Imagerie grand champ en anatomopathologie

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Imagerie grand champ en anatomopathologie

Sophie Morel

To cite this version:

Sophie Morel. Imagerie grand champ en anatomopathologie. Biophysique [physics.bio-ph]. Université Grenoble Alpes, 2016. Français. �NNT : 2016GREAY075�. �tel-01597951�

THÈSE

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Spécialité
:
Physique Arrêté
ministériel
:
25
mai
2016 Présentée
par

Sophie

_Morel

Thèse
dirigée
par
Antoine
Delon

préparée
au
sein
du

Laboratoire
Imagerie
et
Systèmes
d’Acquisition
-CEA-Leti et
de
l’Ecole
Doctorale
de
Physique

Imagerie

_{grand
champ
en}

anatomopathologie

Thèse
soutenue
publiquement
le
28
novembre
2016, devant
le
jury
composé
de
: Mr.
Eric
Lacot Professeur
des
Universités,
Président Université
Grenoble
Alpes Mr.
Olivier
Haeberlé Professeur
des
Universités,
Rapporteur Université
de
Haute
Alsace
Mulhouse Mr.
Serge
Monneret Directeur
de
Recherche,
Rapporteur Délégation
Provence
et
Corse
du
CNRS Mr.
Loïc
Denis Maître
de
conférence,
Examinateur Université
de
Saint-Etienne Mr.
Jacques
Derouard Professeur
Emérite,
Examinateur Université
Grenoble
Alpes Mr.
Cédric
Allier Ingénieur
de
recherche,
Co-Directeur
de
thèse CEA
Grenoble

Remerciements

Les travaux présentés dans ce manuscrit n’auraient jamais pu voir le jour sans l’aide et le soutien des personnes que j’ai côtoyées durant tout ou partie de ces trois ans de thèse, et que je souhaite remercier dans ces quelques lignes.

Je remercie Serge Monneret et Olivier Haeberlé d’avoir accepté d’être rapporteurs pour mes travaux de thèse. Merci à Loïc Denis et Jacques Dérouard d’avoir parti-cipé à mon jury de thèse ainsi qu’à Eric Lacot d’avoir accepté le rôle de président du jury. Je remercie particulièrement Loïc Denis et Olivier Haeberlé d’avoir parti-cipé à mon jury de mi-thèse. Leurs avis et conseils m’ont beaucoup aidée à orienter mes travaux de la dernière année.

Un énorme merci à Cédric Allier pour avoir encadré ma thèse et m’avoir initiée à la méthode scientifique par la démarche expérimentale. Je n’aurais pas pu souhaiter un meilleur encadrement, mélange parfait entre disponibilité et autonomie, tou-jours en m’encourageant à discuter et collaborer en-dehors du laboratoire. Merci également à Antoine Delon d’avoir dirigé ma thèse, et grâce à ta vue d’ensemble, d’avoir su soulever des questions pertinentes pour l’avancement de ces travaux. Cette thèse a été effectuée au laboratoire LISA du CEA Grenoble et je remercie Jean-Marc Dinten et Jean-Louis Amans, respectivement chef de laboratoire et chef de service, de m’avoir accueillie pendant ces trois années.

Les travaux présentés dans ce manuscrit sont le résultat d’un effort commun. Je remercie très chaleureusement la dreamteam de l’imagerie sans lentille pour leur aide, leurs conseils, leur soutien et leur bonne humeur. Je me suis toujours sentie intégrée à cette équipe, ce qui a été une grande source de motivation pendant ma thèse. Merci à Lionel pour ton aide dans le développement des algorithmes de reconstruction, et pour tes conseils littéraires. Merci à Thomas pour ton aide dans le montage de mes manips, pour tes vannes et de m’avoir initiée au biathlon laser-vtt. Merci à Olivier de m’avoir aidé à prendre en main la framboise et pour tes conseils astro. Merci à Pierre J. pour la relecture de mon manuscrit et pour les bons plans touristiques en Ecosse. Merci à Pierre B. pour la relecture de mon manuscrit et pour tes conseils et encouragements qui m’ont toujours redonné la pêche quand j’en avais besoin. Je garde un excellent souvenir de la semaine à SF ! Merci à Anthony d’avoir été ma caution maths. Prends bien soin de Cédric pour ta dernière année de thèse ! J’ai également une pensée pour les autres membres de l’équipe lensfree, avec qui j’ai moins interagi professionnellement, mais que je remercie pour leur bonne humeur, les diverses discussions et leur amitié : merci

Romaric, Camille, Estelle, Selimen. Merci également à Henri pour les coups de main pour monter mes manips. J’ai aussi une grosse pensée pour ceux qui sont partis du labo et qui m’ont beaucoup aidé au début de mon projet : merci Srikanth, Fabien, Jean-Guillaume.

J’ai eu la chance et le plaisir de collaborer avec des personnes en-dehors du labora-toire que je souhaite remercier pour leur disponibilité, leurs conseils et leur intérêt pour mes travaux. Un immense merci au Dr. Fromentin et au service d’anatomo-pathologie du CH Lens pour m’avoir si chaleureusement accueillie deux semaines au début de ma thèse et de m’avoir initiée à leur discipline. Merci également pour la préparation des échantillons, sans lesquels je n’aurais pas pu développer la méthode présentée dans ce manuscrit et obtenir des résultats expérimentaux. Je remercie les Prof. Fabrice Chrétien et Pierre Rocheteau de l’Institut Pasteur pour leur disponibilité, leurs avis sur nos résultats et les lames d’anapath. Je remer-cie également le Dr. Caroline Salon pour sa disponibilité et de m’avoir gentiment accueillie chez elle pour donner son avis sur mes images.

Je remercie chaleureusement Eric Thiébaut du CRAL à Lyon et Corinne Four-nier du Laboratoire Hubert Curien de Saint-Etienne pour leurs avis, conseils et encouragements sur nos méthodes de reconstruction holographique.

J’ai eu l’occasion de passer une semaine au laboratoire de microbiologie de l’hôpital de La Timone à Marseille. Je remercie l’équipe du POC de m’avoir accueillie, et en particulier un énorme merci à Mariama pour les manips et les images.

J’ai eu également le plaisir de collaborer avec Anna Senegas, rencontrée grâce à AITAP l’association des jeunes chercheurs du CEA Grenoble. Merci Anna de m’avoir préparé des échantillons et fait découvrir comment rendre des cerveaux de souris transparents.

Je n’oublie pas les autres membres du LISA, que je remercie pour leur soutien et leur bonne humeur. Grâce à vous j’ai pris plaisir pendant ces trois années à venir travailler au CEA. En particulier, merci à Véronique Duvocelle et Laurence Chas-souant pour l’organisation des missions et de ma fin de thèse, et merci Charlotte pour les croissants du vendredi et pour avoir organisé tous les cadeaux de thèse. Un gros merci au gang du H1 pour votre amitié. Damien pour m’avoir fait redécouvrir le jeu de la conquête du monde, Emeric pour nos discussions d’optique super in-téressantes, Romaric pour avoir éveillé ma conscience bio, Nils pour avoir accepté d’adopter mes plantes, et n’écoute pas trop Anthony, et Anthony, n’embête pas trop Camille car j’en ai besoin pour partir à l’aventure à vélo ! Et je n’oublie pas Justin le parisien, sinon il va râler. Merci Val pour ta tête de Buddy au-dessus de ma cloison, et pour le phoque-ing road trip au pays des cailloux. Et bien sûr, un merci tout spécial à mes co-cernettes Judy et Véro ! Je suis ravie d’avoir partagé ces 3 ans de thèse, de randos, de soirées, de bons moments à vos côtés.

Merci aux autres copains de Grenoble, sans qui ces trois années n’auraient pas eu la même saveur : les copains d’AITAP : Maxime, Bruno, Jacques, Pierre, Anna, Clément, Sophie. Merci à Maxime et David pour les virées astro et montagne, François et Violette chez qui on grozi bien, Faustine pour les confidences autour

d’un bon chocolat chaud. Merci à Florent pour me donner le sourire avec ton rire communicatif et tes blagues de si bon goût. Tu as trouvé en moi un public digne de ta grande maturité d’esprit. Je remercie également mes colocs de Grenoble pour leur soutien en fin de thèse, et ma nouvelle coloc d’Aix grâce à qui j’étais bien dans mes baskets pour la soutenance. Merci aux copains qui habitent un peu plus loin mais dont l’amitié est toujours présente : Mathieu, Thomas, Raphaël, Cécile, Xiao Yu. Merci à Guillaume pour tout ce chemin parcouru ensemble. Vive la rando ! Enfin, merci à mes parents et mes sœurs Pauline et Anne de m’avoir amenée jusqu’ici.

