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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Demols, A. (2003). Immunomodulation de la pancreatite experimentale (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté de Médecine – Médecine, Bruxelles.

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Faculté de Médecine

IMMUNOMODULATION DE LA PANCREATITE EXPERIMENTALE

ULB - Campus Erasme

Bibliothèque de Médecine - CP 607 Route de Lennick, 808 (Bât.E)

B-1070 Bruxelles Tél.; 02/555.61.70

Anne DEMOLS

Service de Gastro-Entérologie et d'Hépato-Pancréatologie et Laboratoire de Gastro-Entérologie Expérinnentale

Hôpital Erasme

Thèse présentée en vue de l'obtention du titre de Docteur en Sciences Médicales

Année académique 200tr200^

I ^CIBLE

Faculté de Médecine

IMMUNOMODULATION DE LA PANCREATITE EXPERIMENTALE

Anne DEMOLS

Service de Gastro-Entérologie et d'Hépato-Pancréatologie et Laboratoire de Gastro-Entérologie Expérimentale

Hôpital Erasme

Thèse présentée en vue de l'obtention du titre de Docteur en Sciences Médicales

Année académique 200^200^

Faculté de Médecine

IMMUNOMODULATION DE LA PANCREATITE EXPERIMENTALE

Anne DEMOLS

Service de Gastro-Entérologie et d'Hépato-Pancréatologle et Laboratoire de Gastro-Entérologie Expérimentale

Hôpital Erasme

Promoteur: Professeur Jacques Devière

Co-promoteur: Professeur Jean-Luc Van Laethem

F A B R I C L E D E S A L L E

FRANÇOIS

ERASME C

Q U E S 0

LA FONDATION

1 E

V V C

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E E A

N R S R N

ERIC QUERTINMONT

L A

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MURIELLE SURQUIN M

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ANDRE E

D E M O L S

B E R T L O

ALBERT T H Y S

JANINE DUMONT

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CHRI STOPHE

DE M O O R

C H A N T A L D E G

G E E R T S A E F

I A P E R S O O N S

A N S L E G R O S

C A T H E R I N ISABELLE S

L DUPONCHELLE B E

D E L H A Y E U

P A K S A C T A J L A F R A L M O N

A M

M B

M A

E U

T

M Y R I AM

TABLE DES MA TIERES:

Pages

Liste des abbréviations 5

Avant-propos 8

CHAPITRE 1: Généralités

1 Pancréatite aiguë humaine: généralités 11 2 Physiopathogénie de la pancréatite aiguë 17

2.1 Phénomènes intra-acinaires 20

2.2 Phénomènes extra-acinaires 26

2.3 Réponse systémique 30

2.4 Phase de régénération 32

3 Pancréatite chronique et fibrose pancréatique 34 3.1 Lithogénèse canalaire et théorie de la

séquence "nécrose-fibrose" 36

3.2 Toxicité de l'alcool et de ses métabolites 36 3.3 Ischémie et ischémie-reperfusion pancréatiques 37

3.4 Cellules étoilées 38

3.5 Auto-immunité et cellules cytotoxiques 41

3.6 Facteurs de croissance 42

3.7 Conclusion 42

4 Cellules immunitaires et pancréatite 44

4.1 Polynucléaires neutrophiles 44

4.2 Macrophages 46

4.3 Lymphocytes T 47

5 Cytokines pro-inflammatoires et pancréatite 50

5.1 Facteur de Nécrose Tumorale Alpha 50

5.2 Interleukine 1 51

5.3 Interleukine 6 52

6 Chimiokines et pancréatite 53

7 Cytokines anti-inflammatoires et pancréatite 56

7.1 Interleukine 10 56

7.2 Interleukine 11 60

8 Transforming Growth Factor Béta 61

9 Modèles expérimentaux de pancréatites 64

9.1 Pancréatite aiguë sécrétagogue 64

9.2 Pancréatite aiguë induite par diète 66 9.3 Pancréatite chronique induite par pancréatites aiguës 67

répétées

CHAPITRE 2: Buts du travail 69

CHAPITRE 3: Résultats 71

1 CD4+ T cells play an important rôle in acute experimental

pancreatitis in mice 72

2 N-Acetylcysteine decreases severity of acute pancreatitis in mice 78 3 Endogenous Interleukin 10 modulâtes fibrosis and régénération

in experimental chronic pancreatitis 83

CHAPITRE 4: Conclusions et perspectives 89

Résumé de la thèse 98

Liste bibliographique 100

Thèse annexe 122

Composition du Jury de thèse 124

Curriculum vitae 125

LISTE DESABBREVIA TIONS;

