PROPOSITION DE SOLUTIONS EFFICIENTES POUR LE DIAGNOSTIC DES STAPHYLOCOCCIES : DETERMINATION DE LA DUREE DE CONSERVATION MAXIMALE DU PLASMA FRAIS DE QUELQUES ANIMAUX TROPICAUX

(1)

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT

SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (MESRS)

*********

UNIVERSITE D’ABOMEY-CALAVI (UAC)

*********

ECOLE POLYTECHNIQUE D’ABOMEY-CALAVI (EPAC)

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DEPARTEMENT DE GENIE DE BIOLOGIE HUMAINE (GBH)

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OPTION : ANALYSES BIOMEDICALES

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RAPPORT DE STAGE DE FIN DE FORMATION POUR L’OBTENTION DU DIPLÔME DE LICENCE PROFESSIONNELLE

Présenté et soutenu par : Sèna Adonias HOUEFONDE

SOUS LA DIRECTION DE :

Membres du jurys

Président : Pr Honoré BANKOLE Surperviseur : Dr Victorirn DOUGNON Examinateur : Dr Hornel HOUDOKPON

Année académique : 2017-2018 11^ème Promotion

PROPOSITION DE SOLUTIONS EFFICIENTES POUR LE DIAGNOSTIC DES STAPHYLOCOCCIES : DETERMINATION DE LA DUREE DE CONSERVATION MAXIMALE DU PLASMA

FRAIS DE QUELQUES ANIMAUX TROPICAUX

TUTEUR :

M. Eustache ACLINOU

Inspecteur d’action sanitaire à l’Hôpital de Zone de Mènontin

SUPERVISEUR :

M. Victorien DOUGNON, PhD

Maitre-Assistant des Universitésdu CAMES Enseignant-chercheur en Microbiologie à

l’Ecole Polytechnique d’Abomey-Calavi

(2)

REPUBLIQUE DU BENIN

**********

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

*********

UNIVERSITE D’ABOMEY-CALAVI

**********

ECOLE POLYTECHNIQUE D’ABOMEY-CALAVI

**********

DEPARTEMENT DE GENIE DE BIOLOGIE HUMAINE

**********

DIRECTEUR : Professeur Guy ALITONOU

DIRECTEUR ADJOINT : Docteur (Maitre conférence) François-Xavier FIFATIN

CHEF DE DEPARTEMENT : Professeur (Maitre conférence) Eugénie ANAGO

(3)

Présenté et soutenu par Sèna Adonias HOUEFONDE i

DEPARTEMENT DE GENIE DE BIOLOGIE HUMAINE (GBH) Noms et prénoms Matières enseignées

ABLEY Sylvestre Déontologie

AGBANGLA Clément Génétique

AGOSSOU Gille Législation et Droit du Travail AHOYO Théodora Angèle Microbiologie / Santé Publique et

Hygiène Hospitalière

AKAKPO B. Huguette Education Physique et Sportive

AKOWANOU Christian Physique

AKPOVI D. Casimir Biologie Cellulaire/ Physiologie Humaine/ Biochimie Métabolique ALITONOU Alain Chimie Générale/ Chimie Organique ANAGO Eugénie Biochimie Structurale/ Biochimie

Clinique/ Biologie Moléculaire ANAGONOU Silvère Education Physique et Sportive ATCHADE Pascal Parasitologie/ Mycologie/

Entomologie

AVLESSI Félicien Chimie Générale/ Chimie Organique BANKOLE Honoré Bactériologie/ Virologie

DARBOUX Raphael Histologie Appliquée LISTE DES ENSEIGNANTS PERMANENTS ET

VACATAIRES

(4)

Proposition de solutions efficientes pour le diagnostic des staphylococcies : détermination de la durée de conservation maximale du plasma frais de quelques animaux tropicaux

Présenté et soutenu par Sèna Adonias HOUEFONDE ii

DESSOUASSI Noel Biophysique

DOSSEVI Lordson Techniques Instrumentales

DOSSOU Cyriaque Techniques d’Expression et Méthodes de Communication

DOUGNON T. Victorien Microbiologie/ Méthodologie de la Recherche/ Informatique médicale HOUNNON Hyppolite Mathématiques

HOUNSOSSOU Hubert Biostatistiques et Epidémiologie KLOTOE Jean Robert Equipement Biomédicaux

KOUNASSO Gabriel Initiation à l’Informatique LOKO Frédéric Biochimie Clinique

LOKOSSOU Gatien Immunologie/ Immuno – Pathologie LOZES Evelyne Immunologie/ Immuno – Pathologie MASSOULOKONON Vincent Histologie Générale

OGOUNDIKPE Nicarette Informatique Médicale SECLONDE Hospice Transfusion Sanguine

SEGBO Julien Biochimie/ Biologie Moléculaire SENOU Maximin Histologie Appliquée

TOPANOU Adolphe Hématologie/ Hémostase

SOEDE Casimir Anglais

YOVO K. S. Paulin Pharmacologie / Toxicologie TOHOYESSOU Zoe Soins infirmiers

(5)

Présenté et soutenu par Sèna Adonias HOUEFONDE iii

A mes parents,

Sans votre amour, je n’aurais pas pu atteindre mes objectifs académiques.

