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une séquence, une structure (dynamique), une (ou plusieurs) fonction

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Academic year: 2022

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(1)

3

ème

année DFGSP UE opt. Bases des interactions médicament/cible thérapeutique Responsables: Drs. A. Chavanieu – A. Echalier

aude.echalier-glazer@cbs.cnrs.fr

1

une séquence, une structure (dynamique), une (ou plusieurs) fonction

2

(2)

Qu’est-ce que c’est?

une discipline de la biochimie et de la biophysique qui permet d’accéder à la structure 3D de macromolécules (protéines, ARN, ADN) en utilisant des techniques de cristallographie aux rayons X, de RMN et de microscopie électronique

A quoi cela sert?

- obtenir des détails moléculaires et atomiques sur les macromolécules

- comprendre leurs fonction et régulation

- servir de point de départ pour la conception rationnelle de médicaments

3

1.  Techniques pour la biologie structurale

2.  Apport d’une structure 3D

3.  Comment la biologie structurale est-elle utilisée dans le cheminement vers un médicament?

4.  Exemple de l’utilisation de la biologie structurale dans le drug design

4

(3)

!  Techniques de base:

◦  Cristallographie aux rayons X

◦  Spectroscopie RMN

◦  Microscopie électronique

!  Techniques complémentaires

◦  Cristallographie aux neutrons

◦  Diffusion des rayons X aux petits angles

◦  Approches computationnelles

* techniques de choix pour l’étude des interactions cible/médicament

*

*

*

5

10-3 10-6

10-9 10-12 10-15

noyau de l'atome

10-7

atome

Les outils d'observation

l'œil microscope

rayonnement synchrotron rayons X collisionneur

de particules CERN

Rappel: 1 Å = 10

-10

m

6

(4)

Principe : soumettre le système à une excitation et étudier ses réactions

système à étudier e.g. solution aqueuse,

cristal

‘sonde’

e.g. faisceau de lumière

signaux ‘émis’ par le système sous l’effet

de la ‘sonde’

e.g. diffraction des rayons X

contiennent de l’information sur les caractéristiques du

système

Champ radiofréquence + champ magnétique : RMN Rayons X : diffraction X

7

Cristallographie aux rayons X

78162 structures RX dans la PDB principe: interaction RX/matière

avantages: positions précises des atomes, pas de limite de taille inconvénients: nécessité d’un cristal, atomes d’hydrogène difficiles à voir

RMN

9869 structures RMN dans la PDB

principe: interaction des spins des noyaux dans un champ magnétique

information sur l’environnement de chaque noyau

avantages: en solution, Information sur la dynamique de la macromolécule.

inconvénients: limitation de taille

moins précis que la cristallographie, solution concentrée Microscopie électronique

516 structures ME dans la PDB principe: interaction électron matière avantages: pas de limite de taille (ex virus).

structure globale

inconvénients: basse résolution, dommage sur l’échantillon

Les différentes techniques

8

(5)

Cristallographie aux rayons X

78162 structures RX dans la PDB principe: interaction RX/matière

avantages: positions précises des atomes, pas de limite de taille inconvénients: nécessité d’un cristal, atomes d’hydrogène difficiles à voir

RMN

9869 structures RMN dans la PDB

principe: interaction des spins des noyaux dans un champ magnétique

information sur l’environnement de chaque noyau

avantages: en solution, Information sur la dynamique de la macromolécule.

inconvénients: limitation de taille

moins précis que la cristallographie, solution concentrée Microscopie électronique

516 structures ME dans la PDB principe: interaction électron matière avantages: pas de limite de taille (ex virus).

structure globale

inconvénients: basse résolution, dommage sur l’échantillon

Les différentes techniques

Virus espirito santo (Vancini et al. 2011)

Jensen et al. 2010

9

Diffusion des rayons X : Small Angle X-ray Scattering (SAXS)

principe: interaction RX/matière

avantages: échantillon en solution, pas de cristal inconvénients: basse résolution*

Neutrons (complément à la radiocristallographie) principe: interaction neutrons/matière

avantages: les atomes d’hydrogène sont visibles inconvénients: gros cristaux

Bioinformatique (en très fort progrès) principe: modélisation in silico, avantages: peu cher, rapide

inconvénients: précision, qualité des résultats

Aucune technique n’est complète

Boura et al. 2011

* La résolution définit la capacité de distinguer clairement deux objets séparés, 10

comme deux objets distincts

(6)

!  Techniques de base:

