FKBP12; FK506 BINDING PROTEIN 12kD

3.1 : Généralités

3.1.1 : Découverte des Peptidyl-Prolyl Cis-Trans Isomérases ; PPIases

Les FK506 binding proteins ; FKBPs, appartiennent à la famille des PPIases : les Peptidyl-Prolyl Cis-Trans Isomérases. Elles catalysent et accélèrent l’isomérisation cis/ trans des liens peptidiques du côté amino-terminal des résidus proline et sont donc nécessaires au reploiement protéique. Il existe plusieurs classes de PPIases, elles présentent toutes la même activité enzymatique, mais leurs séquences primaires ne montrent pas de similarité. Plus de 3000 protéines sont ainsi regroupées parmi les cyclophilines {Wang, 2005} les FKBPs, les parvulines {Joseph, 2003} et le « trigger factor » bactérien {Stoller, 1995}.

La première PPIase, la cyclophiline Cyp18 a été découverte il y a 25 ans dans le laboratoire de Fischer {Fischer, 1984;Fischer, 1984}. C’est en utilisant une matrice d’affinité avec l’immunosuppresseur FK506 qu’une autre sorte de PPIase a été isolée, d’abord chez les mammifères {Harding, 1989;Siekierka, 1989} puis chez S.cerevisiae {Heitman, 1991}. La protéine a donc pris le nom de FKBP12 pour FK506 binding protein de 12kD. Elle est l’archétype de la famille des FKBPs. Le FK506 n’est pas le seul ligand des FKBPs. Elles sont également les récepteurs intracellulaires d’un macrolide structurellement corrélé au FK506 : la rapamycine {Bierer, 1990}. FK506 et Rpm sont produits par deux variétés de bactéries vivant dans le sol : Streptomyces tsukubaesis pour la première, découverte à Tsukuba au Japon {Kino, 1987} et Streptomyces hygroscopicus pour la deuxième, découverte sur l’île de Rapa-nui, d’où elle tient son nom {Sehgal, 1975} (Fig.12).

3.1.2 : PPIases et immunosuppression

Du fait de leur liaison à un immunosuppresseur, FKBPs et cyclophilines sont également appelées immunophilines {Sigal, 1992}. Cette liaison inhibe leur activité enzymatique. De plus, les complexes FK506-FKBP et rapamycine-FK506-FKBP lient respectivement la phosphatase calcineurine CaN {Liu, 1991} et la kinase TOR {Heitman, 1991}, provoquant l’immunosuppression dans les cellules de mammifères. Il est cependant à noter que l’immunosuppression n’est pas liée à la perte de l’activité enzymatique, il s’agirait de deux mécanismes différents engendrés par la liaison PPIase-ligand.

3.1.3 : Conservation des PPIases

Les PPIases sont largement conservées au cours de l’évolution, des procaryotes aux mammifères. Ainsi, le génome humain encode 16 gènes de FKBP, alors qu’ils ne sont que 4 chez S.cerevisiae {Galat, 2003} et 23 chez A.thaliana! La taille des FKBPs humaines, distribuées au sein de divers compartiments cellulaires et tissus, varie de 12 à 135kD {Fischer, 2003}. On retrouve aussi des PPIases dans des organismes parasitaires tels que l’unique FKBP de P.falciparum PfFKBP35 {Monaghan, 2005}.

Figure I.13: Isomérisation cis-trans d’un lien peptidyl-prolyl (Göthel, S.F. and Marahiel M.A., 1999).

Figure I.14: FKBPs humaines et protéines à domaine FKBD (Kay, J., 1996).

En revanche, peu de PPIases ont été décrites chez les Kinétoplastides {Bell, 2006}. Chez T.cruzi, une FKBP, TcMIP est impliquée dans l’infection des macrophages {Moro, 1995}. Une cyclophiline TcCYP19 a été identifiée {Bua, 2001} ainsi que la parvuline PIN1 {Erben, 2007}. Chez le trypanosome africain seul l’homologue de la cyclophiline A, TbCYP19 a été caractérisé {Pelle, 2002}. Il existe également des cyclophilines chez L.major ; LmCYP19 {Rascher, 1998} et L.donovanii ; LdCYP {Chakraborty, 2002;Dutta, 2001}.