Table des matières

Abréviations v

1 Introduction 1

1.1 Présentation de la problématique scientifique . . . 1

1.2 Présentation du contexte : l’anatomocytopathologie . . . 2

1.3 Observation d’échantillons biologiques. . . 5

1.3.1 Imagerie d’échantillons marqués . . . 6

1.3.2 Imagerie d’échantillons non marqués . . . 7

1.3.3 Systèmes hybrides : co-conception optique et traitements d’images . . . 7

1.4 Présentation des travaux de thèse . . . 11

2 Imagerie sans lentille d’échantillons denses 13 2.1 Principes de l’imagerie sans lentille . . . 13

2.1.1 Introduction . . . 13

2.1.2 Formation de l’hologramme . . . 14

2.1.3 Reconstruction holographique . . . 16

Cas idéal : la phase au niveau du capteur est connue . 17 Cas réel : la phase au niveau du capteur n’est pas connue . . . 17

Cas des objets denses . . . 21

2.2 Reconstruction holographique d’objets denses . . . 23

2.2.1 Description de l’algorithme. . . 23

2.2.2 Convergence . . . 25

2.2.3 Interprétation de l’algorithme . . . 27

2.2.4 Résultats de simulations . . . 32

2.3 Discussion . . . 37

3 Mise en œuvre expérimentale 39 3.1 Acquisition des hologrammes . . . 39

3.1.1 Description du banc expérimental . . . 39

3.1.2 Chaîne d’acquisition . . . 43

3.1.3 Correction de l’inclinaison et balayage XY . . . 44

3.2 Performances globales . . . 46

3.2.1 Caractérisation avec des mires USAF . . . 46 i

ii

3.2.2 Imagerie cohérente et caractérisation avec une mire Siemens 50

3.2.3 Définition d’un critère de performance . . . 52

3.3 Influence des paramètres expérimentaux . . . 57

3.3.1 Capteur . . . 57

3.3.1.1 Taille de pixel . . . 57

3.3.1.2 Défauts et bruits dans l’acquisition d’image . . . . 59

3.3.1.3 Capteur couleur . . . 60

3.3.2 Source . . . 62

3.3.2.1 Cohérence temporelle . . . 63

3.3.2.2 Cohérence spatiale . . . 64

3.3.3 Distance objet - capteur . . . 67

3.3.4 Récapitulatif des paramètres physiques ayant une influence sur la résolution spatiale . . . 67

Système limité par la cohérence temporelle . . . 69

Système limité par la cohérence spatiale . . . 70

Système limité par la taille de pixel . . . 71

Bilan . . . 71

3.3.5 Modèle de propagation numérique . . . 71

Spectre angulaire de propagation (Rayleigh-Sommerfeld) 73 Diffraction de Fresnel . . . 73

Diffraction de Fraunhofer . . . 73

3.3.6 Choix des longueurs d’onde . . . 74

3.3.7 Nombre d’itérations. . . 78

3.4 Conclusion . . . 81

4 Imagerie des tissus colorés 83 4.1 Introduction . . . 83

4.2 Méthodes . . . 83

4.2.1 Préparation des échantillons . . . 83

4.2.2 Modalités d’imagerie . . . 84

4.3 Résultats. . . 85

4.3.1 Imagerie sans lentille d’échantillons denses absorbants . . . . 85

4.3.2 Imagerie sans lentille multi-échelle . . . 98

4.4 Conclusion . . . 114

5 Imagerie sans lentille de lames de tissus non colorés 115 5.1 Introduction . . . 115

5.2 Méthode . . . 116

5.2.1 Préparation des échantillons . . . 116

5.2.2 Tissu optiquement translucide . . . 116

5.2.3 Méthodes d’imagerie . . . 117

5.3 Résultats. . . 119

5.3.1 Imagerie sans lentille multi-échelle d’échantillons transparents119 5.3.2 Identification des images "lensfree" en aveugle . . . 121

iii

5.3.3 Limites de la méthode . . . 138

5.3.4 Traitement d’image . . . 141

5.4 Conclusion . . . 143

6 Application au diagnostic en milieu liquide 145 6.1 Suivi de culture bactérienne en milieu liquide. . . 145

6.1.1 Introduction . . . 145

Identification . . . 146

Antibiogramme . . . 147

6.1.2 Méthodes . . . 149

6.1.3 Résultats et discussions. . . 152

6.2 Diagnostic du Liquide Céphalo-Rachidien . . . 156

6.2.1 Introduction . . . 156

6.2.2 Première étude : numération des globules . . . 157

6.2.3 Deuxième étude : numération et distinction des GB et GR . 161 6.2.3.1 Instrumentation . . . 161

6.2.3.2 Analyse . . . 162

7 Imagerie sans lentille d’échantillons biologiques divers 167 7.1 Frottis sanguin . . . 167

7.2 Bactéries uniques . . . 169

7.3 Culture cellulaire . . . 170

A Propriétés de la fonction de propagation de Fresnel 179

B Effet d’une petite perturbation de phase sur σ 181

Abréviations

ADN Acide DésoxyriboNucléique

CCD Charge Coupled Device

CFU Colony Forming Unit

CMI Concentration Minimale Inhibitrice

CMOS Complementary Metal Oxide Semiconductor

CPU Central Processing Unit

EBV Epstein-Barr-Virus

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

GB Globule Blanc

GPU Graphics Processing Unit

GR Globule Rouge

HE Hematoxyline-Eosine

HES Hematoxyline-Eosine-Safran

LED Light Emitting Diode

LCR Liquide Céphalo-Rachidien

MALDI-TOF Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation-Time Of Flight

OCT Optical Cohérence Tomography

ON Ouverture Numérique

OPD Optical Path Difference

PALM Photo-Activated Localization Microscopy

PBS Phosphate Buffered Saline

PCR Polymerase Chain Reaction

POC Point Of Care

RSB Rapport Signal sur Bruit

RVB Rouge Vert Bleu

SIM Structured Illumination Microscopy

SLIM Spatial Light Interference Microscopy

STED Stimulated Emission Depletion

STORM STochastic Optical Resolution Microscopy

TF Ttansformée de Fourier

USAF United States Air Force

Chapitre 1

Introduction

1.1

Présentation de la problématique scientifique

L’optique est la science qui s’intéresse à l’ensemble des phénomènes associés à l’émission, la transmission, la manipulation, la détection et l’utilisation de la lu-mière. La compréhension des phénomènes lumineux permet de développer des instruments qui contrôlent la propagation de la lumière. Il est alors possible de voir ce qui est invisible à l’œil humain, depuis l’infiniment lointain jusqu’à l’infini-ment petit. En particulier, la microscopie optique s’est développée avec la volonté d’observer le vivant. Aujourd’hui, le microscope optique en champ clair est de-venu la méthode de référence pour le diagnostic clinique in vitro. Cet outil permet d’observer en détail des échantillons biologiques après coloration, mais le champ d’observation est limité (ex. : champ d’observation ≈ 1mm avec un objectif ×20, Ouverture Numérique ON = 0, 75 , résolution spatiale ≈ 0, 3µm). Les échantillons observés en anatomopathologie (lames de tissu) ou en cytologie (étalement de cel-lules) ne peuvent donc pas être observés sur une seule image avec la technique de référence.

Une des priorités de la recherche biomédicale est d’améliorer la prise en charge anatomoclinique, notamment en apportant aux médecins des outils d’aide au diag-nostic. Dans cette optique, ce projet de recherche démarre d’une problématique scientifique large : comment obtenir rapidement (< quelques minutes) des images grand champ (> 1cm2_{) et multi-échelles d’échantillons anatomocytopathologiques.}

Le but étant de développer une technique qui viendrait en complément de la mé-thode conventionnelle, à savoir la microscopie en champ clair sur échantillons co-lorés, et qui doit pouvoir s’insérer dans un contexte clinique. Afin de préciser les contraintes liées à un tel environnement, attardons-nous d’abord sur la discipline d’anatomocytopathologie.

Chapitre 1. Introduction 2

1.2

Présentation du contexte :

l’anatomocytopa-thologie

L’anatomocytopathologie est une spécialité médicale basée sur l’analyse macro-scopique, et surtout microscopique d’une biopsie ou d’une pièce opératoire. Cet examen permet d’établir le diagnostic et d’orienter la prise en charge clinique du patient. Pour un prélèvement de liquide pathologique (cytologie), les cellules sont étalées sur une lame de microscope puis colorées. En ce qui concerne les prélève-ments de tissus (anatomopathologie), on peut distinguer deux procédures :

— Pour un examen standard, la pièce opératoire est plongée dans un liquide fixatif pendant plusieurs heures. Après inclusion en paraffine, et coupe au microtome, l’échantillon est coloré et déposé sur une lame de microscope. La préparation de la lame de tissu nécessite au moins 48 heures, souvent plus si l’échantillon prélevé est volumineux.

