Etude de composantes de la voie TOR : caractérisation de TbFKBP12, une protéine de la famille des PPIases (isomérases) impliquée dans l’homéostasie du flagelle chez
Trypanosoma brucei.
LABORATOIRE DE PARASITOLOGIE MOLECULAIRE
Thèse présentée par Anaïs Brasseur
Trypanosoma brucei est un parasite africain unicellulaire, responsable chez l’homme de la maladie du sommeil et chez les bovins de la Nagana. Il passe par différents stades lors de son cycle de vie, les deux principaux étant la forme sanguicole qui prolifère dans le sang des mammifères infectés, et la forme procyclique qui colonise le tube digestif du vecteur, la mouche glossine.
Les trypanosomes sont extracellulaires, ils possèdent un flagelle qui leur permet de se mouvoir dans les différents milieux qu’ils infestent. La structure de celui-ci contient des éléments conservés au cours de l’évolution. Il constitue donc un excellent modèle de base pour en étudier l’architecture. D’autre part, le flagelle du parasite contient des structures propres à certains kinétoplastides, offrant ainsi une cible thérapeutique aux traitements anti- trypanosomiaux.
Le flagelle est véritablement un organite plurifonctionnel nécessaire à la survie du parasite au sein des divers environnements qu’il rencontre lors de son cycle de développement. Outre son rôle moteur, il permet à la cellule d’échapper au système immunitaire de son hôte mammifère et de s’attacher à l’épithélium des glandes salivaires de l’insecte. Il est également requis pour le bon positionnement des organites, la morphogenèse et la division cellulaire. Enfin, il serait impliqué dans l’activité sensorielle du trypanosome. A ce jour, on ne connait quasiment rien des potentielles voies de « sensing ». Elles doivent pourtant exister, permettant l’appréhension de l’environnement, l’interaction avec les hôtes et la réception de signaux induisant la différenciation.
Cet intérêt pour les voies de signalisation du parasite a abouti à l’étude des composantes de la voie TOR. TOR-Target of Rapamycin est un contrôleur central de la croissance cellulaire qu’il régule en fonction de différents stimuli externes. Il a été démontré depuis que chez T.brucei aussi, TOR régulerait la croissance temporelle et spatiale de la cellule.
La kinase TOR est inhibée par sa liaison avec le complexe rapamycine-FKBP12. Nous
avons identifié cette peptidyl-prolyl cis-trans isomérase chez le parasite : TbFKBP12. Elle y
serait localisée au niveau du cytosquelette/flagelle. Contrairement à ce qui est observé chez la
levure S.cerevisiae, l’isomérase est essentielle chez le trypanosome. Son invalidation par
RNAi bloque la cytocinèse des parasites sanguicoles et provoque l’apparition d’axes de
clivage internes à la cellule. Chez les formes procycliques par contre, la disparition de la
protéine entraîne un défaut sévère de motilité du flagelle qui se traduit par une immobilisation
partielle du parasite.
ADN : Acide Désoxyribonucléique APC: Anaphase Promoting Complex ARN: Acide Ribonucléique
ARNdb: ARN double brin
AtFIP37: Arabidopsis interacting protein AUK : Aurora Kinase
BF : Bloodstream form CaM : Calmoduline CaN: Calcineurine CK: Cytosquelette
CMF: Component of Motile Flagella CPC: Chromosomal Passenger Complex CpN: Cyclophiline
CRK : Cdc2 Related Kinase CsA : cyclosporine A CYC : cycline
DLP : Dynein Like Protein
DNAI1: Dynéine Axonémale Intermédiaire1 DRC: Dynein Regulatory System
EC50: half maximal Effective Concentration FAT : FRAP, ATM, TRRAP
FATC : FRAP, ATM, TRRAP FAZ: Flagellum Attachment Zone FC : Flagella Connector
FCaBP : Flagellar Calcium Binding Protein FKBD: FK506 Binding Domain
FKBP: FK506 binding protein FP: Flagellar Pocket
FPC: Flagellar Pocket Collar
Fpr1 : FK506 sensitive proline rotamase FRAP : FKBP12 Rapamycin Associated protein FRB : FKBP Rapamycin Binding
GPI: glycosyl-phosphatidylinositol GST: Glutathione S-Transférase HA: Hémagglutinine
HAT: Human African Trypanosomiasis
HEAT: Huntingtin, Elongation factor 3, A subunit of protein phosphatase 2A et TOR IFT: Intra- Flagellar transport
IgG: Immunoglobuline G IL-2 : Interleukine 2
IP3R : récepteur à l’inositol 1,4,5 triphosphate IPTG : Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside KIN : Kinésine
KO : Knock Out
LRTP: Leucine Rich repeat protein LS: Long Slender
MAP: Microtubules Associated Protein MIP : Macrophage Infectivity Potentiator MT: Microtubules
MTOC : Microtubules Organizing Center
ORF : Open Reading Frame
PACGR : Parkin Co-Regulated Protein PAHX : phytanoyl CoA α hydroxylase Pb : paire de base
PBS : Phosphate Buffered Saline PCR : Polymerase Chain Reaction PDE : Phospho Di-Estérase PF : Procyclic Form
PFC : PFR proteome component PFR : Paraflagellar Rod
PIKK: phosphatidyl Inositol Kinase-related Kinase PLK : Polo-Like Kinase
PPIase : Peptidyl-Prolyl Cis-Trans Isomérase qRT-PCR : quantitative Real Time PCR RACK1: receptor for activated C kinase RE: Réticulum Endoplasmique
REL: Réticulum Endoplasmique Lisse RISC: RNA inducing silencing complex RNAi: RNA interference
RNE: Redundant Nuclear Envelope Rpm: Rapamycine
RS : Reticulum Sarcoplasmique RyR : Récepteur à la Ryanodine SEM : Scanning Electron Microscopy SL : Splice Leader
SS : Short Stumpy
TAC : Tripartite Attachment Complex TAP : Tandem Affinity Purification TBBC: Tb basal body component TBCC : tubulin cofactor C TβR : TGF β Receptor
TEM : Transmission Electron Microscopy TGF β: Transforming Growth Factor β TbFP: T.brucei Flagellum Proteome TLK: Tousled Like Kinase
TOR: Target Of Rapamycin TORC: TOR Complex
TPR : Tetra-trico-Peptide Repeat TSC : Tuberous Sclerosis Complex UTR : Untranslated region
VAP : Average Path Velocity VCL : Velocité curvilinéaire
VSG : Variant Surface Glycoprotein VSL : Velocité Straight line
Wt : wild type
INTRODUCTION ... 5
I : GÉNÉRALITÉS ... 5
1.1 : T.brucei et les Kinétoplastides ... 5
1.2 : La trypanosomiase ... 5
1.3 : Cycle de vie... 6
1.4 : Intérêt de l’étude de T.brucei ... 7
1.4.1 : La transcription polycistronique ... 7
1.4.2 : Les antigènes de surface ... 8
1.4.3 : La variation antigénique ... 8
II : FORME ET FORMATION DU PARASITE ... 9
2.1 : Morphologie générale d’un trypanosome africain ... 9
2.2 : Forme : structure du trypanosome ... 9
2.2.1 : les microtubules du cortex sous-pelliculaire ... 10
2.2.2 : le complexe d’attachement tripartite (TAC) ... 11
2.2.3 : le fuseau mitotique ... 11
2.2.4 : la poche flagellaire et la voie endocytaire ... 11
2.2.5 : Le flagelle... 12
a) Analyses des composants flagellaires ... 12
b) Structure du flagelle... 13
Le corps basal ... 13
L’axonème... 13
Le PFR - ParaFlagellar Rod... 14
Le FAZ – Flagellum Attachment Zone ... 14
Le FC – Flagella Connector... 15
La membrane et la matrice flagellaire ... 15
c) Formation du flagelle ... 16
2.3 : Formation : le cycle cellulaire ... 17
2.3.1 : Evènements de la division cellulaire ... 17
2.3.2 : Régulation du cycle cellulaire... 18
2.3.3 : Points de contrôle ... 18
2.3.4 : La cytocinèse ... 19
2.3.5 : Différenciation et cycle cellulaire ... 20
2.4 : Le flagelle : un organite plurifonctionnel ... 21
2.4.1 : Cycle de vie ... 21
2.4.2 : Endocytose et évasion immune ... 22
