3
èmeannée DFGSP UE opt. Bases des interactions médicament/cible thérapeutique Responsables: Drs. A. Chavanieu – A. Echalier
aude.echalier-glazer@cbs.cnrs.fr
1
une séquence, une structure (dynamique), une (ou plusieurs) fonction
2
Qu’est-ce que c’est?
une discipline de la biochimie et de la biophysique qui permet d’accéder à la structure 3D de macromolécules (protéines, ARN, ADN) en utilisant des techniques de cristallographie aux rayons X, de RMN et de microscopie électronique
A quoi cela sert?
- obtenir des détails moléculaires et atomiques sur les macromolécules
- comprendre leurs fonction et régulation
- servir de point de départ pour la conception rationnelle de médicaments
3
1. Techniques pour la biologie structurale
2. Apport d’une structure 3D
3. Comment la biologie structurale est-elle utilisée dans le cheminement vers un médicament?
4. Exemple de l’utilisation de la biologie structurale dans le drug design
4
! Techniques de base:
◦ Cristallographie aux rayons X
◦ Spectroscopie RMN
◦ Microscopie électronique
! Techniques complémentaires
◦ Cristallographie aux neutrons
◦ Diffusion des rayons X aux petits angles
◦ Approches computationnelles
* techniques de choix pour l’étude des interactions cible/médicament
*
*
*
5
10-3 10-6
10-9 10-12 10-15
noyau de l'atome
10-7
atome
Les outils d'observation
l'œil microscope
rayonnement synchrotron rayons X collisionneur
de particules CERN
Rappel: 1 Å = 10
-10m
6Principe : soumettre le système à une excitation et étudier ses réactions
système à étudier e.g. solution aqueuse,
cristal
‘sonde’
e.g. faisceau de lumière
signaux ‘émis’ par le système sous l’effet
de la ‘sonde’
e.g. diffraction des rayons X
contiennent de l’information sur les caractéristiques du
système
Champ radiofréquence + champ magnétique : RMN Rayons X : diffraction X
7
Cristallographie aux rayons X
78162 structures RX dans la PDB principe: interaction RX/matière
avantages: positions précises des atomes, pas de limite de taille inconvénients: nécessité d’un cristal, atomes d’hydrogène difficiles à voir
RMN
9869 structures RMN dans la PDB
principe: interaction des spins des noyaux dans un champ magnétique
information sur l’environnement de chaque noyau
avantages: en solution, Information sur la dynamique de la macromolécule.
inconvénients: limitation de taille
moins précis que la cristallographie, solution concentrée Microscopie électronique
516 structures ME dans la PDB principe: interaction électron matière avantages: pas de limite de taille (ex virus).
structure globale
inconvénients: basse résolution, dommage sur l’échantillon
Les différentes techniques
8
Cristallographie aux rayons X
78162 structures RX dans la PDB principe: interaction RX/matière
avantages: positions précises des atomes, pas de limite de taille inconvénients: nécessité d’un cristal, atomes d’hydrogène difficiles à voir
RMN
9869 structures RMN dans la PDB
principe: interaction des spins des noyaux dans un champ magnétique
information sur l’environnement de chaque noyau
avantages: en solution, Information sur la dynamique de la macromolécule.
inconvénients: limitation de taille
moins précis que la cristallographie, solution concentrée Microscopie électronique
516 structures ME dans la PDB principe: interaction électron matière avantages: pas de limite de taille (ex virus).