— Lors d’un examen extemporané, le médecin anatomopathologiste doit préparer et examiner une biopsie pendant que le patient est en salle d’opé-ration. Ce type d’examen est demandé par le chirurgien lorsqu’il/elle a besoin d’une analyse anatomopathologique pour décider de la suite d’une opération. Par exemple, le chirurgien veut savoir si une tumeur a été retirée avec suffisamment de marge. Le médecin anatomopathologiste dispose alors de moins de 30 minutes pour préparer et analyser les lames de tissu. Pour ce faire, la biopsie est congelée et découpée au cryotome, puis déposée sur une lame et colorée pour être examinée au microscope. Les lames obtenues après congélation sont souvent de moins bonne qualité que celles obtenues avec l’inclusion en paraffine, et l’examen extemporané doit toujours être complété par un examen anatomopathologique standard.

Figure 1.1: (a) Exemple d’échantillon cytologique : frottis sanguin en colora-tion Giemsa. Le noyaux des globules blancs est coloré en violet. (b) Exemple d’échantillon anatomopathologique : lame de poumon humain coloré en HES

(Hématoxyline-Eosine-Safran).

La Figure1.1montre des exemples d’échantillons anatomocytopathologiques, avec en (a) un étalement de cellules sanguines, et en (b), une coupe de poumon après inclusion en paraffine. L’échantillon de sang est marqué avec la coloration Giemsa

Chapitre 1. Introduction 3

Grandissement O.N. Résolution spatiale Diamètre champ d’observation

λ/(2.ON ) (20 mm champ oculaire)

x4 0,1 2,50 µm 5 mm

x10 0,25 1,00 µm 2 mm

x20 0,75 0,33 µm 1 mm

x40 0,95 0,26 µm 0,5 mm

x100 1,25 0,20 µm 0,2 mm

Table 1.1:Limite de résolution spatiale et champ d’observation pour différents objectifs de microscope

qui révèle les Globules Blancs (GB) en violet. La coloration HES (Hématoxyline-Eosine-Safran) est couramment utilisée pour observer les lames de tissu. L’héma-toxyline colore les noyaux des cellules en bleu-violet, l’éosine colore le cytoplasme en rose, et le safran colore les fibres de collagène en jaune. Plusieurs lames sont préparées pour chaque biopsie, notamment à différentes profondeurs de coupes dans le tissu. L’anatomopathologiste doit donc analyser pour chaque cas un certain volume d’échantillon, et le résultat de l’examen est souvent délivré au patient plusieurs semaines après l’opération.

Les lames de tissu ou de cellules sont observées visuellement au microscope en champ clair, qui est la méthode de référence dans la discipline. L’examen au mi-croscope consiste en une analyse multi-échelle. L’échantillon est d’abord observé à faible grossissement (ex : ×5) afin d’évaluer la structure et l’organisation du tissu en champ large. Le médecin repère alors les zones d’intérêt et utilise des objectifs à plus fort grossissement (e.g. ×20 ou ×40) pour regarder en détail les cellules et les noyaux. Cependant, le champ de vision est limité à quelques centaines de micro-mètres lorsque le médecin utilise un fort grossissement, ce qui nécessite de scanner manuellement l’échantillon si la zone pathologique est étalée. Le Tableau1.1donne des exemples de valeurs du champ d’observation et de la résolution spatiale ob-tenues avec différents objectifs de microscope. Des solutions commerciales ont été développées pour aider l’analyse visuelle du médecin. Ainsi, les scanners de lame permettent l’acquisition d’une image haute résolution de toute la lame de tissu, fournissant une image numérique multi-échelle [1]. Cette technologie a permis le développement de traitements numériques pour identifier et segmenter des zones d’intérêt dans l’image, aidant ainsi le médecin à repérer rapidement les zones pa-thologiques [2]. Par ailleurs, les images de lames numériques ont permis l’essor de la télépathologie. En effet, lorsque l’avis d’un confrère est nécessaire, les médecins anatomopathologistes peuvent s’échanger plus facilement et plus rapidement les images des lames plutôt que de s’envoyer les échantillons par courrier. En outre, la télépathologie peut se révéler particulièrement bénéfique pour la formation de médecins anatomopathologistes [3], pour la recherche, ou pour le diagnostic dans des zones géographiques manquant de médecins spécialisés [4]. Ainsi, la discipline s’oriente vers une transition numérique, mais les scanners de lame sont encore trop chers pour de nombreux laboratoires d’anatomopathologie.

Chapitre 1. Introduction 4 charges pour élaborer un outil d’imagerie d’aide au diagnostic anatomopatholo-gique. Scherf et Huisken ont imaginé les propriétés du microscope du futur dédié à l’observation d’échantillons biologiques, qui serait "intelligent" et minimalement invasif [5]. Les nouvelles techniques de microscopie devraient ainsi résulter d’un compromis entre résolution spatiale, préservation de l’échantillon, Rapport Signal sur Bruit (RSB) et rapidité d’acquisition de l’image (Fig. 1.2(a)). Rajoutons à ces critères les paramètres suivants : champ d’observation, profondeur de champ, rendu des couleurs (Fig. 1.2(b)).

Figure 1.2: (a) Spécifications du microscope idéal selon [5]. (b) Spécifications du microscope idéal dédié à l’imagerie de biopsies.

L’analyse anatomopathologique est principalement de nature morphologique, grâce à la coloration de la lame de tissu. Le rendu des couleurs joue donc un rôle im-portant dans l’interprétation du spécimen. Cependant, cette étape de préparation de l’échantillon est fortement opérateur-dépendante, et la concentration en colo-rant varie selon les habitudes du médecin anatomopathologiste. En outre, certaines colorations spécifiques sont coûteuses. De plus, une fois l’échantillon marqué, on ne peut plus y appliquer des méthodes complémentaires d’analyse quantitative. Plusieurs techniques d’imagerie sont en développement afin d’observer un objet biologique sans marquage, le but étant d’affecter le moins possible l’échantillon. Pour un objet non coloré, l’information d’intérêt est contenue dans l’image de phase, qui peut fournir des informations quantitatives sur l’épaisseur et l’indice de réfraction de l’objet [6]. Il peut donc être intéressant de développer une mé-thode d’imagerie qui puisse observer à la fois des échantillons colorés, pour être compatible avec les protocoles standard de préparation des échantillons, et non colorés.

La profondeur de champ a peu d’importance pour les lames d’anatomocytopatho-logie. En cytologie, le médecin observe un étalement monocouche de cellules. Pour un examen standard en anatomopathologie, les coupes de tissu mesurent ≈ 4µm d’épaisseur et il y a donc peu de contraintes sur la profondeur de champ. Toute-fois, les lames d’examen extemporané sont plus épaisses (≈ 15µm) car le tissu est plus difficile à couper, et l’analyse de la lame est plus compliquée. Il pourrait donc être intéressant de pouvoir observer des coupes plus épaisses, qui seraient plus

Chapitre 1. Introduction 5 faciles à préparer. Il faudrait alors prendre en compte la profondeur de champ de la méthode d’imagerie.

Ce projet de recherche s’intéresse donc au développement d’une nouvelle tech-nique complémentaire de la microscopie en champ clair, qui est le standard de référence en anatomopathologie. Elle fournit au médecin une résolution suffisante pour observer les noyaux des cellules, mais un champ d’observation trop faible pour pouvoir analyser l’échantillon en une seule fois (voir Tableau 1.1). Nous vi-sons donc à développer une méthode d’imagerie :

• grand champ (cm2_),

• multi-échelle afin de pouvoir observer les cellules et leurs noyaux (≈ µm − cm),

• simple,

• rapide pour pouvoir être utilisée lors d’un examen extemporané,

• à moindre coût pour être accessible au plus grand nombre de laboratoires, • compatible avec les techniques de préparation standard des lames d’anato-mopathologies, ou alors doit pouvoir fonctionner sur des échantillons plus simples et/ou plus rapides à préparer (ex : ne nécessite pas de coloration, fonctionne avec des coupes épaisses faciles à couper).

1.3

Observation d’échantillons biologiques

Afin de répondre au cahier des charges précédent, passons rapidement en revue dif-férentes méthodes de microscopie permettant d’observer des échantillons marqués. Nous nous intéresserons également aux méthodes d’imagerie de phase, qui appli-quées aux échantillons non marqués, peuvent toutefois apporter des informations quantitatives tout en préservant l’intégrité de l’échantillon. Enfin, nous discuterons des avancées apportées par les technologies numériques en microscopie.

Figure 1.3: (a) Microscope de Jansen. Premier microscope composé de deux groupes de lentilles, l’objectif et l’oculaire, dans trois tubes coulissant. (b) Dessin

de Globules Rouges (GR) de Van Leeuwenhoek.

L’imagerie du vivant a motivé le développement de la microscopie optique. Le pre-mier microscope composé d’un objectif et d’un oculaire est attribué aux hollandais

Chapitre 1. Introduction 6 Zacharias et Hans Jansen en 1595 [7]. Robert Hooke publia en 1665 dans Micro-graphie le premier recueil d’observations en microscopie [8]. A la même période, les lettres d’Antonie Van Leeuwenhoek à la Royal Society à partir de 1673 rapportent ses observations et les premiers dessins de globules rouges, de spermatozoïdes, de bactéries et de protozoaires [9]. Les microscopes ont ensuite bénéficié des avan-cées de l’optique, notamment dans la compréhension des aberrations sphériques et chromatiques.