2.4.3 : Sensoriel ... 22
2.4.4 : Motilité ... 22
2.4.5 : Morphogenèse cellulaire ... 23
2.4.6 : Taille de la cellule ... 24
2.4.7 : Division cellulaire ... 24
a) Positionnement du FAZ ... 25
b) Mouvement du flagelle ... 25
III: FKBP12; FK506 BINDING PROTEIN 12kD ... 27
3.1 : Généralités ... 27
3.1.1 : Découverte des Peptidyl-Prolyl Cis-Trans Isomérases ; PPIases ... 27
3.1.2 : PPIases et immunosuppression ... 27
3.1.3 : Conservation des PPIases ... 27
3.1.4 : Activité enzymatique isomérase ... 28
3.2 : Structure et fonctions des FKBPs ... 28
3.2.1 : FKBP12, archétype des FKBPs ... 28
a) Structure de FKBP12 et du FKBD... 28
b) Fonctions de FKBP12 ... 29
3.2.2 : FKBP52, une FKBP multi-domaine... 32
a) Structure de FKBP52 ... 32
b) Translocation des récepteurs aux stéroïdes ... 32
c) FKBP52 et le cytosquelette ... 32
d) Activité chaperonne ... 32
e) Autres interactions protéiques ... 33
TABLE DES MATIERES
2
3.2.3 : FKBPs végétales ... 33
3.2.4 : PPIases parasitaires ... 33
a) PfFKBP35 ... 33
b) TcMIP ... 34
c) TbCypA ... 34
3.3 : FKBP12, TOR et Calcineurine : de la transduction de signaux à l’immunosuppression ... 34
3.3.1 : FK506 et rapamycine ... 34
3.3.2 : La phosphatase calcineurine ... 35
a) Structure de la calcineurine ... 35
b) Fonction de la calcineurine ... 35
c) Calcineurine-FK506-FKBP ... 36
d) La calcineurine chez les Kinétoplastides ... 36
3.3.3 : La kinase TOR, contrôleur de la croissance cellulaire ... 37
a) Structure de TOR ... 37
b) TOR, contrôleur de la croissance cellulaire ... 38
c) TOR-Rapamycine-FKBP ... 38
d) TOR chez T.brucei ... 39
OBJECTIF DU TRAVAIL ... 41
RESULTATS ... 43
I : IDENTIFICATION DES FKBPS DE T .brucei ... 43
1.1 : Analyse bioinformatique dans le génome de T.brucei ... 43
1.1.1 : Identification des gènes FKBPs ... 43
1.1.2 : Identification des gènes TORs ... 44
1.2 : Etude de l’expression des gènes FKBPs ... 45
1.3 : Effet des drogues immunosuppressives FK506 et rapamycine sur T.brucei ... 45
II : MISE EN PLACE DES OUTILS NECESSAIRES A LA CARACTERISATION DES FKBPS DE T.brucei ... 47
2.1 : Expression de TbFKBP12 recombinantes ... 47
2.1.1 : Expression et purification d’une TbFKBP12-6his ... 47
a) Production de la protéine ... 47
b) Production d’un anticorps spécifique ... 47
2.1.2 : Expression et purification d’une GST-TbFKBP12 ... 47
a) Production de la protéine ... 47
b) Production d’un anticorps spécifique ... 49
c) Production de mutants GST-TbFKBP12 ... 49
2.2 : Identification du 5’UTR de TbFKBP12 ... 49
2.3 : Parasites invalidés ... 50
2.3.1 : Interférence ARN ... 50
a) Invalidation des différentes TORs ... 50
b) Invalidation des différentes FKBPs ... 51
2.3.2 : Complémentation de l’invalidation TbFKBP12 ... 52
2.4 : Parasites sur-exprimant des formes FKBPs étiquetées avec un TAP ... 53
III : CARACTERISATION DE L’INVALIDATION DES TbTORs ... 54
IV : CARACTERISATION DE L’INVALIDATION DES TbFKBPs... 55
4.1 : Croissance des parasites invalidés ... 55
4.2 : Complémentation du RNAi TbFKBP12 ... 55
4.3 : Description du phénotype d’invalidation de TbFKBP12 ... 56
4.3.1 : Formes procycliques ... 56
a) Effet sur la motilité des parasites procycliques ... 56
b) Effet sur la cytocinèse des parasites procycliques ... 57
c) Analyse de la morphologie des cellules procycliques invalidées ... 58
4.3.2 : Formes sanguicoles ... 59
a) Effet sur la motilité des parasites sanguicoles ... 59
b) Effet sur la cytocinèse des parasites sanguicoles ... 60
V : LOCALISATION CELLULAIRE DE TbFKBP12 ... 62
5.1 : Localisation par immunofluorescence ... 62
5.1.1 : Utilisation d’anticorps anti-FKBP12 ... 62
5.1.2 : Tentative de production de parasites exprimant une FKBP12 étiquetée ... 62
5.1.3 : Utilisation d’un anticorps anti-TAP ... 62
5.2 : Détection par Western blot ... 63
VI : IDENTIFICATION D’EVENTUELLES INTERACTIONS PROTEIQUES ... 64
6.1: Tandem affinity purification (TAP-tag) ... 64
6.2: GST pull-down TbFKBP12-calcineurine ... 65
VII : TENTATIVE DE COMPLEMENTATION CHEZ LA LEVURE ... 66
VIII : ACTIVITE ENZYMATIQUE DE TbFKBP12 ... 67
8.1 : Complémentation du RNAi ... 67
8.2 : Activité peptidyl-prolyl cis-trans isomérase ... 67
8.3 : Agrégation de la citrate synthase ... 69
DISCUSSION ... 70
MATERIEL ET METHODES... 86
I : SOUCHES ET CONDITIONS DE CULTURE ... 86
1.1 : Parasites ... 86
1.2 : Bactéries ... 86
II : MANIPULATION DES TRYPANOSOMES ... 87
2.1 : Transfection de trypanosomes ... 87
2.1.1 : Transfection de trypanosomes sanguicoles monomorphes 328.114 ... 87
2.1.2 : Transfection de trypanosomes procycliques 29-13 et ProAnv ... 87
2.2 : Techniques d’invalidation de l’expression d’un gène et de surexpression ... 87
2.2.1 : RNAi ... 87
2.2.2 : Complémentation du RNAi TbFKBP12 par différentes formes surexprimées du gène ... 88
2.2.3 : Surexpression de formes avec une étiquette TAP ... 88
2.2.4 : Surexpression d’une forme de TbFKBP12 avec une étiquette HA ... 89
2.3 : Sensibilité des trypanosomes à la rapamycine et au FK506 ... 89
III : SOUTHERN BLOT ... 89
3.1 : Préparation d’ADN génomique de trypanosome ... 89
3.2 : Southern blot ... 89
IV : NORTHERN BLOT ... 90
4.1 : Préparation d’extraits d’ARN de trypanosome ... 90
4.2 : Préparation d’ARN messager de trypanosome ... 90
4.3 : Northern blot ... 90
V : IDENTIFICATION DES UTRs DE TbFKBP12 ... 90
VI : PCR QUANTITATIVE EN TEMPS REEL (qRT-PCR)... 91
6.1 : Transcription Reverse (RT) ... 91
6.2 : qRT-PCR ... 91
VII : PRODUCTION DE PROTEINES RECOMBINANTES TbFKBP12 ET GENERATION D’ANTICORPS. ... 91
7.1 : Constructions et conditions d’induction ... 91
7.1.1 : TbFKBP12-6his ... 91
7.1.2 : GST-TbFKBP12 ... 92
7.2 : Purification des protéines d’intérêt. ... 92
7.2.1 : Purification à partir des corps d’inclusion bactériens {Schendel, 1997} ... 92
7.2.2 : Purification à partir de fractions bactériennes solubles ... 93
7.3 : Production d’anticorps spécifiques dirigés contre TbKHC1 ... 93
7.3.1 : Production d’un anticorps en lapin ... 93
7.3.2 : Purification de l’anticorps produit en lapin ... 94
7.3.3 : Production d’un anticorps en rat ... 94
VIII : WESTERN BLOT ... 94
8.1 : Préparation d’extraits protéiques de trypanosome ... 94
TABLE DES MATIERES
4
8.2 : Préparation d’extraits de cytosquelette/flagelle de trypanosome ... 94
8.3 : Western blot ... 95
IX : TECHNIQUES DE MICROSCOPIE... 95
9.1 : Immunofluorescence... 95
9.1.1 : Fixation des trypanosomes au formaldéhyde ... 95
9.1.2 : Fixation des trypanosomes au méthanol. (FAZ-PFR-BB) ... 95
9.1.3 : Fixation de cytosquelettes de trypanosome. ... 95
9.1.3 : Immunofluorescence ... 96
9.2 : Microscopie électronique à transmission TEM ... 96
9.3 : Microscopie électronique à balayage SEM ... 96
X : ETUDES DES INTERACTIONS PROTEIQUES ... 96
10.1 : Tandem Affinity Purification. {Rigaut, 1999} ... 96
10.1.1 : Préparation de lysats de trypanosomes ... 96
10.1.2 : Purification TAP ... 97
10.1.3 : Identifications des protéines ... 97
10.2 : GST pull-down. {Xu, 1998} ... 97
XI : ACTIVITE ENZYMATIQUE ... 98
11.1 : Essai activité peptidyl prolyl cis-trans isomérase ... 98
11.2 : Agrégation de la citrate synthase ... 98
BIBLIOGRAPHIE ... 103
Figure I.1: Nombre de cas reportés annuellement entre 2000 et 2007 à l’OMS.