Recevez ce travail comme une récompense pour tous les efforts et sacrifices consentis.

DEDICACE

(6)

Présenté et soutenu par Sèna Adonias HOUEFONDE iv

La réalisation de ce travail n’aurait pas pu être possible sans l’intervention d’un grand nombre de personnes. Je ne saurais garder l’anonymat sur ces personnes.

 A Dieu le Tout Puissant,

Qui m’a donné la force te la patience d’accomplir ce modeste travail

 A mon oncle Docteur Gérard AGBOTA,

Ce travail est le fruit des inestimables efforts que tu as toujours consentis pour moi. Que cette œuvre reste le témoignage vivant de ton immense amour.

 A ma chère tutrice Aurore HOUNGNISSI AGBOTA,

Tu as été présente à chaque fois pour me remonter le moral et me motiver.

Merci pour tous tes conseils.

 A mes frères et sœurs Laurinaud HOUEFONDE, Morelle HOUEFONDE et Mireille HOUEFONDE,

Votre amour et soutien m’ont beaucoup aidé. Que ce travail vous donne beaucoup d’ardeur et de goût pour les études durant votre parcours et puisse le seigneur raffermir nos liens fraternels.

 A mon superviseur Docteur Victorien T. DOUGNON,

C’est à la fois un privilège et un honneur pour moi que vous ayez accepté sans réserve de diriger ce travail malgré vos multiples occupations. Votre pédagogie, votre abnégation et votre bonne foi font de vous un modèle catholique à copier. Longue vie à vous.

REMERCIEMENTS

(7)

Présenté et soutenu par Sèna Adonias HOUEFONDE v

 A monsieur Eustache ACLINOU,

Vous avez toujours été disponible pour répondre à mes préoccupations.

Merci pour votre contribution et pour vos nombreux conseils dans la réalisation de ce travail.

 A messieurs Godefroy D. ZINSOU et Raoul HOUNKPONOU,

Pour vos conseils et votre disponibilité à mon égard pendant mon séjour à l’Hôpital de Zone de Mènontin.

 A monsieur Brice FANOU,

Vous avez toujours été disponible pour répondre à mes préoccupations. Merci pour votre contribution dans la réalisation de ce travail.

 A mon meilleur ami Anges ALAVO

Pour ton amitié, ton soutien et ton encouragement durant cette formation.

Sincères remerciements.

 A mes amis, Florida ZEHOUNPKE, Flocas DANSI SOCLO, Carine BLENON, Corine HOUNGNANDAN, Kévin SITONDJI et Merveille AKOUTA

Sincères remerciements pour votre solidarité dans la réalisation de ce travail.

 A tous mes camarades de la 10^{ème et}11^eme promotion de la Licence Professionnelle en Analyses Biomédicales,

Profonde reconnaissance.

 A tous ceux qui m’ont aidé de près ou de loin dans la réalisation de ce travail, merci pour tout.

(8)

Présenté et soutenu par Sèna Adonias HOUEFONDE vi

 Au Président du Jury,

C’est un honneur pour nous que vous acceptiez de présider le jury de notre soutenance. Nous vous prions de recevoir nos hommages respectueux.

 Aux Membres du Jury,

Pour avoir accepté de siéger dans ce jury et de juger ce travail. Nous vous prions de recevoir notre profonde gratitude.

HOMMAGES

(9)

Présenté et soutenu par Sèna Adonias

HOUEFONDE vii

ATCC : American Type Culture Collection EDTA : Ethylene Diamine Tétra-Acétique EPAC : Ecole Polytechnique d’Abomey-Calavi GBH : Génie de Biologie Humaine

H : Heure

URMAPha : Unité de Recherche en Microbiologie Appliquéé et Pharmacologie des substances naturelles

S. aureus : Staphylococcus aureus

% : Pourcentage

LISTE DES SIGLES ET ABREVIATIONS

(10)

HOUEFONDE viii

Figure 1 : Comparaison de l’efficacité du plasma frais de lapin et de rat

Wistar selon le temps………. 16

Figure 2 : Performance des deux premiers jours de la conservation du

plasma frais de lapin ……….……… 16

Figure 3 : Performance du 3^ème et du 4^ème jour de conservation du

plasma frais de lapin………..………. 17

Figure 4 : Performance du 5^ème et du 6^ème jour de conservation du

plasma frais de lapin……… 17

Figure 5 : Performance du plasma frais de lapin au bout du 7^ème jour... 18 LISTE DES FIGURES

(11)

HOUEFONDE ix

INTRODUCTION : ………

CHAPITRE 1 : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE.…………...

1- HISTORIQUE 2- HABITAT

3- POUVOIR PATHOGENE 4- PHYSIOPATHOLOGIE

5- DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE

CHAPITRE 2 : MATERIEL ET METHODES ………...……

1- CADRE 2- MATERIEL 3- METHODES

CHAPITRE 3 : RESULTATS ET COMMENTAIRE ...

1- RESULTATS 2- COMMENTAIRE

CONCLUSION :………..……....