◦  Cristallographie aux rayons X

◦  Spectroscopie RMN

◦  Microscopie électronique

!  Techniques complémentaires

◦  Cristallographie aux neutrons

◦  Diffusion des rayons X aux petits angles

◦  Approches computationnelles

un cristal est bombardé de rayons X et des clichés de diffraction sont collectés puis utilisés pour construire la structure 3D de la macromolécule

11

!  un cristal

!  un rayonnement de longueur d’onde approprié (2 – 0.7 Å)

!  des ressources informatiques

Hampton Research

cluster de calcul générateur RX ESRF, Grenoble

12

(7)

Etapes en cristallographie aux RX

macromolécule purification cristallisation diffraction

phasage

modélisation

interprétation biologique

biologie moléculaire

structure de complexes

biotechnologies gène d’intérêt

bioinformatique autres informations étapes limitantes

production, cristallisation et phasage

13

affinement

◦  Quantité importante de macromolécule pure (>95%)

◦  Matériel homogène et actif (caractérisation de la macromolécule en solution)

Persson et al. 2005

14

(8)

◦  Passage de la phase solution à la phase solide

Organisation 3D périodique de macromolécule en la concentrant

◦  Nécessaire: diffraction d’une seule molécule n’est pas suffisante

◦  Cristal typique: 100 x 100 x 100 µm

3

1.10

14

molécules (30 kDa) dans le cristal

!

!

! ! !

!

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15

◦  Concentration de la macromolécule en laissant diffuser lentement de la vapeur d’eau dans un système clos: cristallisation par

diffusion de vapeur

◦  Robotisation de l’étape de cristallisation

O’Reilly et al. 2006

solution de cristallisation solution de protéine

goutte suspendue goutte assise

16

(9)

◦  Concentration de la macromolécule en laissant diffuser lentement de la vapeur d’eau dans un système clos: cristallisation par

diffusion de vapeur

◦  Robotisation de l’étape de cristallisation

O’Reilly et al. 2006

solution de cristallisation solution de protéine

goutte suspendue goutte assise

17

BostonUMC

18

faisceau de rayons X!

rayons diffractés!

détecteur!

cristal!

tête

goniométrique!

anode tournante (générateur de laboratoire)!

tension électrique!

(10)

19 http://www.xtal.iqfr.csic.es/Cristalografia/parte_07-en.html

carte de densité électronique obtenue à partir des données de diffraction d’un cristal

interprétation

construction du modèle pour expliquer la densité électronique

analyse des données collecte des données de

diffraction

Les éléments de symétrie du cristal se retrouvent dans les clichés de diffraction.

20

Cristallographie des Rayons-X

Determination des Phases

La qualité de la carte de densité électronique depend de la resolution de la diffraction

5.0 Å 3.0 Å

2.1 Å Resolution (Å) Structural features observed 5.0 Overall shape of the molecule

3.5 Cα trace

3.0 Side chains

2.8 Carbonyl oxygens (bulges) 2.5 Side chain well resolved,

Peptide bond plane resolved 2.0 Holes in Phe, Tyr rings 0.8 Current limit for best protein

crystals

Cristallographie des Rayons-X

Determination des Phases

La qualité de la carte de densité électronique depend de la resolution de la diffraction

5.0 Å 3.0 Å

2.1 Å Resolution (Å) Structural features observed 5.0 Overall shape of the molecule

3.5 Cα trace

3.0 Side chains

2.8 Carbonyl oxygens (bulges) 2.5 Side chain well resolved,

Peptide bond plane resolved 2.0 Holes in Phe, Tyr rings 0.8 Current limit for best protein

crystals

Résolution (Å) Ce qui est visible:

5,0 forme globale

3,0 trace du polypeptide 2,5 chaines latérales 0,8 limite actuelle

La qualité de la carte de

densité est fonction de la résolution de la

diffraction

Rappel: 1 Å = 10

-10

m

(11)

21

Consortia de génomique structurale - RCSB

Certaines d’entre elles peuvent correspondre à des cibles thérapeutiques

!  Techniques de base:

◦  Cristallographie aux rayons X

◦  Spectroscopie RMN

◦  Microscopie électronique

!  Techniques complémentaires

◦  Cristallographie aux neutrons

◦  Diffusion des rayons X aux petits angles

◦  Approches computationnelles

22

(12)

23

Le noyau de certains atomes possède un spin = aimant qui s’oriente dans le champ magnétique

1

H,

13

C,

15

N,

31

P, …

★ Application de la ‘bonne’ fréquence électromagnétique aux spin alignés (c’est à dire adaptée en fonction du champs magnétique et de la nature de l'atome)

" il y a résonance: les spins basculent - dans un état excité

★ Retour à l'état stable: précession du spin (mouvement d’une toupie)

