

II-2.3. Galactopoïèse

La galactopoïèse correspond à la production et sécrétion de lait par la GM. Ce processus est auto- entretenu à partir du moment où le lait est évacué, mais décline au cours du temps. Au plus fort de l’activité, l’épithélium peut synthétiser et sécréter 15 % de son propre poids par jour sous forme de protéines.

Chez la vache, la sécrétion du lait augmente rapidement à la parturition jusqu’au pic de lactation (autour de la 8

semaine post-partum pour une durée de lactation d’environ 40 semaines), puis diminue graduellement au cours du temps. La sécrétion du lait est dépendante du nombre et de l’activité des CEM (Boutinaud et al., 2004). Après le pic de lactation la perte de production de lait est due, pour partie, à un déséquilibre entre la prolifération et l’élimination progressive des CEM. Cette dernière est induite par deux facteurs : l’entrée des cellules sécrétrices en apoptose et leurs exfoliations (Capuco et al., 2001; Boutinaud et Jammes, 2002; Boutinaud et al., 2004).

II-2.4. Involution

L’involution débute avec l’arrêt de la traite (tarissement volontaire) ou au moment du sevrage.

Durant cette phase, le tissu lobulo-alvéolaire diminue et la proportion de cellules en division devient

les élevages, l’involution du tissu mammaire n’est jamais complète et conserve toujours une partie de son potentiel sécrétoire (Jammes et Djiane, 1988).

IIII- Le lait, ses constituants, leur synthèse et sécrétion

Le lait est l’élément principal de la nutrition des jeunes mammifères fournissant, du fait de ses constituants, tous les nutriments nécessaires pour leur croissance ainsi que des éléments de l’immunité pour leur apporter une première protection.

III-1. La composition du lait

Le lait est un fluide biologique extrêmement complexe constitué d’environ 90 % d’eau. Il comprend une solution vraie (sucres, protéines solubles, minéraux et vitamines hydrosolubles), une solution colloïdale (protéines dont les caséines) et une émulsion (matières grasses). Chaque espèce de mammifère présente la même composition globale, mais les proportions des divers constituants diffèrent (Tableau 2).

Tableau 2 : Composition du lait chez différentes espèces. D’après Jenness (1986).

Espèces Pourcentage par rapport au poids

Énergie Eau Matière grasse Caséines Lactoprotéines Lactose Minéraux

Vache 87 3,9 2,6 0,6 4,6 0,7 66

Chèvre 87 4,5 2,6 0,6 4,3 0,8 70

Brebis 82 7,2 3,9 0,7 4,8 0,9 102

Bufflonne 83 7,4 3,2 0,6 4,8 0,8 101

Chamelle 87 4,0 2,7 0,9 5,0 0,8 70

Ânesse 88 1,4 1,0 1,0 7,4 0,5 44

Jument 89 1,9 1,3 1,2 6,2 0,5 52

Femme 87 4,5 0,4 0,5 7,1 0,2 72

Otarie 35 53,3 4,6 4,3 0,1 0,5 516

Rate 72 9,3 7,2 1,0 3,7 1,4 131

Renne 67 18,0 8,6 1,5 2,8 1,5 214

III-1.1. La matière grasse

La matière grasse est le constituant le plus variable du lait en termes de composition et de structure.

Elle représente, selon les espèces, entre 1 et 50 % de la masse totale de lait sécrété. Ces proportions varient au sein d’une même espèce selon différents facteurs (Cf. partie IV-). Chez la vache laitière, cette matière grasse représente entre 3 et 5 % de la masse totale du lait sécrété.

III-1.1.1. Les globules gras

La matière grasse se présente sous forme de Globules Gras (GG) en émulsion dans la phase aqueuse du lait. Le lait de vache contient en moyenne 15 x 10

GG et leur diamètre varie de 0.2 à environ 15 μm (Couvreur et Hurtaud, 2007). La taille des GG est très importante car elle affecte les fonctionnalités technologiques et sensorielles des produits laitiers (Couvreur et Hurtaud, 2007).