1.3.1

Imagerie d’échantillons marqués

L’observation d’échantillons biologiques a été grandement facilitée par Joseph von Gerlach, qui en 1858, fut le premier à décrire un protocole de coloration de l’échan-tillon, faisant ressortir les noyaux des cellules ayant absorbé le colorant par rapport au cytoplasme peu coloré. Par la suite, de nombreuses colorations ont été élaborées [10]. Citons en particulier la coloration Hématoxyline-Eosine (Paul Mayer, 1896), utilisée en routine aujourd’hui. Elle colore les noyaux en bleu et le cytoplasme en rose. Ainsi, les colorants modifient les propriétés d’absorption de la lumière de l’échantillon étudié.

Le marquage fluorescent représente un autre bond dans l’avancée de la microscopie. Même si le phénomène de luminescence est observé depuis des milliers d’années, les premières descriptions de la fluorescence sont attribuées à John Herschel en 1845. La fluorescéine fut le premier fluorophore synthétisé en 1871. Le marquage fluores-cent a été appliqué par Stanislas von Provazek en 1914 pour acfluores-centuer l’autofluo-rescence des cellules et des tissus, juste après l’invention du premier microscope à fluorescence en 1911 par Oskar Heimstädt. Les progrès en immunologie ont per-mis de développer des marquages plus spécifiques, utilisés en immunohistochimie (marquage spécifique par coloration), ou en immunofluorescence.

Plus récemment, de nouvelles méthodes de microscopie sont développées pour améliorer la résolution latérale et spatiale des images, en diminuant le signal de fond en microscopie de fluorescence. Citons par exemple le microscope confocal [11] à balayage laser (1987), qui permet d’observer en profondeur des échantillons de tissu épais. L’excitation à deux photons [12] (1990) limite le photoblanchiment des fluorophores. La microscopie à feuille de lumière [13] (1993) permet d’imager en 3D un échantillon épais avec une bonne résolution latérale et axiale. Aujour-d’hui, des images sont obtenues avec une résolution meilleure que la limite de diffraction (≈ 200nm) grâce aux techniques de microscopie de super-résolution : STED (déplétion par émission stimulée, 2000)[14], SIM (microscopie par illumi-nation structurée, 2000)[15], PALM (microscopie par localisation photoactivée, 2006)[16], STORM (microscopie de reconstitution optique stochastique)[17]. En particulier, l’illumination structurée (Structured Illumination Microscopy SIM) est utilisée par le groupe du Prof. Brown de l’Université de Tulane, pour obtenir des images grand champ (≈ 30cm2 _{grâce à un scan XY) de la surface de biopsies}

Chapitre 1. Introduction 7

1.3.2

Imagerie d’échantillons non marqués

Les objets transparents non marqués sont difficilement observables en microscopie à champ clair. Leur contraste est amélioré avec la technique du champ sombre, car l’observateur ne voit que les rayons déviés par l’échantillon. Cette technique était largement utilisée pour observer des objets transparents avant l’invention du microscope à contraste de phase par Frits Zernike en 1930 [19]. D’autres techniques permettent d’augmenter le contraste d’objets transparents. Citons notamment la microscopie à contraste interférentiel différentiel [20][21](années 1950), qui donne des images avec un léger effet de relief, ou la microscopie en lumière polarisée, qui améliore le contraste des objets biréfringents.

En 1948, Dennis Gabor invente l’holographie [22], permettant d’enregistrer des in-formations en trois dimensions sur le module et la phase de l’objet observé. L’objet est situé proche de la source, et loin de la surface de détection. Il est éclairé par une onde sphérique cohérente, et une surface photosensible enregistre la figure d’inter-férence entre l’onde diffractée par l’objet observé et l’onde incidente non diffractée. L’objet est restitué en éclairant l’hologramme par l’onde de référence ayant servi à l’enregistrement de celui-ci. Toutefois, l’image restituée est dégradée par le phé-nomène "d’image jumelle", dû à la superposition de l’onde diffractée avec l’onde d’illumination. La restitution de l’hologramme est fortement améliorée avec l’holo-graphie hors-axe (Emmett Leith et Juris Upatnieks, 1962)[23]. L’onde de référence est séparée physiquement de l’onde diffractée et une information quantitative de la phase de l’échantillon peut être restituée [24][25][26]. L’invention du laser dans les années 1960 a permis le développement de nombreuses techniques d’imagerie en lumière cohérente, donnant ainsi accès à des informations quantitatives sur l’échantillon. Citons en particulier des méthodes de microscopie quantitative de phase qui ont été utilisées pour l’imagerie de tissus non marqués. Par exemple, la tomographie de cohérence optique (Optical Coherence Tomography OCT) est uti-lisée pour observer des tissus ex-vivo [27][28]. Des informations quantitatives sont extraites des images de phase de lames de tissus non marqués, obtenues avec le module de Spatial Light Interference Microscopy (SLIM), développé par le groupe du Prof. Popescu [29][30]. Cependant, pour toutes ces méthodes d’imagerie quan-titative de phase, le dispositif expérimental est complexe à mettre en œuvre, et le champ d’observation est limité par l’utilisation d’objectifs de microscope.

1.3.3

Systèmes hybrides : co-conception optique et

traite-ments d’images

Grâce au développement des technologies numériques, l’instrumentation optique tend à se simplifier. De nouvelles techniques d’imagerie résultent de la co-conception de systèmes d’acquisition optique simples, fortement associés à des algorithmes de reconstruction d’image. Le but étant d’améliorer la qualité d’image, l’encombre-ment, ou la complexité des systèmes optiques traditionnels.

Chapitre 1. Introduction 8 Par exemple, la ptychographie de Fourier maximise le champ d’observation et la résolution spatiale via l’acquisition de centaines d’images basse résolution avec un objectif à faible ON (e.g. objectif ×2, ON = 0, 08). Les images sont enregistrées en intensité sous différents angles d’illumination, puis sont combinées dans l’espace de Fourier afin de maximiser les plus hautes fréquences spatiales dans l’image reconstruite [31][32][33]. Cependant, enregistrer plusieurs centaines d’images basse résolution rallonge le temps d’acquisition, et le temps de reconstruction. De récents travaux visent à optimiser le nombre d’images enregistrées [34][35], allant jusqu’à obtenir en 0,8 secondes de temps d’acquisition et 20 minutes de reconstruction l’équivalent d’un champ d’observation d’un objectif ×4, avec la résolution d’une ON de 0,8 [36].

Grâce aux capteurs d’image CCD et CMOS, l’holographie connaît un fort regain d’intérêt, car le montage de restitution optique de l’hologramme peut être rem-placé par des algorithmes de reconstruction numérique. Outre l’avantage de fournir l’information de phase de l’objet, ce qui pourrait à terme remplacer avantageu-sement la coloration de l’échantillon, le dispositif expérimental est extrêmement simplifié car il n’y a plus besoin d’objectif (Fig. 1.4). Grâce aux capteurs d’image CCD ou CMOS, l’intensité de l’hologramme est enregistrée numériquement. Par contre, le capteur n’enregistre pas la phase de l’hologramme et des algorithmes de reconstruction holographique ont été développés pour restituer l’objet en mo-dule et en phase [37]. L’objet peut être éclairé par une source laser [38], une LED (Light Emitting Diode) associée avec un objectif de microscope et un pinhole [39], une source multi-longueur d’onde comme des diodes lasers Rouge, Verte et Bleue (RVB) [40], ou une LED RVB [41]. Comme l’objet est situé plus près de la source que du capteur, un facteur de grandissement est introduit même s’il n’y a pas d’optique, de sorte que le champ d’observation est restreint (de l’ordre de 1mm2_).

Le champ d’observation a été agrandi dans [42] en utilisant un scanner au lieu d’un capteur d’image traditionnel. Toutefois, il en résulte un dispositif beaucoup plus volumineux.