2 5

11

16

21 SOMMAIRE

(12)

Présenté et soutenu par Sèna Adonias HOUEFONDE x

La recherche de la staphylocoagulase libre pour l'identification de

Staphylococcus aureus rencontre un problème assez crucial de nos jours à cause du coût élevé du plasma lyophilisé de lapin. Ce travail a eu pour objectif général d’améliorer l’efficience du diagnostic biologique de Staphylococcus aureus.

Ainsi donc, pour réaliser ce travail, une souche de référence S. aureus ATCC 25923, 20 échantillons de sang de rongeurs prélevés sur tube EDTA ont été utilisés.

Après la caractérisation biochimique de cette souche, la recherche de la staphylocoagulase libre a été faite chaque jour pendant une semaine de conservation au réfrigérateur des plasmas des dits rongeurs.

L’étude à montrer que contrairement au plasma frais de rats wistar celui du lapin a permis de mettre en évidence la staphylocoagulase libre de la souche de staphylocoque.

Le plasma de lapin a été donc conservé durant 7 jours au réfrigérateur entre 2°C et 8°C. Au bout des six premiers jours, 100% des échantillons de plasma ont assuré la révélation de la staphylocoagulase. Au 7^ème jour ce nombre a connu une chute significative (6,67%).

Cette étude apporte donc la certitude que le plasma frais de lapin peut remplacer le plasma lyophilisé de lapin avec une efficience mesurée à condition de le conservé entre 2°C et 8°C pendant un maximum de six jours.

Mots clés : Staphylocoagulase libre, Santé publique, Laboratoire biomédical, Recherche, Développement.

RESUME

(13)

HOUEFONDE xi

Free staphylococci coagulase detection for Staphylococcus aureus identification meets a crucial problem nowadays due to rabbit lyophilized plasma high cost. This study aim was the to improve Staphylococcus aureus diagnostic efficiency.

An ATCC 25923 S.aureus strain and 20 rodent bloods take on EDTA salt has been used. After biochemical characterization of this strain, free Staphylococci coagulase detection has been done during 7 days on refrigerate rodent’s plasma.

The study show that r abbit plasma permitted to detect free staphylococci coagulase contrary to Wister rats plasma. Rabbit plasma has been keep 7 days between 2°C and 8°C the test. During the first 6 days, 100% plasma detect staphylococci coagulase. On day 7 there was a significant fall (6.67%)

This study bring certainty that fresh ra b b i t plasma c a n replace rabbit lyophilized plasma with measured efficiency, if plasma keep between 2°C and 8°C during a 6 days maximum.

Key words: Free staphylocoagulase, Public Health, Medical laboratory, Recherch-Development.

ABSTRACT

(14)

INTRODUCTION

(15)

HOUEFONDE 2

Les infections bactériennes constituent de nos jours un véritable problème sanitaire. Il existe un très grand nombre d’infections bactériennes pouvant affecter l’être humain. Si certaines infections bactériennes sont très bénignes, d’autres au contraire peuvent être mortelles.

Dans la liste de ces bactéries, nous avons le genre Staphylocoque. Les staphylocoques sont des bactéries présentes dans notre environnement, au niveau de notre peau et de nos muqueuses. Ils sont constitués de plusieurs espèces dont Staphylococcus aureus qui occupe une place importante en pathologie humaine et animale (Boerlin et al., 2003 ; Weist et al., 2006). Staphylococcus aureus est une bactérie ubiquiste et commensale de la peau et des voies nasales chez l’Homme (Kateete et al., 2010). La capacité unique de S. aureus de provoquer la coagulation est connue depuis plus d’un siècle (Peetermans, et al,. 2015, Zapotoczna, et al,. 2015).

L’identification de S. aureus au laboratoire est donc basée, entre autres, sur la présence de la staphylocoagulase libre. Une divergence est notée dans la réalisation de la technique. La recherche de la staphylocoagulase libre doit être réalisée en tube à hémolyse en utilisant la suspension de plasma de lapin lyophilisé et le bouillon de 24h à volume égal (Mounier et Dénis, 1987 ; Hanane, 2009).

Cependant, rare sont les laboratoires qui arrivent à le réaliser, compte-tenu du coût élevé du plasma lyophilisé de lapin utilisé dans le cadre de l’identification des souches de Staphylococcus aureus (Bankolé et al, 2014). Des travaux ont été entrepris pour montrer qu’il était possible de réduire le volume de plasma de lapin lyophilisé commercialisé et que le plasma frais de lapin pouvait être utilisé (Bankolé et al., 2014, Ibrahim, 2014).

Même si la preuve de l’efficacité du plasma frais de lapin a été apportée (Ibrahim, 2014), quand est-il de la période pendant laquelle ce plasma pouvait donner des résultats validés ?

(16)

HOUEFONDE 3

C’est ce qui justifie l’intérêt du présent travail dont l’objectif général vise à améliorer l’efficience du diagnostic biologique des staphylococcies. Spécifiquement, il s’est agi de :

- comparer l’efficacité du plasma frais de lapin à celui de rats Wistar - déterminer la durée maximale de conservation du meilleur plasma frais

En dehors de l’introduction et de la conclusion, le présent travail a été rédigé en trois parties essentielles. La première partie a permis d’aborder la synthèse bibliographique, le matériel et la méthodologie adoptés ont été décrits dans la deuxième partie et les résultats suivis du commentaire ont fait l’ossature du dernier chapitre.