Rouge:>1000; Orange: entre 1000 et 50; Bleu: <50; Vert: aucun.
(http://www.who.int/trypanosomiasis_african/disease/en/index.html)
INTRODUCTION
I : GÉNÉRALITÉS
1.1 : T.brucei et les Kinétoplastides
Les Kinétoplastides forment un groupe ancestral de protozoaires possédant une seule mitochondrie.
Celle-ci est caractérisée par la présence d’un kinétoplaste, structure interne contenant son ADN. Cet ADN mitochondrial très concentré et circulaire est visible en microscopie à la base du flagelle.
L’ordre des Kinétoplastides {Haag, 1998;Levine, 1980} comprend la famille des Trypanosomatidés uni-flagellés. Elle se compose majoritairement de parasites tels que les leishmanies (Leischmania sp) et les trypanosomes. Les trypanosomes sont eux-mêmes subdivisés: les Stercoraria (ex :Trypanosoma cruzi) ou trypanosomes américains, transmis via les fèces d’un insecte et les Salivaria ou trypanosomes africains transmis via la salive de l’insecte (ex : Trypanosoma brucei). Trois types de Kinétoplastides sont pathogènes pour l’homme. Il s’agit de Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi et Leischmania sp.
T.brucei est le parasite étudié dans notre laboratoire. Il en existe 3 sous-espèces semblables morphologiquement et biochimiquement mais colonisant des hôtes et des aires géographiques différents : T.b.brucei, T.b.rhodesiense et T.b.gambiense.
1.2 : La trypanosomiase
T.b.gambiense et T. b. rhodesiense sont responsables de la maladie du sommeil ou trypanosomiase humaine africaine (HAT), qui touche 36 pays d’Afrique sub-saharienne (Fig.1) (WHO : World Health Organization : http://www.who.int/topics/trypanosomiasis_african/en/ ; {Barrett, 2003}.
Le parasite est transmis par l’intermédiaire d’un diptère du genre glossina ou mouche Tsé-tsé. Il se multiplie dans le sang et les ganglions lymphatiques et, au second stade de la maladie, envahit le système nerveux central. Il y provoque alors une panoplie de désordres neurologiques graves, notamment des troubles du cycle circadien, d’où le nom de maladie du sommeil. Sans traitement, l’issue en est fatale {Greenwood, 1980}. Selon l’OMS, 300 000 personnes pourraient être actuellement infectées et 55 millions d’individus habiteraient une zone à risque. Ceci constitue une évaluation puisque la surveillance médicale ne toucherait que 5% de la population concernée.
Les traitements disponibles actuellement (suramine et pentamidine au stade sanguin, melarsoprol et eflornithine au stade avancé) sont dépassés, certains se révélant même toxiques pour les patients {Barrett, 2007;Kennedy, 2008}.
Figure I. 2 :Cycle de vie deT.brucei (McKean 2003).
La forme long slender est la forme proliférative des trypanosomes dans le sang de mammifère. Leur mitochondrie est réprimée. Ils se différencient en forme short stumpy, forme quiescente sanguicole dont la mitochondrie est activée partiellement. Ces 2 formes sont recouvertesd’une glycoprotéine hautement antigénique: le VSG.
Après piqûre par une mouche Tsé-tsé, le parasite passe dans le système digestif de l’insecte où il se transforme en forme procyclique, une forme proliférative de la mouche. Sa mitochondrie est active et il est recouvert d’une autre glycoprotéine: la procycline. Il migre vers les glandes salivaires en poursuivant sa différenciation en d’autres formes (non représentées) pour aboutir aux formes épimastigotes d’abord puis métacycliques. Ces derniers sont non prolifératifs et couvertsd’un manteau composé de VSG, pour être prêts pour la transmission à un nouvel hôte mammifère.
L’homme n’est pas la seule cible des Trypanosomes africains : T.brucei, T.vivax et T.congolense entre autres donnent la Nagana au bétail. Ce fléau empêche l’élevage sur 17% de l’Afrique, provoquant un énorme manque à gagner dans des régions où la situation économique est déjà extrêmement difficile (FAO : Food and Agriculture Organization : http://www.fao.org/index_fr.htm).
1.3 : Cycle de vie
T.brucei est un parasite extracellulaire dont le cycle de vie se déroule dans deux hôtes très différents.
Il doit donc être capable de s’adapter de manière rapide et fréquente, en subissant des modifications structurales et métaboliques. Plusieurs formes se succèdent au cours du cycle parasitaire : chez les mammifères, le parasite vit dans du sang à 37°C et doit se protéger des facteurs lytiques et du système immunitaire. Il est également capable de reconnaître et d’utiliser des signaux de son hôte tels que des facteurs de croissance et des cytokines. Lors d’une piqûre par la mouche Tsé-tsé, le parasite change radicalement d’environnement : il subit un choc thermique en passant à une température non constante estimée aux alentours de 27°C et doit interagir avec des cellules et un milieu totalement différents dans le tube digestif de l’insecte.
De plus, le cycle de vie de T.brucei est caractérisé par une alternance de stades prolifératifs adaptés à l’infection et de stades non prolifératifs couplés à l’acquisition de la compétence à la différenciation, permettant l’adaptation à de nouvelles conditions de croissance {Matthews, 2004}. On pense que l’alternance de ces phases de multiplication et de quiescence permet aussi la régulation de la densité de la population avant qu’elle n’atteigne un stade critique pour l’hôte. En effet, une mort précoce de celui-ci n’est pas avantageuse pour la parasite : il doit avoir le temps d’être transmis de la mouche au mammifère, et inversement.
Son cycle se déroule comme suit : {Vickerman, 1985;McKean, 2003} (Fig.2)
La forme proliférative des parasites sanguicoles est appelée long slender (longs minces). Ses fonctions mitochondriales sont réprimées et elle métabolise le glucose grâce à des organites particuliers, les glycosomes dans lesquels se produit la glycolyse d’où cette forme tire son énergie. Les trypanosomes sont alors recouverts d’un manteau uniforme composé d’une glycoprotéine majeure très antigénique : le VSG ou Variant Surface Glycoprotein. Cet antigène est régulièrement remplacé ce qui permet au parasite d’échapper aux réactions immunitaires de son hôte.
Lors de l’infection, les formes slender se différencient progressivement en formes short stumpy (courts trapus) quiescentes, engagées sur la voie de différenciation en procyclique.
Une fois dans l’insecte {Vickerman, 1988}, les parasites traversent la membrane péritrophique, qui sépare l’épithélium de l’intestin du lumen où ils se transforment rapidement en forme procyclique qui se divise activement, possède une mitochondrie opérationnelle (produisant de l’ATP par le cycle de Krebs) et est recouverte d’une glycoprotéine invariante: la procycline. Après 2-3 jours, leur morphologie change, ils
Figure I.3: Changement de position du kinétoplaste pendant le cycle de vie (McKean 2003).
A: position relative du kinétoplaste chez les formes trypomastigotes sanguicoles et procycliques ainsi que chez la forme épimastigote en fonction de la position du noyau et del’extrémité postérieure de la cellule. B: Images en contraste de phase de la différentiation de sanguicoles stumpy en procycliques. L’ADN nucléaire (N) et du kinétoplaste (K) est marqué au DAPI. Le kinétoplaste est progressivement repositionné (de la cellule du haut vers la cellule du bas).
s’allongent (jusqu’à 2 fois plus longs, avec augmentation de la taille du flagelle {Van Den Abbeele, 1999}) et arrêtent de se répliquer. Ils retraversent la membrane péritrophique et migrent via l’œsophage vers les glandes salivaires. Jusqu’ici, dans le sang et le tube digestif de l’insecte, le parasite se trouve sous la forme trypomastigote, c'est-à-dire que le flagelle émerge postérieurement par rapport au noyau (Fig.3).
