EVALUATION DE LA PERFORMANCE DU TEST MPT64 POUR L’IDENTIFICATION RAPIDE DES MYCOBACTERIES TUBERCULEUSES AU BENIN.

RAPPORT DE STAGE

DE FIN DE FORMATION POUR L’OBTENTION DU DIPLOME DE LICENCE PROFESSIONNELLE EN GENIE DE BIOLOGIE HUMAINE

OPTION: Analyses Biomédicales

Thème:

Présenté et soutenu par Karamatou AREKPA

Date de soutenance: 12 Décembre 2017

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UNIVERSITE D’ABOMEY- CALAVI (UAC)

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Ecole Polytechnique d’Abomey (EPAC)

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Centre Autonome de Perfectionnement (CAP)

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Département de Génie de Biologie Humaine (GBH)

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EVALUATION DE LA PERFORMANCE DU TEST MPT64 POUR L’IDENTIFICATION RAPIDE DES MYCOBACTERIES

TUBERCULEUSES AU BENIN.

Sous la supervision de Maitre de conférence Agrég.é Dissou AFFOLABI

UAC/FSS Tutrice

Mme N’Dira SANOUSSI Ingénieur, Doctorante Sciences Bio-Médicales PNT/CNHU-PPC/LRM

REPUBLIQUE DU BENIN « « « « « « « «@ » » » » » »

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

« « « « « « « «@ » » » » » » » »

UNIVERSITE D’ABOMEY-CALAVI

RECTEUR : Professeur Brice SINSIN

« « « « « « « « @ » » » » » » » »

ECOLE POLYTECHNIQUE D’ABOMEY- CALAVI (EPAC)

CENTRE AUTONOME DE PERFECTIONNEMENT (CAP)

DIRECTEUR : Pr AWANTO Christophe

RESPONSABLE DIVISION : Dr DEGNON René

LISTE DES ENSEIGNANTS DE GENIE DE BIOLOGIE HUMAINE(GBH)

Option : Analyses biomédicales Années Académiques: 2016-2017

I- ENSEIGNANTS PERMANENTS

N° NOM ET PRENOMS MATIERES ENSEIGNEES

01 AGBANGNAN Pascal Méthodologie de la recherche

02 AHOYO Angèle Théodora Microbiologie Médicale et TP de microbiologie Médicale, Santé Publique et Hygiène Hospitalière

03 AKOWANOU Christian D. Physique

04 AKPOVI Casimir Biologie cellulaire, Physiologie cellulaire, Biochimie Métabolique des lipides et Ensymologie

05 ALAMOU Eric Biostatistique

06 ALITONOU Guy Chimie organique

07 ANAGO Eugénie Biochimie clinique

08 ATCHADE Pascal Parasitologie médicale appliquée-mycologie

09 BANKOLE Honoré Bactériologie médicale et TP de bactériologie médicale

10 DOUGNON Victorien Déontologie médicale et Méthodologie de la recherche 11 FAH Lauris Histologie générale, Biochimie métabolique des

glucides et Immuno – Hématologie

12 FANOU Brice Armand TP microbiologie médicale et Assurance Qualité en biologie médicale

N° NOM ET PRENOMS MATIERES ENSEIGNEES

13 HOUNSOSSOU Hubert Anatomie générale

14 KLOTOE Jean Robert Santé et Sécurité au Laboratoire, Equipements Biomédicaux, Cytologie sanguine et Hémostase

15 LOKO Frédéric Biochimie analytique

16 LOZES Evelyne Immunologie générale et Immunopathologie

17 SEGBO Julien Biochimie structurale, Biologie Moléculaire et Biologie Moléculaire Appliquée

18 SENOU Maximin Histologie Spéciale et Hémopathies

19 TCHOBO Fidèle Paul Chimie générale

20 YADOULETON Anges Entomologie médicale

21 YEHOUENOU Boniface Microbiologie générale

II- ENSEIGNANTS NON PERMANENTS

N° NOM ET PRENOMS MATIERES ENSEIGNEES

01 AGBANNON Tiburce Gestion des entreprises et Gestion Hospitalière

02 AGOSSOU Gilles Droit de Travail

03 DESSOUASSI Noël Biophysique des solutions

04 HOUNNON Hyppolite Mathématique

05 KOUNASSO Gabriel Informatique médicale

06 YOVO Kokou Paulin Toxicologie-Pharmacologie

DEDICACE

A Allah le Tout Miséricordieux, le Très Miséricordieux.

Pour ses bienfaits et sa lumière qu’il ne cesse de faire briller sur nous. Voici une fois encore que tu me combles de joie, mon cœur te bénit, mon âme t’exalte, mon esprit t’élève. Gloire à toi Allah.

A mon feu père Salami AREKPA,

Malgré ton départ de ce monde, tu es resté constamment présent dans mon cœur.

Je me suis toujours inspirée du grand rêve que tu avais sur tes enfants. Ce travail est le tien, repos éternel à ton âme.

A ma chère maman Marcelline SANT’ANNA, Tu as toujours accepté les souffrances et les humiliations de ce monde afin de garantir à tes filles un avenir meilleur. J’ai de la chance de t’avoir comme mère.

Merci pour ton courage, ton éducation et ton amour.

A mon cher CHABI Idriss Dama, mes enfants,

Vous avez consenti chacun à sa manière, d’énormes sacrifices divers, pour me soutenir dans cette aventure.

A mes frères et sœurs en particulier ma seconde Karimatou AREKPA,

Je vous dédie cette œuvre avec tout le respect et l’amour que je porte pour vous.

A tous mes amis qui m’ont aidé dans la réalisation de ce travail en occurrence Dieu - Donné MALENOU, Boris, Gérando et Kévin.

Pour votre soutien, que Dieu nous garde toujours unis dans son amour.

A tous les camarades de la première promotion d’ABM/CAP.

Bonne suite de carrière à vous.

A tous ceux qui de près ou de loin se sont intéressés à mes études.

REMERCIEMENTS

Au Directeur de CAP : Professeur AWANTO Christophe,

Malgré vos multiples occupations et vos lourdes responsabilités, vous avez tout mis en œuvre pour l’aboutissement correcte et rapide de notre travail. Veuillez croire à nos sentiments de gratitude et de reconnaissance.

Au Professeur ANAGONOU YEHOUENOU Séverin

Recevez mes sincères remerciements Au Professeur AFFOLABI Dissou

Vous nous avez honorés en acceptant de diriger ce travail jusqu’à sa fin malgré vos multiples occupations. Recevez ici notre profonde et sincère reconnaissance.

A notre tutrice, SANOUSSI N’Dira

Pour la réalisation de notre travail, vos observations, conseils et recommandations n’ont pas fait défaut malgré vos multiples occupations.

Nous vous témoignons ici notre profonde gratitude et vous prions d’accepter nos sincères remerciements.

Au Dr YEHOUENOU Carine Merci pour votre soutien Au Personnel du LRM

Pour votre franche participation et votre soutien. Infiniment merci.

A tous nos professeurs du CAP/EPAC, spécialement ceux du Département du Génie de la Biologie Humaine, en reconnaissance de l’enseignement qu’ils nous ont donné tout au long de notre formation.