structure globale
inconvénients: basse résolution, dommage sur l’échantillon
Les différentes techniques
Virus espirito santo (Vancini et al. 2011)
Jensen et al. 2010
9
Diffusion des rayons X : Small Angle X-ray Scattering (SAXS)
principe: interaction RX/matière
avantages: échantillon en solution, pas de cristal inconvénients: basse résolution*
Neutrons (complément à la radiocristallographie) principe: interaction neutrons/matière
avantages: les atomes d’hydrogène sont visibles inconvénients: gros cristaux
Bioinformatique (en très fort progrès) principe: modélisation in silico, avantages: peu cher, rapide
inconvénients: précision, qualité des résultats
Aucune technique n’est complète
Boura et al. 2011
* La résolution définit la capacité de distinguer clairement deux objets séparés, 10
comme deux objets distincts
! Techniques de base:
◦ Cristallographie aux rayons X
◦ Spectroscopie RMN
◦ Microscopie électronique
! Techniques complémentaires
◦ Cristallographie aux neutrons
◦ Diffusion des rayons X aux petits angles
◦ Approches computationnelles
un cristal est bombardé de rayons X et des clichés de diffraction sont collectés puis utilisés pour construire la structure 3D de la macromolécule
11
! un cristal
! un rayonnement de longueur d’onde approprié (2 – 0.7 Å)
! des ressources informatiques
Hampton Research
cluster de calcul générateur RX ESRF, Grenoble
12
Etapes en cristallographie aux RX
macromolécule purification cristallisation diffraction
phasage
modélisation
interprétation biologique
biologie moléculaire
structure de complexes
biotechnologies gène d’intérêt
bioinformatique autres informations étapes limitantes
production, cristallisation et phasage
13affinement
◦ Quantité importante de macromolécule pure (>95%)
◦ Matériel homogène et actif (caractérisation de la macromolécule en solution)
Persson et al. 2005
14
◦ Passage de la phase solution à la phase solide
Organisation 3D périodique de macromolécule en la concentrant
◦ Nécessaire: diffraction d’une seule molécule n’est pas suffisante
◦ Cristal typique: 100 x 100 x 100 µm
3
1.10
14molécules (30 kDa) dans le cristal
!
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! ! !
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15
◦ Concentration de la macromolécule en laissant diffuser lentement de la vapeur d’eau dans un système clos: cristallisation par
diffusion de vapeur
◦ Robotisation de l’étape de cristallisation
O’Reilly et al. 2006
solution de cristallisation solution de protéine
goutte suspendue goutte assise
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◦ Concentration de la macromolécule en laissant diffuser lentement de la vapeur d’eau dans un système clos: cristallisation par
diffusion de vapeur
◦ Robotisation de l’étape de cristallisation
O’Reilly et al. 2006
solution de cristallisation solution de protéine
goutte suspendue goutte assise
17
BostonUMC
18
faisceau de rayons X!
rayons diffractés!
détecteur!
cristal!
tête
goniométrique!
anode tournante (générateur de laboratoire)!
tension électrique!
19 http://www.xtal.iqfr.csic.es/Cristalografia/parte_07-en.html
carte de densité électronique obtenue à partir des données de diffraction d’un cristal
interprétation
construction du modèle pour expliquer la densité électronique
analyse des données collecte des données de
diffraction
Les éléments de symétrie du cristal se retrouvent dans les clichés de diffraction.
20
Cristallographie des Rayons-X
Determination des Phases
La qualité de la carte de densité électronique depend de la resolution de la diffraction
5.0 Å 3.0 Å
2.1 Å Resolution (Å) Structural features observed 5.0 Overall shape of the molecule
3.5 Cα trace
3.0 Side chains
2.8 Carbonyl oxygens (bulges) 2.5 Side chain well resolved,
Peptide bond plane resolved 2.0 Holes in Phe, Tyr rings 0.8 Current limit for best protein
crystals
Cristallographie des Rayons-X
Determination des Phases
La qualité de la carte de densité électronique depend de la resolution de la diffraction
5.0 Å 3.0 Å
2.1 Å Resolution (Å) Structural features observed 5.0 Overall shape of the molecule
3.5 Cα trace
3.0 Side chains
2.8 Carbonyl oxygens (bulges) 2.5 Side chain well resolved,
Peptide bond plane resolved 2.0 Holes in Phe, Tyr rings 0.8 Current limit for best protein
crystals
Résolution (Å) Ce qui est visible:
5,0 forme globale
3,0 trace du polypeptide 2,5 chaines latérales 0,8 limite actuelle
La qualité de la carte de
densité est fonction de la résolution de la
diffraction
Rappel: 1 Å = 10
-10m
21
Consortia de génomique structurale - RCSB
Certaines d’entre elles peuvent correspondre à des cibles thérapeutiques
! Techniques de base:
◦ Cristallographie aux rayons X
◦ Spectroscopie RMN
◦ Microscopie électronique
! Techniques complémentaires