La membrane des GG, qui représente 2 à 6 % de sa masse totale, est composée de trois couches

lipidiques : une première venant du réticulum endoplasmique et une bicouche lipidique venant de la

membrane plasmique des CEM (Cf. partie III-2.1.5 ; Figure 6). La membrane du GG est composée pour

90 % de son poids sec de protéines et de lipides polaires sous forme de phospholipides (Lopez, 2011). Les

principaux phospholipides sont la phosphatidyléthanolamine, la phosphatidylcholine et la sphingomyéline

(Fauquant et al., 2007). La butyrophiline (40 %) et la xanthine oxydase (12 %) sont les deux protéines

majoritaires de la membrane du GG (Lopez, 2011). Chez le bovin, des études protéomiques de la

membrane des GG ont identifié 138 protéines différentes intervenant notamment dans les processus de

transport, l’endocytose, le métabolisme des lipides, les signaux cellulaires ou le système immunitaire

(Reinhardt et Lippolis, 2006, 2008).

Figure 6 : Structure de la membrane du globule gras. D’après Lopez (2011).

III-1.1.2. La composition en acide gras

La composition en AG du lait est complexe. Ces AG se répartissent en trois familles selon le nombre de doubles liaisons dans leur chaîne carbonée. Les AG saturés ne possèdent aucune double liaison alors que les AG mono-insaturés et poly-insaturés en contiennent respectivement une et plusieurs. La double liaison peut être en configuration cis ou trans selon que les deux parties de la chaîne carbonée autour de la double liaison sont du même côté ou de part et d’autre du plan de la double liaison.

Les lipides du lait sont presque entièrement sous forme de TG (98 %), composés d’une molécule de glycérol estérifiée par trois AG. Le lait de vache contient 15 AG majoritaires (Tableau 3) mais plus de 400 AG différents ont été identifiés (Jensen, 2002). Les AG présents sont majoritairement des AG saturés (environ 68 % des AG totaux) dont les plus représenté sont l’acide palmitique et l’acide stéarique. Les AG insaturés correspondent surtout à des AG mono-insaturés (environ 29 % des AG), principalement l’acide oléique.

Les AG poly-insaturés ne représentent que 3 % environ des AG du lait de vache.

Tableau 3 : Concentration moyenne des 15 acides gras majoritaires du lait de vache. D’après Jensen (2002) et Chilliard (2006).

Acide gras Nomenclature Concentration (g/100 g des AG totaux)

Butyrique C4:0 2–5

Caproïque C6:0 1–5

Caprylique C8:0 1–3

Caprique C10:0 2–4

Laurique C12:0 2–5

Myristique C14:0 8–14

Pentadécanoïque C15:0 1–2

Palmitique C16:0 22–35

Palmitoléique C16:1 cis-9 1–3

Margarique C17:0 0,5–1,5

Stéarique C18:0 9–14

Oléique C18:1 cis-9 20–30

Vaccénique C18:1 trans-11 1-3

Linoléique C18:2 cis-9, cis-12 1-3

Linolénique C18:3 cis-9, cis-12, cis-15 0,2-1,5

AG saturés 68,5

AG monoinsaturés 29

AG polyinsaturés 2,9

III-1.2. Les protéines du lait

Le taux protéique correspond au taux de matières azotées totales du lait. Les protéines du lait

représentent 95 % des matières azotées. Les 5 % restants sont constitués d’AA libres, de petits peptides,

d’azote non protéique (urée essentiellement), de créatinine et d’acide urique. Les protéines sont classées

également des minéraux, essentiellement du phosphate de calcium (90 %) et des ions magnésium et citrate (10 %).

