Thesis
Reference
Caractérisation morphologique d'un modèle CEP amélioré de DMLA atrophique
TOBALEM, Stéphan Jonathan
Abstract
La DMLA représente la cause majeure de cécité dans le monde industrialisé après 60 ans et son incidence augmentera considérablement avec le vieillissement de la population. Il n'existe malheureusement pas encore de thérapie approuvée pour la DMLA atrophique, notamment car la complexe physiopathologie n'est pas totalement élucidée ni reconstituée sur des modèles animaux. Supposant que l'inflammation et le stress oxydatif sont deux facteurs physiopathologiques précoces essentiels de cette maladie, un « modèle CEP âgé » a été élaboré dans notre laboratoire. Cette thèse vise à en caractériser les atteintes morphologiques par des analyses fondoscopiques, tomographiques par cohérence optique, histologiques et immunohistochimiques. Les résultats démontrent la possibilité de reproduire en 90 jours, avec une excellente tolérance, les lésions pré-atrophiques de la DMLA atrophique tels que épaississement de la membrane de Bruch, dégénérescence de l'épithélium pigmentaire rétinien et des photorécepteurs, offrant la possibilité de développer de nouvelles perspectives thérapeutiques au stade [...]
TOBALEM, Stéphan Jonathan. Caractérisation morphologique d'un modèle CEP amélioré de DMLA atrophique. Thèse de doctorat : Univ. Genève, 2021, no. Méd. 11059
DOI : 10.13097/archive-ouverte/unige:151796 URN : urn:nbn:ch:unige-1517964
Available at:
http://archive-ouverte.unige.ch/unige:151796
Section de médecine Clinique, Fondamentale, ou Dentaire
Département : Neurosciences Cliniques Service : Ophtalmologie
Thèse préparée sous la direction de la Professeure Gabriele THUMANN
CARACTERISATION MORPHOLOGIQUE
D’UN MODELE CEP AMELIORE DE DMLA ATROPHIQUE
Thèse
présentée à la Faculté de Médecine de l'Université de Genève
pour obtenir le grade de Docteur en médecine par
Stéphan, Jonathan TOBALEM de
FRANCE (Lyon)
Thèse n° 11059
Genève
Les travaux de recherche présentés dans la présente thèse font partie intégrante d’un important projet financé par le fond national suisse (bourse SNF no.
31003A_160195/1) dont l’objectif final est de développer une thérapie génique cellulaire basée sur le système non-viral de transposon Sleeping Beauty (SB) 100X dans la Dégénérescence Maculaire Liée à l’Age (DMLA) atrophique.
Durant mon année de recherche 2017-2018 comme doctorant au laboratoire d’Ophtalmologie Expérimentale de la Professeure Gabriele Thumann (UNIGE), et sous la supervision directe de la Docteure biol. Martina Kropp, je me suis
particulièrement investi dans la caractérisation anatomique d’un modèle murin de DMLA atrophique optimisé par mon prédécesseur Mateusz Kecik.
Ce dernier avait élaboré une version améliorée du modèle carboxyéthylpyrrole (CEP) de Hollyfield1,2 sur des souris âgées C57BL6. Particulièrement, il avait travaillé sur le développement des analyses comportementales et avait pu montrer une altération de la fonction visuelle chez ce modèle (thèse UNIGE en cours).
Mon travail a consisté en deux objectifs. D’abord, reproduire le modèle développé par M. Kecik sur un plus grand nombre de souris, notamment l’immunisation, afin de pouvoir poursuivre les autres objectifs du projet. Ensuite, l’essentiel de mon travail, et objet de cette thèse, a été de caractériser ce modèle sur le plan morphologique dans le but d’identifier les atteintes anatomiques de la DMLA atrophique.
TABLE DES MATIERES
Résumé………....4
Introduction……….5
Considérations anatomiques..………..……….6
Formes cliniques de la DMLA………7
Rôle de l’inflammation chronique et du stress oxydatif dans la DMLA………...7
Modifications morphologiques liées à l’âge……….8
Modifications morphologiques dans la DMLA atrophique……….9
Les modèles animaux existants de DMLA atrophique……...11
Le modèle de souris CEP dans la DMLA atrophique………..……13
But de cette thèse………..16
Discussion et conclusion……….17
Références………21
Functional and anatomical characterization of atrophic age-related macular degeneration in an aged mouse model (Annexe 1)………..…….24
Supplemental material (Annexe2)………..………...………...52
Remerciements………65
RESUME
La DMLA représente la cause majeure de cécité dans le monde industrialisé après 60 ans et son incidence augmentera considérablement avec le vieillissement de la population. Il n’existe malheureusement pas encore de thérapie approuvée pour la DMLA atrophique, notamment car la complexe physiopathologie n’est pas totalement élucidée ni reconstituée sur des modèles animaux. Supposant que l’inflammation et le stress oxydatif sont deux facteurs physiopathologiques précoces essentiels de cette maladie, un « modèle CEP âgé » a été élaboré dans notre laboratoire. Cette thèse vise à en caractériser les atteintes morphologiques par des analyses
fondoscopiques, tomographiques par cohérence optique, histologiques et
immunohistochimiques. Les résultats démontrent la possibilité de reproduire en 90 jours, avec une excellente tolérance, les lésions pré-atrophiques de la DMLA
atrophique tels que épaississement de la membrane de Bruch, dégénérescence de l’épithélium pigmentaire rétinien et des photorécepteurs, offrant la possibilité de développer de nouvelles perspectives thérapeutiques au stade précoce.