3.1.4 : Activité enzymatique isomérase

La torsion de l’angle d’un lien peptidique fait qu’il peut avoir deux conformations : cis ou trans. La conformation trans est favorable d’un point de vue énergétique à l’inverse de la conformation cis pour laquelle il y a encombrement stérique {Galat, 1995}. La structure native des protéines contient donc peu de liens sous forme cis. La seule exception concerne la proline qui a une probabilité bien plus grande de former un lien cis avec l’acide aminé précédant que les 19 autres acides aminés {Pal, 1999}. Beaucoup de protéines ont donc besoin d’isomérisation peptidyl-prolyl pour se trouver sous une forme tridimensionnelle correcte. Or, cette isomérisation est lente et donc limitante {Kiefhaber, 1990}. De plus, les intermédiaires formés lors du reploiement sont très sensibles à la dégradation et à l’agrégation. L’isomérisation peptidyl-prolyl est donc accélérée par des catalyseurs : les PPIases. Jusqu’à présent leur activité enzymatique n’a été démontrée qu’in vitro {Harding, 1989;Siekierka, 1989} (Fig.13).

3.2 : Structure et fonctions des FKBPs

Le rôle général des FKBPs se situe entre l’aide au reploiement protéique et la régulation de transduction de signaux. Elles se caractérisent toutes par la présence d’un domaine FKBD plus ou moins conservé. C’est au niveau de celui-ci que s’exerce l’activité enzymatique PPIase et que se lient la Rpm, le FK506 et leurs dérivés. Les plus petites protéines, telles que FKBP12 se réduisent à leur domaine FKBD. Elles peuvent contenir des signaux de localisation. Il existe également des FKBPs multi-domaines telle que hFKBP52 (Fig.14). Enfin, certaines FKBPs non canoniques comme hFKBP38, ne lient pas FK506 et ne présentent pas d’activité enzymatique : leur domaine FKBD est très peu conservé. (Revu dans {Galat, 2003;Galat, 1995;Kay, 1996;Breiman, 2002;Harrar, 2001;Gothel, 1999;Kang, 2008}

3.2.1 : FKBP12, archétype des FKBPs

a) Structure de FKBP12 et du FKBD

Nous l’avons vu, FKBP12 est l’archétype des FKBPs. Elle existe à peu près dans tous les eucaryotes testés jusqu’à présent (excepté P.falciparum). La FKBP12 humaine étant la plus étudiée, elle servira de modèle. C’est une petite protéine de 108 acides aminés, qui représente jusqu’à 0,4% des protéines

Figure I.15: Structure de FKBP12 humaine (Kay, J., 1996 et Protein Folding Database Fulton et al.)

cytoplasmiques des cellules Jurkat {Siekierka, 1989}. Elle a été localisée dans toutes les cellules mammifères, mais est particulièrement exprimée dans le cerveau {Kay, 1996}. Elle est constituée d’un unique domaine, le FKBD ou FK506 Binding Domain, responsable de son activité catalytique et de sa liaison à FK506-rapamycine. En effet, le FK506, la Rpm et la majorité de leurs dérivés synthétiques ou naturels bloquent l’activité PPIase des FKBPs, indiquant que le domaine de liaison de ces drogues est le même que celui de l’activité enzymatique.

La structure de FKBP12 {Michnick, 1991;Rosen, 1991} est caractérisée par un feuillet β amphipatique à 5 branches anti-parallèles. Le feuillet β pivote sur la droite et s’enroule autour d’une hélice α. Cette conformation permet la formation d’une cavité hydrophobe dans laquelle le ligand peut s’insérer, entre le feuillet β et l’hélice α (Fig.15).

Chaque FKBP12 peut lier une molécule de rapamycine ou de FK506 avec une forte affinité (Kd Rpm=0,2nM ; Kd FK506=0,4nM) {Bierer, 1990}. La formation de complexes entre FKBP et ses ligands augmente sa stabilité. Ils sont plus résistants aux clivages protéolytiques et forment une surface adéquate pour la liaison avec la calcineurine ou TOR. En fait, la moitié de la surface accessible au solvant du ligand est enterrée à l’intérieur de la cavité de FKBP tandis que l’autre moitié est exposée et forme un domaine effecteur disponible pour la création de lien avec une seconde protéine. FK506 et rapamycine provoqueraient l’inhibition de l’activité enzymatique en mimant un stade intermédiaire de l’isomérisation cis/trans {Galat, 2003}.