Les protéines du lactosérum sont obtenues après avoir éliminé les caséines et les lipides par centrifugation et précipitation sélective à pH 4,6. Le lactosérum chez la vache contient en majorité de l’α-lactalbumine, de la β-lactoglobuline, de l’albumine, de la lactoférine, de la transférine et des anticorps.

La β-lactoglobuline est un constituant majeur (environ 50 %) de la fraction protéique soluble qui serait impliquée dans le transport de molécules hydrophobes et de certains AG (Kontopidis et al., 2002, 2004;

Zimet et Livney, 2009). L’α-lactalbumine est la deuxième protéine la plus importante de cette fraction (environ 20 %). Elle intervient dans la synthèse du lactose et a, de ce fait, un rôle majeur dans la synthèse du lait. Des peptides, eux aussi présents dans le lait, sont issus de la digestion des caséines et de certaines protéines du lactosérum. Ces différents peptides identifiés dans le lait (Miranda et al., 2020) pourraient jouer un rôle sur la santé du consommateur (Nagpal et al., 2011; Hafeez et al., 2014).

III-1.3. Les glucides et autres constituants en moindre quantité

Le lait contient également divers glucides, minéraux et vitamines, mais aussi de l’ADN et des ARN présents dans différentes fractions.

III-1.3.1. Les glucides, minéraux et vitamines

Le lactose est le principal glucide du lait. Il régule en partie le volume de lait produit grâce à son pouvoir osmotique. Le lactose est synthétisé par les CEM dans la lumière de l’appareil de Golgi à partir du glucose sanguin et du galactose issue de la transformation du glucose dans les CEM. La synthèse s’effectue via un complexe enzymatique, la lactose synthase, constituée de deux sous-unités : l’α-lactalbumine et la galactosyltransférase.

Le lait de vache contient également une quarantaine d’oligosaccharides (Tao et al., 2008). Ces derniers sont de plus en plus étudiés pour leur rôle dans la qualité nutritionnelle du lait, en particulier chez la femme lors de l’allaitement (Zivkovic et Barile, 2011; Weinborn et al., 2020). Les monosaccharides libres, dont majoritairement le glucose et le galactose, sont également présents dans le lait bien qu’en concentrations négligeables comparativement aux oligosaccharides (Larsen, 2015). La concentration en glucose du lait a été montrée comme étant le reflet de la concentration intracellulaire des CEM (Kuhn et White, 1975; Faulkner et al., 1981).

Le lait contient aussi différents minéraux et vitamines présents en moindre quantité mais qui

interviennent également dans la qualité nutritionnelle du lait. Parmi les minéraux du lait, trois sont en

concentrations majoritaires : le calcium (environ 36 mM), le phosphore (environ 34 mM) et le potassium (environ 39 mM) (Zwierzchowski et Ametaj, 2019). Les vitamines, quant à elles, sont présentes sous forme liposoluble, comme la vitamine A, D et E, ou sous forme hydrosoluble, comme la vitamine B. Cette dernière, et plus spécialement la B12, est fortement présente chez les ruminants comparativement aux monogastriques du fait de son origine microbienne (Gille et Schmid, 2015).

III-1.3.2. Les métabolites du lait

Les métabolites sont des molécules intermédiaires issues de voies métaboliques telles que la glycolyse, le cycle de Krebs, la respiration, la voie des pentoses phosphates, etc… Ces dernières années, plusieurs études ont porté sur les métabolites du lait. Plus de 40 métabolites différents ont été identifiés par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) dans le lait de vache (Klein et al., 2010). Des approches plus ciblées (telles que la fluométrie) permettent la quantification de métabolites majeurs du lait (par exemple : glucose-6-phosphate, isocitrate, glutamine, glutamate, etc.). Le Glucose-6-Phosphate (G6P) est impliqué dans différentes voies du métabolisme énergétique (comme la glycolyse ou la voie des pentoses phosphates) permettant l’apport de NADPH dans le cytoplasme (Figure 7 ; Larsen, 2015). Le NADPH est indispensable aux réactions réductrices de biosynthèse, en particulier lors de la synthèse de novo des AG.