◦ Cristallographie aux neutrons
◦ Diffusion des rayons X aux petits angles
◦ Approches computationnelles
22
23
Le noyau de certains atomes possède un spin = aimant qui s’oriente dans le champ magnétique
1
H,
13C,
15N,
31P, …
★ Application de la ‘bonne’ fréquence électromagnétique aux spin alignés (c’est à dire adaptée en fonction du champs magnétique et de la nature de l'atome)
" il y a résonance: les spins basculent - dans un état excité
★ Retour à l'état stable: précession du spin (mouvement d’une toupie)
La vitesse de précession est dépendante de l'environnent chimique
★ Renseignement sur les liaisons, la proximité spatiale, la géométrie…
sur la structure
24
✓ !!Spectromètre:!champ&magné*que&très&intense&(10615&T)&
A&comparer&avec&le&champ&magné*que&terrestre&(47&μT)&&
✓ &Echan*llon&pur,&concentré,&soluble,&stable&
✓&Macromolécule&de&taille&≤&40&kDa,&avec&marquage&isotopique&–&
15N&et/ou&
13C&
25
✓ !!Spectromètre:!champ&magné*que&très&intense&(10615&T)&
A&comparer&avec&le&champ&magné*que&terrestre&(47&μT)&&
✓&Echan*llon&pur,&concentré,&soluble,&stable&
✓ &Macromolécule&de&taille&≤&40&kDa,&avec&marquage&isotopique&–&
15N&et/ou&
13C&
# Couplage dipolaire: à travers l’espace
# Couplage scalaire: par l’intermédiaire de liaisons covalentes
# Déplacement chimique: environnement chimique
27
7 6 5 4 3 2 1 0
ppm
beaucoup d’électrons dans le voisinage peu d’électrons
dans le voisinage
Des électrons dans des environnements chimiques différents absorbent les ondes à des énergies légèrement différentes: empreinte d’une molécule par ses déplacements chimiques
fréquences caractéristiques en fonction du type de proton comparaison avec des valeurs moyennes dans des tables: information sur l’environnement des protons
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7 6 5 4 3 2 1 0
ppm
beaucoup d’électrons dans le voisinage peu d’électrons
dans le voisinage
Des électrons dans des environnements chimiques différents absorbent les ondes à des énergies légèrement différentes: empreinte d’une molécule par ses déplacements chimiques
fréquences caractéristiques en fonction du type de proton comparaison avec des valeurs moyennes dans des tables: information sur l’environnement des protons
Attribution homonucléaire
Table de Déplacements Chimiques du Proton
Valeurs de déplacements chimiques pour une protéine en structure
“moyenne” (ou “aléatoire”)
- valeurs typiques de déplacements chimiques des protons des 20 acides aminés,
- mesurées pour des peptides non-structurés.
Attention :
Table pour protons dans une structure aléatoire.
Peut différer dans une structure repliée jusqu’à : - 3 ppm pour HN,
- 1-2 ppm pour les autres 1H.
29
couplage scalaire couplage dipolaire
nOe
C H
AC H
BA B
couplage à travers l’espace
C C
H
BH
AA B
couplage à travers des liaisons covalentes JAB JBA
Ces deux types de couplage donnent des informations sur la structure de la molécule étudiée
30
Etapes en RMN
macromolécule purification spectres RMN
attribution des résonances
données sur la conformation
interprétation biologique
affinement
ensemble final gène d’intérêt
calculs des structures structure
secondaire
repliement
31
★ Conformation du polypeptide: déplacements chimiques
★ Contraintes de distances: nOes
★ Contraintes de liaisons hydrogènes
★ Contraintes d’angles dièdres (chaines principale et latérale): couplage scalaire
★ Contraintes d’orientation des liaisons: couplages dipolaires
Toutes ces contraintes sont compilées pour générer un ensemble de structures
Petites/grosses protéines: stratégies de collecte/analyse de données différentes
32
Peptides et petites protéines: spectres 2D homonucléaires.
Protéines > 8 kDa: spectres 3D hétéronucléaires
Spectre 1H de
l’ubiquitine (76 résidus)
> de 500 résonances:
trop compliqué!!!
Il y a beaucoup de superposition
Couplage scalaire, dipolaire.
Attribution des pics + géométrie.
Plusieurs spectres sont
nécessaires
obtention d’un ensemble de modèle
33Grace C R R et al. PNAS 2007.
Fragment du facteur de relargage de la corticotrophine
34
caractérisation des complexes:
interface, affinité, changements conformationnels,…
dynamique des protéines
35
Cristallographie RMN
Quantité de protéines 1-25 mg 10-50 mg (marquée) Taille Pas de limite de taille < 40 kDa
Concentration 3 à 30 mg/mL 10 à 30 mg/mL
Etat de monodispersité cristaux nécessaires nécessaire Flexibilité/dynamique peu d’information très riche
Résolution +++
≈ 2 Å +
ensemble de structures
Détails du site actif +++ +
Structure de la surface + +++
Structure en solution - +++/+
Utilisations/
applications structure
interaction protéine-ligand structure
interaction protéine-ligand interface protéine-protéine analyse de la dynamique de la molécule
Des techniques très complémentaires!
