Effet des extraits de plantes médicinales sur la dissolution des calculs rénaux de cystine in vitro : étude à l’échelle mésoscopique 夽

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ARTICLE ORIGINAL

Effet des extraits de plantes médicinales sur la dissolution des calculs rénaux de cystine in vitro : étude à l’échelle mésoscopique ^夽

Effect of plant extracts on the in vitro dissolution of cystine stones: A study at the mesoscopic scale

B. Hannache

^a^,^b

, D. Bazin

^a

, A. Boutefnouchet

^c

, M. Daudon

^d^,∗

aLaboratoiredephysiquedessolides,universitéParis-XI,bâtiment510,91405Orsay,France

bFacultédessciencesdelanatureetdevie,universitédeConstantine-1,25017Constantine, Algérie

cLaboratoiredebiophysique,facultédemédecine,23009Annaba,Algérie

dServicedesexplorationsfonctionnelles,hôpitalTenon,AP—HP,4,ruedelaChine,75970 Pariscedex20,France

Rec¸ule19mai2012;acceptéle2juin2012

MOTSCLÉS Cystine;

Plantesmédicinales; Calculs;

Dissolutioninvitro; Arenariaammophila

Résumé

Objectifs.—Évaluerl’efﬁcacitésurladissolutiondescalculsdecystinedeplantesutiliséesen médecinetraditionnellecontrelalithiase.

Matérieletméthodes.—Descalculsdecystinepureontétéincubésinvitrodansquatreextraits deplantesutiliséesenmédecinetraditionnelleetdansunesolutiontémoindesérumphysiolo- giquependanthuitsemainessousagitationmagnétique.LesplantesétudiéesétaientArenaria ammophila,(feuillesettiges),Parietariaofficinalis(feuillesetfleursséparément),Paronychia argentea(fleurs).Chaqueexpérienceaétéeffectuéeentriplicata.Lapertedemassedescal- culsetlepHdessolutionsontétédéterminéspériodiquement.Lesmodificationséventuellesde lasurfacedescalculsontétéévaluéesàl’échellemésoscopiqueparmicroscopieélectronique àbalayage.

Résultats.—Aucundesextraits testésn’a eud’effet tangible pourdissoudreles calculsde cystine.LeseulquiasembléavoiruneffetsolvantnonliéaupHétaitl’extraitd’A.ammophila avecunepertemoyenne demassede 99mgàlaﬁn del’expérienceversus 43,7mgpourla solutiondeNaCl(p=0,051).

夽 Niveaudepreuve:5.

∗Auteurcorrespondant.

Adressee-mail:michel.daudont@tnn.aphp.fr(M.Daudon).

http://dx.doi.org/10.1016/j.purol.2012.06.001

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Conclusion.—Nosexpériencesn’ontpaspermisdemettreenévidence,surunepériodedehuit semaines,uneefﬁcacitésigniﬁcativedesextraitstestéspourdissoudrelescalculsdecystine.

Toutefois,l’examendescourbesdedissolutionsuggèrequ’une expositionpluslongueàcer- tainsextraits,notammentA.ammophila,pourraitserévélerefficace.Denouvellesexpériences sontnécessairespourconfirmercettehypothèse.Cependant,ilparaîtdifficileaujourd’huide recommandercesplantespourdissoudredescalculsdecystineinsitu.

KEYWORDS Cystine;

Medicinalplants;

Urinarycalculi;

Invitrodissolution;

Arenariaammophila

Summary

Aim.—Assessingtheefﬁcacytodissolvecystinestonesinvitroofplantextractsusedintradi- tionalmedicinetotreatorpreventurolithiasis.

Materialandmethod.—Purecystinestones wereincubatedduring8weeksundermagnetic stirringinthepresenceoffourplantextractsorofNaCl9g/lsolutionusedascontrol.Plants underexaminationwereArenariaammophila(leavesandstems),Parietariaofficinalis(leaves andflowersstudiedseparately),Paronychiaargentea(flowers).Eachexperimentwasperformed intriplicate.ThemasslossofthestonesandthepHofthesolutionweremeasuredaftereach twoweeksperiod.Possiblechangesinthecystinecrystalsatthestonesurfacewereassessed atthemesoscopicscaleusingascanningelectronmicroscope.