L’isocitrate fournit également, via le cycle de Krebs, une partir du NADPH nécessaire à la synthèse de novo

des AG. Les mesures de concentrations de G6P et d’isocitrate dans le lait reflètent donc indirectement la

lipogenèse mammaire. La glutamine a deux rôles après transformation en glutamate grâce à une

désamination : elle sert à la synthèse protéique ou est transformée en α-cétoglutarate qui entre dans le

cycle de Krebs pour fournir du NADPH nécessaire à la synthèse d’AG (Figure 7 ; Larsen et Fernández, 2017).

Figure 7 : Les voies métaboliques du glucose-6-phosphate, de la glutamine, du glutamate et de l’isocitrate avec la voie de synthèse de novo des acides gras comme exemple de voie d’utilisation du NADPH.

III-1.3.3. L’ADN, les ARN et les miARN dans les fractions du lait

L’Acide Désoxyribonucléique (ADN) présent dans le lait vient essentiellement des cellules somatiques dont des CEM exfoliées. Il est détecté par des tests de Polymerase Chain Reaction (PCR) (Murphy et al., 2002; López-Calleja et al., 2005). De l’ADN bactérien peut être également trouvé dans le lait lors d’infections telles que les mammites.

Il existe différents types d’Acide Ribonucléique (ARN) comme les ARN messager (ARNm) ou les

miARN (cf. partie V-). Ces ARN se retrouvent dans différentes fractions du lait. Par exemple, ils sont

présents dans les GG (Brenaut et al., 2012). Les ARNm sont également présents dans les vésicules

extracellulaires du lait où ils sont protégés de la dégradation (Izumi et al., 2015). Izumi et al. (2015)

observent une absorption des exosomes du lait par des cellules THP-1en culture (lignée cellulaire de

monocyte), et Rani et al. (2017) observent une absorption des exosomes par des cellules Caco-2 (cellule

d’adénocarcinome) proches des cellules endothéliales de l’intestin humain. Les miARN comme les ARNm

sont également détectés dans les différentes fractions du lait (Li et al., 2016) dont les vésicules

extracellulaires (Izumi et al., 2015; Li et al., 2016).

III-2. Synthèse et sécrétion des constituants du lait

La synthèse des constituants du lait est possible grâce à l’adaptation coordonnée du métabolisme des différents tissus et organes qui assurent les apports en nutriments à la GM (Bauman, 2000). La sécrétion des constituants peut s’effectuer par l’une des 5 voies de sécrétion dans les CEM (Shennan et Peaker, 2000) : (i) transmembranaire, (ii) exocytose, (iii) la voie de sécrétion des lipides, (iv) transcytose et (v) paracellulaire.

III-2.1. Synthèse et sécrétion de la matière grasse

Les AG présents dans les GG du lait ont deux origines distinctes : les AG à courtes et moyennes chaînes (C4:0 à C16:0) synthétisés de novo par les CEM, dont la proportion dans le lait reflète la contribution de la GM à la synthèse des lipides, et les AG à chaînes longues importés du plasma suite à l’alimentation et à la mobilisation des réserves corporelles.

III-2.1.1. La synthèse de novo des acides gras à chaînes courtes et moyennes

Chez le ruminant, la synthèse de novo des AG s’effectue dans le cytoplasme des CEM à partir de

différents précurseurs, principalement l’acétate et, dans une moindre mesure, le BHB (environ 15 % des

AG synthétisés de novo, Chilliard et al., 2000b) et le propionate (formant alors des AG à chaîne carbonée

impaire, Vlaeminck et al., 2015). Ces trois précurseurs proviennent de la fermentation ruminale des

glucides alimentaires. La première étape de la synthèse est l’absorption de ces précurseurs par la CEM et

leur transformation par un ajout d’une Coenzyme A (CoA) en acyl-CoA (acétyl-CoA, propionyl-CoA et

butyryl-CoA). L'activité de carboxylation assurée par l'enzyme Acétyl-CoA Carboxylase (ACC), spécifiée par

le gène ACACA, permet de fournir du malonyl-CoA pour la synthèse des AG. Une autre enzyme joue un

