Thèse présentée & la Faculté de médecine. Jean-Luc Parent. en vue de l'obtention du grade de. Université de Sherbrooke

Université de Sherbrooke

Etude de la relation stmcture/fonction du récepteur du

"Platelet-Activating Factorn humain par rnutag6nèse dirigée.

Jean-Luc Parent

Département d'anatomie et de biologie cellulaire Service d'immunologie

Thèse

présentée & la Faculté de médecine en vue de l'obtention du grade de

PhiZosophiae Doctor (PhB) en biologie cellulaire

30 juin 1996

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1*1

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TABLE DES MATERES LISTE DES ABREVIATIONS

RESUME

CHAPITRE 1

-

INTRODUCTION CHAPITRE II - ARTICLE

Mutations of two adjacent amino acids generate inactive and constitutively active forms of the human platelet-activating factor receptor.

CHAPITRE

III -

^ARTICLE

Mutation of an aspastate at position 63 in the human platelet-activating factor receptor augments binding affinty but aboiishes G-protein-coupling and inositol phosphate production.

CHAPITRE

IV -

ARTICLE

Identification of transmembrane residues determinant in the structure/function relationship of the human platelet- activating factor receptor by site-directed mutagenesis.

CHAPITRE

V -

DISCUSSION CHAPITRE

VI -

CONCLUSION

..

REMERCIEMENTS BIBLIOGRAPHIE

WSTE DES ABREVIATIONS

AA: acide arachidonique.

DTM:

Domaine transmembranaire.

GRK: G protein-coupled receptor kinase.

GTPyS: guanosine 5'-O-(3-Mo-triphosphate).

IP:

inositol phosphate.

MAPK: mitogen-activated protein b a s e .

PAF: p platelet-ac tivating factorw) facteur d'activation des plaquettes.

PBS: ("phosphate-buffered saline") tampon phosphate salin.

PCR: polymerase chah reaction.

PI3K: phosphatidy linositol3-kinase.

PKA:

protkine kinase A.

PKC: proteine kinase

C.

PLA2: phospholipase A2.

PLC:

phospholipase C.

PLD: phospholipase

D.

PIX:

protéine tyrosine kinase.

R: conformation inactive du récepteur.

R*: conformation active du dcepteur.

RCPG:

récepteur couple à une protéine G.

TMH. ("transmembrane helix") hélice transmembranaire.

WT: ("wiid-typen) type sauvage.

Etude de la relation structurelfonction du récepteur du

"Platelet-Activating Factorn humain par mutagénèse dirigée.

Par

Jean-Luc Parent

Thèse présentée à la Faculté de médecine en vue de l'obtention du grade de phdosophiae doctor (Ph.D.) en biologie cellulaire,

Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canada.

Le "platelet-activating factorn (PAF) est un puissant médiateur phospholipidique produisant un large thentail de réponses biologiques. Le récepteur du

PAF (PAFR)

fait parti de la superfamille des recepteurs couplés aux protéines G (RCPGs). Ce récepteur lie le

PAF

avec haute affinit6 et est couple à de multiples voies de signalisation menant à des réponses biologiques pouvant être inhibées par une variet6 d'antagonistes du PAF structurellement distincts. L'objectif principal de mes travaux de doctorat consistait à caractériser la relation structure/fonction du PAFR humain par voie de mutagénèse dirigée. Nous cherchions à déterminer des acides aminés du PAFR pouvant être impliqués dans le couplage à la protéine G et dont la mutation p o d t mener B des changements de structure de la protéine, conférant une activité constitutive au récepteur. Nous avons donc mut6 deux résidus adjacents, Ma230 et Leu231, de la partie C-terminale de la 3e boucle intracellulaire du PAFR en Glu et Arg, respectivement. La substitution de Leu231 par un Arg (mutant L231R) amena deux modifications majeures: 1) une activité constitutive accrue du P!dX en termes de production d'inositol phosphates

(IPs)

et 2) une plus grande affinit6 du récepteur pour le PAF (agoniste), mais non poui le WB2086 (antagoniste). Le mutant L231R semble pouvoir atteindre au moins deux conformations distinctes: (i) un 6tat de haute affinité plus Beve que le récepteur de type sauvage (WT) dépendant du couplage ^à la protéine G et (ii) un kat découple du récepteur d'affinité plus haute que l'btat correspondant du récepteur

VIT.

La substitution de l'Ma230 par

A

un Glu résulta aussi en deux modifications majeures: 1) une perte d'akivation du récepteur en termes de production d'IPs suite à une stimulation au PAF et 2) une baisse d'affinité marquk du récepteur pour le PAF et non pour le WEB2086. Des expériences de liaison utilisant du G m ont dbmontré que le mutant A230E possède une basse affinit6, inhbrente à la molécule du récepteur. Les effets de la mutation du résidu Ma230 en Gln suggèrent que le résidu 230 joue un rôle fondamental dans Paffinit6 du récepteur et que la charge du résidu à cette position est déterminante dans le couplage de la protéine G au PAFR. Nous avons également utilise la mutagenèse dirigée afin d'étudier le rôle du résidu Asp63 situé dans le 2e domaine transmembranaire (DTM), des acides aminés Phe97 et Phe98 du 3e DTM, ainsi que des résidus Asn.285 et Asp289 du 7e

DTM,

dans la liaison des ligands, dans l'activation et la régulation de la conformation du PAFR. La substitution de l'Asp63 par un Asn résulta en l'abolition du couplage à la protéine G et de la production dTPs suite B une stimulation au PAF, et augmenta l'affinité du recepteur pour l'agoniste. Le double-mutant FFGG (Phe97 et Phe98 mutés en Gly) montni une affinité réduite de trois à quatre fois pour le PAF, et non le WEB2086, par comparaison au récepteur WT. Le récepteur FFGG démontrait cependant des caractéristiques d'activation normales, suggérant que ces deux résidus

Phe

adjacents maintiennent le récepteur du PAF dans sa conformation optimale, plutôt que d'interagir directement avec le ligand. D'autre part, les résultats obtenus de la mutation de l'Asp289 en Ala et en Asn indiquent que le résidu 289 n'est pas requis pour la liaison du PAF, mais que la formation de ponts hydrogènes impliquant ce résidu pourrait être essentielle ii l'activation du récepteur. Lorsque l'Asn285 fût mutée en

Ala,

le récepteur résultant montrait des caractéristiques identiques au recepteur WT. De façon étonnante, la substitution du même résidu par un Ile causa la perte totale de liaison du PAF et du WEB2086, en dépit d'une expression normale

Zi

la surface cellulaire.

Il

semblerait donc que la molecule du PAF ne se lierait pas à son récepteur en interagissant avec les résidus Asp63, Am285 et Asp289, contrairement il ce qu'un modèle moléculaire récent du PAFR proposait. Nos resultats suggèrent que les résidus 63, 97, 98, 230, 231, 285 et 289, ainsi que la partie C- termianle de la 3e boucle intracelluIaire influencent la conformation et la transition d'&rat inactif

à actif du PAFR

1. INTRODUCTION

Le

PAF ('platelet-activating factor", l-O-alkyl-2-acétyl-m-glyc6m-3-phosph0~holine) est

un m6diateur biologique puissant exerçant ses effets sur une grande vari6té de ceIides et de tissus.