L’étude de la structure de FKBP12 associée à ses ligands {Lepre, 1992}; {Van Duyne, 1991;Van Duyne, 1993} met en évidence 14 acides aminés à des positions clés pour la liaison avec FK506. Mis à part Arg43 et Ile92, ils interagissent aussi avec la rapamycine. Certains résidus sont conservés au cours de l’évolution (Fig.16), principalement ceux se trouvant au niveau de la cavité ou se fait la liaison {Kay, 1996}. Parmi ceux-ci, on retrouve les 14 acides aminés liant FK506 : 10 sont fortement conservés au sein des FKBD qui présentent une activité PPIase. En plus de ceux-ci, 8 leucines/glycines participent à la formation de la poche hydrophobe dans les domaines présentant une forte activité. L’importance de ces résidus a été mesurée en testant l’effet de plusieurs substitutions sur l’activité PPIase {Tradler, 1997;Timerman, 1995;Ikura, 2007;Ludwig, 1994;Bossard, 1994;Aldape, 1992}. Ces différentes études donnent des résultats variables, parfois même opposés quant à la nécessité de tel ou tel acide aminé. Il en ressort cependant 1) que les mutations provoquant une diminution de l’activité enzymatique affectent souvent aussi l’affinité de la protéine pour la Rpm et le FK506 et 2) que les résidusY27, F37, D38, V56, W60, F100 et Y83 semblent incontournables. Plus spécifiquement, la mutation Y83F diminuerait l’activité enzymatique de 50%. Elle est d’ailleurs présente dans bon nombre de FKBD ne possédant peu/pas d’activité PPIase {Kay, 1996;Timerman, 1995}.

b) Fonctions de FKBP12

En plus de son rôle de PPIase et d’inhibiteur de TOR/CaN, FKBP12 possède d’autres fonctions, ne dépendant pas de son activité enzymatique. Toutefois, sa liaison aux drogues bloque ses interactions

Figure I.16: Consensus del’alignement des séquences de 30 domaines FKBD variés (12 de mammifères, 7d’autres eucaryotes et 11 de procaryotes) (Kay, J. 1996). Les acides aminés conservés dans plus de 80% des séquences sont soulignés, les acides aminés impliqués dans l’interaction avec le FK506 sont en rouge. Le positionnement des feuillets béta et del’hélice alpha est également indiqué.

protéiques puisqu’elle met en jeu le même domaine. Le rôle de FKBP12 varie d’un organisme à l’autre. Mais en tous cas, elle un régule la conformation de différentes protéines impliquées dans la signalisation cellulaire, notamment via son interaction avec des récepteurs et des kinases/phosphatases.

hFKBP12 régule le flux de Ca²⁺

1) Les récepteurs à la ryanodine (RyRs) sont membres d’une famille de canaux calcium homotétramériques, localisés dans les organelles stockant le Ca²⁺ tels que le réticulum sarcoplasmique RS {Fill, 2002;Meissner, 2002;Chelu, 2004}. Ils sont activés par le Ca²⁺ et régulés pharmacologiquement entre autres par la ryanodine, le FK506 et la Rpm. Deux isoformes de FKBP12 : FKBP12 et FKBP12.6 stabilisent respectivement les canaux RyR1, enrichi dans les muscles du squelette et RyR2 dans le muscle cardiaque. Un troisième type de canal, le RyR3, peut se fixer à l’une ou l’autre isomérase. La liaison de 4 FKBPs aux 4 homotétramères module les « portes » du canal : elle les stabilise à l’état fermé, facilite la coopération entre les sous-unités et permet le « couple gating », c'est-à-dire l’ouverture/fermeture simultanée de plusieurs canaux adjacents. Ces fonctions sont inhibées en cas de dissociation de FKBP12. On observe alors une fuite de Ca²⁺ hors de réticulum sarcoplasmique {Brillantes, 1994;Lam, 1995;Timerman, 1996;Jayaraman, 1992;Marx, 1998}. L’activité enzymatique PPIase ne peut être tenue pour responsable de la fonction de FKBP12, puisque des mutations d’acides aminés nécessaires à cette activité n’ont pas d’effet sur la liaison au récepteur {Timerman, 1995}. Il semblerait que cette liaison soit modulée par phosphorylation par la PKA {Marx, 2000}. Une dérégulation de ce contrôle entraînerait un dysfonctionnement cardiaque. De même, des souris knock-out pour FKBP12 ou 12.6 présentent un défaut cardiaque précoce pouvant être létal (chez l’embryon), alors que les muscles du squelette restent normaux {Shou, 1998;Wehrens, 2003}. Depuis peu, l’action de FKBP12.6 sur le RyR2 est controversée: la dissociation protéine-récepteur ne serait pas un mécanisme sous-tendant le dysfonctionnement cardiaque {Xiao, 2007}.