Afin de réduire au mieux l’encombrement et la complexité du système d’imagerie, et d’utiliser au maximum le champ couvert par la surface du capteur, une solution consiste à retirer complètement tout système optique entre l’échantillon et le cap-teur. Des algorithmes ont été développés afin de reconstruire numériquement une image super-résolue à partir de multiples images enregistrées à la résolution native du capteur, avec un décalage sub-pixel entre elles [43]. Le champ d’observation correspond ainsi à celui du capteur d’image (10 − 30mm2_{) . L’imagerie de contact}

nécessite que l’échantillon observé soit positionné directement sur le capteur, ou du moins à faible distance de celui-ci (Fig. 1.5). L’objet est éclairé en lumière incohérente ou partiellement cohérente et le capteur enregistre en transmission l’obscuration formée par l’objet sur le capteur. Par exemple, des cellules ont été mises en culture directement sur un capteur CMOS [44]. L’échantillon peut être placé encore plus près de la surface active en retirant la grille de microlentilles habituellement placée au-dessus des pixels [45]. A l’inverse, l’échantillon peut être déporté, et amené artificiellement sur la surface optique via un faisceau de fibres

Chapitre 1. Introduction 9

Figure 1.4: Schéma explicatif de l’holographie en ligne. L’objet est illuminé par une onde cohérente, sphérique divergente, provenant d’un point source si-tué à la distance L de l’échantillon. Le capteur sisi-tué à la distance z de l’objet enregistre l’intensité de l’hologramme, c’est-à-dire la figure d’interférence entre l’onde diffractée par l’objet et l’onde incidente non diffractée. Comme l’objet est situé beaucoup plus près du point source que du capteur, un grandissement géométrique M est introduit. Un algorithme de reconstruction holographique restitue le module et la phase de l’objet à partir de l’intensité de l’hologramme.

Figure 1.5: Schéma explicatif de l’imagerie de contact. L’échantillon est illu-miné par une onde cohérente ou incohérente. Il est placé au plus près du capteur. Il n’y a donc pas de grandissement introduit et le capteur enregistre directe-ment l’ombre de l’objet. L’image n’est donc pas reconstruite numériquedirecte-ment, contrairement à l’holographie en ligne. Les traitements numériques servent ici à augmenter la résolution des images, en utilisant par exemple des algorithmes de

super-résolution.

[46]. Cependant, même si des cellules non marquées ont été observées, cette mé-thode ne permet pas d’enregistrer la phase de l’objet observé, qui pourrait à terme remplacer la coloration de l’échantillon.

L’imagerie sans lentille combine le grand champ, la simplicité et la compacité de l’instrumentation de l’imagerie de contact, avec l’information de phase obtenue en holographie en ligne. Contrairement à cette dernière, l’échantillon est placé près du capteur. Il est éclairé par une onde plane partiellement cohérente, et la source

Chapitre 1. Introduction 10

Figure 1.6: Schéma explicatif de l’imagerie sans lentille. L’objet est illuminé par une onde cohérente issue d’un point source situé à la distance L de l’échan-tillon. Il est situé à la distance z non nulle du capteur, avec z ≪ L. Le capteur enregistre l’intensité de l’hologramme. Comme l’objet est situé près du capteur, on peut considérer qu’il est illuminé par une onde plane, et aucun grandissement n’est introduit. Le champ observé correspond alors à la surface du capteur. Un algorithme de reconstruction holographique restitue le module et la phase de

l’objet à partir de l’intensité de l’hologramme.

est située à quelques cm de l’objet. Ainsi, aucun grandissement géométrique n’est introduit, et le champ observé correspond à la surface du capteur (10 − 30mm2₎

(Fig.1.6). L’image complexe de l’échantillon est reconstruite numériquement, de la même façon qu’en holographie en ligne. L’imagerie sans lentille sera expliquée plus en détail au Chapitre2. Cette technique permet d’observer en une seule image une statistique importante d’éléments biologiques, tels que des molécules d’ADN [47], virus [48], bactéries [49][50], cellules sanguines [51], cellules en culture [52][53][54]. Toutefois, les objets denses n’ont pu être reconstruits que depuis très récemment (2014) en imagerie sans lentille [55][56][57]. Cependant, les temps d’acquisition et de reconstruction sont encore trop longs (1 à 1,5 min./mm2_{) pour pouvoir utiliser}

ces méthodes sur une lame entière de tissu, et en environnement clinique.

Ces méthodes d’imagerie dites "lensless" ou "lensfree", où l’instrumentation op-tique est extrêmement simple, sont de plus en plus couplées à des technologies embarquées en vue de réaliser des tests dits "Point of Care" (POC). Les tech-nologies POC visent à apporter des outils de diagnostic rapides au plus près des patients, notamment dans des environnements où les ressources sont limitées. Par exemple, la télépathologie va dans ce sens. L’imagerie de contact a été intégrée dans un smartphone [58]. Le groupe d’Aydogan Ozcan à UCLA développe des dispositifs couplés à un smartphone, ou des objets connectées [59][60][61][62]. Cette revue non exhaustive des avancées de la microscopie optique permet de dé-gager grossièrement les avantages et inconvénients des différentes technologies. La microscopie de super-résolution fournit des images au-delà de la limite de diffrac-tion avec une instrumentadiffrac-tion complexe sur des échantillons marqués. L’imagerie en lumière cohérente permet de restituer des informations quantitatives de phase

Chapitre 1. Introduction 11 sur des échantillons non marqués. Ces méthodes emploient des objectifs de mi-croscope à fort grossissement, et favorisent la résolution spatiale au détriment du grand champ d’observation. Le développement des technologies numériques a fa-vorisé l’émergence de nouvelles méthodes basées sur une instrumentation simple fortement reliée à des traitements d’images. Des images grand champ (10−30mm2₎

avec une résolution spatiale sub-micrométrique sont obtenues avec des dispositifs sans, ou avec très peu de lentilles. Toutefois, ces méthodes nécessitent d’enregistrer des centaines d’images basse résolution, et des algorithmes coûteux en temps de calcul afin de reconstruire une image haute résolution.

Ce projet de thèse vise à développer une technique d’imagerie grand champ, multi-échelle, rapide, simple et bas coût, pour observer des échantillons anatomopatho-logiques. Ces critères vont dans le sens des derniers développements qui intègrent des imageurs dans des systèmes embarqués.

1.4

Présentation des travaux de thèse

Cette problématique scientifique a été abordée par la méthode expérimentale, basée sur l’observation de phénomènes empiriques produits par une expérience. L’analyse de ces phénomènes aide à comprendre la physique de l’expérience et à émettre des hypothèses. Ces hypothèses constituent les fondations d’une théorie, qui sera ensuite validée ou invalidée par de nouvelles expériences. Ainsi, plusieurs montages optiques répondant à la contrainte de champ large ont été mis en œuvre (camera obscura, scanner et faisceau de fibres fuselées, imagerie sans lentille), et testés sur différents échantillons (bactéries, cellules en culture, cellules en milieu li-quide, tissus), en gardant toujours en vue la problématique scientifique à résoudre. Après une première phase d’allers-retours entre formulations d’hypothèses, expé-riences, analyses et interprétation des résultats, une première reconstruction en-courageante a été obtenue par imagerie sans lentille avec une lame de tissu (Fig.

1.7).

Ce manuscrit présente le développement d’un système d’imagerie sans lentille dé-dié à l’observation d’échantillons anatomocytopathologiques denses (bactéries, cel-lules, lames de tissu). Dans le cadre de la démarche expérimentale, des travaux initiaux ont été menés sur des cellules en milieu liquide. Des premières expériences ont testé le potentiel de l’imagerie sans lentille pour le suivi de population bac-térienne en milieu liquide. Un dispositif d’imagerie sans lentille a été installé en environnement clinique pour l’analyse du Liquide Céphalo-Rachidien (LCR), afin d’évaluer le potentiel de l’imagerie sans lentille pour le diagnostic de la ménin-gite. Ces travaux ont été repris au niveau du laboratoire pour se conclure par une étude de faisabilité à l’hôpital de la Timone. Après l’obtention de résultats prélimi-naires encourageants sur une lame de ganglion, les travaux se sont principalement concentrés sur l’observation de lames de tissu par imagerie sans lentille.

Le principe de l’imagerie sans lentille est détaillé en première partie du Chapitre

Chapitre 1. Introduction 12

Figure 1.7: Imagerie sans lentille d’une lame de ganglion non colorée. (a) Ré-sultat préliminaire encourageant. Image de la phase reconstruite à partir de trois hologrammes illuminés dans les longueurs d’onde Rouge, Verte et Bleue. Le contraste de l’image a été augmenté de 60% pour une meilleure visualisation.

(b) Image microscope correspondante.

pour l’observation rapide et grand champ d’échantillons denses, colorés ou non colorés. Un exemple de mise en œuvre expérimentale est décrit au Chapitre3. Les performances globales sont évaluées, puis nous discutons de l’influence des diffé-rents paramètres expérimentaux sur la qualité des images. Des résultats obtenus en imagerie sans lentille sur des lames de tissus colorés sont présentés au Chapitre

4. Des tissus non colorés peuvent également être observés avec notre méthode. Ces résultats seront présentés au Chapitre 5. Le Chapitre 6 décrit les pré-études menées en début de thèse pour l’imagerie de bactéries en milieu liquide, et l’ana-lyse du LCR. Le Chapitre 7 donne d’autres exemples d’échantillons biologiques pouvant être observés avec notre méthode. Enfin, une conclusion générale résume cette étude et propose des perspectives à ces travaux.