III-2.1.2. Absorption des acides gras à chaînes longues

Chez le ruminant, les AG à chaînes longues (supérieur à C16) et une partie des AG à 16 carbones (C16) proviennent des AGNE qui circulent liés à l’albumine. Les AG à chaînes longues proviennent essentiellement des lipides alimentaires absorbés par le tractus digestif, après une hydrogénation totale ou partielle dans le rumen, et de la mobilisation des réserves corporelles (spécialement en début de lactation, Bjerre-Harpøth et al., 2012; Pires et al., 2015, 2019). Ainsi les TG contenus dans les chylomicrons circulants sont libérés sous l’action de la Lipoprotéine Lipase (LPL) présente sur la membrane des CEM (Barber et al., 1997).

Le mécanisme par lequel les AG traversent l'endothélium des capillaires et l'espace interstitiel des CEM reste mal connu, cependant chez le bovin deux possibilités sont proposées (Bionaz et Loor, 2008a) : La première possibilité serait un passage passif des AG à longues chaînes via les mécanismes de flip-flop de la membrane plasmique des CEM, la seconde possibilité serait le passage des AG grâce à leurs liaisons avec deux protéines spécifiques : Cluster of Differentiation 36 (CD36) et Fatty Acid Binding Protein 6 (FATP6).

Dans la GM bovine, FABP et CD36 sont co-exprimées et leur expression augmente pendant la lactation puis diminue lors de l'involution (Spitsberg et al., 1995), suggérant que cette dernière est en relation avec le transport et le métabolisme des lipides dans les cellules. Les AG sont ensuite activés par une enzyme, ACSL1 (cf. partie III-2.1.4) via l’ajout d’un groupe CoA puis pris en charge par la protéine FABP afin d’entrer dans le processus de synthèse de TG (Figure 8).

III-2.1.3. Désaturation des acides gras

Seulement une fraction des AG prélevés dans le sang par la GM est insaturée ; ceci est dû aux

biohydrogénations des AG dans le rumen. L’enzyme impliquée dans la synthèse des AG insaturés est la

Stéroyl-CoA Désaturase (SCD) qui introduit une double liaison cis en position Δ9 du myristoyl-CoA,

palmitoyl-CoA et stéroyl-CoA acyl-CoA qui ont entre 10 et 19 carbones. Cette enzyme permet notamment

la synthèse de l’acide oléique (C18:1 cis-9), un des composants majeurs des lipides du lait, notamment

chez le ruminant. La SCD est aussi responsable de la synthèse des isomères majeurs du CLA, le

C18:2 cis-9, trans-11 (Chin et al., 1992; Bauman et Griinari, 2003), qui aurait un rôle bénéfique sur la santé

du consommateur.

III-2.1.4. Synthèse des triglycérides

Les AG synthétisés de novo ou absorbés sont activés en acyl-CoA via l’enzyme acyl-CoA synthétase (ACS) avec l’isoforme ACSL1 majoritaire dans la GM bovine (Bionaz et Loor, 2008b). Ils sont ensuite transférés vers le réticulum endoplasmique pour commencer la synthèse de TG. Les AG sont estérifiés en position sn-1 du glycérol pour former du glycérol-3-phosphate via l’enzyme Glycérol-3-Phosphate Acyltransférase (GPAT). La position sn-2 est ensuite estérifiée par l’Acylglycérol-3-Phosphate Acyltransférase (AGPAT) puis enfin la position sn-3 est estérifiée par la Diacylglycérol Acyltransférase (DGAT). Cette dernière est la seule enzyme spécifique de la synthèse des TG, les deux autres peuvent egalement jouer un rôle dans la synthèse des phospholipides (Mayorek et al., 1989; Coleman et al., 2000).