ADH: Alcohol Deshydrogenase ADN: Acide Désoxyribonucléique APC: Antigen-Presenting Cell

ARDS: Adult Respiratory Distress Syndrome ARNm: Acide Ribonucléique Messager a-SMA: Smooth Muscle Actin Alpha BCA-1: B-Cell-Attracting Chemokine 1 CCK: Cholécystokinine

CDE: Cholin Déficient Ethionin Supplemented CD40-L: CD40-Ligand

CMV: Cytomégalovirus

CIVD: Coagulation Intra-Vasculaire Disséminée CRP: C Reactive Protein

CTGF: Connective Tissue Growth Factor CTL: Cytotoxic T Lymphocyte

EBV: Ebsteinbarr Virus

EGF-: Epidermal Growth Factor-

FACS: Fluorescence-Activated Cell Sorter FADD: Fas Associated Death Domain Fas-L: Fas-Ligand

FITC: Fluorescein Isothiocyanate GFAP: Glial Fibrillary Acid Protein

GLD: Generaiized Lymphoproliférative Disease GSH: Glutathion réduit

GSSG: Glutathion oxydé HPF: High-Power Field

ICAM-: Intercellular Adhesion Molecule- ICE: Interleukin-ip Converting Enzyme IFN-: Interféron-

IGF-: Insulin Growth Factor-

IL-: Interleukine-

IL-IRA: IL-1 Receptor Antagonist iNOS: Inductible NO Synthase IP: Intrapéritonéal

IP-10: Interferon Inducible Protein 10

IV: Intraveineux

KO: Knock Out

LFA- : Lymphocyte Fonction Associated Antigen- LNAME: L-Nitro-L-Arginine Methyl Ester

LPS: Lipopolysaccharide Ltn: Lymphotactine mAb: Anticorps monoclonal MAP: Mitogen Activated Protein

MCP-: Monocyte Chemoattractant Protein- MDA: Malondialdhéhyde

MDC: Macrophage-Derived Chemokine MHC: Major Histocompatibility Complex MIP-: Macrophage Inflammatory Protein- MOF: Multiple Organ Failure

MPO: Myéloperoxydase NAC: N-Acétylcystéine

ND: Non Déterminé

NF-

B: Nuclear Factor Kappa B NGF: Netve Growth Factor NK: Naturel Killer

NO: Oxyde Nitrique

OCT : L-2-Oxothiazolidine-4-Carboxylate PA: Pancréatite Aiguë

PAF: Platelet Activating Factor

PBMC: Peripheral Blood Mononuclear Cells PC: Pancréatite Chronique

PDGF: Platelet Derived Growth Factor

PDTC: Pyrrolidine Dithiocarbamate PE: Phycoerythrin

PMN: Polynucléaire neutrophile PSC: Pancreatic Stellate Cell

PSTI: Pancreatic Secretory Trypsin Inhibitor

RANTES: Regulated on Activation Normal T Cell Expressed and Secreted r-IL-10: Interleukine 10 recombinante

ROI: Radicaux libres oxygène

RT-PCR: Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction SIRS: Systemic Inflammatory Response Syndrome SOD: Superoxyde Dismutase

TACE: TNF-a Converting Enzyme TAP: Trypsinogen Activated Peptide TCR: T Cell Receptor

TGF-: Transforming Growth Factor- TNF-a: Tumor Necrosis Factor Alpha

TRADD: TNF Receptor Associated Death Domain

UH: Unités de rehaussement Hounsfield

AVANT-PROPOS :

La pancréatite aiguë humaine est une pathologie fréquente, surtout dans les pays occidentaux où l'alcool en représente l'étiologie principale. Si expérimentalement on en appréhende mieux la physiopathogénie, en revanche aucun traitement spécifique n'est actuellement connu, et ce malgré de nombreux essais expérimentaux menés principalement chez l'animal mais également chez l'homme. La morbidité et la mortalité liées à la pancréatite aiguë restent importantes, surtout dans les formes sévères de la maladie.