La vitesse de précession est dépendante de l'environnent chimique

★ Renseignement sur les liaisons, la proximité spatiale, la géométrie…

 sur la structure

24

!!Spectromètre:!champ&magné*que&très&intense&(10615&T)&

A&comparer&avec&le&champ&magné*que&terrestre&(47&μT)&&

✓ &Echan*llon&pur,&concentré,&soluble,&stable&

✓&Macromolécule&de&taille&≤&40&kDa,&avec&marquage&isotopique&–&

15

N&et/ou&

13

C&

(13)

25

!!Spectromètre:!champ&magné*que&très&intense&(10615&T)&

A&comparer&avec&le&champ&magné*que&terrestre&(47&μT)&&

✓&Echan*llon&pur,&concentré,&soluble,&stable&

✓ &Macromolécule&de&taille&≤&40&kDa,&avec&marquage&isotopique&–&

15

N&et/ou&

13

C&

# Couplage dipolaire: à travers l’espace

# Couplage scalaire: par l’intermédiaire de liaisons covalentes

# Déplacement chimique: environnement chimique

(14)

27

7 6 5 4 3 2 1 0

ppm

beaucoup d’électrons dans le voisinage peu d’électrons

dans le voisinage

Des électrons dans des environnements chimiques différents absorbent les ondes à des énergies légèrement différentes: empreinte d’une molécule par ses déplacements chimiques

fréquences caractéristiques en fonction du type de proton comparaison avec des valeurs moyennes dans des tables: information sur l’environnement des protons

28

7 6 5 4 3 2 1 0

ppm

beaucoup d’électrons dans le voisinage peu d’électrons

dans le voisinage

Des électrons dans des environnements chimiques différents absorbent les ondes à des énergies légèrement différentes: empreinte d’une molécule par ses déplacements chimiques

fréquences caractéristiques en fonction du type de proton comparaison avec des valeurs moyennes dans des tables: information sur l’environnement des protons

Attribution homonucléaire

Table de Déplacements Chimiques du Proton

Valeurs de déplacements chimiques pour une protéine en structure

“moyenne” (ou “aléatoire”)

- valeurs typiques de déplacements chimiques des protons des 20 acides aminés,

- mesurées pour des peptides non-structurés.

Attention :

Table pour protons dans une structure aléatoire.

Peut différer dans une structure repliée jusqu’à : - 3 ppm pour HN,

- 1-2 ppm pour les autres 1H.

(15)

29

couplage scalaire couplage dipolaire

nOe

C H

A

C H

B

A B

couplage à travers l’espace

C C

H

B

H

A

A B

couplage à travers des liaisons covalentes JAB JBA

Ces deux types de couplage donnent des informations sur la structure de la molécule étudiée

30

Etapes en RMN

macromolécule purification spectres RMN

attribution des résonances

données sur la conformation

interprétation biologique

affinement

ensemble final gène d’intérêt

calculs des structures structure

secondaire

repliement

(16)

31

★ Conformation du polypeptide: déplacements chimiques

★ Contraintes de distances: nOes

★ Contraintes de liaisons hydrogènes

★ Contraintes d’angles dièdres (chaines principale et latérale): couplage scalaire

★ Contraintes d’orientation des liaisons: couplages dipolaires

 Toutes ces contraintes sont compilées pour générer un ensemble de structures

Petites/grosses protéines: stratégies de collecte/analyse de données différentes

32

Peptides et petites protéines: spectres 2D homonucléaires.

Protéines > 8 kDa: spectres 3D hétéronucléaires

Spectre 1H de

l’ubiquitine (76 résidus)

> de 500 résonances:

trop compliqué!!!

Il y a beaucoup de superposition

Couplage scalaire, dipolaire.

Attribution des pics + géométrie.

Plusieurs spectres sont

nécessaires

(17)

obtention d’un ensemble de modèle

33

Grace C R R et al. PNAS 2007.

Fragment du facteur de relargage de la corticotrophine

34

caractérisation des complexes:

interface, affinité, changements conformationnels,…

dynamique des protéines

(18)

35

Cristallographie RMN

Quantité de protéines 1-25 mg 10-50 mg (marquée) Taille Pas de limite de taille < 40 kDa

Concentration 3 à 30 mg/mL 10 à 30 mg/mL

Etat de monodispersité cristaux nécessaires nécessaire Flexibilité/dynamique peu d’information très riche

Résolution +++

≈ 2 Å +

ensemble de structures

Détails du site actif +++ +

Structure de la surface + +++

Structure en solution - +++/+

Utilisations/

applications structure

interaction protéine-ligand structure

interaction protéine-ligand interface protéine-protéine analyse de la dynamique de la molécule

Des techniques très complémentaires!