1. Techniques pour la biologie structurale
2. Apport d’une structure 3D
3. Comment la biologie structurale est-elle utilisée dans le cheminement vers un médicament?
4. Exemple de l’utilisation de la biologie structurale dans le drug design
36
Structures secondaires expérimentales Le repliement
Corrélations séquence/repliement/fonction La reconnaissance moléculaire
Le mécanisme catalytique Structure quaternaire Dynamique structurale
La conception de médicament (structure-based drug design - SBDD)
37
Structures secondaires expérimentales
sortie de la PDB
38
Le repliement
repliement de type tonneau β
même structures avec des variations au niveau des boucles, de la longueur/orientation
des structures secondaires 39
structures contenant 10 brins β
27% d’identité
2FR2 2FWVCorrélations séquence/repliement/fonction
Methionyl ARNt synthétases même repliement – même fonction:
Transfert d’un acide aminé à partir d’un ARNt déduction d’une fonction à partir d’un repliement
40
Pyrococcus abyssi Thermus thermophilus
1RQG 2D5B
La reconnaissance moléculaire
Associations:protéine-protéine; protéine-ARN/
ADN; protéine-ligand; protéine- inhibiteur
propriétés physico-chimiques de surface (hydrophobicité, potentiel électrostatique, forme)
interactions spécifiques entre les macromolécules, entre la
macromolécule et son ligand
41
nucléotide
=
base + sucre+ groupement phosphate sucre
base
La reconnaissance moléculaire
Associations:protéine-protéine; protéine-ARN/
ADN; protéine-ligand; protéine- inhibiteur
propriétés physico-chimiques de surface (hydrophobicité, potentiel électrostatique, forme)
interactions spécifiques entre les macromolécules, entre la
macromolécule et son ligand
42 uracile
guanine
cytosine 5’
3’
La reconnaissance moléculaire
Associations:protéine-protéine; protéine-ARN/ADN; protéine-ligand; protéine-inhibiteur
propriétés physico-chimiques de surface (hydrophobicité, potentiel électrostatique, forme)
interactions spécifiques entre les macromolécules, entre la macromolécule et son ligand
43
La reconnaissance moléculaire
Associations:protéine-protéine; protéine-ARN/ADN; protéine-ligand; protéine-inhibiteur
propriétés physico-chimiques de surface (hydrophobicité, potentiel électrostatique, forme)
Zeri A C et al. 2003
interactions spécifiques entre les macromolécules, entre la macromolécule et son ligand
44
La reconnaissance moléculaire
Associations:protéine-protéine; protéine-ARN/ADN; protéine-ligand; protéine-inhibiteur
propriétés physico-chimiques de surface (hydrophobicité, potentiel électrostatique, forme)
interactions spécifiques entre les macromolécules, entre la macromolécule et son ligand
Lin et al. 2011
45
Le mécanisme catalytique
mécanisme catalytique de l’histidine phosphatase 1 humaine proposé par biologie structurale (RMN)
Gong et al. 2009
46
Structure quaternaire
Zeri A C et al. 2003
protéine de bactériophage
47
Dynamique structurale
48
Principe:
- Obtenir des structures dans différentes conformations - Reconstruire à l’échelle atomique des mouvements de grande amplitude
3IFZ
4DDQ 3ILW
1AB4
DNA gyrase
2XCR
Dynamique structurale
49
Principe:
- Obtenir des structures dans différentes conformations - Reconstruire à l’échelle atomique des mouvements de grande amplitude
Jensen et al. 2010
La conception de médicament (structure-based drug design - SBDD)
50
structure 3D de la cible!
analyse
computationnelle et conception!
synthèse organique!
évaluation biologique!
1. Techniques pour la biologie structurale
2. Apport d’une structure 3D
3. Comment la biologie structurale est-elle utilisée dans le cheminement vers un médicament?
4. Exemple de l’utilisation de la biologie structurale dans le drug design
51
52
53 University College London
- validation et connaissance de la cible thérapeutique pour mieux appréhender les mécanismes d’action et de
régulation de la cible et les sites à cibler (site actif;
interface avec une autre macromolécule; site important pour la fonction)!
!- la conception rationnelle des molécules guidée:
identification des interactions entre la cible et la molécule étudiée!
guide pour la modification de la molécule!
!- découverte de nouvelles molécules - fragment-based discovery!