(150 mots)
INTRODUCTION
La Dégénérescence Maculaire Liée à l’Age (DMLA) est une maculopathie
dégénérative acquise, majoritairement bilatérale, multifactorielle3,4. Les progrès de la médecine ont eu pour conséquence le vieillissement de la population et de ce fait une incidence croissante des pathologies liées à l’âge comme la DMLA5. La maladie affecte la macula, zone centrale de la rétine, responsable de la vision photopique, des détails et des couleurs6. Elle représente actuellement la cause majeure de cécité dans le monde industrialisé après 60 ans7, et on estime que le nombre de patients souffrant de DMLA précoce et tardive augmentera respectivement de 15 et 2.7 millions actuellement à 21.5 et 4.8 millions en 20407. Outre l’âge8,9, les autres facteurs de risque majeurs incluent l’histoire familiale et génétique10-13 , le tabac14, l’obésité15 et l’ethnie caucasienne16. Dans la DMLA atrophique, le mutualisme
symbiotique entre les photorécepteurs (PR), l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR), la membrane de Bruch (MB) et la choriocapillaire est perdu17, résultant en une perte de la vision centrale qui s’associe à la dépression, anxiété et surmortalité3,18,19. En raison de la complexité de cette maladie, nous ne disposons pas encore de thérapie approuvée malgré plusieurs essais thérapeutiques en cours tels que la modulation du cycle visuel, la neuroprotection, la thérapie cellulaire et génique, la suppression de l’inflammation ou encore l’inhibition du complément20. Le développement de modèles animaux fiables de DMLA atrophique est la condition sine qua non à la meilleure compréhension de la physiopathologie de la maladie et l’élaboration de nouvelles thérapies. La présente thèse vise à caractériser, sur le plan
morphologique, un modèle de souris amélioré sur des souris âgées, immunisées par la protéine carboxyethylpyrrole conjuguée à de l’albumine murine (CEP-MSA),
responsable de stress oxydatif et d’inflammation chronique à la phase précoce de la DMLA atrophique.
Considérations anatomiques
Les progrès technologiques récents ont permis d’obtenir, grâce à la tomographie par cohérence optique (OCT) (fig.1), des images proches de l’aspect histologique de la rétine (fig.2).
Figure 1 : Coupe OCT Spectral-Domain (SD-OCT) passant par la macula (humain). Les différentes couches de la rétine et la choroïde sont représentées. D’après le rapport de la Société Française d’Ophtalmologie « OCT en ophtalmologie » (2019)21.
Figure 2 : Histologie de rétine humaine (coloration H&E) constituée de dix couches. 1 : membrane limitante
5 : couche nucléaire interne ; 6 : couche plexiforme externe ; 7 : couche nucléaire externe ; 8 : membrane limitante externe ; 9 : photorécepteurs ; 10 : épithélium pigmentaire. A noter que la choroïde sous-jacente est elle- même constituée de cinq couches: membrane de Bruch, choriocapillaire, les deux couches vasculaires de Haller et Sattler, et suprachoroïde D’après le rapport de la Société Française d’Ophtalmologie « Oedèmes maculaires » (2016)22 .
Formes cliniques de la DMLA
La DMLA atrophique est caractérisée par la présence de drusen entre l’EPR et la membrane de Bruch (MB), de remaniements de l’EPR ainsi que d’une atrophie géographique au stade avancé3,4. La perte visuelle est habituellement progressive sur plusieurs années; toutefois dans 10-15% des cas, la détérioration peut être plus rapide et extensive3,4 , et évoluer vers la forme exsudative.
La DMLA exsudative est caractérisée par la formation de néovaisseaux choroïdiens (NVC) à travers la MB qui endommagent l’interface entre MB, EPR et PR3,4. Du fluide, des exsudats et/ou hémorragies peuvent se former dans l’espace sous-
rétinien et/ou sous l’EPR3,4. En l’absence de traitement par injections intra-vitréennes de molécules anti-VEGF (vascular endothelial growth factor), l’évolution naturelle est la formation de cicatrice fibrotique maculaire responsable d’un scotome central3,4.
