UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES FACULTE DES SCIENCES
LABORATOIRE DE PARASITOLOGIE MOLECULAIRE
Mécanismes de contrôle de l’expression des gènes de VSG chez Trypanosoma brucei.
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade académique
de Docteur en Sciences
David Walgraffe
Décembre 2004
Promoteur : Prof. E. Pays Co-promoteur : L. Vanhamme
Remerciements
Il est certain que ce travail n’aurait pu aboutir sans l’aide d’un grand nombre de personnes. Parmi celles-ci, il y bien sûr les membres voire anciens membres de ce laboratoire où il fait bon travailler mais surtout où il fait bon vivre :
Amélia (Amelita)
Nous avons entamé et nous allons terminer notre thèse ensemble. Je tiens à saluer ta gentillesse et ta disponibilité.
Anaïs (Anayis)
Récemment arrivée au labo, tu lui as donné un coup de fraîcheur supplémentaire. Merci pour ta sympathique compagnie, en espérant que ça ne parte pas en « couille »...
Annette (Madame Annette, Anita)
Merci beaucoup pour ta disponibilité infinie et pour la manière dont tu te préoccupes des membres du labo. Attention ne stresse pas trop quand même. Pense aux conseils de notre bon vieux Luc Noël voire de Wally Chef coq !
Benoît
Merci pour les moments passés en ta compagnie, si plaisants et toujours très constructifs.
Boss (Chef, Sa Majesté voire Monsieur Pays)
Je vous exprime mes sincères remerciements pour avoir bien voulu m’accueillir dans votre labo. J’ai tellement appris lors de ces cinq années et pas seulement d’un point de vue strictement professionnel, je vous dois beaucoup.
Cécile (Cesse)
Travailler avec toi est un réel plaisir. Je tiens à te remercier pour l’énergie que tu dépenses afin de mettre sur pied des activités permettant de consolider les liens déjà très forts des membres du labo. Dès que le film « Flipper vs Lassie » sort en DVD, il faudra organiser une projection.
Daniel
Notre photographe maison dont l’expérience m’a été très utile.
David (DPM)
Ton point de vue critique sur mes travaux, ton expérience en microscopie en plus de ta sympathique compagnie m’ont apporté beaucoup, merci.
Denis
Merci pour tes conseils et pour les moments de détente (Squash) passés ensemble.
Derek
Je te remercie pour ta sympathie et pour avoir pu bénéficier de ton expérience concernant les manipulations biochimiques, plus particulièrement pour m’avoir secondé lors des purifications des anticorps dirigés contre les histones.
Didier
Une fois par an, tu nous reviens du Brésil avec tes connaissances qui sont très intéressantes pour un jeune doctorant.
Elizabeth
Méfiez vous de l’eau qui dort, une petite brise peut vite se transformer en tempête…, je rigole. Ta gentillesse et l’écoute dont tu fais preuve auprès des gens sont à saluer. Merci pour ta gaieté, ta joie de vivre et ton aide si importante au bon fonctionnement du labo.
Françoise
Je te remercie pour ton amabilité et ta disponibilité. Un regard critique très constructif sur mes travaux doit également être salué.
FRIA
Un copain à moi sans qui cette thèse aurait été un peu plus compliquée à gérer.
Géraldine
Un autre membre de la « relève » qui comme moi a été formé à Namur. Continue à être aussi positive, c’est bien pour toi et pour ton entourage.
Hubert
Je te suis très reconnaissant Hubert pour les moments passés ensemble (boulot et autres).
Ton aide m’a été très précieuse et m’a permis d’améliorer ma méthode de travail qui n’est toujours pas aussi rigoureuse que la tienne mais qui a quand même bien évolué depuis ta rencontre.
Madame Jambon.
Les puristes la reconnaîtront (c’est juste!), merci de nous avoir bien fait rire.
José
Avec toi José, je pouvais parler boulot mais aussi foot, merci pour toutes ces discussions.