Results.—Noneoftheplantextractshasrevealedasigniﬁcanteffecttodissolvecystinestones bycomparisontothecontrolduringthetimeoftheexperiment.Thebestresultwasamassloss of99mgattheendofexperimentinthepresenceofA.ammophilavs.43.7mgfortheNaCl solution(P=0.051).Consideringtheslopesofthedissolution,onlythatextractcouldhavean actualefﬁcacyonamoreprolongedperiod.

Conclusion.—Ourstudyfailedtodemonstrateasigniﬁcanteffectofthetestedplantextractsto dissolvecystinestonesinvitro.However,theexaminationofthedissolutioncurvessuggeststhat amoreprolongedtestperiodcouldallowanefﬁcacyofsomeextracts,especiallyA.ammophila.

Furtherstudiesareneededtoverifysuchhypothesis.However,wecannotrecommendtheuse ofthetestedplantstotreatcystinestonesinvivo.

Lalithiase urinaire affecte6à15% dela population dans lespaysindustrialisés,selon la régiongéographique. Pour latraiter oulaprévenir,denombreusespopulationsàtra- verslemondeontrecours auxplantesmédicinales, cequi constitue une pratique très ancienne [1,2]. La médecine traditionnelle, principalement basée sur les plantes, est miseenœuvreparpresque80%delapopulationmondiale [3]quiutilise desplantes ouleursextraits contre detrès nombreusespathologies[4—6]ycompriscontrelescalculs [1].

Les données épidémiologiques montrent que plus de 80% des calculs sont composés principalement d’oxalate de calcium (CaOx) et associés dans la plupart des cas à desdésordresnutritionnels[7].Decefait,l’utilisationdes extraits deplantes, essentiellementdirigées contre cette lithiaseoxalocalcique,afaitl’objetdediversespublications [8—10].Enrevanche,trèspeudetravauxsesontintéressés àdeslithiasesplusrares,posantsouventplusdeproblèmes depriseencharge,tellesquelalithiasecystinique[11].

Dans ce travail, nous avons choisi d’étudier l’effet d’extraits de plantes sur les calculs rénaux de cystine.

Cescalculs, quirésultent d’une tubulopathie héréditaire, la cystinurie lysinurie [12], sont particulièrement récidi- vantsetnécessitentdemultiplesinterventionsurologiques.

Différents traitements sont utilisés pour lutter contre la formationdecescalculs[12,13]:curedediurèse,alcalini- sationdesurines,médicamentsporteursd’ungroupe thiol capablesdeformerdescomplexesaveclacystine[14,15].

Cependant,unteltraitementmédicalestsouventmaltoléré avecuntauxélevéd’effetssecondaires.Encequiconcerne lesplantesmédicinalesproposéescontrelescalculsdecys- tine,uneseuleétude,publiéerécemmentdanscetterevue, a montré in vitro que les extraits de Zea mays, Ammi visnaga, Herniaria hirsuta et Opuntia ﬁcus-indica étaient capables de dissoudre les calculs de cystine en quelques semaines[11].

Le but de cette étude a été d’évaluer les effets sol- vantsd’autresplantes incluantArenariaammophila(tiges etfeuilles),lesfeuillesdeParietariaofficinalis,lesfleursde P.officinalis,etlesfleursdeParonychiaArgenteadéjàuti- liséesenmédecinetraditionnellecontrelalithiaserénale.

Pourcefaire,nousavonssuiviexvivolavariationdemasse des calculs etlesmodiﬁcations structurales éventuelles à l’échellemésoscopiqueparobservationdescalculsàl’aide d’unmicroscopeélectroniqueàbalayage(MEB)aucoursde lamêmepérioded’incubationquecelleutiliséedansl’étude précédente,soithuitsemaines[11]. Nousavonscomplété cesobservationspardesmesuresdupHdelasolutionaﬁn de discuter l’effet de ce paramètre sur une dissolution éventuelle.