Trois grands types de contributions de la biologie structurale:
54
connaissance de la structure 3D: conception/amélioration de molécules qui se fixent dans les poches ciblées
I95
F87 L50
L53
I57
V89
Mdm2 en complexe avec un inhibiteur de l’interaction avec p53
I95
F87 L50
L53
I57
V89
55
* Identification des régions à explorer par le ligand
* Information sur la nature des groupements fonctionnels à greffer sur la molécule pour:
augmenter son affinité et sa spécificité pour la cible améliorer ses propriétés physico-chimiques
connaissance de la structure 3D: état d’hydratation de la poche
56 Hoeppner et al. 2013le réseau de molécules d’eau peut être incorporé dans la conception du ligand
57
connaissance de la structure 3D: évaluation et caractérisation de la flexibilité et de la dynamique de la cible
Hoeppner et al. 2013
Image de la plasticité de la cible générée:
• en accumulant plusieurs structures cristallines
• en générant un ensemble de structures RMN
• en utilisant la dynamique moléculaire in silico
58
connaissance de la structure 3D: évaluation et caractérisation de la flexibilité et de la dynamique de la cible
Hoeppner et al. 2013
Image de la plasticité de la cible générée:
• en accumulant plusieurs structures cristallines
• en générant un ensemble de structures RMN
• en utilisant la dynamique moléculaire in silico
1. Techniques pour la biologie structurale
2. Apport d’une structure 3D
3. Comment la biologie structurale est-elle utilisée dans le cheminement vers un médicament?
4. Un exemple de l’utilisation de la biologie structurale dans le drug design:
SBDD
59
60
• Produits contre le HIV depuis 1985: par exemple, l’AZT – analogue de nucléotide Effets secondaires sévères
• Le cycle de réplication du virus HIV passe par l’activité de sa protéase (maturation de protéines)
129 l’actualité chimique - novembre-décembre 2003
Cibles thérapeutiques
Les virus sont des parasites intracellulaires stricts dont le génome est de taille limitée, de l'ordre de 10 kilobases pour le VIH. La plupart utilisant la machinerie cellulaire pour assurer leur réplication, la conception d'antiviraux peut donc tirer profit soit de cibles strictement virales, soit de cibles cellulaires. La première approche est la plus susceptible de fournir des inhibiteurs spécifiques et peu toxiques, mais avec une probabilité importante d'émergence de virus résistants.
La seconde approche pourrait permettre d'identifier des composés à large spectre avec une probabilité moindre de voir apparaître des résistances. Toutefois, le risque de toxicité y est plus important. En pratique, la première approche est celle qui a donné le plus de résultats. Jusqu'à présent, elle a été essentiellement consacrée à la recherche d'inhibiteurs des enzymes virales pour lesquelles il est plus aisé d'obtenir des tests d'activité simples, adaptés au criblage des grandes chimiothèques. Dans le cas du VIH, la réplication du virus dépend de trois enzymes virales qui constituent le moteur moléculaire de la réplication du virus (figure 1) : la transcriptase inverse, la protéase et l'intégrase.
Une quatrième activité enzymatique, l'activité RNaseH, qui est une activité nucléasique dégradant l'ARN, est portée par un domaine de la transcriptase inverse. Ces activités enzymatiques sont donc les cibles privilégiées de la pharmacologie. Les inhibiteurs de transcriptase inverse ont été découverts très tôt, à partir d'inhibiteurs connus de polymérase. Le premier d'entre eux, l'azidothymidine (AZT), a été utilisé dès 1986. Par la suite, la résolution de la structure de la protéase virale a permis la conception rationnelle d'inhibiteurs basés sur des analogues de substrat non clivables. Les polythérapies actuelles utilisent des combinaisons d'antirétroviraux (ARV) dirigés contre ces deux cibles. Toutefois, quels que soient les régimes médicamenteux, on observe à plus ou moins brève échéance l'apparition de virus résistants aux ARV.
La résistance est liée à la présence de mutations dans la séquence du virus qui modifient la structure de l'une ou des deux enzymes ciblées. Ces mutations sont générées par le mode de réplication du virus qui utilise une polymérase, la transcriptase inverse, dénuée d'activité de relecture.
Les mutations, constamment produites, émergent sous la pression de sélection imposée par la présence de l'inhibiteur. Les ARV deviennent alors moins actifs car les mutations sélectionnées se traduisent par une perte d'affinité du produit pour sa cible. La résistance aux ARV est devenue un problème majeur du traitement de l'infection par le VIH. Bien que des dizaines de milliers de composés à activité anti-VIH aient été identifiés (voir http://
apps1.niaid.nih.gov/struct_search/ pour une liste exhaustive), les progrès les plus significatifs portent sur l'obtention de composés actifs contre les isolats viraux résistants et/ou dirigés contre de nouvelles cibles. Ce sont ces progrès que nous détaillons ci-après.