La distribution des AG sur les différentes positions du glycérol n’est pas aléatoire et détermine les caractéristiques fonctionnelles et nutritionnelles des TG du lait (Jensen, 2002). Chez le bovin, les AG estérifiés en position sn-1 et sn-2 sont surtout des AG saturés à chaînes moyennes et longues (80 et 76 % respectivement, Jensen, 2002). Plus précisément, les AG estérifiés en position sn-1 sont surtout le C18:0 et, dans une moindre mesure, le C18:1 (24 % des AG estérifiés pour ce dernier). En position sn-2, ce sont les AG C8:0, C10:0 et C14:0 qui sont préférentiellement estérifiés. Le C16:0 est, quant à lui, estérifié de manière similaire sur les positions sn-1 et sn-2. Les AG estérifiés en position sn-3 sont pour 44 % d’entre eux des AG à chaînes courtes (C4:0 à C8:0) et pour 27 % l’AG C18:1 (Jensen, 2002).

III-2.1.5. Sécrétion des lipides du lait

Les TG nouvellement formés s’accumulent en gouttelettes lipidiques qui fusionnent ensuite pour

former des globules lipidiques cytoplasmiques (Pauloin et al., 2004). Ils sont ensuite transportés jusqu’au

pôle apical de la cellule par le réseau de microtubules afin d’être sécrétées. Lors de la sécrétion, les

globules sont enveloppés par la membrane plasmique, ce qui forme la structure finale de la membrane

des GG (Figure 8). Une partie de cytoplasme est emportée entre la monocouche lipidique et la bicouche.

Figure 8 : Schéma de synthèse et sécrétion des acides gras du lait.

III-2.2. Synthèse et sécrétion des protéines du lait

Les protéines présentes dans le lait proviennent soit d’une synthèse dans les CEM à partir de

l’expression des gènes spécifiques, dont les gènes des protéines majeures du lait (les quatre caséines,

l’α-lactalbumine et la β-lactoglobumine), soit du plasma (les immunoglobulines, la sérum-albumine ou

encore les facteurs de croissance) (Boisgard et al., 2001). Les protéines plasmatiques sont sécrétées dans le lait via des mécanismes de transcytose, c’est-à-dire que les protéines sont endocytées au niveau baso-latéral des CEM puis transportées au pôle apical pour être sécrétées (Burgoyne et Duncan, 1998;

Boisgard et al., 2001). Les protéines issues des CEM sont synthétisées au niveau du réticulum endoplasmique. Le facteur limitant majoritairement leur synthèse est la disponibilité en AA qui sont issus de la circulation sanguine. Ces AA sont aussi une source d’azote et de carbone et peuvent donc servir à la synthèse d’autres AA ou être utilisés dans certaines voies métaboliques comme, par exemple, le cycle de Krebs.

Une fois synthétisées, les protéines transitent entre le réticulum endoplasmique et l’appareil de Golgi. C'est au niveau de l'appareil de Golgi et du réseau trans-golgien que les protéines vont subir des modifications post-traductionnelles (phosphorylation, glycosylation ou sulfatation). En particulier, la phosphorylation des caséines est assurée par des caséines kinases (Bingham et Groves, 1979; Léonil et al., 2013) leur permettant de s’agréger en micelles. Les protéines ainsi modifiées sont transportées par des vésicules de sécrétion jusqu’à la membrane apicale des CEM et sont sécrétées par fusion avec celle-ci.