De même, les mécanismes qui conduisent à la pancréatite chronique, ainsi qu'une éventuelle interrelation entre celle-ci et la pancréatite aiguë, et qui aboutissent à la fibrose du parenchyme pancréatique avec atrophie acinaire, insuffisance exocrine et endocrine secondaires sont encore moins bien élucidés. Si la pancréatite chronique n'est pas directement mortelle, elle est néanmoins grevée de nombreuses complications et d'une morbidité importante.

Actuellement, seuls des traitements supportifs par substitution enzymatique, insulinothérapie, antalgiques, et traitement endoscopique ou chirurgical des complications sont disponibles dans cette pathologie.

Le but des travaux expérimentaux qui seront exposés ci-après est de tenter d'apporter une contribution à la compréhension de la physiopathogénie de la pancréatite aiguë et de la pancréatite chronique. Et ainsi de tenter d'en limiter la sévérité, d'apporter des éléments de réponse quant à de nouvelles thérapies visant à limiter leur évolution vers la chronicité et la fibrose.

La première partie de ce travail a consisté en la mise en évidence et la caractérisation du rôle délétère des lymphocytes T dans le développement de la pancréatite aiguë expérimentale.

La deuxième partie étudie les effets protecteurs de la N-Acétylcystéine administrée de façon prophylactique au cours de la pancréatite aiguë expérimentale.

Enfin, le troisième et dernier volet évalue le rôle de llnterleukine 10 endogène dans les

phénomènes de régénération suivant un épisode de pancréatite aiguë ainsi que dans le

développement de la fibrose et de l'atrophie acinaire dans un modèle expérimental de

pancréatite chronique.

Une meilleure compréhension des mécanismes physiopathogéniques complexes de ces deux

maladies induira l'évolution vers un traitement spécifique, voire préventif de ces affections

pancréatiques qui à l'heure actuelle ne bénéficient que d'un traitement symptomatique.

Généralités.

1 PANCREATITE AIGUE HUMAINE - Généralités:

La pancréatite aiguë est une pathologie fréquente aux étiologies multiples pouvant conduire à des complications sévères, voire léthales (dans 15 à 30% des pancréatites aiguës graves (1),(2)), et pour laquelle aucun traitement, hormis celui des complications, n'est actuellement connu.

Définition ;

La pancréatite aiguë se définit comme un processus inflammatoire du pancréas quelle qu'en soit l'étiologie, se présentant cliniquement par des douleurs abdominales (le plus souvent de l'hypochondre gauche, mais aussi de l'épigastre, irradiant parfois en ceinture, transfixiantes) et biologiquement par une élévation du trypsinogen activated peptide urinaire (TAP), et des enzymes (amylase et lipase, cette dernière étant plus spécifique) sériques d'au moins trois fois les valeurs normales (3).

Etiologies :

Dans les pays occidentaux, 80% des pancréatites aiguës sont attribués à l'alcool et aux lithiases biliaires (3),(4). Les autres causes peuvent être subdivisées en (3),(4),(5) :

- métaboliques: hypercalcémie, hypertriglycéridémie,...

- toxiques et médicamenteuses: thiazides, azathioprine, organophosphates, toxine de scorpion,....

- mécaniques: microlithiases, obstructions ampullaires et périampullaires (bénignes ou néoplasiques), obstructions du canal pancréatique (bénignes ou malignes), malformations congénitales (pancréas divisum ?), traumatiques

- infectieuses: CMV, EBV, HIV, parasites, tuberculose,...

- ischémiques: vasculites, hypotension sévère et prolongée, syndromes d'hypercoagulabilité, occlusions vasculaires (thromboses, embolies)

- héréditaires: mutations des gènes du trypsinogène cationique et du PSTI (SPINKl, PRSSl) - tropicales

- auto-immunes

- idiopathiques, quand aucune cause n'est identifiée

Il est primordial de déterminer si possible l'étiologie de toute pancréatite aiguë afin d'en prévenir ainsi la récidive.