1.  Techniques pour la biologie structurale

2.  Apport d’une structure 3D

3.  Comment la biologie structurale est-elle utilisée dans le cheminement vers un médicament?

4.  Exemple de l’utilisation de la biologie structurale dans le drug design

36

(19)

Structures secondaires expérimentales Le repliement

Corrélations séquence/repliement/fonction La reconnaissance moléculaire

Le mécanisme catalytique Structure quaternaire Dynamique structurale

La conception de médicament (structure-based drug design - SBDD)

37

Structures secondaires expérimentales

sortie de la PDB

38

(20)

Le repliement

repliement de type tonneau β

même structures avec des variations au niveau des boucles, de la longueur/orientation

des structures secondaires 39

structures contenant 10 brins β

27% d’identité

2FR2 2FWV

Corrélations séquence/repliement/fonction

Methionyl ARNt synthétases même repliement – même fonction:

Transfert d’un acide aminé à partir d’un ARNt déduction d’une fonction à partir d’un repliement

40

Pyrococcus abyssi Thermus thermophilus

1RQG 2D5B

(21)

La reconnaissance moléculaire

Associations:

protéine-protéine; protéine-ARN/

ADN; protéine-ligand; protéine- inhibiteur

propriétés physico-chimiques de surface (hydrophobicité, potentiel électrostatique, forme)

interactions spécifiques entre les macromolécules, entre la

macromolécule et son ligand

41

nucléotide

=

base + sucre+ groupement phosphate sucre

base

La reconnaissance moléculaire

Associations:

protéine-protéine; protéine-ARN/

ADN; protéine-ligand; protéine- inhibiteur

propriétés physico-chimiques de surface (hydrophobicité, potentiel électrostatique, forme)

interactions spécifiques entre les macromolécules, entre la

macromolécule et son ligand

42 uracile

guanine

cytosine 5’

3’

(22)

La reconnaissance moléculaire

Associations:

protéine-protéine; protéine-ARN/ADN; protéine-ligand; protéine-inhibiteur

propriétés physico-chimiques de surface (hydrophobicité, potentiel électrostatique, forme)

interactions spécifiques entre les macromolécules, entre la macromolécule et son ligand

43

La reconnaissance moléculaire

Associations:

protéine-protéine; protéine-ARN/ADN; protéine-ligand; protéine-inhibiteur

propriétés physico-chimiques de surface (hydrophobicité, potentiel électrostatique, forme)

Zeri A C et al. 2003

interactions spécifiques entre les macromolécules, entre la macromolécule et son ligand

44

(23)

La reconnaissance moléculaire

Associations:

protéine-protéine; protéine-ARN/ADN; protéine-ligand; protéine-inhibiteur

propriétés physico-chimiques de surface (hydrophobicité, potentiel électrostatique, forme)

interactions spécifiques entre les macromolécules, entre la macromolécule et son ligand

Lin et al. 2011

45

Le mécanisme catalytique

mécanisme catalytique de l’histidine phosphatase 1 humaine proposé par biologie structurale (RMN)

Gong et al. 2009

46

(24)

Structure quaternaire

Zeri A C et al. 2003

protéine de bactériophage

47

Dynamique structurale

48

Principe:

- Obtenir des structures dans différentes conformations - Reconstruire à l’échelle atomique des mouvements de grande amplitude

3IFZ

4DDQ 3ILW

1AB4

DNA gyrase

2XCR

(25)

Dynamique structurale

49

Principe:

- Obtenir des structures dans différentes conformations - Reconstruire à l’échelle atomique des mouvements de grande amplitude

Jensen et al. 2010

La conception de médicament (structure-based drug design - SBDD)

50

structure 3D de la cible!

analyse

computationnelle et conception!

synthèse organique!

évaluation biologique!

(26)

1.  Techniques pour la biologie structurale

2.  Apport d’une structure 3D

3.  Comment la biologie structurale est-elle utilisée dans le cheminement vers un médicament?

4.  Exemple de l’utilisation de la biologie structurale dans le drug design

51

52

(27)

53 University College London

- validation et connaissance de la cible thérapeutique pour mieux appréhender les mécanismes d’action et de

régulation de la cible et les sites à cibler (site actif;

interface avec une autre macromolécule; site important pour la fonction)!

!- la conception rationnelle des molécules guidée:

identification des interactions entre la cible et la molécule étudiée!

guide pour la modification de la molécule!

!- découverte de nouvelles molécules - fragment-based discovery!