(17)

CHAPITRE 1

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

(18)

HOUEFONDE 5

1. HISTORIQUE

Les premières descriptions des staphylocoques isolés à partir de pus d’abcès datent de 1871 mais, c’est quelques années plus tard que ces travaux permettront de proposer un nom à la bactérie rencontrée. Ainsi en 1878, Robert Koch en Allemagne et Louis Pasteur en 1880 en France décrivirent des grappes de coques dans du pus d’origine humaine (Chaalal, 2013). La même année, en Ecosse, Alexander Ogston propose le nom Staphylococcus (staphylê : grappe et kokkos : grain) car les bactéries se regroupent en amas irréguliers ressemblant à une grappe de raisin (Spicer, 2003). Ogston différencie ainsi Staphylococcus de Streptococcus.

Enfin en 1884 en Allemagne, Anton Julius Friedrich Rosenbach donne la première description du genre Staphylococcus en cultivant les bactéries sur milieu solide. Il différencie ainsi S. aureus de S. albus par la coloration des pigments produits par les colonies (Avril et al., 2003).

2. HABITAT

Le réservoir naturel des staphylocoques est l’homme et les animaux à sang chaud. Cependant, éliminées dans le milieu extérieur, ces bactéries très résistantes sont fréquemment retrouvées dans l’environnement. S. aureus est un commensal occasionnel ou permanent de la peau et des muqueuses de l’homme et des animaux (rhino-pharynx, intestin) qui semblent constituer le principal réservoir de ce germe, secondairement localisé dans la nature (Breche et al, 1988). La présence de S.

aureus dans l'environnement est essentiellement due à une contamination par l'homme ou par les animaux (Bergdoll, 1979 ; Breche et al, 1988). Il joue un rôle dans l’équilibre physico - chimique de la peau et constitue une barrière contre l’implantation des bactéries de la flore transitoire (Eveillard, 2007).

(19)

HOUEFONDE 6

3. POUVOIR PATHOGENE

Il est important de distinguer S. aureus des staphylocoques à coagulase négative. S. aureus a un potentiel de pathogénicité très important et est responsable aussi bien d’infections communautaires que nosocomiales. Par opposition, les staphylocoques à coagulase négative sont en règle générale des bactéries opportunistes essentiellement responsables d’infections nosocomiales.

(Barbier, 2008)

4. PHYSIOPATHOLOGIE

Le pouvoir pathogène d’une souche est lié à l’expression de facteurs de virulence. Nous aborderons dans ce paragraphe uniquement le cas de S. aureus dont les facteurs de virulence sont les mieux caractérisés.

On distingue les protéines de surface qui permettent la colonisation de l’hôte, des facteurs qui conduisent au développement et à l’extension de l’infection et des toxines spécifiques responsables de syndromes toxiniques (Dardenne, 2016)

5. DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE 5.1 Morphologie

Ce sont des cocci à Gram positif, isolés ou groupés en diplocoques, en courtes chaînettes ou en amas, ayant la forme de grappe de raisin, immobiles, non sporulés mais parfois encapsulés. Ils mesurent 0,8 à 1 μm de diamètre (Fauchere et Avril, 2002).

En effet, l’association de cocci Gram positif et de polynucléaires dans un prélèvement évoque fortement une infection à staphylocoques. Cependant, le diagnostic définitif du genre et de l’espèce ne sera obtenu qu’après la culture et l’identification des souches (Chaalal, 2013).

(20)

HOUEFONDE 7

5.2 Caractères culturaux

Les staphylocoques sont peu exigeants sur le plan nutritif, aéro - anaérobies facultatifs c'est à dire qu’ils sont capables de se développer à la surface de la peau, en aérobiose et aussi dans les tissus mal oxygénés. Ils croissent bien sur les milieux usuels simples, de même que sur la plupart des milieux qui favorisent la croissance des bactéries à Gram positif.

La température optimale de croissance est de 37°C et le pH optimal est de 7.5, mais ils supportent de grandes variations respectivement de 10 à 45 °C et un pH de 5,6 à 8,1 (Couture, 1990). En bouillon, la culture est rapide, en quelques heures un trouble homogène puis un dépôt sont observés, il n'y a pas de production de pigment en milieu liquide (Kloos et Shleifer, 1975).

Après culture de 24 heures sur gélose au sang, les colonies qu'ils produisent sont de plus grand diamètre que celles produites sur gélose nutritive. Ainsi, une pigmentation peut être observée et la couleur varie selon l'espèce (Couture, 1990). Certaines souches sont pigmentées en jaune doré (d’où le nom aureus). Le milieu de Chapman est particulièrement utilisé, il ne laisse croître au bout de 24 à 48 heures que les staphylocoques, germes halophiles qui tolèrent des concentrations élevées de jusqu’à 7,5% (qui inhibe pour cette raison, la plupart des autres germes). Ce milieu sélectif est rendu différentiel par l'addition de mannitol à 1% et d'un indicateur d'acidité, le rouge de phénol. Ce dernier permet à la fois d'isoler les staphylocoques fermentant le Mannitol à partir d'un prélèvement contenant un mélange de germes et oriente vers S. aureus ou une autre espèce de staphylococcus fermentant le mannitol (Couture, 1990).