Matériel et méthode

Quinze calculs rénaux de cystine pure provenant de la clinique rénale de Daksi-Constantine (Algérie) ont été

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Figure1. a:fiolecontenantlecalculinsérédansunsachetimmergé;b:évolutiondelamassedescalculsdecystine(cerclesbleuspour Arenaria(fleursettiges),trianglesvertspourParonychia(flowers),carrésrougespourParietaria(feuilles),trianglesnoirspourParietaria (fleurs),cerclesblancspourlasolutionaqueusedeNaCl9g/L;c:pertedemassedescalculsdecystine(légendesidentiquesàcellesdela Fig.1b);d:évolutiondupHdurantl’expérience(légendesidentiquesàcellesdelaFig.1b).)

sélectionnésparexamenenmicroscopiebinoculaireetaprès analyse par spectrophotométrie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR). Leur taille était de 7±1mm et leur masse de 472±52mg. Les spectres ont été enregistrés sur un spectromètre FTIR Bruker IFS25 (Bruker Spectros- pin, Wissembourg, France) entre 4000et 400cm⁻¹avec une résolution de 4cm⁻¹comme décrit précédemment [16].

Unextraitdechaqueplanteaétépréparéparinfusion, pendant30minutes,de3gdeplantesèchedans100mLde solutionphysiologiquebouillante(9gdeNaClparlitre),la solutiondeNaClde9g/Létantutiliséeparailleurscomme milieu témoin pour apprécier les modiﬁcations de masse et/oudestructuredescalculs.Après ﬁltration,l’extraita étéréparti(60mL)dansdeserlenmeyersenverre(Fig.1a).

Lecalculaétéplacédansunsachetporeuxenﬁbrestressées aﬁnd’évitertoutcontactaveclebarreaumagnétiqueetmis ensuspension dans l’extrait. Ainsi, lescalculs rénaux ont étéisolésdetouteffetmécanique.Chaqueextraitaétémis sousuneagitationmagnétiqueconstantede130t/min.Pour chaqueexpérience,lepHdelasolutionaétémesurétousles 15joursàl’aided’unpH-mètreetlapertedemassedescal- culsrénauxévaluéeparpeséeducalculaprèsséchagedans

uneétuveà40^◦Cpendant18heures.Chaqueexpériencea étéréaliséeentriple.

Un MEB à effetde champZeiss SUPRA55-VPa été uti- lisépourlesobservationsdemicrostructure.Pourpréserver l’intégritédeséchantillons,lesmesuresontétéeffectuées àunvoltage bas(1,2KV)etsans aucundépôt decarbone préalablesurlasurfacedel’échantillon.

Letraitementstatistiquedesdonnéesaétéeffectuéavec lelogicielNCSS(NCSSstatisticalpackage,J.Hintz,Gaines- ville,FL).

Résultats

Lapertemoyennedemassedescalculspourl’ensembledes expériencesaétéde64±39mgauboutdehuitsemaines.

Les changements de masse des calculs de cystine pen- dantl’incubationavecchaqueextraitoulasolutiontémoin sontprésentéssurlaFig.1b.Lescinétiquesdedissolution semblentêtredifférentesselonl’extraitdeplante.Durant lesdeux premières semaines, la masse des calculs a peu varié. Entre deux et quatre semaines, le taux de disso- lutionest restéfaible eta commencéà augmenter entre

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Figure2. SurfacedescristauxvisualisésparMEB:a:avanttouttraitement;b:aprèstraitementparlasolutionaqueusedeNaCl9g/L; c:aprèstraitementparlasolutioncontenantArenariaammophila;d:aprèstraitementparlasolutioncontenantParonychiaargentea; e:aprèstraitementparlasolution contenantParietariaofficinalis(fleurs);f:aprèstraitementparlasolutioncontenantP.officinalis (feuilles).

quatreetsixsemaines,enparticulierpourArenariaammo- phila et les fleurs de P. officinalis. Les résultats se sont confirmésaprèshuitsemaines,cesdeuxextraitsdeplantes montrantuneffetsurladissolutiondescalculsplusmarqué quelesautres,expriméparunepertedemasseimportante parrapportauxautresextraits etsurtoutàla solutionde NaCl.Toutefois,cettepertedemasse(19,1%vs8,7%pour la solution témoin) n’a pas atteint le seuil de significati- vité(p=0,051)sur lapériode dehuitsemainesfixée pour l’expérience.