Joyce
Encore une personne qui a apporté de la gentillesse et de la joie de vivre au labo. Etant donné que tu as défendu ta thèse quelques temps avant moi, je te remercie pour tous les conseils dont tu m’as fait part concernant la rédaction du manuscrit.
Jake
Merci pour ton aide en tant que sympathique « transmetteur » cyclique de nos bêbêtes.
Jean-François (Jean Jean pour les Namurois)
Un Namurois de plus. Merci pour ton appui technique en spectrométrie et pour la joie supplémentaire apportée au groupe.
Laurence
Voisine de bench, tu as été disponible à tout moment. Merci pour ton agréable compagnie et tes conseils judicieux (notamment au point de vue culturel). J’ai appris que tu n’allais pas à Groland poursuivre ta carrière, ça aurait pu valoir la peine. Je sais « Y a pon d’avance.. »
Luc
Tu m’as passionné pour ce sujet et tu m’as guidé tout au long de cette thèse. Grâce à toi, je suis prêt à continuer à travailler sur cette bestiole passionnante qu’est le trypanosome.
Je tiens à t’exprimer toute ma gratitude pour ces cinq années passées.
Nathalie
Ah une carolo comme moi, ça fait plaisir. Merci à toi Nathalie pour ta gentillesse, ton organisation et le gain de temps dont tu nous fais part.
Patricia (Pat, Patroushka, Patinette…)
Qui aurait pu imaginer que je tombe dans un labo doté d’un cancer 1
erdécan ? Personne ! Sans toi comment aurais-je fait rire de choses qui ne font rire que les membres cancers de ce décan ? Je ne sais pas. Rien que pour cela merci. Il faut également que je te remercie pour tes précieux conseils, pour ta gaieté, pour les séquences publicitaires journalières, pour l’accent carolo que tu perfectionnes de jour en jour, pour le cloug, pour les
doubitchous…
Pierrick
Arrivé récemment au labo, ton aide m’a également été précieuse. Je te remercie pour ta disponibilité, tes idées sans oublier ta sympathie.
Poupou (Poupette, Pupu, Pouproute, Poupix voire Philippe pour les intimes)
Ah Poupou j’ai tant de choses à dire te concernant. Que serait le labo sans toi, que serait Mouscron sans toi, que serait une maison sans toit (elle est bonne hein celle-là ?… Pfff, il n’y a jamais personne qui rigole de mes fintes…), que serait la planète sans toi, là
j’exagère un peu. Merci pour tous ces très bons moments passés ensemble (boulot ou détente). Au point de vue boulot, tu m’as appris à rester concentré et à être rigoureux. A côté de cela, on a bien déconné. Merci pour tes précieuses connaissances et pour ton humour que je peux être fier d’avoir légèrement amélioré. Et n’oublions pas le célèbre dicton : « toute façon… » (Oh la boulette !).
Puri
Même si tu étais souvent pressée, ta compagnie était toujours très agréable, merci.
Rachel
Encore une chouette fille. Merci pour ta sympathie.
Sara (Sarax, Sarita, Sar, Sa ou S)
C’est vraiment giga super génial de travailler en ta compagnie. On a bien ri en chambre de culture, un peu moins en chambre chaude (je m’arrête là car ça va jaser). Merci pour ces 1000000000 bons moments, pour les discussions scientifiques voire philosophiques (Tu préfères…) ainsi que pour tes chansons. Si notre projet se concrétise (la SARWAL entreprise), tout cela est encore loin de se terminer.
Stéphane
Encore un carolo. Je suis vraiment très content de t’avoir côtoyé.
Sylvain
Merci à toi pour ton aide en spectrométrie et veille bien sur Jean jean.
Wally (C’est moi) Merci pour tout ! Xong
Très discret mais tellement sympathique, merci.
Outre les membres du labo, je tiens à adresser mes remerciements à Marc Dieu qui a contribué aux identifications de protéines par spectrométrie de masse.
Je voudrais remercier Vincent Van Mullem pour avoir réalisé les expériences de complémentation en levure.