Nouveaux inhibiteurs de transcriptase inverse
Le génome du virus qui pénètre dans la cellule est constitué de deux molécules d'ARN simple brin. Pour que le virus puisse se répliquer, cet ARN doit être transcrit en ADN double brin (figure 1). Cette étape est catalysée par la transcriptase inverse virale (TI) dont les nucléotides cellulaires sont les substrats endogènes. Les inhibiteurs de TI sont classés en deux catégories selon leur mécanisme d'action.
La première catégorie comprend les analogues de nucléosides (inhibiteurs nucléosidiques ou INTI) qui rentrent en compétition avec les substrats naturels de l'enzyme. Ces composés doivent être triphosphorylés en nucléotides pour pouvoir agir. La première phosphorylation, prise en charge par une kinase cellulaire, est l'étape limitante de leur activité antivirale. Du point de vue virologique, ces inhibiteurs génèrent tous l'apparition de résistances. Les différents produits sélectionnent des mutations différentes, mais celles-ci induisent souvent des résistances croisées [6]. Les principaux enjeux actuels sont l'obtention d'analogues actifs contre les virus résistants aux produits actuels et la synthèse d'analogues de nucléosides monophosphorylés de façon à contourner la première étape de phosphorylation. Citons pour l'exemple deux analogues particulièrement avancés : l'emtricitabine ou FTC (1), un analogue de la cytosine, et l'amdoxovir ou DAPD (2), un analogue de la guanosine (figure 2). L'intérêt de ce dernier réside dans sa capacité à bloquer la réplication des virus portant la mutation dite d'insertion à la position 69 de la TI, mutation associée à une large résistance aux autres INTI. Concernant les analogues Figure 1 - Cycle de réplication du VIH.
Le cycle rétroviral présente plusieurs étapes qui sont les cibles des antirétroviraux actuels. Après l'adsorption du virus sur la membrane cellulaire par fixation sur le CD4 et l'un des deux co-récepteurs (CCR5/CXCR4), le virus pénètre dans la cellule par fusion entre l'enveloppe virale et la membrane cellulaire. Le génome viral sous forme de deux molécules d'ARN est transcrit par la transcriptase inverse (TI) en ADN. Celui-ci migre dans le noyau où il est intégré définitivement dans l'ADN cellulaire par l'intégrase virale (IN). Après la transcription et la traduction, les ARN viraux et les protéines virales s'assemblent pour former une particule virale qui bourgeonne à la membrane cellulaire. Ces particules deviennent infectieuses après maturation par la protéase virale (PR) qui clive les précurseurs polyprotéiques en protéines structurales et en enzymes.
Abréviations
ARV: antirétroviral.
IN: intégrase.
INNTI: inhibiteur non nucléosidique de la transcriptase inverse.
INTI: inhibiteur nucléosidique de la transcriptase inverse.
IP: inhibiteur de la protéase.
OMS: Organisation Mondiale de la Santé.
PR: protéase.
RnaseH: ribonucléase H.
Sida: syndrome de l'immunodéficience humaine acquise.
TI: transcriptase inverse.
VIH: virus de l'immunodéficience humaine.
Cycle de réplication du virus HIV (Mouscadet &
Deprez)
61
• Aspartyl-protéase de 99 résidus
Active sous la forme d’un homodimère
Chatfield et al. 1998
62
• Structure cristalline de la protéase d’HIV en
complexe avec un substrat peptidique
Jeff D. Cronk
1KJF
63
• Utilisation de cette structure cristalline pour concevoir un inhibiteur peptido-mimétique
Mise sur la marché en 2003 sous le nom Reyataz
130 l’actualité chimique - novembre-décembre 2003
Cibles thérapeutiques
phosphorylés, le ténofovir (3), récemment commercialisé, est actuellement l'unique produit dans cette catégorie. C'est un analogue monophosphorylé qui ne requiert donc que deux étapes cellulaires de phosphorylation. Le ténofovir illustre également une autre voie de recherche sur les ARV puisque le produit lui-même n'ayant pas été utilisé du fait de sa très faible biodisponibilité, il est commercialisé sous forme de prodrogue, le ténofovir disoproxil (4), un précurseur hydrolysable. Le ténofovir est également intéressant du point de vue des résistances puisque la mutation M184V, qui est très rapidement sélectionnée sous lamivudine (3TC), confère une hyper-susceptibilité au ténofovir. En contrepartie, la seule mutation majeure associée au ténofovir à ce jour, la mutation K65R, présente un profil de résistance croisée avec l’abacavir, l’amdoxovir, la didanosine, la lamivudine et la zalcitabine.