2) Le récepteur à l’inositol 1,4,5 triphosphate IP3R est également un canal calcium du RS interagissant avec FKBP12. La PKA active le récepteur IP3R par phosphorylation. Il est désactivé par la phosphatase calcineurine. FKBP12 stabiliserait la liaison du récepteur avec la CaN, permettant une régulation négative de l’activité du canal. La dissociation de l’isomérase du canal entraine, comme pour les RyRs une augmentation du flux de calcium à travers celui-ci {Cameron, 1997;Cameron, 1995}. L’épitope de l’IP3R qui le lie à FKBP12 mime structurellement le FK506. La liaison à la CaN peut ainsi se faire sans l’intermédiaire de la drogue. La forme de FK506 copierait donc celle d’un substrat endogène di-peptide, et en l’absence de celui-ci, il prendrait sa place et se lierait à la CaN {Harrar, 2001;Cameron, 1997}.

Afin d’avancer dans les voies reproductrices de la femelle, le flagelle des spermatozoïdes mammaliens doit passer par une étape de motilité hyperactive. L’hyperactivation nécessite un flux de calcium en provenance d’une structure RNE « redundant nuclear envelope » localisée à proximité de la base du flagelle. Il semblerait qu’une partie du pool des IP3Rs de la cellule se trouve à cet endroit, permettant

d’augmenter la concentration intracellulaire du calcium au niveau du flagelle en ouvrant les canaux {Marquez, 2007;Ho, 2001}.

hFKBP12 et les récepteurs aux facteurs de croissance

1) Il existe 2 types de récepteur au TGF β: TβR2 active TβR1 en le phosphorylant. FKBP12 peut recouvrir le site de phosphorylation, stabilisant le récepteur dans une conformation inactive. L’interaction se fait via le site actif de FKBP12 puisqu’inhibée par le FK506 {Wang, 1994}. Il semblerait que FKBP12 empêcherait également l’internalisation du récepteur {Yao, 2000}. L’inhibition de TβR1 ferait de FKBP12 un régulateur du cycle cellulaire: des fibroblastes invalidés FKBP 12^-/- sont arrêtés en G1 à cause de l’hyper-activation du récepteur. Il ne répondrait plus à une stimulation par le TGF β. L’arrêt du cycle cellulaire est proposé comme un des facteurs provoquant la mort embryonnaire des souris FKBP12^-/-{Aghdasi, 2001}.

2) FKBP12 bloquerait la transduction de signaux d’un autre facteur de croissance, associé au TGF, l’activine en se liant à son récepteur, ALK4 « activin type I receptor ». Une fois de plus, cette inhibition serait levée par l’ajout de FK506 {Yamaguchi, 2006}.

3) Enfin, FKBP12 inhiberait l’autophosphorylation du récepteur à l’EGF « epidermal growth factor », alors que la Rpm ou le FK506 la stimulerait {Lopez-Ilasaca, 1998}.

hFKBP12 et la mobilité des spermatozoïdes

De grandes quantités de FKBP12 semblent relâchées dans le système reproducteur mâle et s’associent avec les spermatozoïdes en maturation. L’ajout de FKBP12 recombinante augmente la vélocité des spermatozoïdes immatures. Ceci suggère un rôle de la protéine dans l’initiation de la mobilité. La plus grande concentration de FKBP est localisée à l’endroit de stockage du sperme, le vas deferens {Walensky, 1998}.