HOMMAGES

Au Président de jury

En acceptant de présider notre jury de soutenance de rapport de stage de fin de premier cycle, vous nous faites un grand honneur. Excellence Monsieur le président de jury, par vos observations, nous espérons améliorer ce travail. Nous vous prions de croire en l’expression de nos profonds respects et de nos vives gratitudes.

Aux membres de jury

Nous sommes très heureux de vous avoir dans notre jury. Vos critiques sont indispensables à l’amélioration de ce travail.

Hommages respectueux à vous !

Liste des sigles et abréviations

ATB : Antibiogramme

BAAR : Bacille Acido -Alcoolo-Résistant

BK : Bacille de Kock

CAP : Centre Autonome de Perfectionnement CDT : Centrer de Dépistage et de Traitement

CNHU-PPC : Centre National Hospitalier Universitaire de Pneumo-Phtisiologie de Cotonou

EDS : Eau Distillée

EMB : Ethambutol

EPAC : Ecole Polytechnique d’Abomey Calavi INH

IC

: :

Isoniazide

Indice de Confiance LED : Light Emitting Diode

LJ : Löwenstein-Jensen

LPA : Line Probe Assay

LRM : Laboratoire de Référence des Mycobactéries µg

µL

: :

Micro-gramme Microlitre

MGIT : Manual Growth Indicator Tube

mL : Millilitre

MNT : Mycobacterium Non tuberculosis MT : Mycobacterium tuberculosis M. ulcerans : Mycobacterium ulcerans

OMS : Organisation Mondiale de la Santé

% : Pourcentage

PCR : Réaction en Chaîne par Polymérase PNB : Acide Para-Nitro-Benzoïque

PNT : Programme National contre la Tuberculose PSM : Poste de Sécurité Microbienne

RIF : Rifampicine

STR : Streptomycine

T TB TPM+

UAC

: : : :

Température Tuberculose

Tuberculose Pulmonaire à Microscopie Positive Université d’Abomey-Calavi

VIH : Virus de l’Immunodéficience Humaine

LISTE DES Figures

N° Figure Titre Page

1 Taxonomie des mycobactéries 4

2

Aspect des BAAR au microscope à lumière directe après

coloration de Ziehl-Neelsen (2A) 6

Aspect des BAAR au microscope à fluorescence après coloration par l’auramine. (2B)

3 Colonies de M. tuberculosis sur milieu L.J. 7

4 Aspect de M. tuberculosis sur milieu liquide 8

5 Système Genexpert Dx 09

6 Identification du complexe M.tuberculosis 11

7 Algorithme résumant la méthodologie d’étude. 18 8 Méthode de proportion pour une souche sensible au PNB et

résistante à la RIF, l’INH, la STR et l’EMB

22

9 Méthode de proportion pour une souche identifiée

M.tuberculosis (sensible au PNB et à tous les ATB«RIF, INH, STR et EMB).

22

10 Présentation de cassettes neuves et des tests négatifs et positifs du test SD BIOLINE MPT 64 M. tuberculosis

25

11 Répartition des échantillons par département 26

12 Répartition par tranche d’âge. 27

13 Répartition des échantillons par type de patients 28

14 Répartition des échantillons selon les résultats de culture 29

Liste des tableaux

N° Titre de tableau Page

I Echelle de lecture des tubes de culture 21

II Interprétation des résultats de catalase 23

III Répartition des souches (cultures positives) selon leur nature 29

IV Résultats du test MPT64 à J0. 30

V Apport de la reprise du test MPt64 à J14 : résultat du test MPT 64 à J14 sur les souches MPT64 négatives à J0

30

VI Répartition des souches (sensibles au PNB) selon leur sensibilité aux antituberculeux.

31

VII Résultat de catalase pour les souches (sensibles au PNB) résistants à au moins un ATB.

32

VIII Comparaison des résultats des deux examens : test SD Bioline MPT64 à J0 et le PNB/ catalase

33

IX Comparaison des résultats des deux examens : test SD Bioline MPT64 à J14 et le PNB/ catalase

33

Liste des ANNEXES

N° Titre de tableau Page

I Liste des réactifs, consommables et équipements XVII II Décontamination des expectorations par la méthode de pétroff XX III Préparation des milieux LJ avec antibiotiques XXVI

IV Préparation des inocula XXX

V Préparation tampon phosphate XXX

VI Préparation mélange tween 80à10% -peroxyde XXX

RESUME

L’objectif de la présente étude est de déterminer la performance du test rapide SD BIOLINE Ag MPT64 pour l’identification des mycobactéries tuberculeuses, indispensable pour le diagnostic/traitement de la TB et pour l’interprétation du test de sensibilité aux antituberculeux.

Pour atteindre cet objectif, des crachats à bacilloscopie positive ont été collectés chez 249 patients TB diagnostiqués dans 24 Centres de Diagnostic et de Traitement de la tuberculose (CDT) représentatif du territoire national. Une culture a été réalisée pour tous les crachats.

Pour les échantillons à culture positive, le test rapide d’identification MPT64 a été réalisé et comparé au test conventionnel d’identification (croissance en présence de l’acide para- nitrobenzoique (PNB) couplée à la recherche de catalase thermolabile).

Il ressort de cette étude que :

Le test SD BIOLINE MPT 64 a respectivement à J0 et J14, une sensibilité de 95,1% et 96,45% ; une spécificité de 50% et 50% ; une VPP de 98,5%

et 98,56% ; une VPN de 22,2% et 28,6%.

La performance du test est (non significativement) très légèrement améliorée lorsque les souches négatives sont reprises 14 jours après; mais la performance globale du test demeure faible pour le contexte du Bénin et les souches trouvées négatives doivent être confirmées par d’autres tests d’identification plus fiables.

La majorité (97.3%) des souches de mycobactéries isolées chez les patients avec crachats à bacilloscopie positive sont des MT (PNB/catalase);

Il y a suspicion de maladie à MNT chez 2,7% des patients TB au Bénin.

Mots clés : Mycobactéries tuberculeuses, PNB, test de sensibilité, catalase, SD BiolineAntigen MPT64, spécificité, sensibilité.

ABSTRACT

The aim of this study was to assess the performance of the rapid test SD BIOLINE Ag MPT64 for the identification of tuberculous mycobacteria, which is important for the diagnosis/treatment of TB and for the valid interpretation of drug susceptibility testing.

Smear-positive sputa were collected from 249 pulmonary TB patients diagnosed form 24 TB clinics representative of the nationwide population of TB patients. Culture was performed on each sputum. When culture was positive, the rapid identification MPT64 test and the conventional PNB/catalase (test of growth on PNB medium additionned with heat-labile catalase test) were performed. Resultsobtained, showedthat :

The test SD BIOLINE MPT64 has respectivelyat Day 0 and Day 14, a sensitivity of 95.1% and 96.5%; a specificity of 50% and 50%; a PPV of 98.5%

and 98.6%; a NPV of 22.2% and 22.6%.

The performance of the test was (not significantly) slightly improved when negative isolates were repeated 14 days after. But the overall performance of the test remained low for the context of Benin and isolates found negative with MPT64 test should be confirmed with other more reliable identification tests.