Trois grands types de contributions de la biologie structurale:

54

connaissance de la structure 3D: conception/amélioration de molécules qui se fixent dans les poches ciblées

I95

F87 L50

L53

I57

V89

Mdm2 en complexe avec un inhibiteur de l’interaction avec p53

(28)

I95

F87 L50

L53

I57

V89

55

* Identification des régions à explorer par le ligand

* Information sur la nature des groupements fonctionnels à greffer sur la molécule pour:

augmenter son affinité et sa spécificité pour la cible améliorer ses propriétés physico-chimiques

connaissance de la structure 3D: état d’hydratation de la poche

56 Hoeppner et al. 2013

le réseau de molécules d’eau peut être incorporé dans la conception du ligand

(29)

57

connaissance de la structure 3D: évaluation et caractérisation de la flexibilité et de la dynamique de la cible

Hoeppner et al. 2013

Image de la plasticité de la cible générée:

•  en accumulant plusieurs structures cristallines

•  en générant un ensemble de structures RMN

•  en utilisant la dynamique moléculaire in silico

58

connaissance de la structure 3D: évaluation et caractérisation de la flexibilité et de la dynamique de la cible

Hoeppner et al. 2013

Image de la plasticité de la cible générée:

•  en accumulant plusieurs structures cristallines

•  en générant un ensemble de structures RMN

•  en utilisant la dynamique moléculaire in silico

(30)

1.  Techniques pour la biologie structurale

2.  Apport d’une structure 3D

3.  Comment la biologie structurale est-elle utilisée dans le cheminement vers un médicament?

4.  Un exemple de l’utilisation de la biologie structurale dans le drug design:

SBDD

59

60

•  Produits contre le HIV depuis 1985: par exemple, l’AZT – analogue de nucléotide Effets secondaires sévères

•  Le cycle de réplication du virus HIV passe par l’activité de sa protéase (maturation de protéines)

129 l’actualité chimique - novembre-décembre 2003

Cibles thérapeutiques

Les virus sont des parasites intracellulaires stricts dont le génome est de taille limitée, de l'ordre de 10 kilobases pour le VIH. La plupart utilisant la machinerie cellulaire pour assurer leur réplication, la conception d'antiviraux peut donc tirer profit soit de cibles strictement virales, soit de cibles cellulaires. La première approche est la plus susceptible de fournir des inhibiteurs spécifiques et peu toxiques, mais avec une probabilité importante d'émergence de virus résistants.

La seconde approche pourrait permettre d'identifier des composés à large spectre avec une probabilité moindre de voir apparaître des résistances. Toutefois, le risque de toxicité y est plus important. En pratique, la première approche est celle qui a donné le plus de résultats. Jusqu'à présent, elle a été essentiellement consacrée à la recherche d'inhibiteurs des enzymes virales pour lesquelles il est plus aisé d'obtenir des tests d'activité simples, adaptés au criblage des grandes chimiothèques. Dans le cas du VIH, la réplication du virus dépend de trois enzymes virales qui constituent le moteur moléculaire de la réplication du virus (figure 1) : la transcriptase inverse, la protéase et l'intégrase.

Une quatrième activité enzymatique, l'activité RNaseH, qui est une activité nucléasique dégradant l'ARN, est portée par un domaine de la transcriptase inverse. Ces activités enzymatiques sont donc les cibles privilégiées de la pharmacologie. Les inhibiteurs de transcriptase inverse ont été découverts très tôt, à partir d'inhibiteurs connus de polymérase. Le premier d'entre eux, l'azidothymidine (AZT), a été utilisé dès 1986. Par la suite, la résolution de la structure de la protéase virale a permis la conception rationnelle d'inhibiteurs basés sur des analogues de substrat non clivables. Les polythérapies actuelles utilisent des combinaisons d'antirétroviraux (ARV) dirigés contre ces deux cibles. Toutefois, quels que soient les régimes médicamenteux, on observe à plus ou moins brève échéance l'apparition de virus résistants aux ARV.

La résistance est liée à la présence de mutations dans la séquence du virus qui modifient la structure de l'une ou des deux enzymes ciblées. Ces mutations sont générées par le mode de réplication du virus qui utilise une polymérase, la transcriptase inverse, dénuée d'activité de relecture.

Les mutations, constamment produites, émergent sous la pression de sélection imposée par la présence de l'inhibiteur. Les ARV deviennent alors moins actifs car les mutations sélectionnées se traduisent par une perte d'affinité du produit pour sa cible. La résistance aux ARV est devenue un problème majeur du traitement de l'infection par le VIH. Bien que des dizaines de milliers de composés à activité anti-VIH aient été identifiés (voir http://

apps1.niaid.nih.gov/struct_search/ pour une liste exhaustive), les progrès les plus significatifs portent sur l'obtention de composés actifs contre les isolats viraux résistants et/ou dirigés contre de nouvelles cibles. Ce sont ces progrès que nous détaillons ci-après.