(21)

HOUEFONDE 8

5.3 Caractères biochimique

Toutes les souches du genre Staphylococcus produisent une catalase, permettant ainsi de les distinguer des souches du genre Streptococcus qui n'en produisent pas (Le Minor et Veron, 1990). S. aureus possède également un équipement enzymatique lui permettant de métaboliser de nombreux et divers substrats glucidiques, protéiques et lipidiques (Ferron ,1984). Le métabolisme glucidique est particulièrement intéressant. La plupart des sucres est fermentée;

(glucose, saccharose, lévulose, lactose et mannitol), le glucose est utilisé en anaérobiose et aérobiose ainsi que le mannitol. L’utilisation du mannitol est une indication importante parce que ce polyalcool est fermenté par S. aureus et S.

epidermidis (Couture, 1990). La recherche de la fermentation du mannitol s’effectue généralement sur le milieu de Chapman. Les staphylocoques pathogènes vont fermenter le mannitol en 24h à 48h (acidifient le milieu qui vire au jaune). Cependant certaines souches, pourtant pathogènes demeurent inactives sur le mannitol. La fermentation du mannitol n’a pas de valeur absolue et doit être complétée par d’autres tests (Couture, 1990).

Ce qui caractérise mieux l’espèce S. aureus, c’est la production d’une staphylocoagulase (Fauchere et Avril., 2002). Cependant, certaines souches de S. aureus peuvent ne pas produire de coagulase libre en raison d’une mutation.

Ainsi, une DNase thermostable permet de déterminer si le germe isolé est un S.

aureus (Couture, 1990).

Le test mettant en évidence l’aptitude des bactéries à coaguler le plasma est le principal test caractérisant S. aureus.

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HOUEFONDE 9

Le test de détection consiste à incuber pendant 24 heures à 37°C un mélange de plasma lyophilisé de lapin et de bouillon de 24h de la souche à tester.

L’apparition d’un coagulum est observée en inclinant le tube à 90° Le test de la coagulase permet l’identification de 99% des souches de S. aureus mais certaines souches ne produisent pas de coagulase. L’identification de l’espèce est dans ce cas réalisée par d’autres tests (Chaalal, 2013).

(23)

CHAPITRE 2

MATERIEL ET METHODES

(24)

HOUEFONDE 11

1. CADRE

1.1 Cadre institutionnel

Le département de Génie de Biologie Humaine est l’un des premiers départements de l’Ecole Polytechnique d’Abomey-Calavi (EPAC). Il forme des techniciens supérieurs de laboratoire en Analyses Biomédicales. Ce département est animé à ce jour par plusieurs enseignants-chercheurs.

1.2 Cadre Technique

La présente étude s’est déroulée e n p a rt i e au laboratoire d’analyses biomédicales de l’Hôpital de Mènontin du 29 Mai au 29 Août 2017. Il s’agit d’un établissement privé subventionné par l’Etat. Localisé dans le 10ème arrondissement du département du Littoral, cet hôpital est situé dans la rue pavée après le supermarché «Bénin Marché» en quittant l’échangeur de Godomey.

Le laboratoire d’analyses biomédicales de l’Hôpital de Mènontin est situé à l’étage du bâtiment principal et à l’extrême est. Il dispose d’un hall d’accueil, d’une salle de prélèvement, d’un bureau pour la gestion administrative, d’une salle de garde, d’une salle multidisciplinaire pour la réalisation des analyses sanguines biologiques comme celles de la biochimie, de l’immunologie, de l’hématologie, de l’hémostase, de l’endocrinologie et de l’immuno -parasitologie. Il dispose aussi d’une banque de sang et une salle de microbiologie dans laquelle se déroulent les examens de bactériologie de parasitologie et de mycologie.

L’autre partie s’est déroulée à l’Unité de Recherche en Microbiologie Appliquée et Pharmacologie des substances naturelles (U.R.M.A.Pha).

(25)

HOUEFONDE 12

Substances Naturelles (U.R.M.A.Pha) a été créée en 2017 en tant qu’unité de recherche trans-facultaire. Elle est au sein du Laboratoire de Recherche en Biologie Appliquée (L.A.R.B.A) de l’Ecole Polytechnique d’Abomey- Calavi.

Elle est physiquement et administrativement située au sein du campus de l’Université d’Abomey- Calavi.

Elle est constituée d’un accueil, du bureau de Directeur, d’un laboratoire et d’une salle de travail. Le laboratoire est composé de deux paillasses de manipulation. Les analyses biochimiques, hématologiques et bactériologiques y sont réalisées. Le laboratoire dispose d’un Poste de Sécurité en Microbiologie, d’un microscope et d’un microscope à camera, d’un autoclave, d’un agitateur magnétique, d’un agitateur Vortex, d’un spectrophotomètre et d’un automate.