Ce médiateur phospholipidique a été découvert durant des recherches simultanées sur un facteur dérivé du sang de lapins en anaphylaxie qui activait les plaquetîes et sur un Lipide polaire endogène du rein abaissant la pression sanguine (Hanahan, 1986).

Une

h6tkogéneité moléculaire du PAF a pu être observée

A

la position sn-1. Le groupement alkyle 16:O est prédominant, mais des chaînes de 18:0, 17:O et de 18: 1 sont aussi retrouvées. La signification biologique de cette hétérogdn6it6 est inconnue, cependant, la chaîne 16:O démontre la plus grande acti* biologique (Hanahan, 1986). Le PAF est unique dans son rôle de phospholipide fonctionnant comme médiateur intercellulaire, et de plus, peut agir comme messager intraceiiulaire.

II

existe deux voies de synthèse du PAF, "The remodeling pathway" et la voie "de novo "

.

La première implique le remodelage des phospholipides membranaires de la cellule et semble plus importante dans les réponses inflammatoires et allergiques (Venable et ai., 1993). Cette voie ne génère que peu de PAF dans les cellules au repos. La synthèse est iaitib par une phosphoiipase A2

(PU3

spécifique à l'acide arachidonique (AA).

Il

a été propos6 que la

PL&

hydrolyse le phospholipide 1-O-allcyl-2-arachidonoyl-sn-glycéro-3-phohhoe g6nérant le 1-0-alky1-2- lyso-sn-glycéro-3-phosphocholine (lyso-PAF) et 1'AA. L'AA peut ensuite être convertie en prostaglandines, thromboxanes et leukotriihes, co11ectivement nommés éicosanoides

,

possedant aussi diverses actions biologiques puissantes. Le lyso-PAF est a d * par I'ac6tyl coenzyme AAyso-PAF acétyltransf6rase pour donner le PAF. Cette voie de synthèse a m h e donc la formation de deux classes de lipides biologiquement actifs, reliés dans plusieurs cas par des voies m6tabofiques communes et des mécanismes effecteurs similaires.

Dans

la voie de synthèse "de novo " du PAF, le 1-O-aQ1-sn-glycéro-3-phosphate est

acétylé par la 1-O-alkyl-sn-glyCei.0-3-phosphate:acétyl _coenzyme A acétyl transférase. L'enzyme 1 -0-aikyl-sn-glyc6m3-phosphate phosphohy drolase produit le 1 -0--1-2-ac&yl-sn-glycérol qui peut être converti en PAF par une CDPchoiinephosphotransf6rase insensible au dithiothréitol.

Les

enzymes impliquées dans cette voie de synthèse sont apparamment actives de façon constitutive et semblent êtxe régulées par la disponibilité du substrat (Venable et al., 1993).

Le PAF résultant de ces voies de synthèse est degradé en un produit inactif par une famiue de phospholipases, les

PAF

acétyihydrolases. Cette activité est retrouvée dans une variéte de cellules et tissus, ne requiert pas de Ca2+, et catalyse l'hydrolyse des groupements sn-2 acyle courts seulement (Stafforini et al., 1987). Après l'inactivation du PAF par une ac&ylhydrolase, le lyso- PAF résultant est réacyI6 par une des trois routes possibles: une acyltmmfh.se CoA-dépendante, une tlansacylase CoAdépendante ne requérant pas de M ~ ~ ' , ⁿⁱ d' ATP, ou une transacylase CoA- indépendante. La demi&= voie prédomine dans les cellules au repos, cependant, les trois voies semblent participer suite à une stimulation (Robinson et al., 1985).

Le PAF fut découvert comme h n t un médiateur soluble retrouvé dans une variété de liquides physiologiques. Il apparaît donc que certaines cellules sécrètent le

PAF

après sa synthèse.

Cependant, les cellules endothéliales ne sécrètent que peu, ou pas, du PAF qu'elles synthktisent (Mchtyre et al., 1985).

Il

semble que le pourcentage de PAF sécrété varie dramatiquement dans diff6renk cellules et sous diff6rentes conditions

(Lynch

et Henson, 1986). Un des mécanismes par lequel le PAF exerce ses actions après sa synthèse se retrouve chez les cellules endoth6liales, et peut-être d'autres cellules, où le

PAF

reste associe à la surface cellulaire, se rendant disponible comme messager intercellulaire (Vercelloti et al., 1989). Chez les cellules endothéliales activées, la P-sélectine est rapidement exprimée B la surface où elle accroche les leucocytes circulant au passage. Simultant?ment, le PAF est transféré de la surface des cellules endoth6iiales à celle des neutrophiles, activant ces demiers. Un mécanisme similaire a éte décrit pour l'adhésion des plaquettes aux neutmphiles, le PAF à la surface des neutmphiles activant les plaquettes (Zhou et

al., 1992).

La localisation intraceIIulaire de la synthèse du PAF n'a pas encore été clairement déterminée. Cependant, la PLA2 de haut poids moléculaire, initiant probablement la synthèse du PAF, est cytosolique dans les cellules au repos et se déplace vers une membrane intracellulaire non-identifiée en réponse au calcium. Les autres enzymes impliquées dans la synthèse du PAF sont localisées dans le réticulum endoplasmique et, peut-être, dans d'autres organites intracellulaires (Venable et al., 1993). Lors d'expériences de marquage mktabolique, le PAF apparaiAt d'abord dans la hction phagolysosomale ou dans le dticulum endoplasrnique, tout dépendant du stimulus, pour être ensuite transféré à la membrane plasmique (Venable et al., 1993).

Le

PAF

doit donc être transport6 de son Lieu de synthèse à la membrane plasmique pour sa sécrétion ou pour son expression à la surface celiulaVe. Ce v r t pounait s'exécuter selon au moins deux m6canismes possibles. Une protéine de transport spkinque pourrait déplacer le PAF entre les membranes, comme c'est le cas pour d'autres phospholipides. Une fois rendu à la membrane plasmique, le PAF exécuterait un "flip" pour se retrouver à la surface cellulaire. Ce scénario est appuy6 par l'existence d'une protéine de transport s6lective au PAF, induite durant la diiFf'nciation (Lumb et al., 1990).

De

façon aiternative, le déplacement du

PAF

d'un organite intraceUulaire à la membrane plasmique pourrait avoir lieu par fusion de vésicules de lipides.

En

effet, le PAF synthétisé par les neutmphiles se retrouve dans des vésicules similaires à celles impliqu&s dans le recyclage des membranes (Riches et al., 1990).

Cette

demière altemative est attrayante puisqu'elle constitue _le mécanisme de sécdtion etlou d'expression à la surface c e l l h de plusieurs composés.

Le PAF exerce plusieurs actions en plus d'activer les plaquettes.