Chapitre 2

Imagerie sans lentille d’échantillons

denses

Ce chapitre décrit dans un premier temps le fonctionnement de l’imagerie sans lentille, qui permet de reconstruire des objets épars, mais pas les objets denses. Nous proposons une méthode d’imagerie sans lentille pour reconstruire des ob-jets denses, colorés ou non colorés. L’algorithme de reconstruction holographique présenté dans ce chapitre a été développé avec le concours de Lionel Hervé, en particulier pour l’étude de la convergence. Des résultats de simulation effectuées sur des objets épars denses, d’absorption et de phase sont présentés à la fin de ce chapitre.

2.1

Principes de l’imagerie sans lentille

2.1.1

Introduction

L’imagerie sans lentille a bénéficié ces dernières années du développement des cap-teurs CMOS, qui a accompagné l’essor des téléphones portables. En effet, la course à la miniaturisation des composants a engendré des capteurs à bas coût (quelques dollars), avec des pixels de plus en plus petits, jusqu’à 1µm aujourd’hui (Fig.

2.1), et de plus en plus nombreux. Nous verrons par la suite que ces paramètres sont déterminants dans la qualité des images obtenues en imagerie sans lentille. Les principaux avantages de l’imagerie sans lentille résident dans le grand champ d’observation (10-30 mm2_{), un faible encombrement, et le bas coût des composants}

(pas d’objectif de microscope). En contrepartie, l’imagerie sans lentille est limitée en résolution spatiale. Contrairement à l’holographie en ligne (Fig. 1.4 Chapitre

1) dont elle est inspirée [22][63][64], l’imagerie sans lentille (Fig. 1.6 Chapitre 1) n’introduit pas de grandissement, de sorte que la résolution spatiale est limitée en premier lieu par la taille des pixels. L’échantillon, placé au plus près du capteur, est illuminé par une source cohérente qui émet une onde sphérique. La figure d’inter-férence formée par la somme cohérente de l’onde incidente et de l’onde diffractée

Chapitre 2. Imagerie sans lentille d’objets denses 14

Figure 2.1: Evolution des capteurs CMOS. Le nombre de pixels a considéra-blement augmenté, (jusqu’à 250 millions aujourd’hui), tandis que leur taille n’a

cessé de diminuer. Source : d’après données constructeurs.

par l’objet, habituellement appelée hologramme, est enregistrée par le capteur. Cependant, le capteur n’est sensible qu’à l’intensité de l’hologramme et ne perçoit pas la phase. Le paragraphe 2.1.2 décrit l’information enregistrée par le capteur. Des algorithmes de reconstruction holographique ont été développés pour restituer le module et la phase au niveau de l’objet à partir de l’intensité de l’hologramme mesurée par le capteur. Le principe de la reconstruction holographique est décrit dans la partie 2.1.3, où l’on explique également pourquoi les méthodes classiques ne permettent pas de reconstruire des objets denses. Le paragraphe2.2présente la méthode de reconstruction holographique multi-longueurs d’onde que nous avons développée pour reconstruire des échantillons denses colorés ou non colorés.

2.1.2

Formation de l’hologramme

Considérons dans un premier temps une source parfaitement cohérente temporel-lement et spatiatemporel-lement, c’est à dire monochromatique et issue d’un point source. Le point source émet une onde sphérique, et il est suffisamment éloigné de l’objet pour pouvoir considérer que l’onde incidente sur l’échantillon est plane. Soit un objet situé en z = 0, d’absorption complexe Oλ_{, éclairé par une onde plane}

d’am-plitude Uλ

Chapitre 2. Imagerie sans lentille d’objets denses 15

Figure 2.2:Schéma de principe de la formation de l’hologramme et conventions de notation. L’objet est situé au plan z = 0, le capteur dans le plan z = Z. r désigne les coordonnées radiales. L’objet est éclairé par une onde plane incidente Uλ

inc. Aλ0 représente l’amplitude complexe normalisée juste après l’échantillon. Aλz

représente l’amplitude complexe normalisée dans le plan du capteur.

après la traversée de l’objet par : Uλ

0 = Uincλ (1 − O

λ_{) (2.1)}

L’onde incidente est diffractée par l’objet. Dans la théorie scalaire de la diffraction, le principe de Huygens-Fresnel exprime le champ complexe diffracté à une distance z de l’objet comme le résultat d’une somme d’ondes sphériques cohérentes entre elles. Ces ondes sphériques sont issues de points sources secondaires fictifs, répartis sur toute la surface de l’objet, comme illustré sur la Figure 2.3.

On place un capteur à la distance z de l’objet. Dans l’approximation de Fresnel de la propagation dans un espace libre, (voir §3.3.5), le champ diffracté à la distance z peut se calculer par la convolution de l’onde complexe dans le plan objet par la

Chapitre 2. Imagerie sans lentille d’objets denses 16

Figure 2.3: Illustration du principe de Huygens-Fresnel sur la diffraction par une fente illuminée par une onde plane. Des points sources au niveau de la fente émettent des ondelettes sphériques. L’onde diffractée correspond à la somme

cohérente de ces ondelettes. Crédit "Observatoire de Paris / U.F.E.".

fonction de propagation de Fresnel hλ z : Uzλ = U λ 0 ∗ h λ z (2.2) = Uλ inc(1 − Oλ) ∗ hλz

La fonction de propagation de Fresnel est définie par [65] : hλ z(r) = 1 jλze jkz_ejπr_λz2 _(2.3) avec k = 2π

λ et r = px2+ y2. On parle alors de propagation de Fresnel directe,

lorsque l’onde complexe dans le plan objet est propagée numériquement dans le plan du capteur, par convolution avec hλ

z.

Notons que (Annexe A) : hλ z ∗ ¯h λ z = h λ z ∗ h λ −z = δ (2.4) 1 ∗ hλ z = ejkz (2.5) hλ z1 ∗ h λ z2 = h λ z1+z2 (2.6)

où ¯h désigne le conjugué de h. En utilisant l’Equation2.4, on peut rétro-propager le champ complexe dans le plan du capteur vers le plan de l’objet par convolution avec hλ

−z.

2.1.3

Reconstruction holographique

La reconstruction holographique consiste à restituer numériquement l’amplitude complexe dans le plan objet à partir de l’information d’intensité enregistrée par le capteur.

Chapitre 2. Imagerie sans lentille d’objets denses 17 Cas idéal : la phase au niveau du capteur est connue

Imaginons un capteur idéal permettant d’enregistrer les oscillations rapides d’une onde lumineuse. Un tel capteur nous permettrait de connaître à la fois le module et la phase de l’hologramme. Dans ce cas, la reconstruction consisterait simplement à convoluer l’amplitude complexe dans le plan du capteur Uλ

z par la fonction de

Fresnel inverse hλ

−z, comme illustré en Figure2.4. L’objet serait alors parfaitement

reconstruit en module et en phase.

Figure 2.4: Reconstruction holographique dans un cas idéal fictif où la phase dans le plan de l’hologramme serait connue. L’objet serait alors parfaitement reconstruit en module et en phase. (a) Simulation sur un disque opaque de diamètre 10µm, illuminé par une onde plane de longueur d’onde λ = 520nm. (b)(c) L’onde complexe diffractée par le disque est enregistrée par le capteur qui est situé à la distance z = 1000µm de l’objet. (d) L’objet est parfaitement

reconstruit lorsqu’on connaît le module et la phase au niveau du capteur.

Cas réel : la phase au niveau du capteur n’est pas connue

En réalité, un capteur d’image est sensible à l’intensité d’un signal lumineux. L’intensité Iλ

z enregistrée par le capteur à la longueur d’onde d’illumination λ

Chapitre 2. Imagerie sans lentille d’objets denses 18 capteur. En utilisant l’Equation 2.2 :

Iλ z = |Uzλ|2 (2.7) = |Uincλ |2[(1 − Oλ) ∗ hλz][(1 − O λ ) ∗ hλz] = |Uλ inc|2[1∗ hλz − Oλ∗ hλz][1 ∗ hλz − Oλ ∗ hλz] = |Uincλ |2[e −jkz − Oλ _{∗ h}λ z][e+jkz− O λ ∗ hλz] = |Uincλ |2 h 1 − e−jkz Oλ_{∗ h}λz − e+jkzOλ∗ hλz + O λ ∗ hλz
 Oλ_{∗ h}λ z i = |Uincλ |2 h 1 − 2Re[e−jkz Oλ_{∗ h}λz] + O λ ∗ hλz
 Oλ_{∗ h}λ z i

L’intensité de l’hologramme est donc constituée d’une somme de trois termes A, B et C, avec :