FPR1, homologue de FKBP12 chez la levure

Fpr1, « FK506 sensitive proline rotamase » de S.cerevisiae {Heitman, 1991;Wiederrecht, 1991} partage 56% d’homologie avec hFKBP12 {Kay, 1996}. Elle aussi médie l’inhibition de TOR et de la CaN via son interaction avec FK506/Rpm (Kd de 0.9nM et 0.5nM) {Koltin, 1991}; {Cardenas, 1994}.

Fpr1 n’est pas essentielle à la levure. Un knock-out conjugué de ses 4 Fpr n’a aucun effet sur la survie de la cellule {Dolinski, 1997}! La seule caractéristique des mutants Fpr1 est leur résistance à la Rpm et au FK506. Cependant, une certaine similarité de fonction a dû être maintenue durant l’évolution puisque hFKBP12 est capable de complémenter le knock-out Fpr1 de la levure, en lui rendant sa sensibilité aux drogues {Koltin, 1991}.

Fpr1 est localisée dans le noyau et le cytoplasme {Huh, 2003}. On ne connait pas grand-chose de sa fonction endogène. Elle se lie à l’aspartokinase HOM3 dont elle catalyserait le changement de conformation en réponse à sa liaison avec un ligand {Alarcon, 1997}. Fpr1 s’associerait également à une protéine liant la chromatine, HMO1 ; « High Mobility group » dont elle régulerait l’homo-dimérisation {Dolinski, 1999}. Ces deux interactions sont inhibées par l’ajout de Rpm ou de FK506. (Revu dans {Arevalo-Rodriguez, 2004}.

3.2.2 : FKBP52, une FKBP multi-domaine

(Revu dans {Breiman, 2002;Harrar, 2001;Kang, 2008;Davies, 2005})

a) Structure de FKBP52

FKBP52 est une protéine mammalienne {Nakao, 1985;Tai, 1986} possédant deux domaines PPIase, dont le premier seulement est conservé (55% d’homologie avec hFKBP12) et présente une activité enzymatique inhibée par FK506 {Yem, 1993;Chambraud, 1993}. Il ne permet pas l’inhibition de la CaN {Li, 2003} mais s’associe à d’autres protéines. Le deuxième domaine contient un site de liaison aux nucléotides {Callebaut, 1992;Le Bihan, 1993}. Les FKBDs sont suivis de 3 TPR ou « tetra-trico-peptide repeat » permettant l’interaction avec la chaperonne Hsp90 {Radanyi, 1994}. Finalement, la partie C-terminale de la protéine contient un domaine de liaison putatif à la calmoduline CaM {Cheung-Flynn, 2003}. (Fig.14)

b) Translocation des récepteurs aux stéroïdes

FKBP52 se localise dans le noyau et le long des MT cytoplasmiques {Czar, 1994}. Elle forme un complexe avec les récepteurs aux stéroïdes (tel que le récepteur aux glucocorticoïdes GR) et la chaperonne Hsp90. La PPIase servirait d’adaptateur entre le complexe et la dynéine des microtubules, permettant la translocation du récepteur du cytoplasme vers le noyau, le long de ces MT. Le premier domaine FKBP lie la dynéine et est co-purifié avec celle-ci, contrairement à FKBP12 {Silverstein, 1999;Galigniana, 2002}. Lors de la liaison de l’hormone au complexe GR, il y a un échange de FKBP au sein de celui-ci. La protéine FKBP51 (60% d'identité avec FKBP52) est remplacée par FKBP52. Cet échange permet le recrutement de la dynéine au niveau du complexe, et le mouvement de l’ensemble vers le noyau {Davies, 2002}.

c) FKBP52 et le cytosquelette

FKBP52 est majoritairement nucléaire. Lors de la mitose, elle se situe au niveau du système mitotique : le fuseau, le centrosome et l’interzone séparant les chromosomes. Lors de la cytocinèse on la retrouve au niveau de l’axe de clivage et du « midbody » situé entre les deux cellules-filles en fin de division. Enfin, elle réapparait dans le cytoplasme des cellules-filles sous forme de réseau fibreux. Malheureusement, on ne sait toujours rien de la fonction nucléaire de FKBP52 {Czar, 1994;Perrot-Applanat, 1995}.