La seconde catégorie comprend des composés qui se fixent à l'enzyme sur un site différent de celui du substrat (inhibiteurs non nucléosidiques ou INNTI). Dans cette catégorie, une trentaine de classes chimiques différentes ont été identifiées dont trois produits seulement sont actuellement commercialisés (nevirapine, delavirdine et efavirenz). Les INNTI induisent l'émergence de résistances en quelques semaines. L'apparition de mutations est ralentie par l'utilisation de doses élevées et la combinaison avec des INTI. Une seconde génération d'INNTI est actuellement en développement. Deux produits sont particulièrement avancés : le DPC083 (5) et le TMC125 (6) qui sont actifs à des concentrations nanomolaires non seulement contre la transcriptase sauvage, mais également contre un certain nombre de mutants résistants aux autres INNTI (figure 3).
Plus encore, la résistance au DPC083 nécessite la combinaison de plusieurs mutations, ce qui n'est pas le cas des autres INNTI [7]. Ces deux produits ont montré une activité remarquable dans les essais de phase II et sont actuellement en essais cliniques avancés.
Nouveaux inhibiteurs de protéase
Les protéines de structures et les enzymes du VIH sont produites à partir des gènes viraux sous forme de précurseurs polyprotéiques. La formation de nouveaux virus infectieux nécessite le clivage de ces précurseurs en entités fonctionnelles. Cette maturation, réalisée par la protéase virale, est bloquée par les inhibiteurs de celle-ci (IP). Tous les IP actuellement utilisés sont des peptido-mimétiques du substrat de la protéase qui contiennent une liaison hydroxyéthylène à la place d'une liaison peptidique et qui sont par conséquent non clivables. L'azatanavir (7), un peptido-mimétique approuvé par la FDA en juin 2003 (sous le nom de Reyataz) constitue le développement le plus récent de ce type de composé (figure 4). Cet inhibiteur reste efficace contre certaines mutations associées à la résistance aux autres IP. Par ailleurs, comme l'utilisation de peptido- mimétiques conduit systématiquement à l'apparition de résistances croisées, la recherche d'inhibiteurs non peptidiques est devenue un objectif majeur. De ce point de vue, un premier composé, le tripanavir (8), a démontré une excellente efficacité contre des isolats viraux isolés de patients résistants aux IP. D'autres inhibiteurs non
Figure 2 - Nouveaux inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse.
L'emtricitabine et l'amdoxovir sont deux analogues de nucléosides dont l'activité antivirale dépend d'une triphosphorylation en nucléotides.
L'amdoxovir est une prodrogue, désaminée in vivo en DXG (dioxolane guanine) par une adénine désaminase cellulaire. Le ténofovir est une nucléotide monophosphorylée dont la prodrogue active est le ténofovir disoproxil.
Figure 3 - Nouveaux inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse.
DPC083 et TMC125 sont deux exemples de nouveaux dérivés qui inhibent la transcriptase inverse selon un mode non compétitif. Ils sont tous deux actifs contre des isolats viraux résistants aux mutants sélectionnés par les INNTI actuels.
Figure 4 - Nouveaux inhibiteurs de la protéase virale.
L'atazanavir est le peptido-mimétique le plus récent capable de bloquer l'activité de la protéase virale. Le tripanavir et le mozenavir sont les deux premiers IP non peptido- mimétiques à présenter un intérêt clinique potentiel.
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130 l’actualité chimique - novembre-décembre 2003 Cibles thérapeutiques
phosphorylés, le ténofovir (3), récemment commercialisé, est actuellement l'unique produit dans cette catégorie. C'est un analogue monophosphorylé qui ne requiert donc que deux étapes cellulaires de phosphorylation. Le ténofovir illustre également une autre voie de recherche sur les ARV puisque le produit lui-même n'ayant pas été utilisé du fait de sa très faible biodisponibilité, il est commercialisé sous forme de prodrogue, le ténofovir disoproxil (4), un précurseur hydrolysable. Le ténofovir est également intéressant du point de vue des résistances puisque la mutation M184V, qui est très rapidement sélectionnée sous lamivudine (3TC), confère une hyper-susceptibilité au ténofovir. En contrepartie, la seule mutation majeure associée au ténofovir à ce jour, la mutation K65R, présente un profil de résistance croisée avec l’abacavir, l’amdoxovir, la didanosine, la lamivudine et la zalcitabine.