Nouveaux inhibiteurs de transcriptase inverse

Le génome du virus qui pénètre dans la cellule est constitué de deux molécules d'ARN simple brin. Pour que le virus puisse se répliquer, cet ARN doit être transcrit en ADN double brin (figure 1). Cette étape est catalysée par la transcriptase inverse virale (TI) dont les nucléotides cellulaires sont les substrats endogènes. Les inhibiteurs de TI sont classés en deux catégories selon leur mécanisme d'action.

La première catégorie comprend les analogues de nucléosides (inhibiteurs nucléosidiques ou INTI) qui rentrent en compétition avec les substrats naturels de l'enzyme. Ces composés doivent être triphosphorylés en nucléotides pour pouvoir agir. La première phosphorylation, prise en charge par une kinase cellulaire, est l'étape limitante de leur activité antivirale. Du point de vue virologique, ces inhibiteurs génèrent tous l'apparition de résistances. Les différents produits sélectionnent des mutations différentes, mais celles-ci induisent souvent des résistances croisées [6]. Les principaux enjeux actuels sont l'obtention d'analogues actifs contre les virus résistants aux produits actuels et la synthèse d'analogues de nucléosides monophosphorylés de façon à contourner la première étape de phosphorylation. Citons pour l'exemple deux analogues particulièrement avancés : l'emtricitabine ou FTC (1), un analogue de la cytosine, et l'amdoxovir ou DAPD (2), un analogue de la guanosine (figure 2). L'intérêt de ce dernier réside dans sa capacité à bloquer la réplication des virus portant la mutation dite d'insertion à la position 69 de la TI, mutation associée à une large résistance aux autres INTI. Concernant les analogues Figure 1 - Cycle de réplication du VIH.

Le cycle rétroviral présente plusieurs étapes qui sont les cibles des antirétroviraux actuels. Après l'adsorption du virus sur la membrane cellulaire par fixation sur le CD4 et l'un des deux co-récepteurs (CCR5/CXCR4), le virus pénètre dans la cellule par fusion entre l'enveloppe virale et la membrane cellulaire. Le génome viral sous forme de deux molécules d'ARN est transcrit par la transcriptase inverse (TI) en ADN. Celui-ci migre dans le noyau où il est intégré définitivement dans l'ADN cellulaire par l'intégrase virale (IN). Après la transcription et la traduction, les ARN viraux et les protéines virales s'assemblent pour former une particule virale qui bourgeonne à la membrane cellulaire. Ces particules deviennent infectieuses après maturation par la protéase virale (PR) qui clive les précurseurs polyprotéiques en protéines structurales et en enzymes.

Abréviations

ARV: antirétroviral.

IN: intégrase.

INNTI: inhibiteur non nucléosidique de la transcriptase inverse.

INTI: inhibiteur nucléosidique de la transcriptase inverse.

IP: inhibiteur de la protéase.

OMS: Organisation Mondiale de la Santé.

PR: protéase.

RnaseH: ribonucléase H.

Sida: syndrome de l'immunodéficience humaine acquise.

TI: transcriptase inverse.

VIH: virus de l'immunodéficience humaine.

Cycle de réplication du virus HIV (Mouscadet &

Deprez)

(31)

61

•  Aspartyl-protéase de 99 résidus

Active sous la forme d’un homodimère

Chatfield et al. 1998

62

•  Structure cristalline de la protéase d’HIV en

complexe avec un substrat peptidique

Jeff D. Cronk

1KJF

(32)

63

•  Utilisation de cette structure cristalline pour concevoir un inhibiteur peptido-mimétique

Mise sur la marché en 2003 sous le nom Reyataz

130 l’actualité chimique - novembre-décembre 2003

Cibles thérapeutiques

phosphorylés, le ténofovir (3), récemment commercialisé, est actuellement l'unique produit dans cette catégorie. C'est un analogue monophosphorylé qui ne requiert donc que deux étapes cellulaires de phosphorylation. Le ténofovir illustre également une autre voie de recherche sur les ARV puisque le produit lui-même n'ayant pas été utilisé du fait de sa très faible biodisponibilité, il est commercialisé sous forme de prodrogue, le ténofovir disoproxil (4), un précurseur hydrolysable. Le ténofovir est également intéressant du point de vue des résistances puisque la mutation M184V, qui est très rapidement sélectionnée sous lamivudine (3TC), confère une hyper-susceptibilité au ténofovir. En contrepartie, la seule mutation majeure associée au ténofovir à ce jour, la mutation K65R, présente un profil de résistance croisée avec l’abacavir, l’amdoxovir, la didanosine, la lamivudine et la zalcitabine.