A = |Uincλ |2

B = 2|Uincλ |2Re[e −jkz Oλ_{∗ h}λz] C = |Uincλ |2 O λ ∗ hλz
 Oλ_{∗ h}λ z 

Le premier terme A constant correspond à l’onde de référence non diffractée par l’objet. Le deuxième terme B désigne l’onde diffractée par l’objet. C représente le terme de diffraction non linéaire de l’onde diffractée. Il est négligeable si l’on s’in-téresse à des objets faiblement absorbants, comme des cellules ou des tissus non colorés. En ce qui concerne les tissus colorés, nous verrons au Chapitre 3, para-graphe3.3.5que l’on se place dans un régime de diffraction intermédiaire entre les approximations de Fresnel et de Fraunhofer. Même si tous nos calculs sont effec-tués par propagation de Fresnel, l’approximation de Fraunhofer permet d’estimer facilement la contribution du terme de diffraction non linéaire C par rapport à B pour un objet absorbant. En modélisant une cellule colorée par un disque com-plètement opaque de diamètre d, l’amplitude complexe de l’onde diffractée à la distance z est proportionnelle à la Transformée de Fourier de la fonction disque modélisant la cellule : disque ! p x2_{+ y}2 d " = 1 si px2 _{+ y}2 _{≤ d} = 0 sinon

Dans l’approximation de Fraunhofer, le terme de diffraction est exprimé par :

B ≈ e jkz_ej π(x2+y2) λz jλz T F # disque ! p x2_{+ y}2 d "% x λz; y λz ≈ πd 2 j4λze jkz ej π(x2+y2) 4λz somb ! p x2_{+ y}2_d λz "

Chapitre 2. Imagerie sans lentille d’objets denses 19 où l’on définit la fonction sombrero à partir de la fonction de Bessel de premier ordre J1 : somb(ρ) = 2J1(πρ)/(πρ). La valeur maximale du module de l’amplitude

complexe diffractée est atteinte en (x, y) = (0, 0) et vaut |B|max ≈ πd2/(4λz). Le

module maximum du terme de diffraction d’ordre 2 est proportionnel au carré de cette valeur : |C|max ≈ |B|2max. Pour un disque de diamètre d = 10µm, illuminé à

la longueur d’onde λ = 0, 5µm, situé à la distance z = 1000µm du capteur, on a |B|max = 0, 2 et |C|max = 0, 02. Le terme de diffraction non linéaire est donc un

ordre de grandeur plus faible que le terme de diffraction linéaire, et pourra donc être négligé par la suite. L’intensité de l’onde diffractée dans le plan du capteur vaut alors : Izλ ≈ |U λ inc|21 − 2Re[e −jkz Oλ_{∗ h}λz]  (2.8) ≈ |Uλ inc|2  1 − e−_jkz Oλ ∗ hλ z − ejkzO λ ∗ hλ −z 

Comme seule l’intensité de l’hologramme est enregistrée, la reconstruction simple consiste à rétro-propager numériquement l’intensité de l’hologramme mesurée par le capteur par propagation de Fresnel inverse. L’objet reconstruit est alors exprimé par : I0,reconstruitλ = Izλ∗ h λ −z (2.9) = |Uincλ |2  1 − e−jkz Oλ_{∗ h}λz − e jkz Oλ_{∗ h}λ−z  ∗ hλ−z = |Uλ inc|2e −_jkz 1 − Oλ − ejk2zOλ_{∗ h}λ −_2z 

L’onde reconstruite au plan objet est donc constituée de trois termes : l’onde plane incidente, l’absorption complexe de l’objet Oλ _{et le terme e}jk2z_Oλ _{∗ h}λ

−_2z, appelé

image jumelle. L’image jumelle correspond à l’onde diffractée par l’objet si celui-ci se trouvait au plan +2Z, c’est à dire à une distance +Z derrière le capteur. La présence d’une image jumelle résulte du fait que l’onde diffractée et l’onde incidente de référence dans la formation de l’hologramme se propagent selon le même axe. De plus, le capteur enregistre uniquement l’intensité de l’hologramme, et non la phase. On ne peut donc pas dissocier directement l’onde perturbée par la diffraction et l’onde de référence uniquement à partir de l’intensité de l’hologramme. Cela est à l’origine de l’image jumelle qui apparaît dans le plan objet par simple rétro-propagation de Fresnel.

En holographie en ligne ou en imagerie sans lentille, la reconstruction hologra-phique consiste à restituer numériquement le module et la phase de l’objet à partir de l’intensité d’un ou plusieurs hologrammes. On peut distinguer deux types d’al-gorithmes de reconstruction holographique : les méthodes basées sur l’inversion du système d’acquisition, et les méthodes itératives de reconstruction de la phase ("phase retrieval").

Chapitre 2. Imagerie sans lentille d’objets denses 20

Figure 2.5: Reconstruction holographique dans le cas réel où la phase dans le plan de l’hologramme n’est pas connue. (a) Simulation sur un disque opaque de diamètre 10µm. (b) Le capteur, situé à z = 1000µm de l’objet, enregistre l’in-tensité de l’onde complexe diffractée par le disque. (c) Le capteur n’enregistre pas la phase. (d) L’objet est reconstruit mais il apparaît des franges de diffrac-tion parasites caractéristiques de l’image jumelle. L’image jumelle est considérée

comme un bruit. Ici, le Rapport Signal sur Bruit vaut RSB = 28.

La solution obtenue par rétropropagation simple est polluée par l’image jumelle (Eq. 2.9). La première famille d’algorithmes cherche à trouver une "bonne" so-lution au problème de restitution d’un hologramme qui ne soit pas dégradée par la présence de l’image jumelle, par filtrage inverse [66] [67][68], en ajoutant des contraintes sur l’objet [69][70][71], à partir de un ou plusieurs hologrammes d’un même objet enregistrés à différentes distances du capteur [72][73][74], ou par une approche de type maximum à posteriori [75] . Pour plus de détails, voir [76]. Des algorithmes itératifs dits de "phase retrieval" ont été développés afin d’es-timer la phase dans le plan de l’objet, ou de manière équivalente dans le plan de l’hologramme, à partir d’une mesure du module de la Transformée de Fourier de l’objet [77]. Dans notre cas, la propagation de Fresnel remplace la Transfor-mée de Fourier, et le module de l’hologramme correspond à pIλ

z. L’amplitude

complexe dans le plan objet peut ainsi être reconstruite. L’algorithme itératif de Gerchberg Saxton [78] permet de reconstruire numériquement la phase dans le plan objet, en effectuant des allers-retours par transformées de Fourier directes et inverses entre le plan objet et le plan de l’hologramme. De façon similaire,

Chapitre 2. Imagerie sans lentille d’objets denses 21 la descente de gradient permet également d’estimer la phase de l’objet à partir d’une mesure de l’intensité de l’hologramme [77]. La convergence est améliorée avec des variantes de l’algorithme de Gerchberg-Saxton [79], par exemple en ap-pliquant des contraintes de masquage sur le module autour de chaque objet, à chaque itération. Mais ce type de contraintes ne peut pas s’appliquer aux objets denses comme les tissus, constitués de cellules consécutives, et pour lesquelles on ne peut pas masquer les contours (Figure 2.7). La reconstruction de tels objets est donc floue car elle est polluée par la somme de toutes les images jumelles de la reconstruction des cellules qui constituent le tissu. En rajoutant des données en entrée, les algorithmes itératifs de type "phase retrieval" sont améliorés en utili-sant plusieurs hologrammes d’un même objet, enregistrés à différentes distances du capteur. De manière équivalente, des hologrammes enregistrés sous différentes longueurs d’onde d’illumination permettent d’améliorer le "phase retrieval", en remarquant que la longueur d’onde et la distance au capteur ont une contribution similaire dans la fonction de propagation de Fresnel (Eq. 2.3), si l’on met de côté la dispersion du milieu de propagation. Ainsi, des algorithmes itératifs de "phase retrieval" multi-longueurs d’onde ont été développés en holographie en ligne pour observer des objets biologiques transparents peu denses [80][41][81][82][83]. Ces précédents travaux sont basés sur l’hypothèse que les propriétés spatiales d’un objet biologique transparent varient peu avec la longueur d’onde. Ces méthodes n’ont donc pas été utilisées pour reconstruire des objets colorés. Toutefois, l’illumi-nation multi-longueurs d’onde présente l’avantage de pouvoir enregistrer plusieurs hologrammes d’un même objet sans introduire de déplacement mécanique dans le dispositif d’imagerie. L’instrumentation est donc simplifiée. De plus, il nous a sem-blé pertinent d’illuminer des échantillons pathologiques colorés (par exemple des lames de tissu) sous différentes longueurs d’onde du spectre visible, pour étudier la possibilité de reconstruire les couleurs de l’échantillon. Pour ces raisons, nous avons basé notre méthode d’imagerie sans lentille sur une reconstruction multi-longueurs d’onde dans le but d’éliminer l’image jumelle, de reconstruire une information de phase et d’obtenir une image des objets colorés.