Il

agit dans les processus physiologiques normaux comme l'inflammation, l'hémostase et dans plusieurs aspects de la reproduction. Cependant, son rôle dans la médiation de réponses pathologiques incluant l'asthme, l'ischémie, les allergies et le choc septique en ont fait le focus de recherches intenses. In vitro, le

PAF

peut activer les plaquettes, les leucocytes polymo~phonucléaires, les monocytes et les macrophages, et peut aussi stimuler la glywgénolyse dans le foie perfûs6 (Venable et al., 1993). In vivo, le PAF cause une augmentation de la pexméabilxté vasculaire, I'hypotension, une diminution du volume cardiaque, la stimulation de la contraction utérine, des désordres gastrointestinaux, la bronchoconstriction aigu, et I'adhésion des leucocytes aux ceIiules endothéliales. Le

PAF

est re&ouvé chez des patients subissant un choc septique, et des antagonistes du récepteur du PAF amènent une protection significative dans des modèles animaux de septicémie. Plusieurs

* .

symptômes de septicémie peuvent être induits par L'admInrstration de PAF. Ces effets sont médiés à de faibles concentrations variant de 10-12 à

IO-'

M. Le PAF peut aussi être important dans l'inflammation des poumons puisque son administration induit l'œdème et des symptômes caractérisitques de l'asthme (Venable et al., 1993). Plusieurs évidences suggèrent 1' impïcation du PAF dans les maladies coronariennes et vasculaires (Evangelou, 1994).

Suite à l'identification de la structure du PAF, une grande attention fut dirigée à son récepteur spécificique. Certaines obsentations sugg6raient l'existence d'un récepteur du PAF (PAFR) à la surface cellulaire: des exigences strictes de structure et de stéréospécScit6 pour l'activité biologique du PAF, la découverte d'antagonistes spécifiques, la liaison spécifique et saturable du PAF et d'antagonistes radiomarqués, ainsi que l'activation de systèmes de messagers secondaires. Un lien chimique aikyl-éther à la position sn- l de la molécule du PAF est nécessaire pour son activité biologique, et son remplacement par un lien ester amène la perte de cette activité.

Le groupement acétyle mon= la plus grande activité à la position sn-2, tandis que plus on allonge cette chaîne acyle, moins grande est l'activité. Un groupement phosphorylcholine à la postion sn-3 est crucial ii l'activité de la molécule. Le phosphocholine est actif B cette position, et non le phosphoéthanolamine. La chiralité R à la position sn-2 est active, tandis que le stéréoisomère (la formeS) est inactive (Snyder, 1989). Il existe trois classes d'antagonistes du

PAFR

de structures et puissances variées, incluant les analogues p hosp holipidiques, les produits naturels @lus spécialement ceux isolés de chez les herbes), et les composés chimiques synthétiques (Braquet et

al., 1987). Le développement de l'antagoniste radiomarqd 3 ~ - ~ ~ ~ 2 0 8 6 a p r o c d un excellent outil expérimental pour les études de liaison B ce récepteur, puisque contrairement au PAF, il est m6taboliquement stable et la liaison non-spécifique est faible. Des sites de liaison spkifiques au PAF ont été démonûés sur les plaquettes, les neutrophiles, les éosinophiles, les macrophages, les monocytes, les cellules de Kupffer, les cellules de muscles lisses, les ceildes endoth6liales vasculaireç, les cellules épith6liales de trachée, et dans diff6rents tissus comme, entre autres, les poumons, le foie, le cerveau, la rétine, l'iris et l'utérus (Chao et Olson, 1993).

Les

tentatives de purification du

PAFR

ont rencontré plusieurs diffcultés. Premièrement, le PAF est un phospholipide et s'incorpore facilement dans les micelles, et montre une haute liaison non-spécifique. Le deuxième problème est que les cellules cibles du PAF ne possèdent seulement que quelques centaines à quelques milliers de réceptem. De plus, aucun antagoniste ne se prête à la fabrication d'une colonne d'affinité. Quelques essais de purification du réceptew ont été effectués employant des colonnes de chromatographie conventionnelles. De ces travaux ressortirent des protéines de plusieurs masses moléculaires (52, 160, 180, et 220 kDa) réclamant le tiîre de récepteur du

PAF

(Schukla, 1992). Heureusement, le groupe de ShimUni wonda et al., 1991) clona le PAFR de cobaye en utilisant le systErne des oocytes de Xenopus 1aevi.s.

Les

oocytes ont une machine de traduction très efficace et sont capables d'effectuer Ies modifications post- traductionnelies, et de transporter les protéines nouvellement formées aux compartiments cellulaires

9

appropriés.

De

plus, le système d'oocytes o f b i t l'avantage que les récepteurs lies au m6tabolisme des PIS par une protéine G peuvent êûe détectés par un courant vers l'intérieur ("inward")

-

impliquant un canal d'ions Cl dkpendant du ca2'.

Les

oocytes montrèrent un courant vers l'intérieur prédominant lorsque stimulés au PAF 10" _M après trois jours d'incubation suite à l'injection dg& de poumons de cobaye. Une banque de cDNA fiactionnée selon la taille fut conssuite partir d ' M m de poumons de cobaye.

Des

cRNA de dix hctions de 30 000 clones indépendants ont été injectés dans les oocytes et analysés par &ctrophysiologie. Les fractions positives furent sous-divisées jusqu'à l'obtention d'un clone contenant un insert de 3 Kbp (Honda

6 et al., 1991). Un cDNA du PAFR humain a par la suite été isole de banques de cDNA de leucocytes ~akamura et al., 199 1; Kunz et

aL,

1992), de cellules

HL60

Cye et al., 199 l), du coeur (Sugimoto et al., 1992), de cellules EoGl (TPuni et al., 1995) et d'une banque d'ADN génomique (Chase et al., 1993).

Tous

les cDNAs humains montrent la même séquence dans la région codante, cependant deux régions 5' non-codantes ont 6té obtenues (Mutoh et al., 1993).

Un cDNA pour le

PAFR

de rat a aussi éî6 clon6 (Bito et al., 1994).

Les

PAFR humain et de cobaye comportent 342 acides aminés, mais les réceptem du rat et de la souris ont un acide amin6 en moins dans la troisième boucle extracellulaire. Le poids moléculave calcul6 est d'environ 39000.

Les

analyses d'hydrophobicité indiquaient la présence de sept domaines transmernbranaires (DTMs) caractkristiques de la famille des récepteurs couplés aux proté- G (RCPGs).

Le clonage d'un grand nombre de récepteurs et de canaux ioniques a rév616 que plusieurs de ces pmîéines rnembranaires critiques peuvent êûe regroupées en superfades de gènes basées sur des similarités de séquence et de structure. Une de ces superfardles est celle des RCPGs.

Même si les mécanismes de transmission de signal ne sont pas connus pour tous les membres de cette f a d e , dans la plupart des cas la stimulation du récepteur induit l'activation d'une protéine G.

En 1982, la séquence d'acides aminés complète & la rhodopsine bovine fut déterminée (Ovchinnikov et al., 1982). Sa structure prédite, contenant une partie N-termioale et sept hélices a transmembranaires (Harpve et al., 1983) était remarquablement similaire celle précédemment identifiée par ciBiaction d'6lectrons et I'anaiyse de la séquence de la bacténorhodopsine (Probst et al., 1992).