Evaluation de la sévérité :

Il est important de déterminer la sévérité d'une pancréatite aiguë puisque que plus elle est grave plus elle est associée à des complications et à une mortalité importantes. Dans environ 75% des cas la pancréatite aiguë évolue favorablement; cependant dans un quart des cas elle est sévère avec, dans ce dernier cas, une mortalité associée de 15 à 30% (1),(2).

Déterminer précocement la sévérité d'une pancréatite aiguë permet d'identifier les patients nécessitant une surveillance et un traitement en unité de soins intensifs, et plus à risques de développer des complications.

La sévérité de la pancréatite aiguë s'évalue dans un premier temps par la clinique, s'y ajoutant des marqueurs biologiques et radiologiques, l'ensemble fusionné en des critères et scores de sévérité.

Le plus ancien score, ou score de Ranson (6) décrit en 1974, prend en compte des critères biologiques et cliniques objectivés à l'admission puis ré-évalués 48 heures plus tard (Tableau 1).

Si moins de trois critères sont présents, la pancréatite est de sévérité modérée; elle est étiquetée de sévère si plus de trois de ces critères sont présents.

Tableau 1: Score de Ranson

Critères à l'admission Critères à 48 heures

-

âge> 55 ans

- leucocytes> 16000/mm^

-

glycémie> 200 mg/dl - LDH> 1.5 X la normale

-

AST>

la normale

V

hématocrite de > 10 % r urée de > 5 mg/dl

-

Ca'^'^< 8 mg/dl

-

Pa 02 < 60 mmHg

V

bicarbonates> 4 mEq/l

-

séquestration liquidienne> 61

Il est important de noter que les performances de ce score sont peu rentables à l'échelon

individuel, avec une sensibilité de 76% et une spécificité de 70%.

Le score APACHE II , introduit par Knauss en 1984 (7) puis adapté pour l'évaluation de la pancréatite aiguë par Larvin (8), est d'utilisation complexe mais offre les avantages de pouvoir être utilisé d'emblée à l'admission du patient puis d'être ré-évalué au jour le jour. Il permet d'éliminer une forme grave quand il est inférieur à 9 dans les 24 premières heures de l'admission. Un score supérieur à 9, quel que soit le moment de l'évaluation, identifie une pancréatite aiguë sévère mais avec une spécificité de 76% et une sensibilité de 82% dans l'étude de Glasgow (9).

Pour pallier au manque de sensibilité et de spécificité des scores bio-cliniques, des facteurs morphologiques de gravité ont été introduits. Balthazar, en 1985, publie une classification radiologique (10), basée sur l'évaluation de l'inflammation et de la présence de collections intra- et péri-pancréatiques au CT scanner pancréatique. Dans ce système, plus le grade augmente, plus les complications (sous forme d'abcès) ainsi que la mortalité augmentent.

Grade A ; pancréas normal

Grade B : élargissement pancréatique diffus ou localisé

Grade C : inflammation limitée au pancréas et à la graisse péri-pancréatique Grade D : présence d'une collection liquidienne péri-pancréatique

Grade E : présence d'au moins deux collectons liquidiennes et/ ou de gaz adjacents ou intra- pancréatiques

Ce score a été affiné (score de Balthazar modifié ou CT Severity Index (11)), en tenant compte de et en quantifiant la nécrose pancréatique qui est définie comme un défaut de rehaussement (<50 UH) du parenchyme pancréatique après injection de produit de contraste (Tableau 2).

Tableau 2: CT Severity Index

Inflammation oancréatiaue Nécrose oancréatiaue

Grade A : 0 point Pas de nécrose : 0 point

Grade B : 1 point Nécrose< 30% ; 2 points

Grade C ; 2 points Nécrose 30-50% : 4 points

Grade D : 3 points Nécrose> 50% : 6 points

Grade E : 4 points

L'addition du score d'inflammation au score de nécrose définit le "CT Severity Index". Plus ce score augmente et plus la morbidité et la mortalité sont importantes (Tableau 3).

Tableau 3: Morbidité et mortalité liées au score du CT Severity Index

Index Morbidité f%I Mortalité f%l

<3 8 3

4 à 6 35 6

7 à 10 92 17

En pratique, on recommande la réalisation d'un CT scanner pancréatique avec injection de produit de contraste dans les 48 à 72 premières heures d'évolution d'une pancréatite aiguë.