Most (97.3%) of mycobacteria strains isolated from smear-positive TB patients belonged to the M. tuberculosis complex (PNB/catalase);

There is a suggestion of non-tuberculous mycobacterial disease, among 2.7% of smear-positive TB patients in Benin.

Key words: tuberculous mycobacteria, PNB, drug susceptibility testing, catalase, SD Bioline Antigen MPT64, spécificity, sensitivity.

SOMMAIRE

INTRODUCTION ... 1

PARTIE I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE ... 3

I.1 La tuberculose : agent étiologique, formes cliniques, transmission, symptomatologie et épidémiologie ... 3

I.2 Les mycobactéries ... 4

I.3 Diagnostic bactériologique de la TB ... 8

PARTIE II : CADRE, MATERIEL ET METHODES ... 12

II.1 Cadre d’étude ... 12

II.2 Matériel d’étude ... 15

PARTIE III :RESULTATS ET COMMENTAIRES... 12

III.1 Résultats ... 26

III.2 Discussion ... 35

CONCLUSION ... 39

SUGGESTIONS ... 40

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ... 41

INTRODUCTION

La tuberculose (TB) est une maladie infectieuse, contagieuse qui reste un problème de santé publique dans les pays en développement comme le Bénin.

Dans le monde, chaque année, 8 millions de nouveaux cas sont déclarés entraînant 2 millions de décès. Au Bénin, plus de 4 000 cas de tuberculose- maladie toutes formes confondues sont déclarés chaque année avec une incidence de 39 cas à microscopie positive pour 100 000 habitants [1].

La TB est causée par une mycobactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis. Plusieurs techniques peuvent être utilisées pour le diagnostic bactériologie de la TB : les techniques phénotypiques comme la microscopie et la culture et les techniques génotypiques comme le GeneXpert. Le diagnostic par la microscopie et la culture se limite à une détection des mycobactéries, sans la possibilité de préciser si elles sont tuberculeuses ou non. Tandis que l’identification qui consiste à différencier les mycobactéries tuberculeuses (MT) des mycobactéries non tuberculeuses (MNT), est une étape nécessaire après une culture positive.

Plusieurs techniques peuvent être utilisées pour l’identification. Les techniques génotypiques d’identification bien que rapides, nécessitent des équipements et réactifs coûteux et un personnel spécialisé. La technique d’identification phénotypique de référence, relativement moins chère, est basée actuellement sur la détermination de la sensibilité de la souche de mycobactérie à l’acide paranitrobenzoique (PNB) plus ou moins couplée à la mise en évidence d’une catalase thermolabile [2]. Mais elle nécessite une longue durée d’incubation (jusqu’à 42 jours). En revanche, une autre technique phénotypique plus rapide, pouvant se réaliser en moins d’une heure, juste après la sortie de la souche de l’étuve a été récemment développée : le test immuno-

chromatographique MPT64 qui se base sur la détection de la protéine mpt64 uniquement secrétée par les mycobactéries tuberculeuses. Ce test ne nécessite aucun appareillage particulier. Sa performance a été évaluée par plusieurs auteurs, après culture sur milieu liquide MGIT (Mycobacterial Growth Indicator Tube) a montré des résultats satisfaisants. Mais ce test a rarement été évalué après culture sur milieu solide, notamment le milieu LJ couramment utilisé. Par ailleurs, en milieu liquide MGIT, la reprise du test sur des échantillons ayant des résultats préalablement négatifs, augmenterait la sensibilité du test [3].

C’est dans cette optique, que la présente étude se propose d’évaluer la performance du test MPT 64 pour l’identification rapide des mycobactéries tuberculeuses au Bénin isolées à partir des milieux LJ.

Objectif général

Evaluer la performance du test MPT64 pour l’identification rapide des mycobactéries tuberculeuses au Bénin.

Objectifs spécifiques

 Déterminer la sensibilité et la spécificité du test MPT64 pour l’identification des mycobactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis.

 Evaluer l’intérêt de la reprise du test MPT64, 14 jours après un résultat négatif.

 Etablir la prévalence des mycobactéries non tuberculeuses chez les patients à microscopie positive au Bénin

PARTIE I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

I.1. La tuberculose : agent étiologique, formes cliniques, transmission, symptomatologie et épidémiologie

Cent trente-cinq ans après la découverte du bacille responsable de TB par R.

Koch en 1882, elle reste une maladie préoccupante à l’échelle planétaire. La TB est due aux bactéries du complexe M. tuberculosis touchant le plus souvent les poumons (TB pulmonaire). Elle peut aussi toucher d’autres organes (TB extra- pulmonaire) :

La TB pulmonaire se transmet d’une personne à l’autre par voie aérienne. Quand une personne ayant une tuberculose pulmonaire tousse, éternue ou crache, elle projette des bacilles tuberculeux dans l’air. Il suffit d’en inhaler seulement quelques-uns pour s’infecter.

Environ un tiers de la population mondiale est infectée par le bacille tuberculeux mais ils ne sont pas (encore) malades et ne peuvent pas transmettre la maladie. Sur toute la durée de leur vie, les sujets infectés ont un risque de 10% de développer la maladie. En revanche, le risque est beaucoup plus élevé pour ceux qui ont un système immunitaire déficient, comme les personnes vivant avec le VIH, en état de malnutrition ou ayant le diabète. Lorsqu’une tuberculose évolutive apparaît, les symptômes (toux, fièvre, sueurs nocturnes ou perte de poids) peuvent rester bénins pendant de nombreux mois, ce qui peut entraîner un retard à la consultation et favoriser la transmission du bacille dans la communauté.

La tuberculose touche surtout les adultes pendant les années où ils sont le plus productifs, mais le risque existe pour toutes les tranches d’âges.

On recense plus de 95% des cas et des décès dans les pays en développement. Les sujets infectés ayant aussi le VIH ont 20 à 30 fois plus de risque de développer une tuberculose évolutive

I.2. Les mycobactéries

I.2.1 Le genre mycobacterium : taxonomie et classification

Le genre Mycobacterium est le seul genre de la famille des Mycobacteriaceae.

Cette famille fait partie du sous-ordre des Corynebacterineae dans l’ordre des Actinomycetales (figure 1). [4, 5].

Figure 1 : Taxonomie des mycobactéries

A ce jour, le genre Mycobacterium comprend plus de 100 espèces qui sont saprophytes, pathogènes ou opportunistes. L’acido-alcoolo-résistance, la présence d’acides mycoliques ayant 60 à 90 atomes de carbone et un

Bacteria

Actinobacteria

Actinomycetales

Mycobacteriaceae

Mycobacterium Domaine

Classe

Ordre

Famille

Genre

génome présentant un pourcentage en G + C de 62 à 70 % constituent les trois critères utilisés pour définir le genre Mycobacterium[6]. Les espèces mycobactériennes peuvent être classées:

- suivant qu’elles causent la tuberculose ou pas : les mycobactéries du complexe M. tuberculosis (responsable de la tuberculose) et les mycobactéries non tuberculeuses (responsable d’autres maladies mycobactériennes) encore appelées mycobactéries atypiques,

- Suivant le risque d’infection de l’homme: pathogènes et non pathogènes et saprophytes.