Le

clonage subséquent de quatre opsines humaines (Nathans et Hogness, 1984;

Nathans et ai., 1986) et du récepteur &adrénergique de hamster (Dixon et al., 1986) montrèrent aussi ces caract&istiques strucmales qui devinrent le sceau de cette famiUe de récepteurs. Plus d'une centaine.de RCPGs ont été clonés, et ce nombre augmente rapidement. Le clonage de ces récepteurs permit l'expression à haut niveau de leur protéine dans des lignées cellulaires, facilitant leur caractérisation pharmacologique. L'altération de leur séquence par des techniques de biologie moléculaire a procuré en grande partie les connaissances actuelles sur le rôle fonctiomel de régions

et résidus particuliers de ces récepteurs (Savarese et Fraser, 1992).

Lm RCPGs

sont composés _{que d'une} seule chalne polypeptidique. La structure prédite de ces protéines contient sept segments de 20 2 30 acides aminés hydrophobes fonnant vraisemblablement des h6lices a transmembranaires. Ces hélices sont référées comme étant les domahes tninsmembranaires 1 à 7 (Dl341 il _{D m .} Cette stmcture prédite, basée sur l'hydrophobicité, est appuyée par des analyses de difhction d'6lectrons de la bactériorhodopsine (Henderson et al., 1990) et des 6tudes de digestions protéolytiques de la rhodopsine et du récepteur BI-adrénergique ( E k p v e et al., 1982; Dohlman et al., 1988), ainsi que par l'utilisation d'anticorps contre les diff6rents domaines iatra- et extraceliulsires du' récepteur fkadrénergique (Savarese et Fraser, 1992).

Les RCPGs

ont une partie N-terminale extracellulaire et une partie C- temllnale cytoplasmique.

Les régions de plus grande homologie parmi les

RCPGs

se retrouvent dans les DTMs (Probst et al., 1992). Certains résidus sont présents dans presque tous les RCPGs et pourraient être impliqués dans la structure tertiaire requise pour l'activité du récepteur (Hibert et al., 1991).

Plusieurs Pro dans les

DTM4,5

, 6 et 7 sont particdièrement bien conservées. Ces acides aminés introduisent probablement des torsions ("kinks") dans les h6lices a et pourraient être importants dans la formation du site de liaison ("binding pocketn) (Kibert et

aL,

1991). Parmi d'autres acides aminés bien conservés, on retrouve une Gly, _une Asn et une Val dans le

DTM1;

une

Leu,

deux Aia et un Asp dans le

D m ;

une Ile dans le DTM3; une Trp dans le DTM4; une Phe et une Trp dans le DTM6; et une Asn _et une

Tyr

dans le DTM7 (Pmbst et al., 1992).

Certains

résidus conservks sont remplacés dans des sous-familles particuli2res de RCPGs. Par exemple, la Tip du IYIU6 est substituée par une Met dans les récepteurs des hormones glycoprotéiques (Robst et al.. 1992).

La plupart des

RCPGs

ont une Cys conservée dans chacune des deux premiéres boucles extraceildaires pouvant former un pont disulfure qui stabiliserait la structure fonctionnelle de la

protéine (Savarese et Fraser; 1992). La mutation de l'une ou l'autre de ces Cys altère de façon prononcée la fonction de la rhodopsine et des récepteurs muscariniques ^et &adrénergiques (Savarese et _Fraser, 1992). ia séquence intraceIIiilairre la plus hautement consede est le triplet Asp-Arg-Tyr

(DRY)

adjacent au

D M .

L'Arg de ce triplet est invariable, tandis que 1'Asp et la

Tyr

sont substituées de façon conservative dans plusieurs RCPGs (Robst et al., 1992). ^La partie N-terminale de ces récepteun varie graudement en termes de m e .

Elles

vont de 7 acides aminés chez le kepteur adhosine A2 jusqu'à 300 résidus chez les récepteurs d'hormones glycoprotéiques.

Il

y a en général peu d'homologie de séquence parmi les

RCPGs

entre leurs parties N-terminales. On retrouve la séquence consensus de glycosylation N-X-SiT dans ce premier domaine extfaceUulaire de presque tous les

RCPGs.

La glycosylation peut contribuer à l'expression ad6quate de ces protéines membranaires (Savarese et Fraser, 1992). Certains récepteurs arborant de courtes parties N-terminales, comme les récepteurs a2~-a&nergiques et ad6nosine Ai et A2, ne contiennent pas de site de glycosylation N-terminal (Probst et al., 1992).

La compréhension de la structure du site de liaison des

RCPGs

et des acides aminés interagissant avec les agonistes et les antagonistes evolue rapidement

Les

sites de Liaison de la rhodopsine et des récepteurs adrénergiques et muscariniques ont été partiellement déterminés par des approches biochimiques et de biologie moléculaire (Savarese et Fraser, 1992). Pour la majorité des

RCPGs,

sauf pour les dcepteurs des hormones glycoprotéiques, le site de liaison semble être fom6 par les DTMs. Comme encore aucun

RCPG

n'a 6té criscristallisb, la modélisation en trois dimensions de l'arrangement des

h&es

a est basée sur la structure de la bacténorhodopsine, qui a été d6texminée à haute résolution (Henderson et al., 1990). Cependant, une étude comparative de cartes de projection d'électrons ("projection map") 5 basse résolution a montré une in~Iinaison diff6rente des DTMs de la rhodopsine et de la bacténorhodopsine (Schertier et al., 1993).

Les

D M

disposés "en forme de baril" forment un environnement hydrophile pour la

liaison du ligand @Mme et al., 1990). L'awngement possible des acides aminés autour du site de Iiaison a 6t6 analys6 par le mode1 de roue en hélice ("helical wheel").

Les

helices a contiennent 3.6 acides aminés par tour d'helice (Pmbst et al., 1992). La localisation des résidus autour de l'h6lice pour plusieurs RCPGs suggère que les DTMs contiennent une prédominance d'acides aminés hydrophobes sur un côte, et hydrophiles sur l'au= côté (Donneily et al., 1989). Le côté hydrophile de chaque hélice est postd6 comme fhisant

face

vers l'intérieur et formerait le site de liaison polaire pour le ligand ("binding pocket").

Cette

disposition semble appuyée par des modèles informatiques d'interactions ligands-récepteurs (Hibert et al., 199 1).

Dans les récepteurs a- et badrénergiques, ainsi que pour le récepteur ml muscarinique, la mutag6nèse dirigée a montré que 1'Asp conservé du DTM3 est critique pour la liaison des agonistes et antagonistes (Wang et al., _1991). Les amines cationiques, incluant I'adFénaüne, la noradrénaline, la dopamine, la s6mtonine et l'acétylcholine, contiennent toutes un groupe amine chargé positivement interagissant vraisemblablement avec I'Asp du DTM3 de ces récepteurs. Des études de mutagthèse ont aussi sugg6ré que certains résidus conservés dans des sous-classes de récepteus peuvent contribuer à la spécificité d'interaction avec l'agoniste. Deux Ser conserv6es dans le DïM5 seraient impliquées dans la formation de ponts hydrogènes entre les récepteurs

P-

adrénergiques et leun agonistes. La substitution de chaque Ser par une Ala réduit la liaison de I'agoniste au même point que l'enl&vement du groupe hydroxyle du iigand (Strader et ai., 1989a).