La vision du laboratoire est d’être une unité nationale d’excellence ou les scientifiques travaillent ensemble pour trouver des solutions aux problèmes sanitaires et environnementaux d’importance majeure au Bénin et en Afrique.

2. MATERIEL

2.1. Matériel Biologique

Le matériel biologique était constitué de la souche de S.aureus ATCC 25923, de 20 échantillons de sang dont 15 échantillons de sang de lapins et 05 échantillons de sang de rat Wistar. Ils ont été recueillis chez des animaux en parfaite santé dans une ferme d’élevage.

2.2. Milieux de culture

Pour la caractérisation biochimique de la souche de référence

Staphylococcus aureus ATCC 25923, les milieux manitol salt agar e t d e Mueller Hinton ont été utilisés. Pour le test de stérilité du plasma, la gélose de Mueller Hinton a été utilisée et pour la staphylocoagulase libre, le bouillon de Mueller Hinton a été utilisé.

(26)

HOUEFONDE 13

2.3. Réactifs

Les réactifs utilisés étaient les colorants pour la coloration de Gram, l’eau oxygénée pour la mise en évidence de la catalase. De l’eau distillée et de l’eau physiologique ont été également utilisées.

2.4 Equipements et consommables

Des équipements comme des réfrigérateurs, des microscopes, un autoclave, des bouteilles de gaz, des burettes graduées, des balances de précision, une étuve à 37°C et des portoirs ont servi à réaliser l’étude.

Des consommables tels que les marqueurs, les lames et lamelles, les boîtes de Pétri, des pipettes Pasteur ont également servi à la réalisation de l’étude.

3. METHODES

Le travail effectué a été réalisé en partie à l’Hôpital de Zone de Mènontin puis à l’Unité de Recherche en Microbiologie Appliquée et Pharmacologie des substances naturelles (URMAPha). Plusieurs étapes ont été suivies lors de la manipulation qui a duré 11 jours.

3.1 Obtention et caractérisation de la souche de Staphylococcus aureus La souche de référence de S.aureus ATCC 25923 a été obtenue au laboratoire de l’URMAPha. La caractérisation de cette dernière s’est faite le jour même selon les normes standards du diagnostic biologique de Staphylococcus aureus. L’état frais, l’état coloré et l’ensemencement sur les milieux de Chapman et de Mueller Hinton ont donc été faits.

La lecture des géloses ensemencées a été faite le 2^ème jour et des tests biochimiques ont été réalisés. La recherche de la staphylocoagulase libre a été réalisée sur le bouillon Muller Hinton de 24 heures ensemencé et du plasma lyophilisé de lapin commercialisé.

Dans un tube à hémolyse, 0,5 ml de plasma lyophilisé de lapin a été ajouté à 0,5ml du bouillon de 24heures ensemencé avec la souche de référence ATCC 25923. Un témoin négatif T(-) a été préparé en mélangeant le bouillon non

(27)

HOUEFONDE 14

37°C. La lecture a été faite à 30min, 1h, 2h, 3h, 4h, 5h, 6h et 24 h. La réaction positive s’est traduite par la prise en masse du mélange.

La lecture a été faite selon la méthode de Turner et al., (1958).

Test négatif : non évidence de la formation fibrine Test positif : + Petit coagulum organisé,

++ Coagulum organisés peu opaque,

+++ Coagulum opaques très fermes restant en place après retournement du tube.

3.2 Prélèvement des animaux et obtention des échantillons de plasma frais Le 3^ème jour, les rats Wistar ont été prélevés par ponction rétro-orbitale et les lapins au niveau de la veine marginale de l’oreille. Les sangs recueillis dans des tubes EDTA ont été centrifugés à 1500 tours/min pendant 15min. Les plasmas ont été décantés dans des tubes Eppendorf. A partir de ces plasmas nous avions réalisé un test de stérilité en les ensemençant sur gélose Muller Hinton.

3.3 Comparaison de l’efficacité des échantillons de plasma frais

Le 4^ème jour, la réalisation de la staphylocoagulase libre a été faite à partir des différents plasmas de rat Wistar et de lapin dans le but de ressortir le meilleur plasma.

3.4 Monitorage de la durée de conservation du meilleur plasma

Conservation au réfrigérateur entre 2°C et 8°C des plasmas frais et poursuite du test de la staphylocoagulase libre sur les 7 derniers jours.

(28)

CHAPITRE 3

RESULTATS ET COMMENTAIRE

(29)

HOUEFONDE 16

De l’étude de la révélation de la staphylocoagulase avec les plasmas de rongeurs, il ressort que le plasma de Rat Wistar ne donne pas de bons résultats. En effet au bout de 24h, seulement 20% de plasma de rat Wistar ont coagulé alors qu’au bout de 30 minutes déjà ceux de lapin l’étaient (Figure1).

Figure 1 : Comparaison de l’efficacité des plasmas frais de lapin et de rats Wistar selon le temps

Le premier jour et le deuxième jour de conservation ont montré une efficacité du plasma de lapin. Au bout de trente minutes, un coagulum avait déjà été observé et ce durant les 24 heures d’observation (Figure 2).