- Suivant leur vitesse de croissance: mycobactéries à croissance rapide (culture positive en moins de 7 jours sur milieu solide) ou lente (culture positive en plus de 7 jours sur milieu solide)

La classification la plus utilisée est celle qui subdivise les mycobactéries en mycobactéries tuberculeuses et mycobactéries non tuberculeuses (MNT). Les espèces de MNT sont ensuite classées selon la production ou non de pigment (couleur des colonies) en présence de la lumière (classification de Runyon) et on distingue: les MNT photochromogènes, scotochromogènes et non chromogènes (qui sont tous à croissance lente) et les MNT à croissance rapide [7, 8]. Les principales mycobactéries pathogènes strictes sont uniquement à croissance lente. On y trouve :

- les bactéries du complexe M. tuberculosis responsable de la tuberculose (M. bovis, M. tuberculosis, M. microti, M. africanum et M. canettii)

- M. leprae, agent étiologique de la lèpre

- M. ulcerans, pathogène émergent à l’origine de l’ulcère de Buruli représentant une cause importante de morbidité en Afrique de l’Ouest.

C’est la seule mycobactérie connue pour sécréter une toxine, la mycolactone, responsable de son pouvoir pathogène [9, 10, 11].

I.2.2 Caractéristiques microscopique et culturales des mycobactéries Les mycobactéries sont des bacilles légèrement incurvés ou droits, de 1 à 10 μm de long et de 0,2 à 0,6 μm de diamètre (figure 2). Elles ne possèdent pas de flagelle ni d’autre appendice de type pili ou fimbriae, et ne forment pas de spore.

Figure 2:Aspect des BAAR au microscope à lumière directe après coloration de Ziehl- Neelsen (tirée et adaptée de www. Bioltrop.fr/

spip.php ,TB org/ZehL-Neelsen- stain-02jpg)

Figure 2 : Aspect des BAAR au microscope à fluorescence après coloration par l’auramine. (tirée et adaptée de www. Fraensrl.com, Fraen corporation LED fluorescence)

Du point de vue physiologique, les mycobactéries sont aérobies ou

micro- aérophiles. La température optimale de croissance varie selon les espèces entre 30°C et 45°C.

A B

La culture s’effectue en aérobie sur milieu spécifique solide (Löwenstein-Jensen ou LJ, ou Middlebrook 7H11) ou milieu liquide (BACTEC MGIT 960, BacT/ALERT 3D ou Middlebrook 7H9).

Les mycobactéries synthétisent des catalases et produisent des acides gras à partir des sucres par la voie oxydative. Sur milieu solide, les différentes mycobactéries donnent des colonies de types différents :colonies lisses (S) ou rugueuses (R), eugoniques (colonies de grande taille) ou dysgoniques (petites colonies).

L’aspect des colonies est variable en fonction du milieu mais reste invariable pour un milieu donné (Figure 3).

Figure 3: Colonies de M. tuberculosis sur milieu LJ

En milieu liquide, les cellules de M. tuberculosis ont tendance à se ranger parallèlement pour constituer des «cordes » ou « serpentines ». Cette propriété

est associée à la présence d’un glycolipide toxique appelé "cord factor" [12]

(Figure 4)

Figure 4: Aspect de M. tuberculosis sur milieu liquide

I.3. Diagnostic bactériologique de la TB I.3.1 Microscopie

L’examen microscopique demeure encore la méthode la plus utilisée pour confirmer un cas de tuberculose dans les pays à faible revenu. Elle est simple, moins coûteuse, rapide et efficace. Elle présente l’avantage de pouvoir être réalisée aisément et ne nécessite que peu de matériel. Cependant, elle ne permet pas l’identification de l’espèce en cause.

I.3.2 PCR

Aujourd’hui, de nombreuses techniques moléculaires adaptées au diagnostic de la tuberculose sont utilisées, dont notamment l’amplification génique (PCR) permettant la détection de séquences nucléiques spécifiques.

La technique la plus utilisée actuellement est le GeneXpert qui est basé sur la PCR en temps réel. La figure 5 est l’appareil servant à réaliser le Genexpert

Figure 5 : Système GeneXpert Dx

I.3.3 Culture

La culture est la méthode de référence pour le diagnostic de la tuberculose. Elle peut détecter 100 bacilles/ml.

I.3.4 Identification

Plusieurs types d’identification existent selon le but visé. Il y la différentiation des MT des MNT, l’identification des espèces membres du

complexe M. tuberculosis et l’identification des espèces membres des MNT. Il existe les méthodes d’identification phénotypiques et génotypiques.

Les tests biochimiques (méthode phénotypique) se basent sur l'analyse de caractères structuraux et de propriétés biochimiques des bactéries.

Deux principaux tests biochimiques sont utilisés : l'étude de la sensibilité à l'acide para-nitrobenzoique (PNB) et la recherche d'une catalase thermolabile. L’étude de la sensibilité au PNB et la recherche de l’activité catalasique à 68°C permettent de différentier le groupe des MT du groupe des MNT (Figure 6)

Les méthodes immunochromatographiques (méthode phénotypique) dont le test MPT64 sont basées sur l’identification rapide du complexe M.tuberculosis. Il utilise des anticorps monoclonaux de souris spécifiques à des épitopes de la protéine mpt64, immobilisés d’une part dans le puits à échantillon et d’autre part sur la ligne-test (bande d’essai). L’anticorps monoclonal immobilisé dans le puits à échantillon est conjugué avec de l’or colloïdal; ce qui permet d’obtenir une bande colorée sur la ligne-test après une réaction de type ELISA avec la protéine mpt64 et l’AC immobilisé sur la ligne test. Une ligne-contrôle (contenant des anticorps anti-souris) est également présente sur la cassette et apparaîtra toujours si le test a été réalisé correctement.

Les méthodes moléculaires : elle se base sur une PCR spécifique suivi ou non d’hybridation sur sondes spécifiques (southern blot). Au nombre de ces méthodes, il y a la PCR de la séquence d’insertion IS6110 et les méthodes d’hybridation sur bandelette (Line Probe Assay) comme le Hain Genotype Mycobacterium CM/AS, et le séquençage…etc.

Figure 6 : Identification du complexe Mycobacterium tuberculosis (tirée et adaptée de [2])

I.3.5 Test de sensibilité aux médicaments

Le test de sensibilité aux antituberculeux est effectué à partir des souches de culture en milieu solide. Il permet de déterminer la sensibilité du bacille tuberculeux aux différents antibiotiques utilisés dans le traitement de base [13].La méthode des proportions décrite par Canetti [14] demeure la référence.

Il consiste en l’observation de la croissance mycobactérienne sur milieu de LJ (milieu à l’œuf) contenant différentes concentrations d’antibiotiques [15].

Malheureusement, cette technique est longue, étant donné la lenteur de croissance de M. tuberculosis. Les résultats sont obtenus quatre (4) semaines après l’identification de la bactérie. Ce délai peut être réduit de moitié par la réalisation de l’antibiogramme en milieu liquide du type MGIT.

Récemment, deux tests moléculaires permettent de détecter la résistance M.tuberculosis aux deux antibiotiques majeurs à savoir la rifampicine et l’isoniazide (le MTBDR plus de HAIN) et à la rifampicine seule (le Gene xpert).