Merci à Michel Riva, Christophe Carles et Manu Favry pour m’avoir initier à la purification biochimique de la Pol I.
Je remercie le Professeur Keith Gull ainsi que Klaus Ersfeld pour les travaux de microscopie réalisés ensemble.
Merci à Miguel Navarro pour ses clones ainsi que pour ses conseils.
Je remercie également Pierre Thuriaux et Jovan Mirkovitch pour leurs précieuses informations.
Enfin merci à Muriel Moser, Marjorie Vermeersh et Valérie Acolty pour l’aide fournie concernant la production d’anticorps monoclonaux.
Je n’oublie pas les membres de mon comité d’accompagnement, Carine Van Lint et
Véronique Kruys qui m’ont encadré durant cette thèse et qui me font le plaisir de lire mon
manuscrit, tout comme les autres membres du jury. J’adresse un merci tout particulier à
Philippe Bastin qui vient de Paris pour évaluer mon travail.
Merci à tous mes amis extérieurs au labo tout simplement pour leur amitié si précieuse.
J’exprime mes plus sincères remerciements à mes parents ainsi qu’à ma sœur qui sans cesse me soutiennent afin que je réalise ce que j’aime.
Je tiens finalement à remercier sans retenue mon bébé sur qui j’ai pu compter depuis que
nous sommes ensemble c’est-à-dire depuis que j’ai commencé cette thèse, qui a dû subir mes
moments de stress tout comme mes moments d’exaltation, qui m’a donné un sacré coup de
pouce pour fignoler le manuscrit,… pour tout son amour.
Glossaire
Forme « slender » Stade particulier de la forme sanguicole où le trypanosome est étiré et en phase proliférative.
Forme « stumpy » Stade particulier de la forme sanguicole où le trypanosome est trapu et en phase quiescente.
Forme métacyclique Forme du trypanosome présente dans les glandes salivaires de son hôte insecte recouverte d’un manteau de protéines appelées VSG.
Forme procyclique Forme du trypanosome présente dans l’intestin de son hôte insecte et recouverte d’un manteau de protéines appelées procyclines.
Forme sanguicole Forme du trypanosome présente dans le sang de son hôte mammifère recouverte d’un manteau de protéines appelées VSG.
Gonorrhée Ecoulement urétral.
Kinétoplaste ADN mitochondrial organisé en réseau caractéristique de l’ordre des kinétoplastidés.
Kinétoplastidés Ordre constitué d’organismes dotés d’un kinétoplaste
Matrice nucléaire Ensemble de structures intranucléaires auxquelles s’attachent des séquences d’ADN.
Pandémie Propagation d’une maladie infectieuse à presque tous les habitants d’une région plus ou moins étendue, parfois à l’humanité toute entière.
RNAi Blocage de l’expression d’un gène par dégradation de son ARN messager ou par inhibition de l’étape de traduction.
Ce blocage fait suite à la transcription d’ARN double brin correspondant à ce gène.
SL RNA Séquence d’ARN ajoutée en 5’ de chacun des pré-ARNms chez les kinétoplastidés par épissage en trans.
Variation antigénique Changement de structure antigénique suite à des altérations de l’ADN ayant lieu au hasard (variation antigénique non programmée) ou bien suite à des mécanismes actifs et spécifiques se manifestant à des fréquences plus élevées que celles auxquelles apparaissent les altérations d’ADN ayant lieu au hasard (variation antigénique programmée).