Arrivés dans les glandes salivaires, une nouvelle étape de division s’enclenche, accompagnée d’une différenciation en forme épimastigote : le flagelle émerge du côté antérieur par rapport au noyau. Ces parasites sont attachés aux microvillosités de la paroi des glandes salivaires par leur flagelle {Tetley, 1985}.
La division se fait alors que les trypanosomes sont attachés à la paroi.
Petit à petit, la taille du flagelle régresse, les parasites se couvrent de VSG et adoptent une forme quiescente trypomastigote. Voilà les métacycliques, prêts à être transmis à l’hôte mammifère. Une fois dans le sang, ceux-ci deviendront des long slender.
1.4 : Intérêt de l’étude de T.brucei
T.brucei étant responsable de la maladie du sommeil et de la Nagana, son étude offre évidemment un intérêt médical, agronomique et économique de premier ordre.
Il présente également de nombreux avantages pour la recherche fondamentale : Premièrement, son cycle de vie relativement simple est extracellulaire et les stades slender et procyclique peuvent être cultivés in vitro, clonés et conservés dans de l’azote liquide. Son second avantage est d’ordre technique : les parasites peuvent être transfectés par électroporation pour produire des « knock-out » {Clayton, 1999;Clayton, 1999}
ou des « knock-down » {Wirtz, 1995} {Bellofatto, 2008}. De plus, son génome a été entièrement séquencé {El-Sayed, 2000} {Hall, 2003} {Berriman, 2005} (http://www.genedb.org/).
Mais ce sont surtout ses particularités biologiques qui le rendent si intéressant. Elles ont été développées pour permettre au parasite de s’adapter et de survivre au sein de différents environnements : le sang de mammifère, le tube digestif et les glandes salivaires de l’insecte. En conséquence les stades procycliques et sanguicoles présentent des particularités structurelles et métaboliques adaptées à la vie parasitaire et aux différents milieux rencontrés lors du cycle de vie.
1.4.1 : La transcription polycistronique
Les gènes du trypanosome codant pour des protéines sont organisés en unités polycistroniques {Vanhamme, 1995}. Les seuls promoteurs de ces gènes identifiés à l’heure actuelle chez T.brucei sont ceux du VSG et de la procycline. Ils sont transcrits par une ARN polymérase I {Rudenko, 1990;Clayton, 1990}
{Zomerdijk, 1990} {Pays, 1990}. Tous les autres gènes codant des protéines sont transcrits par une ARN polymérase II. La transcription primaire par cette polymérase II est constitutive {Palenchar, 2006}.
Cependant des gènes d’une même unité transcriptionnelle peuvent être exprimés à des stades différents du développement, il y a donc un mécanisme de contrôle post-transcriptionnel {Clayton, 2002}. Ce contrôle se
Figure I.4: Vagues de parasitémie à comptages réels (A) et stylisées (B).
Lors d’une infection de l’hôte mammifère suite à une injection de parasites, les trypanosomes (slender) se multiplient dans le sang de manière clonale. Un pic de parasitémie est observé après 7 à 10 jours, la population atteint sa densité maximale. Elle commence alors à diminuer suite aux attaques par les anticorps anti-VSG du système immunitaire et est remplacée progressivement par un nouveau clone muté possédant un autre VSG. Celui-ci se multipliera à son tour pour atteindre sa densité maximale 7 à 10 jours plus tard.
Cette fluctuation de la densité de population du parasite provoque un profil de « vagues de parasitémie ». Elle est associée à la différentiation de celui-ci en forme stumpy et au changement des antigènes de surface VSG. Cela permettra à son hôte de survivre suffisamment longtemps bien que son système immunitaire ne soit pas arrivé à éliminer totalement les trypanosomes. Ils auront ainsi le temps d’être transmis .
Anti-VSG2
Parasite number
Time
2
Anti-VSG1 Anti-VSG3
1 3
A
B
fait au niveau de la stabilisation, de la maturation et de la traductibilité des ARNm. D’autre part, un contrôle post-traductionnel permet de réguler la stabilité des protéines synthétisées. L’initiation constitutive de la transcription dans la cellule permettrait à celle-ci de faire face rapidement à un changement de milieu drastique, lors du passage d’un hôte à l’autre.
1.4.2 : Les antigènes de surface
La cellule est recouverte d’un manteau dense de glycoprotéines très antigéniques (107 sur toute sa surface) : le VSG chez les sanguicoles, la procycline chez les procycliques.
Le VSG est nécessaire à la survie des parasites : il masque les antigènes invariables que sont les protéines membranaires au système immunitaire de l’hôte auquel il échappe par une variation régulière {Pays, 2004}. Il n’y a pas de mécanisme de variation antigénique chez les procycliques. Leur manteau, constitué de procycline {Stebeck, 1994}, les protège des enzymes digestives de l’insecte.
Le VSG et la procycline représentent 10% des protéines totales du parasite, elles sont donc synthétisées en très grandes quantités, ce qui expliquerait l’emploi de l’ARN polymérase I (et donc d’un promoteur ribosomal) car celle-ci a une processivité beaucoup plus élevée que la polymérase II.
1.4.3 : La variation antigénique
Les protéines du manteau sont ancrées à la membrane du parasite par une ancre GPI (glycosyl- phosphatidylinositol) {Blum, 1993}. Régulièrement (10-2 à 10-5/cellule/génération), le trypanosome sanguicole remplace son manteau. Son nouveau manteau est composé d’un autre VSG. Il lui permet d’échapper au système immunitaire. Ce phénomène est appelé variation antigénique. A l’échelle d’une population, lorsque les parasites couverts d’un type de VSG sont éliminés, quelques parasites exprimant un autre VSG vont se multiplier par expansion clonale, provoquant des vagues caractéristiques de parasitémie (Fig.4). Cette chute régulière du nombre d’individus permet au trypanosome de réguler sa croissance. Il maintient son hôte en vie le temps d’assurer sa transmission au vecteur {Pays, 2004}.
Figure I.5: Morphologie générale d’un trypanosome (Overath and Engstler 2004).
Postérieur
Antérieur
Sens de la nage
Figure I.6: Mouvement d’un parasite sauvage (Hill 2003).
II : FORME ET FORMATION DU PARASITE
2.1 : Morphologie générale d’un trypanosome africain
L’architecture générale des parasites sanguicoles (15µM de long sur 2µm de large) et procycliques (20- 25µm de long et 3-5µm de large) (Fig.5) est similaire, allongée et sous-tendue par un corset sous pelliculaire de microtubules fortement polarisés. Ces deux formes de développement sont trypomastigotes : leur flagelle unique sort postérieurement par rapport au noyau et s’enroule de manière lévogyre autour de la cellule donnant à l’ensemble une structure hélicoïdale. Par conséquent, lorsque le parasite avance, il tourne sur lui- même et son mouvement ressemble à une vrille (Fig.6). C’est de cette caractéristique qu’il tient son nom : en grec, soma signifie corps et trypanon vrille {Hill, 2003;Gruby, 1843}. Les trypanosomes nagent avec le flagelle qui guide. Ceci définit l’orientation de la cellule avec l’extrémité distale du flagelle définissant le côté antérieur et le corps cellulaire se trouvant du côté postérieur {Matthews, 2004}.
La structure la plus postérieure est la poche flagellaire, invagination de la membrane plasmique d’où sort le flagelle et lieu unique d’endo- et exocytose {Overath, 2004}. Le flagelle est constitué d’un axonème conventionnel associé à une structure semi rigide le « paraflagellar rod » PFR, et est attaché à la membrane du corps cellulaire via le FAZ, le « flagellum attachment zone » {Ralston, 2008} {Kohl, 2005} {Vaughan, 2003}
{Bastin, 2000}. Il est initié au niveau du corps basal, juste sous la poche flagellaire. Ce corps basal est lui- même lié au kinétoplaste par un complexe d’attachement {Ogbadoyi, 2003}. La réplication et la ségrégation du génome mitochondrial, du corps basal et du flagelle sont ainsi interdépendantes.
L’unique mitochondrie s’étend tout au long de la cellule. Sa structure est simple chez les sanguicoles puisque inactive. L’appareil de Golgi {He, 2004} est situé entre le noyau et le kinétoplaste, de même que les endosomes et le lysosome, composant la voie endocytaire {Overath, 2004}.