De nouveaux marqueurs biologiques ont été testés comme prédicteurs de sévérité, utilisés seuls et ceci dès les premières heures de l'admission du patient. Ainsi, le TAP urinaire est non seulement utilisable comme test diagnostic très précoce (détecté dans les urines dès les premières heures d'évolution de la PA) et spécifique, et constitue également un bon facteur prédicteur de la sévérité de la PA après 24 heures d'évolution (avec une valeur prédictive négative de 86% (12) à 100% (13) selon les études).

L'IL-6, dosable dans le sérum 24 heures avant l'élévation de la CRP (14), est élevée chez

environ 90% des patients présentant une PA sans être spécifique de celle-ci. Par contre, elle est

un marqueur précoce (dans les 24 premières heures d'évolution) prédictif positif de sévérité

dans des modèles d'analyses multivariées (15),(16),(17). Malheureusement, peu d'hôpitaux

disposent d'un dosage d'IL-6 sérique en routine, limitant ainsi son utilisation en pratique

courante. En revanche, la CRP, même si elle ne s'élève que plus tardivement (14) soit après la

48 eme [^gure, est dosée de façon routinière par les laboratoires. Elle constitue un bon marqueur

d'évaluation de la sévérité de la pancréatite aiguë après 48 heures d'évolution (si elle est

supérieure à 12 (18) ou à 15 (19) mg/dl selon les études).

Complications :

On peut diviser les complications attribuées à une pancréatite aiguë en deux groupes : les complications précoces et tardives.

Les complications précoces surviennent dès les premières heures et jours d'évolution de la maladie. Elles consistent essentiellement en une réaction systémique inflammatoire ou SIRS (systemic inflammatory response syndrome), un syndrome de détresse respiratoire de l'adulte ou ARDS (adult respiratory distress syndrome) et en une défaillance multisystémique ou MOF (multiple organ failure). Elles sont causées par les différents médiateurs pro-inflammatoires libérés au cours de la phase précoce de la pancréatite aiguë : radicaux libres oxygène, PAF, TNF-a, IL-1,... (voir chapitre 2). Trente à cinquante % des décès secondaires à une pancréatite aiguë sont liés à ces complications et surviennent au cours de la première semaine d'évolution de la pathologie (20),(21).

Les complications tardives qui s'observent dans les deux à trois semaines d'évolution de la maladie consistent en une infection du tissu pancréatique et péri-pancréatique nécrosé avec formation de collections, d'abcès, et de pseudo-kystes. Cinquante pourcent des décès dûs à une pancréatite aiguë surviennent au cours de cette phase tardive et sont essentiellement liés au sepsis et au MOF secondaires à l'infection des nécroses et aux abcès (20),(21).

Traitement ;

Hormis l'éviction de l'agent causal s'il a été identifié comme c'est la cas de la pancréatite biliaire, aucun traitement pharmacologique spécifique de la pancréatite aiguë n'existe même si plusieurs molécules ont été évaluées dans ce but à titre expérimental. Les recherches se développent actuellement et concernent des traitements précoces (ou préventifs), focalisés sur une fenêtre thérapeutique d'environ 48 heures après la survenue des symptômes, et visant à modifier le cours de la pancréatite aiguë. Tous les autres traitements utilisés en clinique sont supportifs, visant essentiellement à prévenir l'infection de la nécrose, et ainsi la morbidité et la mortalité associées.

La nutrition entérale jéjunale (après levée de l'iléus) (22),(23),(24) associée à une compensation

hydro-électrolytique adéquate font partie du traitement supportif de base, ainsi qu'une antalgie

adaptée. Les pancréatites aiguës sévères pourront requérir, en phase aiguë, une surveillance et

un traitement des complications en unité de soins intensifs (dialyse, ventilation mécanique, et

autres traitements du choc distributif).

Une prévention de l'infection de la nécrose pancréatique est actuellement recommandée si la CRP est supérieure à 12mg/dl et si la nécrose est documentée par CT scanner (avec injection de produit de contraste) (25),(26).

Le traitement chirurgical n'est recommandé qu'en cas de pancréatite sévère compliquée de nécrose infectée dont l'évolution n'est pas contrôlée par le traitement médical (antibiothérapie adaptée).