Liste des abréviations utilisées
ADP Adénosine 5’-DiPhosphate BF Forme sanguicole bp Paire de bases
CPSF Cleavage Polyadenylation Specificity Factor
CStF Cleavage Stimulation Factor
CTD Carboxy Terminal Domain ES Site d’expression du VSG ESAG Expression Site Associated
Gene ESB ES Body
FISH Fluorescence In Situ Hybridisation
GST Glutathione S-Transferase HAT Histone Acetyl Transferase HDAC Histone DeACetylase IF ImmunoFluorescence IP ImmunoPrécipitation kb Kilobase
kDa Kilodalton
LIS Diiodosalicylate de lithium MAR Matrix Attachment Region NAD Nicotinamide Adenine
Dinucleotide
nt Nucléotide
ORF Open Reading Frame PF Forme procyclique Pol I ARN polymérase de type I
ou ribosomique
Pol II ARN polymérase de type II Pol III ARN polymérase de type
III
Pol ARN polymérase RNAi RNA interference SAR Scaffold Attachment
Region
SL RNA Spliced-leader RNA snRNA small nuclear RNA snRNP small nuclear
RiboNucleoProtein TAP Tandem Affinity
Purification
TbH4-Ac Histone H4 acétylée de T.
brucei
TBP TATA-box Binding Protein VSG Gène codant pour un VSG VSG Variant Surface
Glycoprotein
Table des matières
1
INTRODUCTION
1. Le trypanosome. ... 3
1.1. Généralités... 3
1.2. Cycle... 3
1.3. Intérêt du « modèle trypanosome »... 4
2. La variation antigénique. ... 5
2.1. Définition... 5
2.2. Variation antigénique chez le trypanosome... 8
2.2.1. Le VSG... 8
2.2.2. Le site d’expression du VSG... 9
3. Le contrôle de la variation antigénique chez le trypanosome. ... 12
3.1. Le promoteur... 12
3.2. Les éléments extincteurs et activateurs... 13
3.3. La chromatine... 14
3.4. L’extinction télomérique... 17
3.5. L’attachement à la matrice nucléaire... 18
3.6. Une nouvelle base... 20
3.7. Un compartiment nucléaire... 21
4. La transcription. ... 22
4.1. Les ARN polymérases... 22
4.2. Les étapes de la transcription... 24
4.3. La maturation de l’ARN... 26
4.4. La transcription et la maturation de l’ARN chez les trypanosomes... 28
4.5. La transcription des ESs... 30
5. Objectif. ... 32
RESULTATS ET DISCUSSION 6. Exploration du couplage entre l’(in)activité d’un site d’expression et la maturation (in)correcte de l’ARN. ... 33
6.1. Northern blot... 33
6.2. RT-PCR... 33
7. Analyse de la chromatine. ... 35
7.1. Anticorps dirigés contre l’histone H4... 35
7.2. Immunoprécipitations de chromatine... 36
7.3. Colocalisation sur fibre de chromatine étirée... 38
7.4. Attachement à la matrice nucléaire... 39
8. L’élongation de la transcription au niveau des ESs. ……….…...41
8.1. TFIIS... 42
8.1.1 Structure. ... 42
Table des matières
2
8.1.2. Clonage de TbTFIIS chez le trypanosome... 43
8.1.3. Invalidation de TbTFIIS1 et TbTFIIS2 par RNAi. ... 44
8.2. Caractérisation de la Pol I chez T. brucei... 48
8.2.1. Purification biochimique du complexe Pol I chez T. brucei. ... 48
8.2.2. Clonage de TbRPA12 chez le trypanosome... 49
8.2.3. Isolement du complexe de la Pol I chez T. brucei par “tagging” de TbRPA12.50 8.2.4. Production d’anticorps monoclonaux... 55
8.2.5. TbRPA1 est phosphorylée in vivo. ... 56
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES……….… 58
MATERIEL ET METHODES 9. L’analyse de la maturation des transcrits d’ESs par PCR... 64
10. L’étude de la chromatine... 64
10.1. Immunoprécipitations de chromatine (Collas et al., 1999)... 64
10.2. Purification des anticorps dirigés contre TbH4... 65
10.3. Etirement de la chromatine... 66
10.4. Electroélution de chromatine... 67
10.5. Isolement de complexes ADN/matrice nucléaire... 68
11. Les clonages. ... 69
11.1. TbTFIIS1... 69
11.2. TbTFIIS2... 69
11.3. TbRPA12... 69
11.4. Analyse des séquences et comparaison... 70
11.5. Anticorps dirigés contre TbTFIIS1 et TbRPA12... 70