Figure 2 : Performance des deux premiers jours de conservation du plasma frais de lapin

0 2 4 6 8 10 12 14 16

30 min 1h 2h 3h 4h 5h 6h 24h

Nombre de plasma

Temps de coagulation

Plasma de lapin coagulé Total plasma lapin Plasma de rat coagulé Total plasma rat

0 2 4 6 8 10 12 14 16

30 min

1h 2h 3h 4h 5h 6h 24h

Nombre de plasmas

Temps de coagulation

Plasma de lapin coagulé Total plasma de lapin

(30)

HOUEFONDE 17

Durant le troisième et le quatrième jour, le coagulum a été révélé à partir de 60 minutes.

Figure 3 : Performance du 3ème et du 4ème jour de conservation du plasma frais de lapin

Le cinquième et le sixième jour, il a été constaté qu’au bout de 30 minutes, aucun coagulum n’a été révélé. 60 minutes plus tard, la plupart des plasmas (86,67%) ont coagulé le bouillon de 24 heures. Ce n’est qu’après 2 heures de temps que la totalité des plasmas ont agi (Figure 4).

Figure 4 : Performance du 5^ème et du 6^ème jour de conservation du plasma frais de lapin

0

15 15 15 15 15 15 15

15 15 15 15 15 15 15 15

0 5 10 15 20

30min 1h 2h 3h 4h 5h 6h 24h

Nombre de plasma

Temps de coagulation Plasma coagulés Total plasma lapin

0

13 15 15 15 15 15 15

15 15 15 15 15 15 15 15

0 5 10 15 20

30min 1h 2h 3h 4h 5h 5h 24h

Nombre de plasma

Temps de coagulation Plasma coagulés Total plasma lapin

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Au 7^ème jour, les résultats ont signalé l’inefficacité du plasma.

Figure 5 : Performance du plasma frais de lapin au bout du 7^ème jour

2. COMMENTAIRE

Cette étude a visée analytique a eu pour objectif général, d’améliorer le diagnostic biologique des staphylococcies. Ainsi, pour la validation des résultats, le test à la staphylocoagulase libre avec le plasma lyophilisé du lapin sur la souche Staphylococcus aureus de référence ATCC 25923 a révélé qu’elle est productrice de coagulase libre.

Les 15 plasmas de lapins utilisés ont donné un résultat positif lors de la première expérience avec 100% de succès contrairement aux plasmas de rat Wistar qui ont donné 20% de réussite. Ce faible taux de réussite du plasma de rat peut traduire la non spécificité et la non fiabilité du plasma en présence de la souche ATCC 25923 (Mohamed, 2003). Ceci permet de conclure que des deux plasmas, seul le plasma de lapin peut constituer un substituant au plasma lyophilisé pour la révélation de la staphylocoagulase libre.

0 0 1 1 1 1 1 1

15 15 15 15 15 15 15 15

0 5 10 15 20

30 min 1h 2h 3h 4h 5h 6h 24h

Nombre de plasma

Temps de coagulation Plasma coagulés Total plasma lapin

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De plus, les résultats révèlent que durant les deux premiers jours de conservation, le plasma de lapin donne un coagulum au bout de 30 minutes.

Au fur et à mesure que les jours s’écoulent du 3^ème au 4^ème jour, le temps de formation du coagulum s’étend à 60 minutes puis à 2h au bout des 5^èmes et 6^èmes jours. Au bout du 7^ème jour d’évaluation du pouvoir du plasma frais de lapin, seul un des plasmas s u r 15 a donné un résultat positif. Ceci pourrait s’expliquer par une altération de la composition du plasma conservé. Néanmoins, l’influence de cette altération subie par le plasma frais conservé n’a été remarquée qu’au bout de six jours contrairement au constat fait par Ibrahim (2014) qui rapportait une altération au bout de 5 jours.

Au vu des résultats obtenus avec le plasma frais de lapin, facile d’accès, moins coûteux par rapport au plasma lyophilisé et de délai de conservation réduit, il serait bénéfique aux laboratoires d’analyses et de recherches de l’utiliser dans l’identification de S. aureus. Toutefois, il faudra le maintenir au réfrigérateur pendant 06 jours au plus. Cette disposition permettrait que les résultats ne soient pas biaisés.

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CONCLUSION

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Au regard de cette étude, nous pouvons dire que le plasma frais de lapin peut constituer un substituant efficace et efficient au plasma lyophilisé lors de la recherche de la staphylocoagulase libre. De plus, ce plasma peut non seulement être conservé pendant 6 jours mais permet également d’obtenir au bout de deux heures des résultats concrets.

Il serait judicieux d’opter pour son utilisation afin de faciliter le diagnostic de S. aureus dans les laboratoires d’analyses biomédicales.

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REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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Avril J.L., Dabernat H., Denis F. et Monteil H., 2003. Bactériologie Clinique.

3^ème édition. ellipses, Paris. 8-28p.

Barbier F, 2008. Staphylocoque E.D Bactériologie DCEM 1, p : 8-9.