Il est primordial pour la cellule de coordonner et de réguler position, réplication et ségrégation de ces différents organelles tout au long du cycle cellulaire et de la cytocinèse. La formation/position de l’un influençant, nous le verrons, celle de l’autre.
2.2 : Forme : structure du trypanosome
Chez beaucoup de protozoaires, dont T.brucei, la forme de la cellule est définie par un cytosquelette. Il est responsable du maintien de l’architecture cellulaire ainsi que de la modulation de celle-ci au cours du développement. Il est un des nombreux reflets de l’adaptation du parasite à son mode de vie {Gull, 1999}
{Kohl, 1998}. Certains composants du cytosquelette sont conservés durant tout le cycle de développement:
1) les microtubules du corset sous-pelliculaire, 2) le TAC ou complexe d’attachement tripartite liant corps basal, flagelle et mitochondrie au cytosquelette, 3) le fuseau mitotique, et finalement 4) le flagelle auquel nous consacrerons un chapitre. Le seul endroit de la cellule qui ne soit pas sous tendu par le corset sous
Figure I.7: les microtubules (MT) sous-pelliculaires (Vaughan and Gull 2008).
A: Image d’un parasite procyclique en microscopie électronique à balayage. On y voit la polarité des MT du corset (en vert) et du flagelle (en rouge). B: Coupe transversale en microscopie électronique à transmission illustrant le flagelle attaché à la cellule et le corset de microtubules sous-pelliculaires.
pelliculaire est la poche flagellaire, nous en parlerons également. Enfin, certaines structures du cytosquelette n’apparaissent qu’à un moment au cours du cycle. C’est le cas des filaments responsables de l’attachement du parasite épimastigote à la paroi des glandes salivaires de la mouche {Tetley, 1985}.
2.2.1 : les microtubules du cortex sous-pelliculaire
Les microtubules (MT) sont les composants majoritaires du cytosquelette du parasite. On en trouve de différents types. Les microtubules du corset sous-pelliculaire, disposés sous la membrane plasmique, déterminent la forme et la rigidité de la cellule. Nous reparlerons plus tard des microtubules du flagelle. Ces microtubules (cytosquelette et flagelle) sont très stables, ils résistent à une extraction à l’aide de détergent non ionique. La structure du trypanosome peut ainsi être isolée et étudiée {Robinson, 1991}.
Une coupe transversale dans un trypanosome révèle, juste sous la membrane et le manteau de glycoprotéines qui la couvre, plus de 100 microtubules sous-pelliculaires, précisément ordonnés {Sherwin, 1989} (Fig.7). Ils sont espacés de manière régulière, arrangés en hélice le long de l’axe de la cellule et ont une longueur variable. Lorsqu’un MT s’arrête, les 2 tubules adjacents se connectent. La forme du parasite est ainsi modulée, aux extrémités plus fines de la cellule, et lors du passage d’un stade de vie à un autre.
Les microtubules sont des polymères de tubuline α et β générant un protofilament polarisé : une extrémité +/plus s’allonge rapidement et une extrémité -/moins s’allonge lentement. Chez T.brucei les microtubules du cortex ont tous la même polarité, leur côté plus dirigé vers la partie postérieure de la cellule {Robinson, 1995}. Seule exception : les 4 microtubules associés au FAZ, qui lie le corps cellulaire au flagelle, dont l’axonème est également de polarité opposée. La tubuline peut subir différentes modifications post-traductionnelles : acétylation des MT stables {Schneider, 1987} {Woods, 1989}, détyrosination lors du vieillissement des MT {Sherwin, 1987} et glutamylation {Schneider, 1997}. La tubuline γ sert de marqueur pour les centres organisateurs des microtubules, les MTOCs (Microtubules Organizing Center) {Scott, 1997}.
Les microtubules sont fortement interconnectés, entre eux mais aussi par rapport à la membrane plasmique {Robinson, 1991}. Ces connections sont l’œuvre de MAPs : microtubules associated protein. Peu de MAPs on été identifiées à ce jour chez le trypanosome {Affolter, 1994}, {Balaban, 1992}, {Vedrenne, 2002}.
La régulation physique de la longueur des microtubules se fait de 2 manières : par l’addition/soustraction de tubuline à l’extrémité du protofilament, ou par l’introduction de cassures internes au microtubule grâce à des « microtubules severing proteins ». Récemment, ces protéines impliquées dans le fractionnement des microtubules chez T.brucei ont été caractérisées {Casanova, 2009} : l’invalidation de la katanine bloque la cytocinèse. Celle-ci est localisée au niveau de l’axe de clivage durant la division cellulaire.
Lors de sa progression, la katanine remodèlerait la membrane et les MT du cytosquelette.
Au cours de la division cellulaire, le corset n’est jamais interrompu : de nouveaux microtubules viennent s’insérer entre les anciens. Chaque cellule-fille recevra donc un set entier de microtubules. La moitié de ceux-ci est nouvellement synthétisée, l’autre provient de la cellule-mère : on parle de division semi- conservative {Sherwin, 1989}.
Figure I.8:Le complexed’attachement tripartite TAC (Ogbadoyi, Robinson et al. 2003). A: Image en microscopie électronique au niveau de la poche flagellaire (FP). Le corps basal (BB) est connecté au kinétoplaste via: les filaments unilatéraux (petits crochets) qui lient le kinétoplaste à la membrane interne de la mitochondrie et, les filaments de la zone d’exclusion (grands crochets) qui lient la membrane externe de la mitochondrie au corps basal.
B: Représentation du TAC et de sa réplication pendant le cycle cellulaire .A gauche en G1, au milieu en S quand le kinétoplaste est en cours de ségrégation, que le pro corps basal est mature et que les deux nouveaux pro corps basaux sont formé. A droite quand les kinétoplastes et BB ont ségrégés.
2.2.2 : le complexe d’attachement tripartite (TAC)
En microscopie électronique à transmission, il est possible de visualiser une série de filaments denses aux électrons {Ogbadoyi, 2003} qui maintiennent une cohésion entre le flagelle, le corps basal et le kinétoplaste (Fig.8). Lors du cycle cellulaire, le TAC est conservé et dupliqué en même temps que les organelles qu’il relie. La ségrégation du kinétoplaste est dès lors intimement liée à la réplication du corps basal et donc du flagelle
2.2.3 : le fuseau mitotique
La structure principale du noyau en division du trypanosome est son fuseau mitotique, décrit pour la première fois en 1970 {Vickerman, 1970}. La mitose chez T.brucei se fait sans interruption de la membrane nucléaire. Le fuseau se forme donc à l’intérieur de celle-ci où il participe à la ségrégation de la chromatine qui n’est pas condensée. En microscopie électronique à transmission, on le voit s’étendre à partir des pôles du noyau et traverser le nucléole. Il est également localisé dans la zone de constriction entre les 2 noyaux en formation {Ogbadoyi, 2000}.
Chez la plupart des Eucaryotes supérieurs, comme chez T.brucei, les microtubules du fuseau sont initiés par un centre organisateur de microtubules MTOC, défini par la présence de tubuline γ. Malgré l’absence de structure équivalente au « spindle pole body » et au centrosome, le principe de l’organisation et de la formation des microtubules du fuseau serait conservé chez le trypanosome.
2.2.4 : la poche flagellaire et la voie endocytaire
L’extérieur du trypanosome est entièrement couvert de glycoprotéines. L’intérieur est sous-tendu par un corset de microtubules. Ces deux caractéristiques entravent les interactions avec le milieu et le trafic de vésicules. Toutefois, le parasite a besoin d’internaliser macromolécules et nutriments. Ce dilemme est résolu grâce une structure permettant le contrôle sur une surface limitée des échanges avec l’environnement : la poche flagellaire (FP). Elle représente 5% de la surface totale et n’est pas soutenue par le cortex de microtubules. La formation de vésicules de la voie endocytaire et de sécrétion se fait uniquement dans cette poche {Ogbadoyi, 2003;Overath, 2004} {Morgan, 2002;Morgan, 2002}.
La poche flagellaire est physiquement ancrée au cytosquelette. D’une part elle est traversée par l’axonème du flagelle. D’autre part, on trouve au niveau de son orifice le FPC « Flagellar Pocket Collar », une structure du cytosquelette attachée au flagelle {Sherwin, 1989} {Lacomble, 2009}. Sa ségrégation lors du cycle cellulaire est coordonnée spatialement et temporellement avec d’autres éléments du cytosquelette, probablement sous l’influence du flagelle {Robinson, 1991}. Récemment, BILBO1 a été identifiée comme étant la première protéine du cytosquelette de la poche flagellaire {Bonhivers, 2008}. Elle est localisée au niveau du col et établit un réseau de cytosquelette pour former la poche. L’invalidation par RNAi de cette protéine inhibe cette formation et suite à une série de malformations morphologiques impliquant le golgi, le flagelle et la cytocinèse, provoque la mort des parasites.