Rôle de l’inflammation chronique et du stress oxydatif dans la DMLA
Les processus inflammatoires exercent un rôle majeur dans le développement de la DMLA atrophique. Ceux-ci incluent la formation de drusen, contenant la
vitronectine23 et de nombreuses molécules de l’inflammation4,24-26 telles que la cascade du complément27,28; le recrutement de macrophages destructeurs
tissulaires29 ainsi que l’activation et l’accumulation de la microglie rétinienne30. Il a aussi été montré une association entre les polymorphismes du gène pour le Facteur H du Complément (CFH) et la DMLA31,36.
développement de la DMLA atrophique. La rétine est particulièrement vulnérable au stress oxydatif en raison de sa consommation importante en oxygène et haute proportion d’acide gras polyinsaturés37-40, et de la présence de molécules
photosensibles telles que la rhodopsine ou la lipofuscine38. Plusieurs facteurs de risque de la DMLA tels que l’âge, le tabac et l’exposition à la lumière du soleil augmentent le stress oxydatif37,41. Les individus atteints de DMLA présentent des niveaux élevés de péroxydation lipidique42. Les suppléments alimentaires à base d’anti-oxydants ont montré une réduction du risque de progression de la maladie43. En outre, les systèmes de lutte contre le stress oxydatif rétinien sont altérés dans la DMLA44 par une réduction de l’activité des enzymes (superoxyde dismutase,
glutathion peroxydase et catalase) et molécules accessoires anti-oxydantes
(vitamine C, vitamine E, ubiquinol et caroténoïdes)43,44 ; en particulier la lutéine et la zéaxanthine, deux pigments maculaires appartenant aux caroténoïdes et protégeant la rétine des espèces réactives d’oxygène, y sont diminuées45-47.
Modifications morphologiques liées à l’âge
Le vieillissement physiologique s’accompagne d’un ensemble de modifications
maculaires affectant les PR, l’EPR, la MB et la choriocapillaire48-50. La répartition et la densité des PR diminuent48-50. L’EPR témoigne d’une perte de pigments de
mélanine, de la formation de granules de lipofuscine et d’une accumulation d’organites48-50. Au niveau de la membrane basale s’accumulent des dépôts
laminaires (matériel granulaire riche en lipides et fibres collagènes laches localisés entre la membrane plasmatique et la membrane basale de l’EPR) et linéaires
(vésicules phospholipidiques et granules denses en électrons situés au niveau de la
couche de collagène interne de la MB)51-55 (fig.3). La choriocapillaire présente une involution progressive56.
Figure 3 : Illustration schématique des dépôts laminaires et linéaires basaux qui entraînent un épaississement de la couche de collagène de la membrane de basale. D’après le rapport de la Société Française d’Ophtalmologie « Rétine et vitré » (2018)50.
Modifications morphologiques dans la DMLA atrophique
Les drusen sont typiquement retrouvés dans la DMLA atrophique. Au fond d’oeil, ils ressemblent à des petites lésions arrondies et jaunâtres situées au pôle
postérieur3,50. En SD-OCT, ils réalisent des élévations nodulaires sous l’EPR ou des décollements de l’EPR50. Histologiquement, ils correspondent à un épaississement pathologique de la MB (en microscopie optique) et à des dépôts laminaires et linéaires (en microscopie électronique) pouvant causer une rupture de la MB à un stade avancé50,51 (fig.4). Les modifications structurelles de l’EPR sont caractérisées par l’hyperpigmentation focale et l’atrophie3,50 (fig.4). Au fond d’oeil, dans les zones
d’atrophie, les vaisseaux choroïdiens non-masqués sont plus facilement visibles3,50. En SD-OCT, il existe une interruption de l’EPR, de la ligne ellipsoïde et de la couche des PR qui s’associe à une hyper-réflectivité des couches rétiniennes externes50. Histologiquement, l’atrophie se caractérise par une perte des PR et des cellules d’EPR avec adhérence de la couche plexiforme externe à la MB épaissie, et des mottes pigmentaires s’accumulent dans l’espace sous-rétinien et en rétine
externe50,51. La choriocapillaire est aussi le siège d’amincissement et d’atrophie56-58. Il semble que l’atteinte des PR et celle de la choriocapillaire survienne
secondairement à la formation des drusen et au dysfonctionnemet de l’EPR17. En somme, la relation de mutualisme symbiotique entre les PR, l’EPR, la MB et la choriocapillaire est perdue, ce qui résulte en la destruction et au dysfonctionnement de tous les composants de ce complexe17.
Figure 4 : Schéma représentant les changements dégénératifs de l’épithélium pigmentaire rétinien (RPE) et de la MB durant l’évolution de la DMLA atrophique. (A) Morphologie en cube de l’EPR sain. La MB est d’épaisseur normale. (B) Aplatissement de l’EPR avec premiers dépôts laminaires basaux (BlamD). (C) Poursuite de l’aplatissement de l’EPR avec développement de nombreux dépôts laminaires basaux et apparition de dépôts linéaires basaux (BlinD). (D) Large drusen composé de débris hétérogènes s’accumulant dans les dépôts laminaires et linéaires basaux. Epaississement et rupture de la MB. Atrophie de l’EPR sus-jacent. BrM, Bruch Membrane; RPE, Retinal Pigment Epithelium; BlamD, Basal laminar deposits; BlinD, Basal linear
deposits. D’après Handa JT, Mol Aspects Med (2012)59.