Cas des objets denses

Lorsque les objets sont bien séparés, l’image jumelle résiduelle après reconstruction holographique n’est pas trop gênante, surtout si la distance entre l’objet et le capteur est grande devant la dimension de l’objet. Le contraste de l’image jumelle est faible par rapport à l’objet reconstruit, et le Rapport Signal sur Bruit (RSB) de l’image reconstruite n’est pas trop dégradé (Fig.2.5(d)). Lorsque les objets sont plus rapprochés, les images jumelles se superposent, le bruit associé augmente et le RSB est dégradé (Fig.2.6(d)). En effet, dans le cas des échantillons denses comme les lames de tissu, l’objet est constitué de multiples sous-objets (ex : cytoplasme des cellules, noyaux, etc.) accolés les uns à côté des autres. Les contraintes basées sur la faible densité de l’échantillon ne peuvent pas s’appliquer et l’image reconstruite est fortement polluée par l’image jumelle (Fig.2.7).

Dans la suite de ce chapitre, nous proposons une méthode d’imagerie sans len-tille pour l’imagerie rapide et grand champ d’échantillons denses, colorés ou non

Chapitre 2. Imagerie sans lentille d’objets denses 22

Figure 2.6: Reconstruction holographique dans le cas réel où la phase dans le plan de l’hologramme n’est pas connue. (a) Simulation sur des disques opaques de diamètre 10µm. (b)Le capteur, situé à z = 1000µm du plan objet, enre-gistre l’intensité de l’onde complexe diffractée par les disques. (c) Le capteur n’enregistre pas la phase (d) L’objet est reconstruit mais il apparaît des franges de diffraction parasites caractéristiques de l’image jumelle. Dans le cas d’objets denses, les images jumelles de chaque objet reconstruit se superposent, et ces franges parasites sont assimilables à du bruit. Ici, le Rapport Signal sur Bruit

vaut RSB = 4.

colorés. Nous avons développé une méthode d’imagerie sans lentille basée sur l’ac-quisition de plusieurs hologrammes d’un même objet. Cette méthode emploie plu-sieurs longueurs d’onde d’illumination, centrées en Rouge, Vert et Bleu (RVB) afin de reconstruire rapidement une image couleur grand champ d’échantillons denses, sans introduire de mouvement mécanique dans le dispositif. Le fonctionnement de notre algorithme de reconstruction holographique multi-longueurs d’onde, qui per-met de reconstruire des objets denses, est expliqué dans la partie suivante (§2.2). C’est cette méthodologie qui sera ensuite appliquée à l’imagerie de lames de tissus colorés (Chapitre 4), et non colorés (Chapitre 5), ainsi que sur d’autres objets biologiques denses, comme des cellules en culture, des cellules sanguines, et des bactéries (Chapitre 7).

Chapitre 2. Imagerie sans lentille d’objets denses 23

Figure 2.7: Gauche : module reconstruit d’une lame de colon humain en ima-gerie sans lentille, avec un algorithme itératif de type Gerchberg-Saxton. Droite :

comparaison au microscope, objectif ×20, ON = 0, 75.

2.2

Reconstruction holographique d’objets denses

2.2.1

Description de l’algorithme

L’objectif de la reconstruction holographique est de trouver la meilleure estimation de la transmission complexe de l’objet Aλk

0 = (1 − Oλk) à partir des acquisitions

multi-longueur d’onde Iλk

z , avec k l’indice désignant l’une des longueurs d’onde

d’illumination. Par la suite, k = 1, 2, 3. La Figure2.8présente le schéma de l’algo-rithme de reconstruction multi-longueurs d’onde développé dans le cadre de cette thèse.

On définit Aλk

z l’amplitude complexe dans le plan du capteur :

Aλk z = m λk z exp(jφ λk z ) (2.10) φλk

z représente la phase, et mλzk désigne le module de Aλzk.

La première étape consiste à initialiser la phase et le module de l’onde complexe dans le plan du capteur :

φλk z = 0 (2.11) mλk z = v u u t Iλk z Iλk f ond avec Iλk

f ond l’intensité mesurée lorsqu’il n’y a pas d’objet devant le capteur.

La deuxième étape consiste à rétro-propager l’onde complexe Aλk

z du capteur vers

Chapitre 2. Imagerie sans lentille d’objets denses 24

Figure 2.8:Schéma de l’algorithme de reconstruction holographique multispec-tral pour la reconstruction d’objets denses. Le fonctionnement de l’algorithme itératif est illustré sur une simulation d’un disque opaque de 10µm de diamètre, situé à 500µm du capteur. L’hologramme RVB est enregistré aux longueurs

Chapitre 2. Imagerie sans lentille d’objets denses 25 d’onde λk correspondante. Cette étape fait apparaître l’objet recherché, superposé

à son image jumelle (Eq. 2.9).

L’étape 3 consiste à moyenner les amplitudes complexes reconstruites aux diffé-rentes longueurs d’onde. On crée alors un objet synthétique < m0 >λ, commun à

toutes les longueurs d’onde.

L’amplitude complexe moyenne est ensuite propagée vers le plan du capteur, par propagation de Fresnel directe pour chaque longueur d’onde (Étape 4) :

˜ Aλk

z =< m0 >λ ∗hλzk (2.12)

La contrainte d’attache aux données consiste à remplacer le module de l’onde complexe obtenue dans le plan du capteur par le module de l’hologramme mesuré :

Aλk z,p+1 ←− mλzk ˜ Aλk z,p | ˜Aλk z | (2.13) avec mλk

z le terme d’attache aux données (Eq. 2.11). La phase dans le plan du

capteur obtenue à l’issue de l’ Étape 4 est conservée. Puis une nouvelle itération reboucle à l’Étape 2. Les étapes 2, 3, 4 et 5 sont répétées de façon itérative, avec p désignant le numéro d’itération. Un critère de convergence peut être défini en comparant à chaque itération l’hologramme mesuré, et l’hologramme obtenu à l’Étape 4. Par exemple, cette comparaison peut se faire en calculant la norme euclidienne de la différence des modules des deux hologrammes, et en définissant un seuil de convergence ǫ : ǫ <    Abs ˜A λk z  − mλk z       (2.14)

Après généralement cinq itérations, l’onde complexe dans le plan du capteur com-porte un module correspondant aux hologrammes mesurés, et une phase recons-truite par l’algorithme itératif. Cette onde complexe est rétro-propagée une der-nière fois dans le plan objet à chaque longueur d’onde d’illumination (Étape 2). Si l’échantillon est un objet absorbant, comme une lame de tissu coloré, une image couleur de l’objet est obtenue en fusionnant les modules reconstruits en rouge, vert et bleu. Si l’échantillon est un objet de phase, comme une lame blanche de tissu non coloré, l’information est contenue dans la phase reconstruite.

2.2.2

Convergence

De manière similaire aux algorithmes itératifs de type Gerchberg-Saxton [84], la convergence de notre algorithme peut être évaluée à travers une recherche de point fixe. La recherche de point fixe vise à obtenir une solution Φλk

z , qui est un

point de convergence de l’équation : φλk

z,p+1 = f φλz,pk

Chapitre 2. Imagerie sans lentille d’objets denses 26 Nous allons montrer que notre algorithme peut s’exprimer sous la forme d’une fonction récursive du type Eq. (2.15), et que cette équation admet au moins une solution.

Puisque tous les hologrammes enregistrés proviennent du même objet, les am-plitudes complexes dans le plan objet reconstruites à différentes longueur d’onde possèdent des caractéristiques communes, et des caractéristiques qui dépendent de la longueur d’onde (ex : absorption). On cherche à reconstruire les caractéris-tiques communes en minimisant un critère σ. Le critère σ représente la variance des amplitudes reconstruites, calculée sur les longueurs d’onde, et intégrée sur les coordonnées spatiales. Par simplicité de notation, on écrira le plus souvent A0 au

lieu de Aλk 0 (~r). σ = Z < (A0− < A0 >λ) ∗ (A0− < A0 >λ) >λ d~r (2.16) = Z < (A0)∗A0 >λ − < (A0)∗ >λ< A0 >λ d~r

où <>λ désigne l’opérateur "moyenne sur les longueurs d’onde". Par exemple,

< A0 >λ= 1/Nλ Nλ

P

k=1

Aλk

0 , avec Nλ le nombre de longueurs d’onde utilisé. On peut

montrer (AnnexeB) qu’une petite perturbation de phase de φZ entraîne une

per-turbation du critère σ selon : ∂σ ∂φz = 2 Nλ Im [(Az) ∗ (< A0 >λ ∗hz)] (2.17)

Si l’algorithme converge vers une solution Φz, alors σ a atteint un minimum et

 ∂σ ∂φz  Φz = 0 (2.18) On a alors (Az) ∗ [< A0 >λ ∗hz] = α (2.19)

avec α nombre réel. En multipliant les deux côtés de l’équation par Az/|Az|2 :

< A0 >λ ∗hz = Az

α |Az|2

(2.20) Ainsi, la phase du terme à gauche de l’équation est égale à la phase de Az modulo

2π. On peut donc définir :

φz,p+1 = Arg [< Az,p∗ h−z >λ ∗hz] (2.21)