La seconde catégorie comprend des composés qui se fixent à l'enzyme sur un site différent de celui du substrat (inhibiteurs non nucléosidiques ou INNTI). Dans cette catégorie, une trentaine de classes chimiques différentes ont été identifiées dont trois produits seulement sont actuellement commercialisés (nevirapine, delavirdine et efavirenz). Les INNTI induisent l'émergence de résistances en quelques semaines. L'apparition de mutations est ralentie par l'utilisation de doses élevées et la combinaison avec des INTI. Une seconde génération d'INNTI est actuellement en développement. Deux produits sont particulièrement avancés : le DPC083 (5) et le TMC125 (6) qui sont actifs à des concentrations nanomolaires non seulement contre la transcriptase sauvage, mais également contre un certain nombre de mutants résistants aux autres INNTI (figure 3).

Plus encore, la résistance au DPC083 nécessite la combinaison de plusieurs mutations, ce qui n'est pas le cas des autres INNTI [7]. Ces deux produits ont montré une activité remarquable dans les essais de phase II et sont actuellement en essais cliniques avancés.

Nouveaux inhibiteurs de protéase

Les protéines de structures et les enzymes du VIH sont produites à partir des gènes viraux sous forme de précurseurs polyprotéiques. La formation de nouveaux virus infectieux nécessite le clivage de ces précurseurs en entités fonctionnelles. Cette maturation, réalisée par la protéase virale, est bloquée par les inhibiteurs de celle-ci (IP). Tous les IP actuellement utilisés sont des peptido-mimétiques du substrat de la protéase qui contiennent une liaison hydroxyéthylène à la place d'une liaison peptidique et qui sont par conséquent non clivables. L'azatanavir (7), un peptido-mimétique approuvé par la FDA en juin 2003 (sous le nom de Reyataz) constitue le développement le plus récent de ce type de composé (figure 4). Cet inhibiteur reste efficace contre certaines mutations associées à la résistance aux autres IP. Par ailleurs, comme l'utilisation de peptido- mimétiques conduit systématiquement à l'apparition de résistances croisées, la recherche d'inhibiteurs non peptidiques est devenue un objectif majeur. De ce point de vue, un premier composé, le tripanavir (8), a démontré une excellente efficacité contre des isolats viraux isolés de patients résistants aux IP. D'autres inhibiteurs non

Figure 2 - Nouveaux inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse.

L'emtricitabine et l'amdoxovir sont deux analogues de nucléosides dont l'activité antivirale dépend d'une triphosphorylation en nucléotides.

L'amdoxovir est une prodrogue, désaminée in vivo en DXG (dioxolane guanine) par une adénine désaminase cellulaire. Le ténofovir est une nucléotide monophosphorylée dont la prodrogue active est le ténofovir disoproxil.

Figure 3 - Nouveaux inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse.

DPC083 et TMC125 sont deux exemples de nouveaux dérivés qui inhibent la transcriptase inverse selon un mode non compétitif. Ils sont tous deux actifs contre des isolats viraux résistants aux mutants sélectionnés par les INNTI actuels.

Figure 4 - Nouveaux inhibiteurs de la protéase virale.

L'atazanavir est le peptido-mimétique le plus récent capable de bloquer l'activité de la protéase virale. Le tripanavir et le mozenavir sont les deux premiers IP non peptido- mimétiques à présenter un intérêt clinique potentiel.

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130 l’actualité chimique - novembre-décembre 2003 Cibles thérapeutiques

phosphorylés, le ténofovir (3), récemment commercialisé, est actuellement l'unique produit dans cette catégorie. C'est un analogue monophosphorylé qui ne requiert donc que deux étapes cellulaires de phosphorylation. Le ténofovir illustre également une autre voie de recherche sur les ARV puisque le produit lui-même n'ayant pas été utilisé du fait de sa très faible biodisponibilité, il est commercialisé sous forme de prodrogue, le ténofovir disoproxil (4), un précurseur hydrolysable. Le ténofovir est également intéressant du point de vue des résistances puisque la mutation M184V, qui est très rapidement sélectionnée sous lamivudine (3TC), confère une hyper-susceptibilité au ténofovir. En contrepartie, la seule mutation majeure associée au ténofovir à ce jour, la mutation K65R, présente un profil de résistance croisée avec l’abacavir, l’amdoxovir, la didanosine, la lamivudine et la zalcitabine.