Les TPR permettraient une interaction directe avec la tubuline, ce qui inhiberait la polymérisation et la stabilité des MT. FKBP52 serait donc une protéine régulatrice du cytosquelette et pourrait contribuer à la différenciation neuronale {Chambraud, 2007}.

d) Activité chaperonne

Les chaperonnes reconnaissent et lient les protéines dont la conformation n’est pas native, c'est-à-dire pas encore définie. Elles empêchent les interactions moléculaires non désirées et sont impliquées dans les étapes de reploiement. Une fois la protéine correctement reployée, la chaperonne se détache. FKBP52

possède une activité chaperonne in vitro qui n’est pas affectée par l’ajout de Rpm ou de FK506. Elle serait donc indépendante de son activité PPIase {Bose, 1996}.

e) Autres interactions protéiques

Le premier FKBD de FKBP52 permet la liaison à FAP48 ; FKBP Associated protein. Celle-ci interagit également avec FKBP12, liaison inhibée par le FK506 {Chambraud, 1996}. Le complexe FAP-FKBP augmenterait la production d’IL2, à l’inverse de FK506 qui provoque l’immunosuppression en bloquant la synthèse d’IL2 {Krummrei, 2003}.

FKBP52 s’associe aussi à l’hydroxylase de peroxisome PAHX {Chambraud, 1999}, et au facteur de transcription IRF4; « interferon regulated factor 4 », impliqué dans la maturation des cellules lymphoïdes. Pour la première fois, l’activité PPIase in vivo d’une FKBP se révèle essentielle à la régulation protéique : l’activité transcriptionnelle de l’IRF4 nécessite l’activité isomérase de FKBP52 {Mamane, 2000}.

3.2.3 : FKBPs végétales

FKBP12 chez les plantes, d’abord identifiée chez V.faba {Luan, 1994}, présente une homologie de 35% avec hFKBP12 {Kay, 1996}. Les FKBP12 des plantes supérieures ne médieraient pas l’action de FK506 ni de la Rpm {Xu, 1998}. Bien qu’un homologue de TOR existe chez celles-ci, il ne s’associerait pas avec FKBP12 {Menand, 2002}. Etrangement, VfFKBP12 serait capable de former un complexe instable et de faible affinité avec FK506 et la CaN bovine {Xu, 1998}. En revanche, l’algue unicellulaire C.reinhardtii est sensible à la Rpm et sa FKBP12 se lie à TOR {Crespo, 2005}.

Certaines FKBP végétales, comme VfFKBP12 possèdent un pont disulfure : le DTT qui coupe ces ponts diminue fortement la formation du complexe CaN-FK506-FKBP {Xu, 1998}. On retrouve également deux ponts di-S chez la protéine chloroplastique AtFKBP13, régulée en fonction de son statut redox {Gupta, 2002} ; {Gopalan, 2004}. Les chloroplastes contiennent une grande quantité d’immunophilines, justifiant peut être l’abondance de PPIases chez les plantes.

L’association d’AtFKBP12 à la protéine AtFIP37 « Arabidopsis interacting protein », est inhibée par FK506 {Faure, 1998}. AtFIP37 essentielle au développement embryonnaire, serait impliquée dans la régulation du cycle cellulaire {Vespa, 2004}.

La protéine FKBP73 du blé, possédant plusieurs FKBDs ainsi que des TPR est une chaperonne. Elle peut remplacer FKBP52 dans le complexe GR-Hsp90. Les FKBPs végétales de grande taille pourraient donc avoir une fonction semblable à leurs homologues mammaliens. {Breiman, 2002;Owens-Grillo, 1996}. Ces FKBPs multi-domaines sont nécessaire au développement des plantes comme PAS1 « PASTICCINO1 » chez A.thaliana {Geisler, 2007;Vittorioso, 1998}.

3.2.4 : PPIases parasitaires

La seule FKBP présente chez le parasite est PfFKBP35, une FKBP possédant un domaine FKBD conservé ainsi que 3 TPRs, permettant l’association à Hsp90. La protéine est une chaperonne, et possède une activité isomérase. Ces deux activités enzymatiques sont inhibées par les drogues. Etonnamment, FKBP35 est