Bankolé H.S., Dougnon T.V., Fiogbé E.P., Amoussou A.N., Baba-Moussa L., 2014. Identification de Staphylococcus aureus : est-il possible de réduire le volume de plasma de lapin sans influencer la recherche de la staphylocoagulase libre? Journal of Applied Biosciences, 73: 6027– 6032.

Bergdoll, M.S., 1979. Staphylococcal intoxications. In: Riemann H, Bryan FL.

Food-borne infections and Intoxications. Academic press New York, 443- 494p.

Bhatia A, et Zahoor S., 2007. Staphylococcus aureus enterotoxins. Journal of clinical and Diagnostic Research 3 : 188-197.

Boerlin P., Kuhnert P., Hussy D., and Schaellibaum M., 2003. Evaluation of six agglutination tests for Staphylococcus aureus identification depending upon local prevalence of methicillin-resistant S. aureus (MRSA). Journal of Medical Microbiology, 55: 283–290.

Breche P., Gaillard J. et Simonet M., 1988. Collection de la biologie à la clinique.

Chaalal W., 2013. Occurrence et profil de d’antibiorésistance des Staphylococcus aureus isolés de produits alimentaires. Mémoire pour l’obtention du diplôme de magister en Microbiologie Fondamentale et Appliquée. Faculté des Sciences. Université d’Es -Senia Oran, Algérie : 94-107p.

Couture B., 1990. Bactériologie médicale «Etude et méthodes d’identification des bactéries aérobies et facultatives d’intérêt médical». Vigot, Paris : 15- 32p.

Dardenne L., 2016. « Des chercheurs belges auront-ils raison du Staphylocoque doré ? », sur LaLibre.be.

Eveillard M., 2007. Politique de dépistage de Staphylococcus aureus résistant à la méticilline à l’admission : adaptation à la diversification des facteurs de

(37)

HOUEFONDE 24

risque de portage, conséquences de cette politique pour les indicateurs de surveillance et la transmission. Thèse de Doctorat. Ecole Doctorale d’ANGERS. Université D'ANGERS. France : 159p.

Fasquelle R., 1974. Eléments de bactériologie médicale 9^èmeédition. Flammarion, Paris : 27-36p.

Fauchere J.L. et Avril J.L., 2002. Bactériologie générale et médicale. Ellipses, Paris. 213-217p.

Hanane A., 2009. Isolement des souches de Staphylococcus aureus résistantes à la méthicilline: Etude de leur sensibilité aux autres familles d’antibiotiques.

Mémoire pour l’obtention du diplôme de master en microbiologie appliqué et biotechnologie microbienne. Faculté Des Sciences de la Nature et de la Vie. Université Mentouri, Constantine, Algérie.94p.

Ibrahim B., 2014. « Identification de staphylococcus aureus : utilisation du plasma frais de lapin pour la recherche de la staphylocoagulase libre » Mémoire pour l’obtention du diplôme de licence professionnelle en Analyses Biomédicales à l’Ecole Polytechnique d’Abomey-Calavi p : 60-67.

Kateete D. P., Kimani C. N., Katabazi F. A., Okeng A., Okee M. S., Nanteza A., et al, 2010. Identification of Staphylococcus aureus: DNase and Mannitol salt agar improve the efficiency of the tube coagulase test. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials, 07p.

Kloos W.E. et Shleifer K.H, 1975. «Simplified scheme for routine identification of human Staphylococcus species». Journal of clinical Microbiology. 1: 82- 88.

Le Minor L. et Veron M., 1990. Bactériologie Médicale «Staphylococcus et Micrococcus» J.Fleurette 2ème édition. Flammarion Médecine-Sciences,

(38)

HOUEFONDE 25

Paris.773-794.

Mohamed E., 2003 « Conventional and molecular epidemiology of Staphylococcus aureus isolates originated from human animals » a thesis submitted in partial Fulfilment of Master Degree of Veterinary Science Faculty of Veterinary Medecine, University of Khartoum, p 65-78.

Mounier et Denis, 1987. Les cocci Gram positif. Bactériologie médicale techniques usuelles, Paris, France, ISBN285334276X, p.105-107.

Peetermans M, 2015. Plasminogen activation by staphylokinase enhances local spreading of S. aureus in skin infections.

Spicer W., 2003. Pratique clinique en bactériologie mycologie et parasitologie Flammarion Médecine-Sciences, Paris. 28 – 29p.

Todar K.., 2005. Staphylococcus aureus Editor Todar online text book of bacteriology ; www.textbookofbacteriology.net

Tuner F., Schwartz B., 1958. The use of plasma lyophilized human plasma standardized for blood coagulation factors in the coagulaseand fibrinolytic tests. J Lab Clin Med. 5 (6): 888-894.

Weist K., Cimbal.A-K., Lecke C., Kampf G., Ruden H. et Vonberg R-P., 2006.

Evaluation of cis agglutination tests for S.aureus identification depending upon local prevalence of methicillin resistant S.aureus (MRSA). Journal of Medical Microbiology, 55: 283-290.

Zapotoczna M, 2015. Convergence of staphylococcus aureus persister and biofilm research: can biofilms be defined as communities of adherent persister cells.