Figure I. 9:La voie endocytaire deT.brucei(Overath and Engstler 2004).
A: Vue agrandie des structures de la partie postérieure d’un trypanosome. B:
Diagramme représentant la voie d’endocytose via différents compartiments cellulaires.
Les flèches noires indiquent le trajet du VSG lors de son recyclage à la membrane. Les flèches rouges indiquent les voies d’endocytose menant au lysosome.
Ax : axonème; BB: corps basal; CCV-G : vésicules provenant du Golgi et couvertes de clathrine; CCV I: vésicules couvertes de clathrine de type 1; CCV II: vésicules couvertes de clathrine de type 2; EE : endosome précoce; ER : réticulum endoplasmique; EXC : transporteur d’exocytose; FAZ : zone d’attachement flagellaire; FL : flagelle; FP : poche flagellaire; G : appareil de Golgi; K : kinétoplaste; L : lysosome; LE : endosome tardif; Mt : mitochondrie;
N : noyau; PFR : paraflagellar rod; PMT: corset de microtubules sous- pelliculaires; RE : endosome de recyclage; SC : manteau de surface.
B
A
Le trafic de vésicules de/vers la poche flagellaire est contrôlé en fonction du stade de vie : il est de 10 à 100 fois plus rapide chez les sanguicoles. Chez ceux-ci, le trafic remplirait une fonction supplémentaire : la régénération du VSG. En effet, de part son ancrage GPI, la protéine est mobile au sein de la membrane. Elle est donc constamment poussée vers la FP par les forces hydrodynamiques résultant du déplacement du trypanosome {Engstler, 2007;Dean, 2007}. Le VSG est endocyté, recyclé et/ou remplacé : 1) pour éliminer les anticorps qui y sont attachés, 2) lors de la variation antigénique, 3) lors d’un changement de milieu et donc de forme de vie. Il faut en moyenne 12.5 minutes à la cellule pour remplacer l’entièreté de son manteau {Engstler, 2004}! Cette rapidité est autorisée vu la petite taille de la poche flagellaire et de la voie endocytaire. L’endo/exocytose est confinée à la partie postérieure de la cellule : les endosomes, l’appareil de golgi, le lysosome et autres vésicules de la voie endocytaire se trouvent entre la poche flagellaire et le noyau, à l’exception du réticulum endoplasmique.
L’architecture de la voie endocytaire des trypanosomes est unique tout en étant constituée de compartiments classiques et conservée au cours de l’évolution. (Fig.9) Ces différents compartiments sont caractérisés par différentes GTPases, les protéines Rab. Des anticorps dirigés contre ces protéines permettent donc de localiser spécifiquement chaque partie de la voie endocytaire {Morgan, 2002}.
L’endocytose est dépendante de la clathrine. Son invalidation provoque un agrandissement de la poche flagellaire qui se solde par la mort des parasites sanguicoles {Allen, 2003}. Ce phénotype appelé « BigEye » est dû à un arrêt de l’endocytose, sans arrêt concomitant de l’exocytose et de la fusion de membrane au niveau de la poche. Chez les procycliques aussi la protéine est essentielle mais son invalidation ne produit pas les mêmes effets. L’invalidation de l’actine produit également un phénotype de « BigEye » en sanguicole {Garcia-Salcedo, 2004}, prouvant son rôle dans le trafic cellulaire et l’endocytose. Elle serait nécessaire à la formation des vésicules couvertes de clathrine à partir de la poche flagellaire, mais pas à l’export de protéines nouvellement synthétisées : les voies d’endocytose et de sécrétion ne seraient ainsi pas liées {Garcia-Salcedo, 2004}. Chez les procycliques, l’actine n’est pas essentielle.
2.2.5 : Le flagelle
Le trypanosome est un modèle de premier ordre pour l’étude du flagelle puisque sa structure de base est conservée. Mais il comporte aussi des structures uniques aux Kinétoplastides (et à quelques espèces proches) : le paraflagellar rod et la flagellar attachment zone. Celles-ci peuvent donc constituer des cibles privilégiées pour la formulation de médicaments antiparasitaires.
a) Analyses des composants flagellaires
La possibilité de purifier le flagelle {Robinson, 1991} ainsi que la technique d’interférence ARN ont permis de définir le protéome flagellaire et de le comparer avec d’autres espèces. Le CMF « Component of Motile Flagella » {Baron, 2007}, le TbFP « T.brucei Flagellum Proteome » {Broadhead, 2006}, les PFCs
Figure I.10: Représentation schématique du flagelle de T.brucei (Ralston and Hill 2008) et des protéines structurelles qui le compose.
Les structures principales sont indiqués et les doublets externes de microtubules sont annotés selon la nomenclature conventionnelle.
En bleu: les 4 microtubules spécialisés du FAZ. DRC: dynein regulatory complex; IFT: transport intra-flagellaire; FAZ: zone d’attachement du flagelle;
PFR: praflagellar ro; MT: microtubules.
RSP3 LC1-2, DNAI1
TbPF16-20 PACGR
PFR1-2
FLA1, FAZ1 TPN
« PFR proteome component » {Portman, 2009} et finalement une analyse protéomique approfondie {Hart, 2009} en forment les données principales. De celles-ci, il ressort que T.brucei possède plus de protéines flagellaires (plus de 700) que d’autres espèces. Cette abondance pourrait refléter l’aspect unique du mouvement du flagelle du trypanosome ou de son organisation asymétrique, bordée par le PFR qui nécessiterait une régulation particulière.
b) Structure du flagelle (Fig.10) (revu dans {Bastin, 2000;Kohl, 2005;Ralston, 2008;Vaughan, 2003;Ralston, 2009}
Le corps basal
Le corps basal est l’équivalent du centriole mammalien. Sa structure à partir de laquelle l’axonème du flagelle est nucléé, contient 9 triplets de microtubules {Sherwin, 1989}. Le corps basal sert ainsi de MTOCs pour les microtubules de l’axonème, mais également pour des MT subpelliculaires. En effet, les 4 MT du FAZ trouvent leur origine à son niveau. De plus, cette structure contrôle la ségrégation des kinétoplastes grâce à leur interaction physique via le TAC {Ogbadoyi, 2003}.
Les protéines suivantes : tubuline gamma {McKean, 2003}, centrin1 {Selvapandiyan, 2007}, TBBC (Tb basal body component) {Dilbeck, 1999}, TbLRTP (Leucine Rich repeat protein) {Morgan, 2005} et TbNRKC (NIMA-related kinase) {Pradel, 2006} ont toutes été localisées au niveau du corps basal. Lors de l’invalidation de ces deux dernières, des corps basaux surnuméraires sont créés. Elles jouent donc un rôle dans leur duplication. La protéine TbRP2, qui contient un domaine TBCC (tubulin cofactor C) {Stephan, 2007}, interagit avec la tubuline destinée à être incorporée dans les MT axonémaux. D’ailleurs, son invalidation induit la production de cellules à flagelle plus court. Elle co-localise avec le corps basal mature, qui pourrait servir de contrôle qualité aux protéines entrant dans le flagelle.
L’axonème
Classiquement, l’axonème de T.brucei est composé d’une paire centrale de microtubules internes entourée de 9 doublets de microtubules externes (outer MT). Ils sont reliés à la paire centrale via les ponts radiaires ou « radial spokes » et entre eux par des liens de nexine. Les microtubules externes sont flanqués de bras de dynéine externes et internes. Ces bras constituent le moteur du flagelle : suite à l’hydrolyse d’ATP, ils sont transloqués vers le doublet de MT adjacent. Ils permettent de cette manière le glissement d’un microtubule par rapport à l’autre et le mouvement.