Les modèles animaux existants de DMLA atrophique
Un certain nombre de modèles décrits ont permis de mieux comprendre les rôles essentiels du stress oxydatif chronique, de l’inflammation et de la dysrégulation immunitaire, ainsi que du métabolisme lipidique dans la physiopathologie de la
DMLA59. Cependant, aucun ne combine toutes les caractéristiques histologiques et
fonctionnelles de la DMLA humaine.
Ceux agissant sur les facteurs du complément
Ils présentent un phénotype incomplet (absence d’atrophie des PR dans le modèle transgénique CFH Y402H)60, des éléments atypiques dans la DMLA atrophique (amincissement de la MB dans le modèle Cfh-/-. décollements de rétine et prolifération/migration de cellules endothéliales intra-rétiniennes dans le modèle transgénique surexprimant C3)61 ou encore une apparition trop tardive de la maladie (1 an pour le modèle transgénique CFH Y402H)60.
Ceux agissant sur les chémokines
En général, ils présentent un âge d’apparition tardif de la maladie (9 mois pour les modèles Ccl2-/- et Ccr2-/-62, 12 mois pour le modèle Cx3cr1-/-63). A l’inverse, dans le modèle Ccl2/Cx3cr1-/- les premiers signes de la maladie sont visualisables dès 6 semaines mais avec dans 15% des cas une néovascularisation chroroïdienne
Ceux agissant sur le métabolisme lipidique/glucidique
Les modèles riches en matière grasse66, index glycémique élevé38, ApoE-/-66 ou transgénique mcd67 présentent les symptômes de la DMLA tardivement à l’âge de 8- 9 mois.
Ceux induisant du stress oxydatif
Les modèles Ceruloplasmin/hephaestin-/-68 et Sod2-/-69 sont responsables de la mort précoce de l’animal. Le modèle Sod1-/- présente un âge d’apparition tardif de la maladie (7 mois)70 et dans 10% des cas une néovascularisation chroroïdienne secondaire71. Le modèle de rat OXYS, responsable de sénescence accélérée, présente vers l’âge de 12 mois une fibrose et des décollements hémorragiques de la rétine secondaires à la néovascularisation chroroïdienne72. D’autres modèles, tels que la stimulation par la lumière et l’injection d’iodate de sodium73-75, sont peu coûteux, de développement rapide (en 1-7 jours) réduisant ainsi la souffrance de l’animal, mais ne reproduisent toutefois que le stade ultime de la maladie. Le modèle NRF2-/-, par l’inactivation de la voie Nrf2, induit une surélévation plasmatique de la protéine CEP59. Enfin, « le modèle CEP »1,2, basé sur l’immunisation de l’animal par la protéine CEP-MSA, est expliqué plus en détail dans la section suivante. Il s’agit du modèle choisi dans la présente thèse en raison de ses multiples avantages dans la DMLA atrophique : peu coûteux et reproductible, possibilité de reproduire de manière accélérée (mais selon chaque étape) les atteintes fonctionnelles et histologiques de la maladie ainsi que de réaliser des manipulations génétiques, et absence de néovascularisation choroïdienne secondaire.
Le modèle de souris CEP dans la DMLA atrophique
La protéine CEP (fig.5), qui est présente à un taux élevé dans le vitré et le plasma de patients atteints de DMLA38,76,77, est responsable de stress oxydatif. Elle est le
produit de l’oxydation d’un acide gras polyinsaturé essentiel, l’acide
docosahexaenoïque (DHA, 22:6n-6), retrouvé abondamment dans les PR78.
Figure 5: Synthèse chimique de la protéine CEP-modifiée. D’après Salomon RG et al, Chem Res Toxicol (2011)79.
Pour cette raison, Hollyfield1,2 a utilisé la protéine CEP-MSA pour générer une réponse immunitaire et simuler les symptômes de DMLA atrophique chez de jeunes souris C57BL6 âgées de 2 mois. Afin d’étudier également le rôle du vieillissement sur la réponse immunitaire, deux groupes ont été établis. Dans le groupe immunisé
“à court terme”, les souris recevaient un protocole renforcé d’immunisation étalé sur une période de 2-3 mois avant d’être euthanasiées. A l’opposé, dans le groupe immunisé “à long terme” incluant les effets de la sénescence, les souris recevaient un protocole d’immunisation plus faible et plus court, puis étaient évaluées pendant 12-14 mois avant d’être euthanasiées. Le modèle de Hollyfield à « court terme » montrait des modifications focales de l’EPR et des PR telles que vésicules et gonflement cellulaire, mort cellulaire, pyknose des PR, envahissement de cellules immunitaires (macrophages et monocytes) dans la matrice interphotoréceptrice et de complément C3d, alors que le modèle « à long terme » retrouvait aussi un
épaississement de la MB et des dépôts laminaires basaux et drusénoïdes. Il est
intéressant de constater que ce modèle n’a développé aucune néovascularisation choroïdienne justifiant tout son intérêt dans la DMLA atrophique.
Toutefois, ce modèle présente certaines limites. En effet, l’âge est le principal facteur de risque de la DMLA atrophique; paradoxalement, dans le modèle d’Hollyfield, l’immunisation a été pratiquée sur des souris jeunes agées de 2 mois seulement.