SurlaFig.1c,estrapportéelapertemoyennedemasse descalculsselonl’extrait.Onpeutconstaterquelapertede masseétaitde99mgàlafindel’expérience(huitsemaines) pour l’extrait d’Arenaria (p=0,051) et de 80mg pour les fleursdeP.officinalis(p=0,11)versus44mgpourlasolution deNaCl.

En ce qui concerne le pH du milieu (Fig. 1d), la valeur initiale variait de 5,8pour P. argentea à 8,8pour les feuilles de P. ofﬁcinalis (p<0,001). Nous avons observé une diminution initiale du pH pendant les quatre premières semaines de l’expérience pour tous les extraits de plantes ainsi que pour la solution témoin.

LesFig. 2a et b montrent lesimages MEB des cristal- litesdecystinerespectivementavantetaustadefinaldans le cas de la solution aqueuse de NaCl 9g/L comparées à celles des calculs de cystine en contact avec l’extrait d’Arenaria(Fig.2c).Bienquedesdifférencessemblentexis- teràl’échellemésoscopiqueentrelessurfacesdescalculs soumisàl’actiondesextraitsdeplantesparrapportàcelle observée avant traitement, il est difficile de les quanti- fier.Letraitementparaîtavoirdissoutenpartielespetits

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cristaux de cystine,ne laissant bien visibles que les plus gros d’entre eux, séparés par des espaces vides plus ou moinslarges.L’extraitdeP.ofﬁcinalis(Fig.2e)exerc¸aitun effet similaire à celui d’Arenaria, l’organisationdes cristaux apparaissant feuilletée en raison, d’une orientation différente (Fig. 2c). En revanche, l’extrait de Paronichia argenteasembleavoireupeud’effetssurlastructuredes calculs(Fig.2d).

Discussion

Lesplantes sélectionnées pour notre étude n’ont pas été choisiesaléatoirement.Ellessontutiliséesactuellementen Algérie pour le traitement médical des calculs rénaux ou pour prévenir leur formation. Bien qu’en Algérie comme danstouslesautrespays,l’oxalatedecalciumsoitlaforme cristallinelapluscourante,nousavonschoisilescalculsde cystineparceque cetypedecalculest souventplus difﬁ- cileàtraiter etàprévenir parlesprocéduresurologiques et médicales actuellement disponibles. De plus, il a été montrérécemmentquedes plantesutiliséesenmédecine traditionnelleauMaroccontrelescalculsengénéralétaient capablesdedissoudreefﬁcacement invitro lescalculs de cystine[11].

Nousavonsdoncétudiéinvitrol’effetdequatreextraits de plantessur la dissolution de calculs rénauxde cystine biencaractéristiquesetnousavonschoisileMEBàeffetde champpoursuivreleschangementséventuelsdanslamor- phologie descristallites permettant d’afﬁrmerl’existence d’interactions entrelesextraits de plantesetles calculs.

DenombreusesétudesbaséessurlesobservationsMEBdes calculs rénaux[17,18] ont largementdémontré que cette techniqueétaitbienadaptéeàcetteproblématique.Avec unmicroscopemodernecommeleFEI-Zeiss,ilestpossible d’observerlesdétailsdelasurfacedescristallitessansavoir à recouvrir l’échantillon avec une couche conductible de carbone,cequipermetderépéterlesobservationsaucours del’expériencesans modiﬁerlasurfacedes prélèvements paruntraitementquipourraitgênerl’actionultérieuredes extraitsdeplantetestés.