La majorité des protéines axonémales sont nécessaires à la mobilité du flagelle. Ainsi, l’interférence ARN de composantes du bras externe de dynéine, LC1-2 ou DNAI1, respectivement chaînes légère et intermédiaire de dynéine {Baron, 2007}, {Branche, 2006} provoque une disparition du bras suivie d’une paralysie du flagelle. Ces dynéines flagellaires seraient régulées par un DRC, « Dynein Regulatory Complex ». La protéine RSP3 est nécessaire à l’assemblage et à la maintenance des ponts radiaires tandis que TbPF16-20 contribuent à l’orientation de la paire centrale. La stabilité du microtubule supérieur (outer MT)
serait assurée par des PACGR « parkin co-regulated proteins » ainsi que par des protéines répertoriées comme des composantes CMF. L’invalidation de toutes ces protéines perturbe également la mobilité flagellaire {Baron, 2007;Baron, 2007;Branche, 2006;Ralston, 2006}.
Le PFR - ParaFlagellar Rod
Structure para-cristalline composée de filaments, le paraflagellar rod est caractéristique des Kinétoplastides, Euglènoïdes et Dinoflagelés. Il est divisé en trois régions appelées domaines proximal, intermédiaire et distal. Des filaments connecteurs, « PFR connectors » le lient physiquement à l’axonème. Il est formé au sortir de la poche flagellaire et s’étend tout le long du flagelle. La position du PFR par rapport au corps cellulaire est clairement définie, il y est toujours accolé.
Le paraflagellar rod n’existant quasiment pas ailleurs, on peut se demander quelle est son utilité chez le trypanosome. Premièrement, sa constitution fibreuse renforcerait le flagelle et augmenterait l’efficacité du battement {Santrich, 1997;Branche, 2006}. Deuxièmement, il pourrait servir de point d’ancrage à des protéines impliquées dans le mouvement du flagelle, qu’elles soient régulatrices ou servant à l’assemblage structurel {Bastin, 1999;Bastin, 1999;Pullen, 2004}.
Le PFR a été dentifié dès 1962 {Vickerman, 1962}. Ses composants principaux sont PFR1/C et PFR2/A {Schlaeppi, 1989;Deflorin, 1994}. L’invalidation de PFR2 chez T.brucei provoque un défaut de motilité, et de cytocinèse, létal chez les formes sanguicoles {Branche, 2006;Broadhead, 2006}{Bastin, 1999}.
Plusieurs protéines identifiées lors des diverses analyses protéomiques du flagelle sont des enzymes métaboliques, localisées au niveau du PFR {Oberholzer, 2007} Elles peuvent être divisées en trois groupes.
Le premier contient des enzymes impliquées dans le métabolisme des nucléotides, donc énergétique telles que les adénylates kinases ; ADK-A et B {Pullen, 2004}. On y trouve aussi deux cAMP phosphodiestérases;
TbPDEB1- et 2 {Zoraghi, 2002;Oberholzer, 2007}. L’invalidation de ces ADK et PDEB ne donne pas de phénotype visible en procycliques, alors que l’invalidation des PDEBs en sanguicoles est létale. Un deuxième groupe comprend des enzymes glycolytiques, nécessaires à la production d’énergie dans le flagelle. Enfin, le dernier ensemble regroupe des protéines liant le calcium. Il semble en autre que le PFR soit riche en calmoduline {Ruben, 1987} {Ridgley, 2000}{Wu, 1994;Wu, 1992}. D’autres protéines liant le Ca2+ ont été identifiées lors des cribles, elles ne sont pas encore caractérisées : par exemple, 6 des PFCs possèdent un domaine associé au calcium {Portman, 2009}. La membrane du flagelle en contient également, nous reparlons plus bas des calflagines.
Le FAZ – Flagellum Attachment Zone
Le FAZ n’est pas à proprement parler une structure du flagelle {Kohl, 1999}. Il sert plutôt d’attache entre le corps cellulaire et le flagelle et est donc intimement lié à ce dernier. Le FAZ accroche le flagelle au corps cellulaire aussitôt qu’il sort de la poche flagellaire. Mais il s’arrête là où le flagelle devient libre, peu avant la fin de la cellule.
La face cytoplasmique du FAZ comporte un filament dense aux électrons de composition inconnue. Il est localisé dans un trou entre deux microtubules du corset, sous le flagelle {Sherwin, 1989}. En traversant les membranes, il se connecte au niveau du PFR et du PFR connector. En plus de cette structure cytosquelettique, d’autres liens membranaires interviennent probablement. Ainsi, la trypanine, composante du DRC semble localisée au niveau du FAZ {Hutchings, 2002;Ralston, 2006}. Sa répartition tout comme celle du FAZ, est ponctuée le long d’un des côté du PFR (Kohl, Sherwin et al.1999). A côté du filament, 4 microtubules spécialisés sont associés au réticulum endoplasmique {Sherwin, 1989}. La polarité de ces microtubules est inversée par rapport au reste du corset sous-pelliculaire, comme l’axonème du flagelle auquel le FAZ est associé {Robinson, 1995}.
Si l’ultra structure du FAZ est donc bien définie, il en est autrement pour ses composantes protéiques.
Les protéines FLA1 et FAZ1 sont localisées au niveau du FAZ et nécessaires à l’attachement du flagelle. Leur invalidation conduit à un mauvais assemblage du FAZ et donc à un décollement du flagelle puis à un défaut de cytocinèse {LaCount, 2002},{Vaughan, 2008}. La Polo-like kinase TbPLK se localiserait également au niveau de cette structure {Kumar, 2006}. Il n’est pas surprenant de voir qu’un défaut au niveau du FAZ bloque la cytocinèse, sachant qu’il est intimement lié au flagelle, nécessaire à la division cellulaire.
Le FC – Flagella Connector
Uniquement observé chez les formes procycliques de T.brucei, le flagella connector représente un nouveau type de jonction cellulaire mobile et dynamique. Localisé à l’extrémité distale du nouveau flagelle, il la lie au côté de l’ancien flagelle {Moreira-Leite, 2001}. A l’heure actuelle seule l’architecture du FC est connue. L’ensemble à une allure triangulaire avec 3 couches de densité électronique différentes et des extensions filamenteuses s’étendant jusqu’au bout du nouveau flagelle {Briggs, 2004}. Le FC est présent exclusivement lorsque le nouveau flagelle est assemblé, dès qu’il sort de la poche flagellaire. Il progresse vers l’extrémité postérieure de la cellule lors de l’élongation du nouveau flagelle. Ce système d’ancrage permettrait l’orientation de l’élongation flagellaire. Elle se ferait ainsi toujours de manière hélicoïdale, à gauche de l’ancien flagelle et guiderait l’assemblage du nouveau FAZ. Ce mécanisme cytotactique préserverait le schéma de la cellule de génération en génération {Briggs, 2004;Moreira-Leite, 2001}.
La membrane et la matrice flagellaire
Comme le reste du trypanosome, le flagelle est recouvert de VSG ou procycline. A ce jour, les seules protéines décrites, spécifiques de la membrane flagellaire sont l’adénylate cyclase ESAG4 {Paindavoine, 1992} et les calflagines {Wu, 1992}. Ces dernières sont localisées au niveau de la membrane, en association avec les « lipid rafts ». Leur localisation dépend de la palmitoylation de leur extrémité N-terminale {Emmer, 2009}. Les calflagines sont capables de lier le calcium, ce sont des « EF-hand calcium binding proteins », homologues de la FCaBP « Flagellar Calcium Binding Protein » de T.cruzi {Engman, 1989}. Enfin, après plusieurs années d’études controversées, la phospholipase C, GPI-PLC, capable de cliver le VSG de la surface
des parasites sanguicoles a été localisée au niveau de la membrane flagellaire, le long du FAZ {Hanrahan, 2009}.
Plusieurs composants du complexe de transport intra-flagellaire IFT (voir plus bas) se retrouvent dans la matrice du flagelle. Il en existe deux stocks : d’une part une réserve soluble et flagellaire et d’autre part une partie insoluble, localisée à la base du corps basal {Absalon, 2008}.
c) Formation du flagelle
La formation du flagelle est totalement liée au cycle cellulaire. Il est nucléé à partir d’un nouveau corps basal. Ce dernier contient 9 triplets de microtubules sans paire centrale {Kohl, 1999;Sherwin, 1989;Woodward, 1990}. L’initiation de cette paire est dépendant de la tubuline γ, marqueur des MTOCs {Sherwin, 1989}. Elle a lieu au-dessus d’une zone de transition (9 doublets), entre le corps basal et le flagelle.