Le &teur aî-adrénergique interagimit de facon semblable avec les ligands adrénergiques (Wang et al., 199 _{1). Deux} Ser correspondantes sont dans le

D M

de tous les récepteurs de la dopamine et une seule Ser conserv6e est retrouvée dans le DTM5 des récepteun de la sérotonine. La similarité de structure du ligand et de la sBquence de ces récepteurs suggèrent que ces Ser formeraient amsi des liens hydrogènes avec le groupe hydroxyle de leur agoniste respectif (Probst et al., 1992).

L a

récepteurs muscariniques contiennent tous une Asn conse~vée dans le DTM6, absente de chez d'autres sous-classes de RCPGs, proposée comme interagissant avec le groupe ester de l'acétylcholine (Hibert et al., 199 1).

De

même, des résidus aromatiques conservés des

10 DTM6 et m"M7 des récepteurs adrénergiques et _{de la} s&otonine pouwient interagir avec les anneaux aryles de leurs ligands (Dixon et al., 1988; Hibert et ^al., 199 1).

Les

hormones glycopmtéiques, telles que la

TSH,

la FSH et la W C G , sont beaucoup plus grosses que la plupart des ligands des autres

RCPGs.

Pour cette raison, la sous-classe de

RCPGs

pour ces hormones auraient &olu6 vers une structure distincte contenant un premier domaine extracellulaire extrêmement long, comportant le site de liaison de l'hormone. Ce domaine extracellulaire glysosylé est riche en Cys pouvant former des ponts disulfures et ainsi aider dans le maintien de la structure en trois dimensions de la protéiine (Sprengel et al., 1990). La localisation extracellulaire du site de liaison de ces homones a 6té confirmée par' l'utilisation de récepteurs chimériques (Nagayama et al., 1991). Au contraire, la liaison du ligand par les récepteun

P-

adrénergiques ne dépend pas du domaine N-terminal extracellulaire (Dixon et ai., 1987).

La liaison et l'activation d'un dcepteur mutant de la W C G dont la partie N-termi.de fut presque totalement délétée montra que la CG peut se lier à la composante formée par les 7

IYThls

du récepteur (Ji et Ji, 1991). Même si cette liaison est de plus basse affinité en absence du domaine N-terminal, ces données suggèrent que le dcepteur peut contenir un site de liaison extracelluLaire de haute affinité et un site de basse affinité dans les DTMs. ïa liaison de la CG au nkepteur mutant stimule tout-de-même la production d'AMPc.

Ii

est possible que le site de liaison

extra ce^^

de haute affinité serve à capter l'hormone et B la présenter au site de liaison intramembranaire, pour ensuite induire la transmission de signal (Probst et al., 1992).

Les RCPGs

sont couplés à diffirents enzymes intraceUulak, canaux ioniques ^et transporteurs par l'entremise de protéines G mimbaumer et al., 1990). Les protéines G, qui s'associent avec les

RCPGs

ii la face intraceliulaire de la membrane plasmique, sont composées de sous-unités a,

P

^et y (Ga, Gp,

Gy).

Par un mécanisme encore mal connu, la liaison de I'agoniste au RCPG catalyse l'échange du GDP pour un

GTP

sur G a (activation de la proteine G), résultant

en sa dissociation des GByet à la stimulation _d'une ou plusieurs voies de signalisation (Birnbaumer et al., 1990). Les Gu libres ont été initialement montrées comme activant deux enymes effectrices, I'addnylate cyclase et la GMPc phosphodiestérase, et il semblait raisonnable

B

ce moment d'assumer que G a contrôlait directement l'activité de toutes les enzymes effectrices. L e rôle assigne aux Gf3y était de mettre fin B l'action des Ga en reformant le complexe hétkotzimérique inactif, et de guider les Ga auprès du récepteur pour la réactivation (Clapham et

Neer,

1993). Ce point de vue changea en 1987 par I'observation de la réguiation d'une enzyme effectrice par les G& (Logothetis et al., 1987). Depuis ce temps, la liste des enzymes régulées par les GPy ne cesse de s'allonger, et jusqu'à présent, autant d'enzymes effectrices sont connues comme étant dgul&s par les Gf3y que les Ga (Clapham et Neer, 1993).

La spécificité de transmission de signai peut être détenninée par la spécificité de couplage entre un récepteur et les protéines

G.

Trois types de travaux, detaillés plus loin, étudiant la relation entre la structure du récepteur et l'affinité pour la protéine G ont été effectués. La mutagénèse dirigée et par délétion impliquent certains acides amines et régions nécessaires pour le couplage à la protéine G. Des &tudes de compétition avec des peptides synthétiques suggèrent les domaines oligopeptidiques pouvant interagir directement avec la pmteine G. L'emploi de chim&res indiquent les régions des récepteurs d6tenninant la spécificité de couplage à la protéine G. Certains principes gh%aux se degagent de ces multiples approches.

Tous

les domaines intracellulaires de divers récepteurs sont impliqués dans le couplage efficace à la prot6ine G. De courtes séquences des dgions adjacentes à la membrane plasmique de la tmisième boucle intraceilulaire, et possiblement de la queue carboxyterminde, apparaissent particulièrement critiques pour d6tenniner la spBcificit6 de couplage

B

la proteine G de plusieurs RCPGs (Pmbst et al., 1992).

La mutation d'acides aminés dans les boucles cytoplasmiques du récepteur f3-adrénergique réduit la transmission de signal @kon et al., 1988). La mutag6nèse dirigée _d'une

Pro

conservée en Thr dans la 2e boucle intracellulaire ne cause aucun changement dans la liaison de I'agoniste au

récepteur, mais amène une réduction d'environ 35% de stimulation de l'adenylate cyclase (O'Dowd et al., 1988). La mutagénèse dirigée a identifi6 des acides aminés chargés dam les w o n s adjacents à la membrane plasmique & la 2e et 3e boucles contribuant au couplage efficace à la protéine G. La mutation de 1'Asp hautement conserv6 adjacent au DTM3 dans la 2e boucle intracellulaire du &epteur Fadrhergique (Aspl30) produit un récepteur de haute affinité pour le ligand mais un couplage réduit ou absent ^iî la protéine G (Fraser et al., 1988). Des résultats similaires ont été obtenus pour les récepteurs muscariniques m i et

au,

adrénergiques (Savarese et Fraser, 1992). Le Glu retrouvé à la position correspondante dans la rhodopsine est impliqué de la même façon dans I'interaction avec la tramducine (Fianke et al., 1990). L'Asp du DTM2, conservé dans presque tous les

RCPGs,

est déterminante dans l'affinité de Liaison du Ligand et l'activation de la prot6ie G de plusieurs RCPGs (SeaKon et al., 19%).