La seconde catégorie comprend des composés qui se fixent à l'enzyme sur un site différent de celui du substrat (inhibiteurs non nucléosidiques ou INNTI). Dans cette catégorie, une trentaine de classes chimiques différentes ont été identifiées dont trois produits seulement sont actuellement commercialisés (nevirapine, delavirdine et efavirenz). Les INNTI induisent l'émergence de résistances en quelques semaines. L'apparition de mutations est ralentie par l'utilisation de doses élevées et la combinaison avec des INTI. Une seconde génération d'INNTI est actuellement en développement. Deux produits sont particulièrement avancés : le DPC083 (5) et le TMC125 (6) qui sont actifs à des concentrations nanomolaires non seulement contre la transcriptase sauvage, mais également contre un certain nombre de mutants résistants aux autres INNTI (figure 3).

Plus encore, la résistance au DPC083 nécessite la combinaison de plusieurs mutations, ce qui n'est pas le cas des autres INNTI [7]. Ces deux produits ont montré une activité remarquable dans les essais de phase II et sont actuellement en essais cliniques avancés.

Nouveaux inhibiteurs de protéase

Les protéines de structures et les enzymes du VIH sont produites à partir des gènes viraux sous forme de précurseurs polyprotéiques. La formation de nouveaux virus infectieux nécessite le clivage de ces précurseurs en entités fonctionnelles. Cette maturation, réalisée par la protéase virale, est bloquée par les inhibiteurs de celle-ci (IP). Tous les IP actuellement utilisés sont des peptido-mimétiques du substrat de la protéase qui contiennent une liaison hydroxyéthylène à la place d'une liaison peptidique et qui sont par conséquent non clivables. L'azatanavir (7), un peptido-mimétique approuvé par la FDA en juin 2003 (sous le nom de Reyataz) constitue le développement le plus récent de ce type de composé (figure 4). Cet inhibiteur reste efficace contre certaines mutations associées à la résistance aux autres IP. Par ailleurs, comme l'utilisation de peptido- mimétiques conduit systématiquement à l'apparition de résistances croisées, la recherche d'inhibiteurs non peptidiques est devenue un objectif majeur. De ce point de vue, un premier composé, le tripanavir (8), a démontré une excellente efficacité contre des isolats viraux isolés de patients résistants aux IP. D'autres inhibiteurs non Figure 2 - Nouveaux inhibiteurs nucléosidiques de la

transcriptase inverse.

L'emtricitabine et l'amdoxovir sont deux analogues de nucléosides dont l'activité antivirale dépend d'une triphosphorylation en nucléotides.

L'amdoxovir est une prodrogue, désaminée in vivo en DXG (dioxolane guanine) par une adénine désaminase cellulaire. Le ténofovir est une nucléotide monophosphorylée dont la prodrogue active est le ténofovir disoproxil.

Figure 3 - Nouveaux inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse.

DPC083 et TMC125 sont deux exemples de nouveaux dérivés qui inhibent la transcriptase inverse selon un mode non compétitif. Ils sont tous deux actifs contre des isolats viraux résistants aux mutants sélectionnés par les INNTI actuels.

Figure 4 - Nouveaux inhibiteurs de la protéase virale.

L'atazanavir est le peptido-mimétique le plus récent capable de bloquer l'activité de la protéase virale. Le tripanavir et le mozenavir sont les deux premiers IP non peptido- mimétiques à présenter un intérêt clinique potentiel.

✓ Pistes explorées pour améliorer les inhibiteurs:

- diminuer la taille

- optimiser les interactions avec la chaine principale - garder la flexibilité

✓ Dans le cas du mozenavir, exploitation de la connaissance du réseau de molécules d’eau

✓ Utilisation d’inhibiteurs peptido-mimétiques souvent associée à

l’émergence de résistance: développement d’inhibiteurs non-peptidiques

✓ Choix rationnel ou par criblage des noyaux inhibiteurs

Ren Wei

Ren Wei structure-structure-based drug designbased drug design 2525

Solvent Effects: incorporated to the Solvent Effects: incorporated to the

designed Ligand designed Ligand

• Nonpeptide HIV Protease Inhibitors Based on Cyclic Urea Compounds

Incorporate an

Oxygen Atom Where a Bound Water

Molecule Was

Visualized in X-Ray

Structures;

(33)

65

✓ Développement important de biologie structurale dans les processus de conception rationnelle de médicaments

✓ La suite sur la SBDD appliquée aux protéine-kinases

Références

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