PARTIE II : CADRE, MATERIEL ET METHODES

II.1 Cadre d’étude

L’étude s’est déroulée au Centre National Hospitalier Universitaire de Pneumo- phtisiologie de Cotonou (CNHU-PPC). Le CNHU-PPC est le centre national de référence en matière de prise en charge des maladies respiratoires dont la TB au Bénin. Il est le plus grand centre de traitement et de diagnostic de la tuberculose (CDT) du Bénin. Le CNHU-PPC comprend les services suivants :

- un service administratif et financier ; - un service clinique ;

- un laboratoire polyvalent de biologie clinique qui est également le Laboratoire de Référence des mycobactéries (LRM) ;

- un service de radiologie.

Les patients ont été recrutés de 24 CDTs (les 4 plus grands CDTs de chacun des 6 anciens départements du Bénin). L’analyse biologique des échantillons collectés de ces 24 CDT a été réalisée au Laboratoire de Référence des Mycobactéries (LRM) de Cotonou qui est également le Laboratoire Polyvalent de Biologie Clinique du CNHU-PPC. Ce laboratoire organise le diagnostic, et le suivi bactériologique de la TB et de l’ulcère de Buruli au Bénin, ainsi que la supervision des laboratoires de CDTs sur toute l’étendue du territoire.

II.1.1 Laboratoire de Référence des Mycobactéries (LRM) Les locaux du LRM sont répartis comme suit :

 une salle de réception des crachats,

 une salle de stérilisation et de destruction,

 une salle de microscopie,

 une salle d’hématologie et de biochimie,

 deux salles pour culture (M. tuberculosis, M. ulcerans),

 une salle de coloration et de lecture des frottis,

 trois salles pour la biologie moléculaire (salle Pré-PCR, salle d’extraction, salle Post-PCR)

 une salle des techniciens

 deux salles de réunion

 des bureaux,

 deux magasins.

Les prestations du LRM sont assurées par une équipe de vingt quatre (24) personnes dont:

 trois (03) médecins biologistes,

 dix-sept (17) techniciens de laboratoire,

 une (01) secrétaire,

 trois (03) agents d’entretien.

II.1.2 Activités du LRM Le LRM mène plusieurs activités à savoir :

la réalisation des examens tels que :

 l’examen microscopique à la recherche des Bacilles Acido- Alcoolo-Résistants (BAAR) ;

 la culture et l’identification phénotypique et génotypique des mycobactéries ;

 le test de sensibilité phénotypique et génotypique de Mycobacteriumtuberculosis aux antibiotiques ;

 la caractérisation moléculaire de Mycobacterium tuberculosis par spoligotypage ;

 l’examen direct, la culture, l’antibiogramme et l’identification des germes usuels ;

 la numération des lymphocytes T CD4 et la quantification de la charge virale VIH pour la prise en charge des patients co-infectés par le VIH (TB/VIH) ;

 divers examens biochimiques, hématologiques et sérologiques.

 la supervision des activités des laboratoires des CDT sur toute l’étendue du territoire national ;

 la formation et/ ou le recyclage des techniciens de laboratoire du réseau de microscopie de la TB du Bénin ainsi que des pays de la sous-région ;

 la formation et l’encadrement des stages des techniciens de laboratoires et des étudiants en pharmacie et en médecine ;

 la conduite de travaux de recherche ;

II.2. Matériel d’étude II.2.1 Matériel biologique

Les expectorations (crachats) ont été utilisées dans cette étude.

II.2.2 Réactifs, consommables et équipements

Les réactifs, consommables et équipements utilisés sont listés en annexe 1.

II.3 Méthode d’étude II.3.1 Type d’étude

Il s’agissait d’une étude transversale prospective à visée analytique qui s’est déroulée d’Avril 2016 à Avril 2017.

II.3.2 Population d’étude

II.3.2.1 Critères d’inclusion

Ont été inclus dans l’étude :

- Tout nouveau cas de TB ou cas de retraitement (échec ; rechute, reprise) à bacilloscopie positive

- ayant au moins 15 ans

- ayant donné son consentement éclairé (si patient adulte : ≥18 ans) ou dont le représentant légal (si âge du patient situé entre 15 et18 ans) a donné le consentement éclairé

II.3.2.2 Critères de non inclusion

Ont été exclus de l’étude :

- tout patient souffrant d’une TB extra-pulmonaire uniquement ou - tout patient dont le traitement anti-TB a commencé.

II.3.2.3 Echantillonnage et taille de l’échantillon

Tous les cas de retraitement et les 4 nouveaux patients suivant un cas de retraitement, provenant des CDTs concernés ont été inclus dans l’étude. En utilisant la méthode de Mc Nemar pour échantillons appariés (calculateur en ligne :www.statstodo.com/SSizMcNemar_Pgm.php), la taille minimale requise pour l’échantillon était de 194 cultures positives pour détecter une différence entre le test MPT 64 et la méthode de référence si :

- le MPT64 donne plus de 4% de résultats faussement MTN et/ou plus d’un résultat faussement MT

- la précision et la puissance sont respectivement de 5% et 80%.

Au LRM, le taux de positivité de la culture étant de 80% [données du bilan 2016], le nombre minimal d’échantillons à inclure pour avoir les 194 cultures positives étaient de 243. Au total, 249 échantillons ont été inclus.

II.3.3 Méthode de traitement des échantillons

Les échantillons de patients TPM+ éligibles ont été collectés et acheminés des CDTs concernés au LRM à Cotonou. Au LRM, la culture a été réalisée dès la réception des échantillons. Si la culture était positive, les examens tels que le test d’identification MPT 64, le test de sensibilité au PNB sur LJ et la recherche de la catalase à température ambiante et à 68°C étaient réalisés.

La figure 7 montre l’algorithme résumant la méthode d’étude.

Au CDT

Au LRM

Figure 7: Algorithme résumant la méthodologie utilisée d’étude

Test MPT64

Négatif Résistant au PNB

MNT

Positif

Test MPT64 à J14

64

Expectoration BAAR +

Culture (environ 60jours)

Positiv e ^Négative

Test de sensibilité

Sensible au PNB

Sensible à tous les ATB

Résistant à au moins un ATB

Complexe M.

tuberculosis

Positive=MNT Négative=Complexe

M.tuberculosis

Test de catalase ^{à 68°C}

II.3.3.1 Culture

Les échantillons d'expectorations ont été décontaminés par la méthode de Pétroff (voir annexe 2). Après la décontamination, les échantillons ont été ensemencés sur 2 tubes de LJ simple et 1 tube de LJ enrichi au pyruvate (3 tubes LJ ont été utilisés pour chaque échantillon au total) , puis incubée à 37°C. La lecture des milieux ensemencés a été faite à J7 (jour 7), J14, J21, J28, J42, J56, J70 et J90 d’incubation. L’incubation a été arrêtée dès positivité des cultures.

II.3.3.2 Test d’identification utilisant le PNB (référence) et test de sensibilité aux antituberculeux

Pour chacun des échantillons, les antibiotiques tels que RIF, INH, STR, EMB et PNB ont été testés.