Dans

les récepteurs

a-

adrénergiques et de la dopamine, cet Asp est essentiel pour la modulation du couplage du récepteur par les ions Na' et

H ' ,

possiblement dû à la modulation allostérique de la conformation du récepteur (Neve et al., 1991). Une

C y s

du DTM6, conservée dans la plupart des

RCPGs,

semble être impliquée dans la transmission de signal par le récepteur &acidnergique (Savarese et Fraser,

1992).

Des études de mutagenèse par d6létion du récepteur $2-adrénergique indiquent que les régions pmximales ii la membrane de la 3e boucle intracellulaire sont nécessaires à la transmission de s i g d par ce récepteur (Strader et al., 1987).

Dans

le &epteur abadrénergique, la dél6tion de 7 acides aminés de

la

3e boucle intracelidaire adjacents à la membrane cause une réduction marquée dans le couplage A la phospholipase C (Cotecchia et al., 1990).

Des

délétions d'acides aminés de la queue cytoplasmique adjacents au DTM7 produisent des récepteurs mutants ayant une capacité réduib d'activer la protéine G (Savarese et Fraser., 1992). La mutation d'une Cys palmitylée de la queue cytoplasmique réduit grandement la stimulation de l'adénylate cyclase par le récepteur f32-adréndergique (O'Dowd et ai., 1989). Cette Cys palmitylée pourrait attachée la queue cytoplasmique du récepteur,à la membrane, produisant une 4e boucle intraceilulaire. Cet ancrage à

la membmne placerait possiblement les acides aminés de la queue cytoplasmique pour une interaction optimale avec la proteine G (Ovchinnikov et, 1988). La palmitylation de la Cys correspondante de certains autres RCPGs peut diminuer le couplage du récepteur à ces voies effecaices, diminuer la vitesse d'internalisation du récepteur, ou tout simplement ne pas avoir d'effet détectable (Bouvier et al., 1994).

Les

régions de la queue cytoplasmique et de la 3e boucle intracellulaire adjacentes à la membrane pourraient former des hélices a amphipatiques regroupées.

Ces hklices, ainsi que les acides aminés chargés de la 2e et 3e boucles intracellulaires, interagiraient de façon coopérative pour lier et activer la protéine G (Palm et

al.,

1990). L'activation de protéines G par des hélices a amphipatiques est appuyée par des expériences dans lesquelles les protéines

Gi

et Go ont été directement activées par le mastopamn et d'autres petits peptides fonnant des hkiices a amphipatiques à la surface intracellulaire de la membrane plasmique (EZigashijima et al., 1990).

De plus, l'activation directe de la

Gs

fut démontrée par des peptides synth6tiques représentant les séquences de la 3e boucle intracellulaire adjacentes ^aux M'MS et DTM6 du Iécepteur ^P2- adrénergique (Cheung et al., 199 1).

Des

expériences de compétition dans lesquelles de courts peptides lient de façon compétitive les protéines G, sans toutefois les activer, ont été utiles pour déterminer les régions des RCPGs contactant vraisemblablement les protéines G. Le découplage du récepteur suite à une mutation ou une d&tion d'un segment peut être dû B une perte de contacts avec la protéine G ou à une alté&ion de la structure tertiaire des rieceptem. L'apport des études de compétition a donc été d'une grande valeur pour confinner que la perte de transmission de signal observée suite à une mutation ou à une délétion implique des acides aminés interagissant directement avec la protéine G (Probst et al., 1992). Les régions de divers récepteurs impliquées dans des études de compétition par des peptides incluent, entre autres, les régions adjacentes à la m e m h e des trois boucles intracellulaires et de la queue cytoplasmique du récepteur &adrénergique (Munch et al., 1991), la

2e boucle intracellulaire et la partie C-terminaIe de la 3e boucle intracelluaire du récepteur a 2 ~ - adrénergique ( D a b a n et Neubig, 1991), et la 2e et 3e boucles intracellulaires, ainsi que la région

N-terminale de la queue cytoplasmique de la rhodopsine (Konig et al., 1989). Des ^Iésultaîs sindaires sont obtenus par l'emploi de récepteurs chim6nques (Probst et al., 1992).

La phosporylation de résidus cytoplasmiques a ^été identifiée comme un mécanisme important de la régulation du couplage de la protéine G ii certains R& (Prémont et al., 1995).

La 3e boucle intracellulaire et la queue cytoplasmique sont riches en résidus Ser et Thr constituant des sites potentiels de phosphorylation.

Les

Ianases des RCPGs (GRKs) forment une f d e de sérine/tb%nine kinases qui phosphory lent seulement les RCPGs en confoxmaiion active, i.e. dans la fome liée à I'agoniste (Remont et al., 1995).

Les

récepteurs phosphorylés par une

GRK

d e v i e ~ e n t la cible pour la liaison d'une protéine nommée "arrestine". L'arrestine liée à un récepteur phosphorylé par une

GRK

empêche le couplage du récepteur _à la protéine G. La spécificité de substrats des GRKs est encore mal connue et a ^été determinée surtout par des essais in vitro de phosphorylation de récepteurs purifiés, ou dans des systi3mes de surexpression (Rémont et al., 1995). Ces sites de phosphorylation peuvent être aussi le substrat des protéines kinases A ou C impliquées dans la désensibilisation homologue et h6témlogue des RCPGs (Prémont et aI., 1995).

Plusieurs études ont montré que les signaux induits par le PAF impliquent l'activation de proteines G. La liaison du PAF à son récepteur stimule I'activité GTPase (Hwang et al., 1986).

Le G T P ~ ses analogues stables causent des deplacements d'affinité de la liaison du PAF (Hwang et al., 1986). Le type de protéines G impliqué dans les réponses au PAF peut varier selon le type cellulaire et le système effecteur étudiés.

Il

a eté montré que dans les cellules CHO, le

PAFR

est coup16 ii une Gai ou

G q

(Inimi et al., 1995), ainsi qu'8 une Gao (van Biesen et al., 1996). Le couplage du PAFR aux G a , Gaii, Gai2 et Gao fut observé dans la lignée ceiiulaire neurohybride

NCB-20

flue et al., 1992).

Le PAF active le m6tabolisme des polyphosphoinositols dans p1.usieurs systèmes incluant

les plaquettes, les macrophages, les monocytes, les neutrophiles, les Bosinophiles, les lignéw de lymphocytes B, les cellules _de muscles lisses, les hépatocytes, les cellules de Kupffer, les kératinocytes, les astrocytes et plusieurs autres types cellulaires (Chao et OIson, 1993).

Cette

voie d'activation est médiée par la PLC, et deux produits en sont g&érés, l'inositol I,4,5-triphosphate (IP3) et le diacyiglyc&l. L'IP3 mobilise le ca2+ intmcellulaire et le diacylglychl active la PKC.