Dans la cellule en G0-G1, le corps basal mature d’où part le flagelle est flanqué d’un pro-corps basal immature, tous deux liés au kinétoplaste. Le premier évènement du cycle est cellulaire sera la maturation de ce pro corps basal suivie de sa duplication. Le nouveau corps basal mature pourra alors servir à la nucléation du nouveau flagelle. Le PFR et le FAZ seront créés et vont s’allonger avec le flagelle dès qu’il sort de la poche flagellaire. Il va alors étroitement suivre le parcours de l’ancien flagelle, auquel il est lié par le flagella connector. Sa progression est arrêtée environ à mi-longueur du vieux flagelle. C’est à cet endroit que la cytocinèse débutera et divisera la cellule. Lors de la construction d’un nouveau flagelle, l’ancien reste en place. Il servira de patron à la formation du nouveau flagelle, permettant la conservation de l’organisation cellulaire {Moreira-Leite, 2001}.
La biogenèse du flagelle du trypanosome est conservée et implique des protéines du transport intraflagellaire IFT {Bastin, 1999;Bastin, 1999;Absalon, 2008;Davidge, 2006;Davidge, 2006}. Les protéines flagellaires sont produites dans le cytoplasme et localisées aux environs du corps basal. Elles sont véhiculées à l’extrémité du flagelle par un transport antérograde grâce au cheminement de la kinésine II le long des microtubules. Un transport rétrograde opérerait dans le sens inverse via des dynéines {Blacque, 2008;Rosenbaum, 2002}.
Plusieurs gènes d’IFT ont été identifiés chez le trypanosome. Ils font partie du complexe antéro/rétrograde ou codent pour des protéines motrices telle que TbDHC1 (Dynein Heavy Chain1) {Kohl, 2003;Davidge, 2006}. Le complexe de transport est nécessaire à la construction du flagelle. L’invalidation des protéines le constituant présente toujours le même phénotype : la taille du nouveau flagelle est réduite de génération en génération tandis que celle de l’ancien n’est pas affectée. C’est la totalité de la longueur du flagelle en formation qui est touchée : axonème, PFR et FAZ. Ce raccourcissement s’accompagne d’une diminution de la taille du parasite. Le FAZ étant plus court, l’axe de clivage ne se forme pas au bon endroit.
Finalement, les parasites qui ne produisent plus du tout de flagelle ne se divisent plus {Kohl, 2003;Absalon,
Figure I.11:Régulation du cycle cellulaire deT.brucei(Hammarton 2007).
Les différentes étapes de réplications des organelles majeures ainsi que de la structure du parasite sont schématisées. Les régulateurs de la phase G1 sont en noir. Les protéines impliquées dans : la réplication des corps basaux sont en rose, la réplication du golgi en vert, la mitose en rouge et la cytocinèse en gris.
2008}. Ceci suggère donc un rôle direct ou indirect pour l’IFT dans le contrôle de la croissance flagellaire ainsi que dans la morphogénèse et la division cellulaire via son action sur le flagelle.
Il faut noter que chez le parasite, deux structures différentes doivent être assemblées, le PFR et l’axonème {Bastin, 1999}. De plus, le flagelle est associé sur toute sa longueur aux filament et microtubules du FAZ, suggérant que leur assemblage est dépendant de la présence du flagelle {Kohl, 2003}.
2.3 : Formation : le cycle cellulaire
Deux caractéristiques importantes sous tendent le déroulement du cycle cellulaire de T.brucei.
Premièrement, les organelles telles que la mitochondrie, le Golgi, le flagelle, le corps basal et le kinétoplaste sont présentes en exemplaire unique dans la cellule. Elles sont connectées via les structures du cytosquelette mentionnées auparavant. Il est donc clair que les réplications et ségrégations de tous ces composants seront étroitement liées.
Deuxièmement, le parasite dispose de pools génétiques différents, le noyau et le kinétoplaste. Celui-ci présente comme le noyau une phase S de synthèse d’ADN : il y a dès lors coordination entre le cycle du noyau et celui du kinétoplaste {Woodward, 1990}.
2.3.1 : Evènements de la division cellulaire
Le cycle cellulaire typique d’un Eucaryote est composé de 4 phases : G0/G1, S, G2, M. Pendant la première phase (Gap phase 0-1), la cellule se prépare à la duplication de son génome, régulée en fonction des nutriments nécessaires et de sa taille. L’ADN est répliqué pendant la phase S et est divisé lors de la mitose, M, juste après la phase G2 – Gap2. Chez T.brucei, hormis la présence de 2 génomes, la division se déroule à peu près comme tel.
Les étapes précises du cycle cellulaire du trypanosome peuvent être suivies en marquant les ADN kinétoplastiques et nucléaires avec un colorant des acides nucléiques tel que le DAPI. Le déroulement du cycle de la forme procyclique est le suivant : (Fig.11) (revu dans {McKean, 2003} {Vaughan, 2008}
{Hammarton, 2007} {Hammarton, 2007}).
La première étape morphologique, durant la phase, G1 est l’élongation et la maturation du pro-corps basal et la nucléation d’un nouveau flagelle à partir de celui-ci, suivie de la duplication de l’appareil de Golgi.
La réplication de l’ADN du kinétoplaste Sk commence juste avant celle du noyau Sn. Elle se termine également plus tôt car elle est plus courte. La ségrégation des kinétoplastes D est donc terminée avant même le début de la mitose nucléaire M, donnant lieu à des parasites 2K1N. Au début de la phase G2 nucléaire, les corps basaux se séparent. Comme ils sont liés via le TAC aux kinétoplastes, ils vont entraîner ceux-ci dans la ségrégation {Ogbadoyi, 2003}. Si ce TAC est mal formé, le réseau d’ADNk est réparti asymétriquement entre les cellules filles {Wang, 2002}. La mitose se fait intra-nucléairement et sans condensation de la chromatine
grâce au fuseau mitotique. Chez les procycliques, le nouveau noyau est positionné entre les 2 kinétoplastes, tandis que chez les sanguicoles les noyaux restent côte à côte.
La division du matériel génétique et des composants de la cellule s’accompagne bien entendu d’une augmentation de la longueur et du diamètre du trypanosome. L’élongation est possible par extension des microtubules du corset de leur côté positif c'est-à-dire au niveau postérieur de la cellule. L’élargissement quant à lui, se fait nous l’avons vu, par insertion de nouveaux microtubules entre les anciens, donnant lieu à une division semi-conservative.
2.3.2 : Régulation du cycle cellulaire
L’architecture de la division du trypanosome est, nous l’avons vu, assez complexe. Cette complexité se reflète également au niveau de la régulation moléculaire du cycle cellulaire. On retrouve dans le génome de T.brucei des homologues de protéines conservées telles que les cyclines, les « cyclin dependent kinases » (CDKs), les « mitogen activated protein kinases » (MAPKs), aurora et polo-like kinases. Le nombre élevé de protéines de régulation est probablement nécessaire à différents contrôles du cycle cellulaire, en fonction du stade développemental.
La phase G1 est régulée par l’action conjointe de cycline (CYC2) et de kinases « cdc2 related » (CRK1- 2). Chez les procycliques, leur invalidation cause une déformation du corset de MT ainsi qu’une accumulation de cellules en G1 {Hammarton, 2004}; {Tu, 2004} {Tu, 2005}. Le contrôle de la morphogenèse et la progression en G1 seraient liés chez les formes de l’insecte.
L’invalidation de l’aurora-like kinase TbAUK1 qui inhibe l’assemblage du fuseau mitotique, bloque la mitose et la cytocinèse aux stades sanguicole et procyclique {Li, 2006;Tu, 2006}. Différentes interactions protéiques de TbAUK1 ont récemment été mises en évidence {Li, 2008;Li, 2008}. Elle serait ainsi une composante du CPC « Chromosomal Passenger Complex », nécessaire à la cytocinèse, à la ségrégation des chromosomes et à l’assemblage du fuseau mitotique. Après la mitose, le complexe migre vers le côté dorsal de la cellule là où l’extrémité antérieure de la cellule-fille est attachée. Il bouge ensuite vers le côté postérieur durant la cytocinèse, en suivant probablement l’axe de clivage. Cette délocalisation est permise par les kinésines TbKIN-A et B, associées à AUK1. Enfin, la protéine TbTLK, interagissant avec le complexe, est elle aussi requise pour la formation du fuseau mitotique {Li, 2007}. L’ensemble de ces protéines régulerait les étapes précoces de la mitose.
(Revu dans {Hammarton, 2007;Hammarton, 2007}).
2.3.3 : Points de contrôle
La séparation des corps basaux / des kinétoplastes est nécessaire à la cytocinèse {Ploubidou, 1999}.
Ainsi, l’invalidation/ la surexpression de protéines telles que les centrines, LRTP, NRKC ou TbPLK