Nos résultats n’ont pas permis de voir une différence signiﬁcativeentrelesextraitsnientrelesextraitsetlasolu- tiontémoinencequiconcernelapertedemassedescalculs de cystine sur la période expérimentale choisie. Cepen- dant, l’examen de la Fig. 1c montre que la pente de la courbe de dissolution obtenue pour l’extrait d’A. ammo- phila s’accentuait fortement dans les dernières semaines parrapportauxcourbesobservéesaveclesautresextraits, suggérant que cette plante est probablement plus efﬁ- caceque lesautres pourdissoudre lescalculs decystine, mais demande sans doute plus de temps que les plantes testéesdans l’étudemarocaineprécédemment publiée.À l’échellemésoscopique,deschangementsàlasurfacedes calculs rénaux ont été observés dés le premier examen, c’est-à-direau bout de deuxsemaines d’expérimentation (donnéesnonmontrées),maisnesontdevenusperceptibles, entermesdepertedemassecristalline,qu’aprèsquatreà sixsemainesdecontactaveclesextraitsoulasolutionde contrôle.

Notreprotocoleexpérimentalétaitunpeudifférentde celuidécritpourl’étudedesplantesmarocainesencesens

quelescalculsontétéenfermésdansunsachetporeuxen fibrestresséespouréviterlecontactaveclebarreaumagné- tique.Ceprotocoleaétéchoisipouréviterunedissociation descristauxdecystineàlasurfacedescalculsparuneffet mécaniqueet non par le seul effet chimique de la solu- tiontestée. Cette différence pourrait être à l’origine de l’efficacitéretardéedesextraitsdeplantestestés.Pourle vérifier,unenouvelleexpérienceseraréalisée, comparant leseffets des plantestestées dans l’étudemarocaine,en particulierZeamaysetAmmivisnaga,etdecellesexami- néesdans leprésent travail,notammentA.ammophila et lesfleursdeP.officinalis.

En ce qui concerne le pH du milieu, la valeur initiale apparaîttrès différente selonlesextraits, comprise entre 5,8pour P. argentea et 8,8pour les feuilles de P. offici- nalis(p<0,001). Lavaleurélevée dupH suggère uneffet d’alcalinisationsurladissolutiondescalculsdecystinepour certains extraits. Cependant,si oncompare la courbe de pHobtenueaveclasolutionsalineàcelleobtenueavecles extraitsd’A.ammophilaoudes fleurs deP.officinalis, on constatequelescourbessonttrèsvoisines,suggérantque leseffetsdesextraits deplantesurlapertedemassedes calculsnesontpasliésaupHmaisàlacompositionchimique del’extraitdeplante.

Conclusion

L’effet de plusieurs plantes médicinales utilisées dans le traitement des calculs en médecine traditionnelle a été étudié in vitro à l’échelle mésoscopique par microscopie électroniqueàbalayage. Leschangementsdans lescarac- téristiquesultrastructurales descalculs rénaux de cystine aprèstraitementaveclesplantesmédicinalessuggèrentque ces plantes exercent uneffet sur les cristauxde cystine, maisl’évaluationdes résultats parla pertede masse des calculs comparativement à une solution de référence de NaCl9g/Ln’a paspermis demettreenévidenceuneffet solvantsignificatifdecesextraitsdeplantesurlapériode expérimentalechoisie.Auvudescourbesdepertedemasse descalculstestés, cemanquedesignificativités’explique probablement par une durée de contact insuffisante. De cefait,malgréleurutilisationenmédecine traditionnelle pourletraitementdelalithiase,onnepeutrecommander, dansl’étatactueldenosconnaissances,l’utilisationdeces plantespour letraitementoulapréventiondescalculsde cystine.Desessaiscomplémentairesserontnécessairespour objectiverunbénéfice scientifiquementdémontré decer- tainsdesextraitstestéssurlasolubilisationdetelscalculs.

Comptetenudesdélaisnécessairespourobserveruneffet bénéﬁque in vitro, il paraît difﬁcile de recommander ces planteschezlespatientscystinuriques pour dissoudredes calculsdecystineinsitu.Cependant,cesplantespourraient avoirunintérêt,quiresteàévaluer,pourlapréventiondes récidives.

Déclaration d’intérêts

Lesauteursdéclarentnepasavoirdeconﬂitsd’intérêtsen relationaveccetarticle.

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582 B.Hannacheetal.

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