La sensibilité de chaque échantillon aux différents antibiotiques a été analysée aux concentrations critiques suivantes :

- rifampicine (RIF) 40 µg /ml - isoniazide (INH) 0,2 µg/ml - ethambutol (EMB) 2 µg/ml - streptomycine (STR) 4 µg/ml

- acide p-nitrobenzoïque (PNB) : 500µg/ml

Pour la préparation des milieux LJ avec antibiotiques, voir annexe 3.

II.3.3.2.1 Inoculation

Une suspension bacillaire a été d’abord préparée à partir des colonies.

Puis cette suspension a été diluée :

- Dilution 10^-1 de la suspension bacillaire initiale - Dilution 10^-3 de la suspension bacillaire, et - Dilution 10^-5 de la suspension bacillaire

Ces différentes suspensions ont été ensemencées sur les milieux LJ incorporés d’antibiotique et sur milieux sans antibiotique de la façon suivante :

- Pour chacune des dilutions 10^-1 et 10^-3, ensemencer 0,2 ml dans :

 un tube de LJ avec antibiotique (RIF ou INH ou STR ou EMB)

 Ensemencer le tube LJ-PNB avec la dilution 10^-3uniquement (0,1 ml) [2]

 deux tubes LJ sans antibiotique.

- Pour la dilution 10^-5, ensemencer 0,2 ml dans deux tubes LJ sans antibiotique.

- Pour chaque milieu ensemencé, répartir la suspension sur toute la pente du milieu.

Toutes les manipulations ont été faites dans un poste de sécurité microbiologique (PSM). (Voir préparation des inocula en annexe 4).

II.3.3.2.2 Incubation

Les milieux ensemencés ont ensuite été incubés en position inclinée de façon à couvrir toute la pente avec l’inoculum bacillaire à 37°C pendant 42 jours.

II.3.3.2.3 Lecture et interprétation des résultats

La lecture des milieux incubés se fait à J28 et J42. Pour ce faire, le nombre de colonies sur chaque tube est compté selon l’échelle suivante :

Tableau I : Echelle de lecture des tubes de culture

Nombre de colonies Résultats à reporter

0 Négative

Moins de 50 Mettre le nombre de colonies

50 à 100 1+

100 à 200 (colonies bien séparées) 2+

200 à 500 (colonies semi-confluentes) 3 +

L’interprétation des résultats obtenus après lecture a été faite de la manière suivante :

Pour le PNB

- S’il n’y a pas de colonies (pas de croissance) sur le tube 10^-3 avec PNB, la souche était interprétée comme sensible au PNB.

- S’il y a des colonies (croissance) sur le tube 10^-3 avec PNB, la souche est interprétée comme résistante au PNB.

Pour les antibiotiques (RIF, INH, STR, EMB)

- Si le nombre de colonies sur le tube 10^-3 avec antibiotique est supérieur ou égal au nombre de colonies sur les tubes témoins 10^-5, la souche est interprétée comme résistante à l’antibiotique. S’il lui est inférieur, alors cette souche est dite sensible. Lorsque sur l’un de ces 2 tubes, il y avait une contamination ou une absence de croissance insuffisante dans le tube 10^-5), considérer les tubes 10^-1 avec antibiotique et témoins 10^-3.

- Si le nombre de colonies sur le tube 10^-1 avec antibiotique est supérieur ou égal au nombre de colonies sur les tubes témoins 10^-3, la souche est alors résistante (figure 8) à l’antibiotique. S’il lui est inférieur, cette souche est sensible (figure 9).

Figure 8: Méthode de proportion pour une souche sensible au PNB et résistante à la RIF, l’INH, la SM et l’EMB.

La couleur de l’étiquette indique l’antibiotique contenue dans le milieu. Le rose représente le PNB, le blanc l’isoniazide, le bleu la streptomycine, le rouge la rifampicine et le vert l’ethambutol. Les 7 tubes à gauche ont été ensemencés avec la dilution 10^-1, les 7 au milieu avec la dilution 10^-3 et les 2 à droite avec la dilution 10^-5. Les 2 premiers pour chaque dilution représentent les tubes témoins sans ATB.

Figure 9: Méthode de proportion pour une souche identifiée M.tuberculosis (sensible au PNB et à tous les antibiotiques (RIF, INH, SM, EMB) : pas besoin

de tester la catalase-68°C).

II.3.3.2.4 Test d’identification à la catalase labile à la chaleur (68°C)

Le test de la catalase se fait également sous un PSM (hotte).

Réalisation

- Prendre deux tubes de culture à capuchon à vis et les étiqueter (l’un avec température ambiante et l’autre avec 68°C)

- Prélever quelques colonies (au moins une anse pleine) et les mettre en suspension dans 0,5ml de tampon phosphate 0,067M ; pH 7,0 (voir préparation en annexe 5) dans chacun des tubes à capuchon à vis

- Incuber les tubes soit à température ambiante soit au bain-marie à 68°C, selon le cas.

- Après refroidissement à température ambiante du tube chauffé, ajouter 0,5ml d’un mélange Tween 80 - peroxyde fraîchement préparé (voir préparation en annexe 6) dans les deux tubes et laisser le couvercle dévissé. L’interprétation des résultats de catalase est faite de la manière suivante :

Tableau II : Interprétation des résultats de catalase Tube T.ambiante Tube 68°C Interprétation +

+

-

- +

-

MT MNT

Invalide ou souche non productible de catalase

II.3.3.2.5 Test d’identification SD Bioline TB Ag MPT 64

L’identification antigénique, pour les souches du complexe M. tuberculosis, au moyen du SD Bioline TB Ag MPT64, a été réalisée juste à la sortie de la souche de l’étuve et après 14 jours d’incubation supplémentaire si le test est négatif.

II.3.3.2.5.1 Réalisation Le test MPT64 se fait sous un PSM.

Les étapes de la réalisation du test Mpt64 sont les suivantes :

- Mettre 200µl de réactif d’extraction (fourni par le fabricant du kit MPT64) dans un microtube de 1,5 ou 2 ml

- En utilisant une anse en plastique stérile à usage unique, prélever 3 à 4 colonies du tube LJ

- Mettre les colonies en suspension dans les 200µL de réactif d’extraction - Retirer la cassette de son emballage et la placer à plat, sur une surface

sèche

- Etiqueter la cassette.

- Prélever puis mettre dans le puits échantillon, 100µl du mélange colonies- liquide d’extraction

- Au cours de la réaction, un flux pourpre visible migre à travers la fenêtre de résultat du test. Attendre 15 minutes avant de lire la réaction.

II.3.3.2.5.2 Lecture et interprétation

Lire les résultats au bout de 15 minutes (Figure 10). Des résultats hautement positifs peuvent apparaître plus vite.

- Quand le test est négatif, une ligne de contrôle rosâtre apparaît. Aucune autre ligne n’apparaît.

- Quand le test est positif une ligne de contrôle rosâtre apparaît et une ligne de test rosâtre apparaît en dessous de la ligne de contrôle.

- Quand le test est non valide, aucune ligne n’apparaît. Si aucune ligne de contrôle ne se forme, qu’une ligne de test apparaisse ou non, le test est non valide. Dans ce cas, refaire le test avec un nouveau mélange colonies- liquide d’extraction du même échantillon et une nouvelle cassette.

Figure 10: Présentation du test SD Bioline MPT64 (La cassette à gauche représente une cassette neuve, donc avant le test. La cassette au milieu représente un exemple de test MPT64 négatif et celle à droite un exemple de test positif.)