Dans le groupe “à court terme”, l’euthanasie des animaux a eu lieu seulement à l’âge de 5-6 mois ne permettant pas d’étudier le rôle du vieillissement dans la
physiopathologie de la maladie. Dans le groupe “à long terme”, l’euthanasie a eu lieu plus tardivement vers 14-16 mois, mais les souris jeunes au moment de
l’immunisation présentaient encore de bonnes défenses anti-oxydantes, ne reproduisant ainsi pas de manière correcte la physiopathologie de la maladie.
Acessoirement, cela pose un problème de coût et de logistique car les souris doivent être hébergées et surveillées pendant plus d’une année. En conséquence, il
semblerait physiologiquement plus intéressant d’étudier le modèle de DMLA atrophique sur des souris déjà âgées au moment de l’immunisation.
Fondement de la démarche éthique appliquée à l’expérimentation animale, la règle des 3Rs (réduire, raffiner, remplacer) soutient l’amélioration des méthodes
d’expérimentation afin de réduire autant que possible les souffrances affligées à l’animal. Certains auteurs ont proposé de réaliser l’injection dans le jarret au lieu de la patte de l’animal. L’injection au jarret réduit le contact du site d’injection avec le sol de la cage possiblement infecté (litière, fèces, urine), évite l’appui sur le site
d’injection permettant ainsi de conserver l’agilité de l’animal, et réduit
significativement la douleur et le pourcentage d’effets secondaires (infection et nécrose). Toutefois, la méthode d’injection à la patte reste encore souvent utilisée (parfois sur justification valable) bien qu’allant à l’encontre des lois relatives à la
protection des animaux. Dans son modèle, Hollyfield n’a pas précisé explicitement le site d’injection utilisé.
Le groupe d’Ophtalmologie Expérimentale de la Professeure Thumann travaille entre autres sur le développement de thérapies géniques pour la forme atrophique de la DMLA ce qui requiert des modèles fiables de cette maladie. En partant du postulat que l’inflammation et le stress oxydatif37-39,44 sont deux facteurs clés dans la
physiopathologie de la DMLA atrophique, un projet de recherche a été élaboré afin de développer un modèle CEP optimisé de DMLA atrophique reproduisant plus fidèlement la physiopathologie supposée de la maladie et respectant le bien-être des animaux. Ce projet a été décomposé en deux parties effectuées au cours de deux thèses de doctorat en médecine humaine. Dans la première partie, le doctorant M.
Kecik a élaboré (thèse UNIGE en cours) un protocole d’immunisation amélioré se basant sur quatre injections (une immunisation principale à J0 de 100 μg de CEP- MSA en solution dans le CFA injectée dans chaque jarret, puis trois rappels à J10, J20 et J90 de 100 μg de CEP-MSA en solution avec l’IFA injectés dans la nuque) chez des souris C57BL6 âgées entre 12 et 18 mois dans le but de provoquer une réponse immunitaire maximale et reproduire la progression lente de la DMLA atrophique tout en réduisant la souffrance de l’animal. La souris a été choisie car il s’agit d’un modèle bien adapté et établi en ophtalmologie expérimentale,
particulièrement dans la dégénérescence rétinienne, en raison d’une anatomie comparable à l’oeil humain (bien qu’elle ne dispose pas de macula), de la possibilité de transfert génétique et de microchirugie comme la transplantation sous-rétinienne tout en gardant un coût abordable et hébergement facile en animalerie80. M. Kecik a réalisé des analyses comportementales retrouvant une baisse d’acuité visuelle liée à
l’âge plus importante dans le groupe immunisé (thèse UNIGE en cours). La deuxième partie est l’objet de ma these dont le but est décrit ci-après.
But de cette thèse
L’objectif du projet a été la caractérisation morphologique rétinienne du modèle CEP amélioré développé par M. Kecik. Par le biais d’analyses fondoscopiques,
d’imageries in vivo (OCT), histologiques (microscopies optique et électronique) et immunohistochimiques (Rhodopsine, RPE 65, Iba-1, GFAP, Vitronectine, C3, TUNEL), la présente thèse vise à évaluer les altérations pathologiques structurelles retrouvées dans la DMLA atrophique en supposant le rôle essentiel de l’inflammation et du stress oxydatif dans la physiopathologie précoce de la maladie.
DISCUSSION ET CONCLUSION
La prévalence élevée de la DMLA atrophique et la nécessité de développer des traitements efficaces ont conduit à la conception de multiples modèles animaux.
Ces derniers ont permis de mettre en lumière l’importance du stress oxydatif chronique, de l’inflammation et de la dysrégulation immunitaire, ainsi que du métabolisme lipidique dans la physiopathologie de la DMLA20.
Les modèles animaux de DMLA in vivo déjà décrits81 agissent sur ces derniers facteurs par le biais de modifications génétiques62-65,67,72,82,83 , pharmacologiques1,2, ou stimuli physiques73-75.