L'augmentation du Ca2' intracelldlaire induite par le PAF est principalement due à I'influx de Ca2' extracellulaire, plutôt que de la mobilisation intraceilulaire du ca2' dependante de l'IP3. Les mecanismes de cet

influx

demeurent à déteminer (Chao et Olson, 1993). Le

PAF

active la

PLC

par le couplage à une pmtéine G sensible ou insensible à la toxine de pertussis, dépendant du type cellulaire ( .et al., 1995). Un autre mécanisme possible de l'activation de la PLC par le

PAF

est par l'entremise de sa phosphorylation par des protéines tyrosines kinases (PTKs).

L'implication de PTKs

dans

l'activation de la PLCy par le PAF a ^été proposée dans les plaquettes et les cellules A43 1 (Jlurston et al., 1993).

Des

travaux &cents ont clairement montré que le PAF induit la phosphorylation de

Tyr

et l'activation de la PLCy dans une lignée de lymphocytes B (KuruviUa et d., 1994).

Pa. I'activation de la PLA2, le

PAF

stimule le relâchement de L'AA et des éicosanoides dans divers tissus et cellules (Chao et Olson, 1993).

Cette

production d'&cosanoides semble jouer un r8le important dans la vasoconstriction coronarienne et

La

contactilité du coeur, la broncho~onstriction, l'aggrégation et l'activation des neutrophiles (Inimi et al., 1995). Le PAF active la PLAî par un mécanisme dependant de la PKC, régulé par le niveau intraceUulaire de L'AMPc (Chao et al., 1990). Le PAF a été montré comme stimulant la phosphatidylinositol 3- kinase (PI3K) dans les neutrophiies (Stephens et al., 1993) et

dans

une lignée de lymphocytes B (Kunivilia et al., 1994). Le r61e biologique de la PI3K dans la sipnaiisation du PAF reste à ducider (Iaimi et al., 1995). Le PAF stimule aussi la phospholipase D (PD) dans plusieurs types cellulaires (Chao et Olson, 1993). Le

ca2',

la

PKC

et l'activité de PTKs semblent impliqués dans l'activation de la PLD par le

PAF

(Inimi et al., 1995).

Il

M t connu que les FTKs jouaient un rôle important dans les voies de signalisation des récepteurs de facteurs de croissance, mais des travaux récents indiquent qu'elles sont aussi impliquées dans la transmission de signal médîée par les prot6ines G (Mmhall. 1995). Des études employant des anticorps anti-phosphotyrosines ont montré que le PAF induit la phosphorylation sur

Tyr

de nombreuses proteines ceuulaires des plaquettes, des neutrophiles, des cellules A43 1, des cellules de Kupffer et des lymphocytes B (Tzumi et al., 1995). Quelques unes des bandes phosphorylées ont été identifiées comme suit: la pp60c-src dans les plaquettes et les cellues A43 1, la dans les plaquettes et les lymphocytes

B,

la sous-unit6 régulatrice p85 de PI3

Ky

Fyn et Lyn aussi dans les lymphocytes B, et la MAPK dans les cellules CHO' exprimant le récepteur du

PAF. Des

inhibiteurs de

PT&,

tels que la génistéine et l'erbstatine, inhibent l'activité de la

PLC

stimulée par le PAF (Enmi et al., 1995). Ces inhibiteurs bloquent aussi l'activation de la

P m

et de la

MAPK

induite par le PAF dans les cellules CHO tfansfectées avec le récepteur du PAF

(Liu

et al., 1994).

En plus de son rôle de médiateur pro-infiammatoire, le PAF transmet des signaux de prolif61'dtion et de différentiation dans les cellules non-inflammatoires. Le

PAF

induit l'excroissance des cellules pheochmmocytomes PC12 (Squinto et al., 1989) et régule à la hausse la prolif6ration des lymphocytes (Leprince et al., 1991). Le

PAF

induit aussi l'expression des gènes de réPoGe primaire comme c-fos, c-jun, et

TIS-1

dans plusieurs types cellulires. Ces gènes de réponse primaire semblent jouer des rôles importants dans la croissance et la difl6rentiation cellulaires induites par le PAF. Certains de ces effets peuvent êûe expliqués par l'activation de la

MAPK

par le

PAF.

Le

PAF

induit l'expression de d'autres gènes comme le

CR1

(un récepteur du fragment C3b du s y s t h e de complbment) chez les neutrophiles, l'IL-3 chez les cellules mononucléaires du cordon ombilical humain, l'IL-1, l'IL-6, le TNF, et l'IL-2Ra chez les monocytes (Inimi et al., 1995). Le

PAF

semble augmenter l'expression du gène de son propre récepteur (Mutoh et al., 1994). L'expression de ces g h e s peut jouer un rôle dans l'inflammation,

les réponses immunitall.es et le dommage à la cellule induits par le PAF, mais les mecanismes impliqués restent ii mieux caractériser.

La réponse au PAF montre une désensibilisation homologue à des stimdations dpétées ou prolongées au PAF, entre autres, dans les processus suivant: la sécrétion des amines vasoactifs des plaquettes de lapin, la contraction des muscles lisses de cobaye, l'exocytose des granules des neutrophiles, l'aggdgation des plaquettes, et le relâchement de la dopamine par la lignée cellulaire PC-12 @uni et al., 1995). Plusieurs réponses ceUulaiRs au PAF sont désensibilisées, c o m m e l'activité GTPase (Homma et Hanahan, 1988), la production d'IF3 (Morrison et Shukla, 1988)' la mobilisation du

ca2+

(Schwertschfag et Whorton, 1988), et la phoiphorylation de protéines (Schukla et al., 1989). Le récepteur du PAF exprimé dans les oocytes de Xenopus laevis, les cellules CHO et les cellules COS, montre aussi une désensibilisation de la production d'IR et de mobilisation de

CaZ'

@on& et al., 199 1; Takano et al., 1994).

Des 6tudes de désensibilisation h6térologue ont aussi 6té men6es. La phosphorylation de prot6ines induite par le PAF est désensibilisée dans les plaquettes pdtraitées à la thrombine, mais le prétraitement au PAF n'influence pas la phosphorylation résultant d'une stimulation à la thrombine (Shukia et al., 1989). Dans la lignée cellulaire LLC-PK1, les cellules stimulées par le PAF ou le ON01 11 13 (un analogue du

TXA?)

montrent une désensibilisation hétérologue à l'autre agoniste (Ueda ^et al., 1991). La désensibilisation h6térologue de l'influx de

Ca2*

produit par le PAF dans les cellules prétraitées B la bradykinine fut observée, et l'inverse, le @traitement des cellules avec le

PAF

affecte la réponse calcique induite par la b r a d y u e dans les cellules neurohybrides NG108-15 (Inimi et al., 1995). Le

PAF

désensibilise de façon hétérologue l'activation de la

PU:

induite par le récepteur du TXAZ chez les plaquettes, mais n'a aucun de ces effets sur les cellules de muscles lisses vasculaires (Furci et al., 1991). L'absence de désensibilisation h6téroIogue de la mobilisation de Ca2+ fut observée dans les cellules NG108-15 entre le ph? 'et la bradykinhe, l'endothéline, l'angiotensine II et I'ATP (Yue et al., 199 1). L'activati~ de l'activité GTPase et la

mobilisation du

@'

par le PAF sont inhibées par le prétraitement dz leucocytes avec le

FMLP,

le C5a et l'IL-8 uomhave et al., 1994).