II.4 SAISIE ET ANALYSE DES DONNEES

La saisie des résultats a été faite dans le logiciel Excel puis analysés à l’aide du logiciel Stata IC 12.

PARTIE III : RESULTATS ET COMMENTAIRES

III.1 Résultats

III.1.1 Caractéristiques socio-démographiques des patients III.1.1.1 Provenance (département) des échantillons

La figure 11 présente la répartition des échantillons par département. Plus de la moitié des échantillons (52,2%, 130) provenaient de l’Atlantique/ Littoral.

L’Ouémé/ Plateau venait en deuxième position avec 14,9% (37) des cas. Le Borgou/Alibori présentait la plus faible proportion de cas inclus avec 4,8% des cas

Figure 11 : Répartition des échantillons par département

III.1.1.2 Sexe

Les patients étaient majoritairement de sexe masculin. En effet, ils étaient 174 hommes (70%) contre 75 patients de sexe féminin (30%). La sex-ratio était donc de 2,3

III.1.1.3 Age

La tranche d’âge la plus touchée était celle de 25-34 ans avec près de 33,7% des patients (figure 12) et des extrêmes de 15 et 78ans.

Figure 12: Répartition par tranche d’âge

III.1.2 Type de patients

La figure 13 présente la répartition par type de patients TB.

Les nouveaux cas étaient majoritaires (78%, 194) suivis des rechutes (15%, 38), des échecs (6%, 15) et une reprise (1%, 2)

Figure 13: Répartition des échantillons par type de patients TB

III.1.3 Résultat de la culture

La figure 14 présente la répartition des échantillons selon le résultat de la culture. La culture a été positive pour 200 échantillons (80,3%), négative pour 43 échantillons, et contaminée pour 6 échantillons (2,4%). Le tableau III présente la répartition des souches (cultures positives) selon leur nature. Parmi les 200 cultures positives (souches), 143 étaient eugoniques non contaminées.

Figure 14 : Répartition des échantillons selon les résultats de culture

Tableau III : Répartition des souches (cultures positives) selon leur nature

Nature des souches Effectif

Eugonique non contaminées 143

Eugonique partiellement contaminée 15

Dysgonique non contaminée 41

Dysgonique partiellement contaminée 01

Total 200

III.1.4 Test MPT64

Le test MPT64 a été réalisé sur 194 souches. Le tableau IV présente les résultats du test MPT64 à J0. Le test MPT64 a été positif pour 92.2% (179) des souches à J0.

Tableau IV: Résultats du test MPT64 à J0

MPT64 à J0 Effectif (n) %

Positive 179 92.2

Négative 15 7.7

Total 194 100

Le test MPT64 a été repris à J14 sur les 15 souches à MPT64 négative à J0. Le tableau V montre le résultat obtenu. Des 15 souches MPT64 négatives à J0, 4 sont devenues positives à J14.

Tableau V: Apport de la reprise du test MPT64 à J14 : Résultats du test MPT64 à J14 sur les souches MPT64 négatives à J0

MPT64 à J14

Groupe de souches avec MPT 64

disponible, n(%)

Groupe de souches avec MPT 64 et PNB disponibles, n (%)

Positive 4 2

Négative 11 (5,7%) 7 (4,9%)

Total négative à J0 15 (7.7%) 9 (6.3%)

Positive à J0 179 134

TOTAL 194 143

p (J0=J14, Mc Nemar exact) 0,125 0,5

III.1.5 Test d’identification par le PNB couplé à la recherche de la catalase 68°C

III.1.5.1 Test de sensibilité au PNB et aux antituberculeux Les résultats des tests de sensibilité ont montré que 139 des 143 souches étaient sensibles au PNB. Au total, 24 de ces 139 souches sensibles au PNB, sont en revanche résistants à au moins un antituberculeux (tableau VI).

Tableau VI: Répartition des souches (sensibles au PNB) selon leur sensibilité aux antituberculeux

ATB Effectif

Sensible à tous les ATB

Tous 115

Résistant à au moins 1 ATB

RMP seul 02

INH seul 00

STR seul 15

EMB seul 03

RMP et INH 00

STR et EMB 01

STR et RMP 01

STR et INH 01

INH et EMB 01 Total Résistant 24

Total 139

ATB : antituberculeux RMP : rifampicine INH : isoniazide STR : streptomycine

III.1.5.2 Test de la catalase 68°C

La stabilité de la catalase à 68° a été testée sur les 24 souches résistantes à au moins un ATB. Les résultats sont présentés dans le tableau VII

Tableau VII: Résultats de catalase pour les souches (sensibles au PNB) résistants à au moins un ATB

Catalase 68°C Effectif Fréquence(%) Total

Négative: labile(MT) 24 100 24

Positive: stable (MNT) 00 00 00

Ce tableau montre que toutes les 24 souches (100%) sont catalase négative à 68°C (donc thermolabile).

Au total, le test d’identification au PNB couplé à la catalase a détecté 139 sur les 143 souches, comme étant des MT.

III.1.6 Comparaison des résultats du test d’identification MPT64 et du ‘’PNB couplé à la catalase 68°C’’ (test de référence) La comparaison des résultats du test MPT64 et du PNB couplé à la catalase 68°C (PNB/Catalase) pour les 143 souches testées est présentée d’une part dans le tableau VIII pour le cas où le test MPT64 est réalisé seulement à J0 et d’autre part dans le tableau IX pour le cas où le test MPT64 est répété à J14 pour les souches négatives à J0.

Tableau VIII: Comparaison des résultats des deux examens : tests SD BIOLINE MPT64 à J0 et le PNB/catalase

MPT64 à J0

PNB/catalase (test de référence)

Total

MT MNT

MT 132 2 134

MNT 7 2 9

Total 139 4 143

Sensibilité: 95% (95% IC: 89,9% - 98%) Spécificité : 50% (95% IC: 6,8% - 93,2%)

Valeur Prédictive Positive (VPP): 98,5% (95% IC: 94,7% - 99,8%) Valeur Prédictive Négative (VPN): 22,2% (95% IC: 2,8% - 60%)

Ce tableau montre que 134 (93.7%) des 143 souches ont des résultats concordants pour les 2 tests (132 MT, 2 MT).Cependant, il y a 9 (6.3%) souches dont les résultats sont discordants pour les 2 tests (2 cas sont MNT au test PNB/catalase et MT au test rapide, 7 cas sont MT au PNB/catalase et MNT au test rapide.

Tableau IX: Comparaison des résultats des deux examens : tests SD BIOLINE MPT64 à J14 et le PNB/catalase

MPT64 à J14

PNB/catalase (test de référence)

MT MNT Total

MT 134 2 136

MNT 5 2 07

Total 139 4 143

Sensibilité : 96,4% (95% IC:91,8% - 98,8) Spécificité : 50% (95% IC:6,8% - 93,2%) VPP: 98,5% (95% IC:94,8% - 99,8%) VPN: 28,6% (95% IC:3,8% - 71%)

Ce tableau montre que 136 (95.1%) des 143 souches ont des résultats concordants pour les 2 tests (134 MT, 2 MT).Cependant, il y a 7 (4.9%) souches dont les résultats sont discordants pour les 2 tests (2 cas sont MNT au test PNB/catalase et MT au test rapide, 5 cas sont MT au PNB/catalase et MNT au test rapide.