Cependant, ces modèles ne sont pas optimaux car ils se heurtent à des
problématiques majeures limitant leur transférablité à l’homme telles que leur coût élevé et complexité, la survenue de néovaisseaux choroïdiens ou encore une dégénérescence rétinienne trop rapide (ne reproduisant que le stade terminal de la maladie) ou au contraire trop lente. Surtout, aucun ne combine toutes les
caractéristiques histologiques et fonctionnelles de la DMLA humaine. Ils ne permettent pas non plus de reproduire l’influence de l’âge au cours de la DMLA atrophique. Enfin, l’apparition de comorbidités qui augmentent la souffrance de l’animal est incompatible avec le principe des 3Rs.
Le modèle développé par M. Kecik se diffère de celui d’Hollyfield1,2 par un protocole renforcé sur des souris plus âgées et un site d’injection au jarret plus éthique
(diminution de la douleur, réduction du risque infectieux et conservation de l’agilité)85,86.
Ce modèle a montré son efficacité sur l’altération de la fonction visuelle (fig. 2 de l’annexe 1) (thèse UNIGE M. Kecik en cours).
Les résultats présentés dans cette thèse montrent qu’il a été possible de simuler, en seulement 90 jours et avec une excellente tolérance de l’animal, les symptômes pré- atrophiques habituels de la DMLA en induisant une réponse immunitaire maximale sur des souris C57BL6 âgées. Les analyses fondoscopiques ont retrouvé des altérations drusénoïdes à 3 mois (fig. 3 de l’annexe 1). Les études histologiques et immunohistochimiques (fig. 5, 7-10 de l’annexe 1) démontrent la dégénérescence des segments externes des PR (désorganisation, gonflement, vacuolisation, et pyknose), la présence de dépôts laminaires basaux et drusénoïdes et l’invasion de cellules immunitaires dans l’interface sous-rétinienne, l’hypoplasie de l’EPR et l’épaississement de la MB, réalisant un tableau associant à la fois les symptômes des modèles court terme et long terme de Hollyfield2. En outre, l’imagerie in vivo par SD-OCT a retrouvé une augmentation de l’épaisseur rétinienne avec l’âge qui est davantage prononcée chez les souris CEP (+0.172 UI en 8 mois ) que le groupe contrôle (+0.150 UI en 8 mois) (p<0.0001) (fig.4 de l’annexe 1). Aussi, contrairement à d’autres modèles73,87, il n’a pas été retrouvé d’apoptose (TUNEL) (fig.6 de l’annexe 1) laissant donc supposer un processus nécrotique au stade de DMLA pré-
atrophique. De manière générale, les contrôles non-CEP âgés présentaient des altérations rétiniennes similaires aux souris CEP mais à un degré moindre,
confirmant les modifications morphologiques rétiniennes liées au seul facteur âge.
Ce dernier point démontre l’importance de considérer le vieillissement lors de l’élaboration de nouvelles approches thérapeutiques et de différencier dans de
futures études les effets du vieillissement de ceux liés à l’immunisation. Une limite de cette étude est liée à son design imposant des analyses in vivo répétées et des sessions d’entraînement élaborées ce qui n’a pas permis de travailler sur un plus grand échantillon limitant ainsi la puissance de l’étude.
En règle générale, un modèle fiable d’une maladie est une aide précieuse au développement de nouvelles thérapies. L’élaboration de notre modèle servira à tester de nouvelles thérapies pour la DMLA atrophique au stade précoce, c’est-à-dire au mieux avant la perte visuelle et la destruction anatomique (photorécepteurs, EPR, MB et choroïde). En particulier, le groupe d’Ophtalmologie Expérimentale évalue actuellement une thérapie génique non virale par le système de transposon
SB100X88-91. Les transposons sont des séquences d’ADN présentes aléatoirement dans la nature qui ont la capacité de se déplacer dans le génome par un mécanisme de transposition92. Brièvement, des cellules d’épithélium pigmentaire sont isolées à partir de biopsie autologue, électroporées pour délivrer les gènes codant pour les protéines thérapeutiques PEDF (pigment epithelium-derived factor)93-96 et GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)97,98 dans le génome cellulaire de l’hôte, puis transplantées sous la rétine afin de délivrer de manière continue et
durable des protéines anti-inflammatoires et neuroprotectrices pour la rétine.
En conclusion, le « modèle CEP âgé » utilisé dans cette thèse offre la possibilité de reproduire en seulement 90 jours les lésions morphologiques pré-atrophiques de la DMLA atrophique et améliore le confort de l’animal. Les analyses fondoscopiques ont retrouvé des altérations drusénoïdes à 3 mois et l’imagerie in vivo par OCT a montré une épaisseur rétinienne augmentée à 6 mois. Les analyses microscopiques (optique et électronique) et immunohistochimiques (Rhodopsine, RPE 65, Iba-1, GFAP, Vitronectine, C3, TUNEL) ont pu montrer, à partir de 3 mois, la dégénérescence des segments externes des PR (désorganisation, gonflement, vacuolisation, pyknose), la présence de dépôts laminaires basaux et drusénoïdes ainsi que de cellules immunitaires dans l’espace sous-rétinien, l’hypoplasie de l’EPR
et l’épaississement de la MB. Il apporte de nouvelles perspectives pour le développement de thérapies dans la lutte contre la dégénérescence rétinienne au stade précoce de la DMLA atrophique, comme notre thérapie génique basée sur le SB100X visant à préserver un environnement rétinien neuroprotecteur en diminuant le stress oxydatif et l’inflammation.