La seconde catégorie comprend des composés qui se fixent à l'enzyme sur un site différent de celui du substrat (inhibiteurs non nucléosidiques ou INNTI). Dans cette catégorie, une trentaine de classes chimiques différentes ont été identifiées dont trois produits seulement sont actuellement commercialisés (nevirapine, delavirdine et efavirenz). Les INNTI induisent l'émergence de résistances en quelques semaines. L'apparition de mutations est ralentie par l'utilisation de doses élevées et la combinaison avec des INTI. Une seconde génération d'INNTI est actuellement en développement. Deux produits sont particulièrement avancés : le DPC083 (5) et le TMC125 (6) qui sont actifs à des concentrations nanomolaires non seulement contre la transcriptase sauvage, mais également contre un certain nombre de mutants résistants aux autres INNTI (figure 3).
Plus encore, la résistance au DPC083 nécessite la combinaison de plusieurs mutations, ce qui n'est pas le cas des autres INNTI [7]. Ces deux produits ont montré une activité remarquable dans les essais de phase II et sont actuellement en essais cliniques avancés.
Nouveaux inhibiteurs de protéase
Les protéines de structures et les enzymes du VIH sont produites à partir des gènes viraux sous forme de précurseurs polyprotéiques. La formation de nouveaux virus infectieux nécessite le clivage de ces précurseurs en entités fonctionnelles. Cette maturation, réalisée par la protéase virale, est bloquée par les inhibiteurs de celle-ci (IP). Tous les IP actuellement utilisés sont des peptido-mimétiques du substrat de la protéase qui contiennent une liaison hydroxyéthylène à la place d'une liaison peptidique et qui sont par conséquent non clivables. L'azatanavir (7), un peptido-mimétique approuvé par la FDA en juin 2003 (sous le nom de Reyataz) constitue le développement le plus récent de ce type de composé (figure 4). Cet inhibiteur reste efficace contre certaines mutations associées à la résistance aux autres IP. Par ailleurs, comme l'utilisation de peptido- mimétiques conduit systématiquement à l'apparition de résistances croisées, la recherche d'inhibiteurs non peptidiques est devenue un objectif majeur. De ce point de vue, un premier composé, le tripanavir (8), a démontré une excellente efficacité contre des isolats viraux isolés de patients résistants aux IP. D'autres inhibiteurs non Figure 2 - Nouveaux inhibiteurs nucléosidiques de la
transcriptase inverse.
L'emtricitabine et l'amdoxovir sont deux analogues de nucléosides dont l'activité antivirale dépend d'une triphosphorylation en nucléotides.
L'amdoxovir est une prodrogue, désaminée in vivo en DXG (dioxolane guanine) par une adénine désaminase cellulaire. Le ténofovir est une nucléotide monophosphorylée dont la prodrogue active est le ténofovir disoproxil.
Figure 3 - Nouveaux inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse.
DPC083 et TMC125 sont deux exemples de nouveaux dérivés qui inhibent la transcriptase inverse selon un mode non compétitif. Ils sont tous deux actifs contre des isolats viraux résistants aux mutants sélectionnés par les INNTI actuels.
Figure 4 - Nouveaux inhibiteurs de la protéase virale.
L'atazanavir est le peptido-mimétique le plus récent capable de bloquer l'activité de la protéase virale. Le tripanavir et le mozenavir sont les deux premiers IP non peptido- mimétiques à présenter un intérêt clinique potentiel.
✓ Pistes explorées pour améliorer les inhibiteurs:
- diminuer la taille
- optimiser les interactions avec la chaine principale - garder la flexibilité
✓ Dans le cas du mozenavir, exploitation de la connaissance du réseau de molécules d’eau
✓ Utilisation d’inhibiteurs peptido-mimétiques souvent associée à
l’émergence de résistance: développement d’inhibiteurs non-peptidiques
✓ Choix rationnel ou par criblage des noyaux inhibiteurs
Ren Wei
Ren Wei structure-structure-based drug designbased drug design 2525
Solvent Effects: incorporated to the Solvent Effects: incorporated to the
designed Ligand designed Ligand
• Nonpeptide HIV Protease Inhibitors Based on Cyclic Urea Compounds
Incorporate an
Oxygen Atom Where a Bound Water
Molecule Was
Visualized in X-Ray
Structures;
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