III.2. Commentaires

L’objectif général de ce travail était de déterminer la performance du test rapide SD BIOLINE Ag MPT64 pour l’identification des mycobactéries tuberculeuses des mycobactéries non tuberculeuses, indispensable pour l’interprétation du test de sensibilité aux antituberculeux et le diagnostic/traitement de certains suspects de TB.

III.2.1 Caractéristiques socio-démographiques de la population d’étude

Les données montrent pour cette étude que l’échantillon est constitué en majorité d’hommes (70%) contre 30% de femmes avec une sex-ratio homme/

femme de 2,3. Cette répartition confirme la prédominance masculine parmi les cas de tuberculose au plan national : 1,9, 1,9 et 1.8 respectivement en 2012, 2013 et 2014 qui sont de (rapport PNT 2012, 2013 et 2014).

La tranche d’âge de 25-34 ans quel que soit le sexe, enregistre la plus forte proportion de TPM+ (33,7%) suivie de la tranche 35-44ans (19,3%) et des tranches 15-24 ans (17,3%) et 45-54 ans (15,7%). Les plus faibles proportions sont enregistrées chez les plus de 65ans (5,6%). Ces proportions de TPM+ par tranche d’âge sont comparables à celles rapportées par le PNT, également sur le plan national, en 2012, 2013 et 2014 : 30% pour la tranche 25-34ans. La population d’étude peut donc être considérée comme représentative de la population des patients TB sur le plan national.

III.2.2 Résultats de la culture

Dans la présente étude, la culture a été positive pour 200 échantillons (80,3%) Ce résultat est largement supérieur à celui obtenu dans des années antérieures au Bénin qui sont respectivement de 62,8% et 57,5% [16].

Cette différence observée dans cette étude pourrait s’expliquer par le fait qu’en plus les cas de retraitement, les nouveaux cas également ont été inclus dans cette étude tandis que les études citées plus haut ont pris en compte que les cas de retraitement. De plus, l’organisation du transport des échantillons s’est améliorée au cours de la présente étude. En revanche, le taux de contamination de la culture (2,4%) dans cette étude est comparable à ceux trouvés dans les deux études précédentes (respectivement 2.4% et 2,3%,).

III.2.3 Comparaison du test SD BIOLINE MPT 64 au PNB/catalase

Dans cette étude, la spécificité de SD BIOLINE Ag MPT64 à J0 est faible (50%) tandis que la sensibilité est élevée (95%) pour l’identification de MT des MNT. Cette sensibilité est comparable à celle obtenue en Chine par Xiamao et al et par Cissé et al au Mali qui sont respectivement 97% et 99% [3,17].

Cependant, cette spécificité (50%) est inférieure à celle obtenue en Chine (98%), et au Mali (100%) [3, 18]. La VPP (98,5%) trouvée dans la présente étude, est supérieure aux 83.3% trouvé en Chine par Xiamao et al ; tandis que la VPN (22,2%) est inférieure aux 52,6% trouvé par le même auteur[18].

Par ailleurs, il y a un très léger apport (non statistiquement significatif) par rapport à la répétition du test MPT64 14 jours après. La sensibilité est passée de 95% à 96,4%, la VPN de 22,2% à 28,6% tandis que la spécificité et la VPP sont restées inchangées. Les faibles spécificités et VPN observées dans la présente étude pourrait s’expliquer par la présence de mutations dans le gène mpt64, ou à une différence dans la répartition des sous-types de souches tuberculeuses dans les divers pays, étant donné que certains sous-types expriment faiblement la protéine mpt64et qu’un sous-type prédominant au Bénin aurait des mutations dans le gène mpt64. Une étude de la performance du test sur les différents

sous-types des MT pourrait permettre de mieux comprendre cette variabilité de la performance globale du test d’un pays/contexte/milieu à un autre.

Les valeurs obtenues pour la sensibilité, spécificité, VPP et VPN, montrent qu’au Bénin, le résultat du test peut être considéré seulement lorsqu’il est positif.

Il y a une proportion de MT parmi les souches négatives au test ; d’où une nécessité de confirmer les souches négatives au MPT64 par une autre technique d’identification plus fiable telles que le PNB/catalase ou les techniques génotypiques d’identification (GeneXpert,GenotypeHainCM/AS). Les techniques génotypiques, lorsqu’elles sont disponibles ont l’avantage d’être rapide (quelques à 2 jours) comparées à la technique phénotypique PNB/catalase (28 à 42 jours). Les laboratoires (non centraux) ne réalisant pas le PNB/catalase ou les techniques génotypiques mais où la culture est disponible, donc où le test MPT64 peut être mise en place, peuvent envoyer les souches dont le test MPT 64 est négatif aux laboratoires pouvant réaliser ces tests de confirmation.

Ce test est d’une grande utilité pour le diagnostic rapide de la TB (pulmonaire ou extra pulmonaire) chez les patients avec des échantillons à microscopie négative (GeneXpert non disponible), ou à GeneXpert direct négatif (lorsque disponible) surtout dans les cas de suspicion de tuberculose extra pulmonaire.

Les résultats seraient plus rapidement obtenus si on ajoutait systématiquement en plus de la culture sur milieu LJ, une culture en milieu liquide connue pour sa plus grande rapidité par rapport au LJ, mais plus susceptible d’être contaminée.

En se basant sur les résultats de la PNB/catalase, la technique de référence, une MNT a été détectée chez 2.7% (4/146) des patients à culture positive dans la présente étude. Bien que cela ne signe pas une infection à MNT (car nécessité d’isoler la même MNT à plusieurs reprise chez le même patient), cela pourrait être une suspicion d’infection à MNT ou d’une contamination exogène de l’échantillon par un MNT (de l’environnement) qui a poussé sur le

milieu empêchant les MT de pousser. Une étude plus approfondie devrait être réalisée en répétant l’isolation des mycobactéries chez les patients suspects d’infection à MNT, pour mieux apprécier la place des MNT dans les affections respiratoires au Bénin.

Conclusion

Au terme de cette étude il ressort les conclusions suivantes :

Le test SD BIOLINE MPT 64 a respectivement à J0 et J14, une sensibilité de 95% et 96,4% ; une spécificité de 50% et 50% ; une VPP de 98,5% et 98.5% ; une VPN de 22,2% et 28,6%.

Il y a suspicion de maladie à MNT chez 2,7% des patients TB au Bénin.

SUGGESTIONS

A l’endroit du Ministère de la santé

Soutenir financièrement le PNT dans ses activités, surtout pour la sensibilisation sur la tuberculose et la mise en place d’autres outils diagnostic.

Donner au PNT des moyens pour la prise en charge des MNT.

A l’endroit du LRM

Réaliser systématiquement le test MPT64 sur toute culture positive, et répéter après 14 jours si MPT64 négative.

Utiliser les méthodes génotypiques (rapides) comme test de confirmation des souches MPT64 négatives du LRM et des CDTs qui font le test

Réaliser une étude basée sur des tests génotypiques sur les cas de discordances entre les différents tests

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