REFERENCES
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ANNEXE 1 :
Functional and anatomical characterization of atrophic age-related macular degeneration in an aged mouse model.
Stéphan Tobalem1, 2*, Mateusz Kecik1, 2*, Maëllie Midroit1, 2, 3, Djehna Scaldino4,5, Sébastien Tardy4,5, Thais Bascuas1, 2, Nina Harmening1, 2, Leonardo Scapozza4,5, Gabriele Thumann1, 2, Martina Kropp1, 2
*equal contribution
1Experimental Ophthalmology, University of Geneva, Geneva, Switzerland;
2Department of Ophthalmology, University Hospitals of Geneva, Geneva, Switzerland
3Department of Fundamental Neurosciences, University of Lausanne, Switzerland
4Pharmaceutical Biochemistry/Chemistry group, School of Pharmaceutical Sciences, University of Geneva, Geneva, Switzerland.
5Institute of Pharmaceutical Sciences of Western Switzerland, University of Geneva, Geneva, Switzerland.
Word count: 5049
Grant information: the work has been funded by the Swiss National Science Foundation (SNSF), grant no. 31003A_160195
Commercial relationship disclosures: None.
Cet article a été publié dans Journal of Ophthalmology and Research
(J Ophthalmol Res 2021; 4 (2): 128-152 - DOI: 10.26502/fjor.2644-00240032).
Abstract
Purpose: To develop an animal model of atrophic age-related macular degeneration (aAMD) in aged mice that more closely mimics the natural progression of the disease. Methods: 12 and 18-month old CBl57/6JRj mice were immunized with murine serum albumin (MSA) conjugated with carboxyethylpyrrole (CEP). The immunization, given into the hock, was followed by 3 booster injections into the neck over a 3-month period. Immunized mice and age-matched controls were trained for a visual discrimination and an optokinetic response task to determine the objective visual threshold (OVT) at arrival and at 3 months; funduscopy and ocular coherence tomography were performed. After sacrifice, the eyes were enucleated for histological, immunofluorescent and electron microscopy analyses. Results: Retinal imaging confirmed that all mice had normal retinas upon arrival. Three months after mice were immunized the normal retinal age-related alterations were significantly more pronounced in CEP–immunized than in control mice as evidenced by drusenoid alterations, increased retinal thickness, immune activation, signs of retinal degeneration, decreased OVT. Electron microscopy indicated degeneration of the retinal pigment epithelium (RPE). Conclusions: The retinal and behavioral changes in the “CEP-aged-mouse“ will be useful for the investigation of novel treatments of aAMD.
Introduction
In industrialized countries excellent health care and progress in medicine have increased life expectancy and the number of elderly people1, with concomitant increase of age-related diseases such as age-related macular degeneration (AMD)2. It is estimated that the number of patients suffering from early and late AMD will
increase from 15 and 2.7 Mio, respectively, to 21.5 and 4.8 Mio respectively by 20403; approximately 80% of these patients will suffer from atrophic AMD (aAMD).
No current approved therapies are available to treat aAMD. Even though several promising treatment approaches are being considered, which focus on visual cycle modulation, neuroprotection, suppression of inflammation and complement inhibition4, progress is hampered by the absence of an appropriate animal model.
A significant cause for age-related diseases, including aAMD, is cellular oxidative stress with the resultant accumulation of reactive oxygen species, which damages and causes cell death2. Several animal models of aAMD have been developed;
however, animal models that develop choroidal neovascularization (CNV)5–7, which is not a feature of aAMD, time-consuming6,7 or cause rapid retinal degeneration7,8 are not suited for the analysis of therapeutic approaches that endeavor to interfere with the development of aAMD at an early stage of the disease.
Hollyfield et al. developed a model of aAMD in mice by immunizing 2-month-old mice with carboxyethylpyrrole coupled to murine serum albumin (CEP-MSA); CEP is an oxidation adduct produced from docosahexaenoic acid and is elevated in the vitreous and plasma of aAMD patients9,10. Here, we report a modification of the model of aAMD that Holyfield developed in young mice9,10 by modifying the immunization protocol and using old mice establishing a model of aAMD that better recapitulates to the human disease without accompanying adverse events.
Methods Chemicals
Isoflurane (Baxter AG, Deerfield, USA); Ketamine (Ketalar®, Pfizer, New York, USA);
Medetomidine (Domitor®, Orion Pharma, Dhaka, Bangladesh); NaCl (Laboratrium Dr.