Il

a p p d t donc que la désensibilisation hétérologue est régulée par plusieurs mécanismes avec une sélectivité pour diff6rents types de stimulants pouvant varier selon le cellulaire.

La

PKC

semble impliquée dans la désensibilisation de la réponse au PAF. Le préimitement de plusieurs types ceildaires avec des activateurs de PKC, comme le

PMA

et la té1éocidine, désensibilise les signaux induits par le PAF (Chao et Olson, 1993). L'activation de la

PKC

n'est pas entièrement responsable de la désensibilisation du récepteur du

PAF

(Dom et Davis, 1992). Le récepteur _du

PAF

exprim6 dans les cellules RBL2H3 est phosphoryl6'pa.r l'application du PAF, du PMA ou de I'AMPc dibutyrique. La staurosporine inhibe cornpl&tement la phoshorylation du récepteur par _le

PMA,

mais partiellement celle induite par le PAF. La phosphorylation du récepteur induite par le

PAF

et le PMA, mais pas celie causée par I'AMPc dibutyrique, c o d e avec la

1 i désensibilisation du récepteur (Ali et al., 1994). Donc, le récepteur du

PAF

peut être phosphorylé

, par trois types de kinases, la

PKA,

la PKC et d'autres kinases, probablement du type GRK.

Le

C

PAF fut montré comme activant la PKC et provocant sa translocation à la membrane plasmique dans divers types cellulaires (Chao et Olson, 1993). Dans les leucocytes humains, le PAF induit la translocation d'une

GRK

du cytoplasme à la membrane plasmique, et stimule son activité à un plus haut niveau que l'isoprotérénol (Chuang et al., 1992). Puisque l'induction de la tmslocation d'une GRK est considérée comme la première étape de

La

désensibilisation homologue par une

GRK

(LRfkowitz, 1993), une

GRK

joue possiblement un rôle dans l'arrêt de la signalisation par le récepteur du PAF.

Un

récepteur du PAF dont la queue cytoplasmique fut mnquée peut induire des élévations soutenues d'IP3 et de Ca?

Des

résultats similaires sont obtenus avec un mutant où les &idus Ser et Thr distaux de la queue cytoplasmique sont mutés en Ala. Ces deux mutants activent à de plus haut degrés la MAPK, le relâchement d'AA et l'inhibition de I'adenylate cyclase que le dcepteur W. Tandis que la queue cytoplasmique du PAFR n'est pas requise pour l'activation de multiples voies de signalisation, elle joue un rôle critique dans I'aîténuation du signal

induit par I'agoniste. Il a aussi W noté qu'un peptide synth6tique de la queue cytoplasmique du récepteur du PAF est phosphoryl6 par la

GRKS,

suggerant qu'une _des GRKs peut ê t ~ impliquk dans la phosphorylation et la désensibilisation homologue de ce récepteur ( T ' h o et al., 1994).

L'alignement du récepteur du PAF avec d'autres membres de la famille des RCPGs a mon& que plusieurs de ses acides aminés sont hautement conservés (Kajihara et al., 1994).

Parmi ces résidus conservés, on retrouve la Gly28 et l'Ah35 dans le DTM1; la Leu.59, l'Ah62 et l'Asp63 du

D W ;

la Trp83 et la Cys90 de la premi5re boucle extraceIldaire; la Serl04, la Leu108 et l'ne1 1 1 du DTM3; l'A@ 15 de la 2e boucle intraceiiulaire; la Trp 142 du DTM4; la Cys 173 de la 2e boucle extracellulaire; la Phe195 et l'ne209 du DTMS; la Glu225 de

h

3e boucle intracellulaire;

la Phe241 et la Pro247 du DTM6; l'Asn285, la Pro290 et la Tyr293 du lYïM7; et, la Phe308 et la e s 3 1 7 de la queue cytoplasmique. Les résidus conservés Cys90 et Cys173 poumient former un pont disulfure comme pour d'autres RCPGs (voir plus haut dans cette thèse). Un rôle potentiel des Pro conserv&s des

DTMo

_et Ml47 seraient de participer à la formation du site de liaison ("binding pocket"). Même si le PAF contient un groupe choline charge positivement, 1'Asp du

DTMî,

un présum6 "counter ionn pour les Ligands cationiques (les catécholamines et l'acétylcholine), est absent du PAFR.

Le

PAFR

humain contient un seul site consensus de glycosylation sur Asn (Asn169) dans la 2e bokle extraceUulaire, contrairement au récepteur de cobaye et de rat qui en montrent un de plus dans l'extdmité N-terminale de la protéine. Il a r6cexnxnent eté montré que Streptucoccur pneumoniae utilisait le

PAFR

pour adherer et pénétrer les ceiiules hôtes endoth6iiales, épith6lides ou COS ûansfectées exprimant le récepteur. La progression de l'infection chez le lapin est diminuée de 90% par le traitement avec un antagoniste du

PAFR

(Cundell et al., 1995). Le site de glycosylation sur l'Am169 augmente l'attachement de la bactQie au PAFR mais n'est pas requis pour cet intemction (Rodriguez et al., 1995). Ce site de glycosylation est cependant nécessaire pour le transport efficace à la membrane plasmique, mais ne semble pas jouer de rôle dans l'affinité

et l'activation du récepteur (Rodriguez et al., 1995).

Très

peu d'information existe sur les déténninants de la fonction et de la structure du P A R Mon projet de doctorat consistait donc B déterminer des résidus pouvant influencer l'affinit6 du PAFR pour son ligand ainsi qu'a identifier des acides aminés pouvant participer au couplage de ce récepteur à la protéine G, ou à la transition du nkepteur vers un état de conformation active suite à la liaison de l'agoniste. Dans un premier temps, nous avons donc cherché à muter des résidus de la partie C-temllnale de la 3e boucle intracellulaire du récepteur dans le but &entuel d'intervenir dans le couplage du récepteur B la protéine G etlou d'obtenir un mutant coIlSfitutivement actif.

Les

résultats de ces travaux sont retrouvés dans' le premier aiticle présente dans cette thèse (Chapitre II). D'autre part, nous voulions étudier le rôle du résidu -63 du 2e

DTM

de ce récepteur, qui constitue un acide aminé consem6 dans 98 % des RCPGs à cette position (Probst et al., 1992) (Chapitre III). Nous étions 6gaiement interessés à ~ o ~ ~ t r e le rôle des résidus Phe97, Phe98, As11285 et Asp289; ces points se retrouvent dans le Chapitre

IV

où l'on discute de ces données en relation avec un modèle molécukk en mis dimensions _du site de liaison du PAF réCernment publié (Kajihara et ai., 1994).

II.

ARTICLE

Mutations of two adjacent amino acids generate inactive and constitutively active forms of the human platelet-activating factor receptor.

(Parent, J.L.,

C. Le

Gouili, A.J. de Bmm-Fernandes,

M.

Rola-Pleszczynski et J.

Stankova. J. Bial. Chem. 271,7949-7955, 1996)