IIV- Les facteurs modulant la composition du lait

Les concentrations des différents constituants du lait peuvent varier d’une espèce à l’autre, mais

aussi au sein d’une même espèce. Cette variabilité est liée à différents facteurs : à l’animal lui-même

(facteurs intrinsèques) ou à l’environnement, agissant ensemble sur les mécanismes de synthèse et de

sécrétion des différents constituants du lait. De nombreuses recherches en agronomie ont eu pour but de

préciser ces facteurs permettant de moduler la composition du lait pour en améliorer les qualités

(nutritionnelles, technologiques ou sensorielles) afin de répondre à la demande des différentes filières et

IV-1.1. Le facteur génétique

Les polymorphismes au sein d’une même espèce permettent de définir des races. Les polymorphismes de chaque race peuvent affecter divers paramètres tels que la synthèse ou la sécrétion de certains constituants du lait comme les protéines (Sanchez et al., 2017).

Il existe différentes races de vaches laitières, chacune ayant des caractéristiques phénotypiques qui leur sont propres, telles que le potentiel de production de lait (Figure 9), la composition du lait, les performances de reproduction, la santé ou la facilité d’élevage (Balandraud et al., 2019). Par exemple, les comparaisons de réponses de vaches Holstein et Montbéliarde à divers systèmes d’élevage (systèmes à l’herbe, mono-traite, système extensif vs semi-extensif) ont montré une plus grande sécrétion de lait, de matière grasse, de matière protéique et de lactose chez la race Holstein (Dillon et al., 2003; Pomiès et al., 2007; Pires et al., 2015). La sélection génétique a mis en avant ces différences pour mieux répondre aux besoins des Hommes. Par exemple, entre 1996 et 2016, la sélection des vaches Holstein a permis d’augmenter la production de lait de 2120 kg par lactation (https://primholstein.com/2017/lumiere-sur- les-resultats-de-20-ans-de-progres-genetique/).

Les variabilités des caractères d’une race à l’autre ou intra-race ont fait l’objet de nombreuses

études afin d’en identifier leurs origines ou, pour le moins, de s’en approcher. À un même locus (une

localisation chromosomique), il peut exister des allèles différents d’un même gène au sein d’une même

espèce. C’est ce qu’on appelle le polymorphisme génétique. Le polymorphisme peut apparaître dans des

parties codantes ou non du génome, par insertion ou délétion de base, mais surtout plus couramment par

la mutation d’un seul nucléotide : les Single Nucleotide Polymophysme (SNP ; Boussaha et al., 2016). Ces

régions chromosomiques (codantes ou non) dans lesquelles un polymorphisme est associé à une

modification quantitative d’un caractère de production (production de lait, taux butyreux …) sont appelées

Quantitative Trait Loci (QTL). De nombreux travaux chez les bovins ont permis, par exemple, d’identifier

50 178 QTL associés aux caractères laitiers (http://www.animalgenome.org). Des mutations causales ont

également été identifiées. Par exemple, chez les bovins, un polymorphisme au locus de DGAT1 (enzyme

de la synthèse des TG) a été identifié comme responsable de modifications de la matière grasse laitière :

Une mutation (K232A), qui entraîne la substitution d’un résidu lysine par un résidu alanine en position 232

de la chaîne peptidique de cette enzyme, est associée à une forte réduction de la production de matière

grasse, du taux butyreux et, dans une moindre mesure, du taux protéique chez les individus porteurs de

cette mutation (Grisart et al., 2002; Winter et al., 2002). Cette mutation conduit également à une

modification de la composition en AG et en minéraux du lait avec une diminution de l’AG C16:0, du calcium,

du phosphore et du zinc, et une augmentation des AG C18 insaturés et de l’acide linoléique conjugué (Schennink et al., 2007; Bovenhuis et al., 2016).

Si le polymorphisme peut affecter directement un caractère de production, certains d’entre eux

peuvent avoir pour conséquence une différence de réponse physiologique à une condition particulière,

telle qu’un déficit énergétique en début de lactation. Par exemple, en début de lactation, les Holstein vont

avoir une perte de la note d’état corporelle plus forte que des Montbéliarde ou des Normande (Dillon et

al., 2003), montrant une réponse physiologique plus forte en lien avec leurs caractéristiques de production

élevées.