G. Bichsel, Unterseen, Switzerland); Thiopental Inresa (Ospedalia AG, Hünenberg, Switzerland); complete (CFA) and incomplete (IFA) Freund’s adjuvants (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, USA); glutaraldehyde (GDA, Polysciences, Warrington, USA);
cacodylate buffer, osmium tetroxide, propylene oxide, Epon and N-benzyl- dimethylamine, paraformaldehyde (PFA), Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), hemalum (Haemalum Mayer's) solution for microscopy, eosin (Eosin Y), citrate acid monohydrate, BSA, Tween 20 (Merck, Darmstadt, Germany);
Vectamount (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA); ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA); MSA was kindly provided by Prof. Scapozza (University of Geneva, Geneva, Switzerland).
Reagents and Analytical procedures for the Synthesis of CEP-conjugated MSA All reagents for the synthesis were purchased from Sigma-Aldrich (Merck, St Louis, Missouri) with a purity greater than 98% and used without prior purification.
Anhydrous solvents kept over 4 Å molecular sieves (Acroseal® 100 mL bottles) were used for reactions (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA). Solvents of analytical or HPLC grade were used for purifications and reaction treatments (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA). For working under inert conditions argon (PanGas 6.0 quality, Dagmersellen, Switzerland) was used. Flash chromatographic purifications were performed on an automated Grace Reveleris® apparatus and using a pre-packed silica gel column (FlashPure® ID Silica 4 g or 12 g, 0.040-0.060 mm mesh, Büchi Labortechnik, Flawil, Switzerland). Reactions were monitored by thin layer chromatography (TLC) on precoated silica gel plates (Merck silica gel 60 F254) and observed with a UV lamp at 254 nm and 366 nm. A Bruker Avance III HD 600 MHz NMR (Nuclear Magnetic Resonance) spectrometer equipped
with a QCI 5 mm Cryoprobe and a SampleJet automated sample changer (Bruker BioSpin, Rheinstetten, Germany) was used to perform 1H and 13C DEPTQ (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer including detection of quarternary carbons) NMR experiments.
Names of compounds follow IUPAC rules and molecules are drawn by ChemDraw Professional software (version 16.0). All chemical shifts are expressed in parts per million (ppm) relative to the peak of deuterated chloroform (CDCl3). The following abbreviations are used to explain the observed multiplicities of signals: s, singlet; d, doublet; dd, doublet of doublet; ddd, doublet of doublet of doublet; t, triplet; td, triplet of doublet; q, quadruplet; m, multiplet. The device used to record low resolution mass spectra (LRMS) was an Advion ExpressionL CMS operating in electrospray positive and negative mode (ESI) simultaneously.
Animals and immunization
Male 12 and 18-months old CBL57/6JRj mice (Janvier Labs, Le Genest Saint Isle, France) were housed at the University of Geneva animal facility under standard animal facility conditions on a 12 h light/dark cycle, with food and water available ad libitum. For short-term anesthesia mice were placed for 30-60 sec in a gas-tight, acrylic glass box containing 5% isoflurane and 95% O2. Long-lasting anesthesia was induced by intraperitoneal (i.p.) injection of Ketamine (75 mg/kg) and Medetomidine (0.36 mg/kg) diluted 1:2 in 0.9% NaCl. Animals were sacrificed by an overdose of Thiopental Inresa (150 mg/kg i.p.). Animal experiments were approved by the cantonal Département de la sécurité, de l'emploi et de la santé, Domaine de l’expérimentation animale, Geneva, Switzerland (no. GE/82/18), and complied with the ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research.
The immunization procedure is based on studies of Hollyfield et al.9,10 and Kamala et al.11. Briefly, animals were injected subdermally (s.d.) into the hocks with CEP-MSA, emulsified in CFA followed with 3 booster injections in the neck with CEP-MSA in IFA at 10, 20 and 90 days. Tolerability of the procedure was documented qualitatively in a score sheet based on criteria including weight, spontaneous standing on back legs, local signs of inflammation, general agility, fur and grimace scale.
Synthesis of CEP-conjugated MSA
The strategy for grafting the CEP entity onto MSA has been inspired by the synthesis work published by Salomon et al.12 and Lu et al.13. Briefly, the synthesis consists of five steps (Figure 1). The first 4 steps of the CEP-conjugated albumin synthesis consist in the synthesis of 9-fluorenylmethyl (Fm) ester of 4,7-dioxoheptanoic acid (DOHA) to be then coupled via Paal–Knoor reaction to the activated MSA during step number 5. The first 4 steps were performed under inert atmosphere of argon while the fifth step was performed in PBS. Reactions were monitored by TLC and compounds were purified by flash chromatography. The identity of each synthetized product was assessed by 1H and 13C DEPTQ NMR and LRMS. 1H and DEPTQ 13C NMR spectra as well as LRMS analysis are provided in supplementary material. The purity was evaluated from the quality of the 1H NMR spectra and monitored by chromatography.
In vivo retinal imaging and intraocular pressure (IOP) measurement
Before funduscopy and ocular coherence tomography (OCT), five IOP measurements were done in non-sedated mice and the mean calculated automatically using the Tonovet® device (Icare, Vantaa, Finland). Anesthetized mice