Enfin, un traitement endoscopique des complications tardives (pseudo-kystes) sera envisagé au

cas par cas.

2 PHYSIOPA THOGENIE DE LA PANCREA TITE AIGUE ;

La pancréatite aiguë est une maladie dont les mécanismes physiopathologiques précoces sont complexes. Au cours des dix dernières années, grâce au développement de modèles et d'études expérimentales, la compréhension des mécanismes précoces évolue et devient de plus en plus précise.

Quelle que soit l'origine de la pancréatite aiguë, les cellules acinaires y jouent un rôle central.

Elles sont à la fois le siège de la lésion primaire du pancréas mais aussi responsables de la cascade inflammatoire qui s'ensuit conduisant aux lésions tissulaires pancréatiques dans un premier temps. Cette cascade implique d'autres cellules intra-pancréatiques comme les monomacrophages, les polynucléaires neutrophiles, les lymphocytes T, les cellules nerveuses, les cellules endothéliales, les plaquettes et les cellules étoilées. Dans un deuxième temps, cliniquement et simultanément du point de vue biologique, une réaction inflammatoire systémique suivie de complications extra-pancréatiques (hépatiques et pulmonaires) surviennent (Figure 1 adaptée d'après Weber et Tableau 4).

Figure 1: Principaux acteurs cellulaires et organes impliqués dans ia pancréatite aiguë

Stellate cell

de la pancréatite aiguë

PANCREAS

Acteurs cellulaires Evénements cellulaires Médiateurs Cellule acinaire Activation du trypsinogène -événement initiateur

-cathepsine B, D et H -calcium ionisé

-mutation du trypsinogène Inflammation -translocation du NF-

B

-transcription IL-1, TNF-a, IL-6, IL-8, MCP-1, MOB-1, ICAM-l

-PAF

Stress oxydatif -ROI, dérivés de peroxydation -trancription de iNOS

Mort acinaire -polynucléaires neutrophiles -ROI

-TNF-a, Fas-FasL, IFN-y

Monomacrophages Invasion -chimiokines

Activation -médiateurs pro-inflammatoires : NF-

B, TNF-a, IL-1, IL-6

-NO -ROI Interaction avec lymphocytes T -IL-12

-CD40-CD40L, B7-CD28 Polynucléaires neutrophiles Invasion du pancréas -IL-8

-ICAMl

Activation -nécrose acinaire

-ROI

Cellules étoilées Activation -NF-

B, TNF-a, IL-1, IL-6, MCP-1, RANTES, TGF-p

Cellules endothéliales Transcription iNOS -médiateurs pro-inflammatoires Adhésion et invasion PMN -LAMl, ICAMl

Plaquettes Inflammation -PAF

Contrôle inflammatoire -TGF-p Cellules nerveuses Œdème

Infiltrat par PMN

-substance P

Tableau 4 :

FOIE

Acteurs cellulaires Evénements cellulaires Médiateurs

Cellules de Kupffer Activation - inflammation -NF-

B, TNF-a, IL-1, IL- 6 , MCP- 1, RANTES

POUMONS

Acteurs cellulaires Evénements cellulaires Médiateurs Macrophages aivéoiaires Invasion -chimiokines

Activation -médiateurs pro-inflammatoires : NF-

B, TNF-a, IL-1, IL -6

-NO -ROI

Celluies endothéliales Adhésion et invasion PMN -LAMl, ICAMl Polynucléaires neutrophiles Invasion du parenchyme -IL -8

-ICAMl

Activation -élastase

-ROI

2.1 PHENOMENES INTRA-ACINAIRES ;

Activation intra-acinaire du trvDsïnoaène :

Dans les conditions physiologiques, les enzymes pancréatiques existent dans la cellule acinaire sous forme de pro-enzymes ou zymogènes, et ne sont activées qu'une fois dans le duodénum par les entérokinases de la bordure en brosse et par la trypsine (27). Le trypsinogène existe sous trois formes, dont seule la forme 3 ou trysinogène cationique est capable d'auto-activation dans la cellule acinaire (28),(29). Cette auto-activation est limitée par le PSTI (Pancreatic Secretory Trypsin Inhibitor) qui par liaison covalente au trypsinogène en protège le site de clivage protéique. Lors de l'activation du trypsinogène en trypsine, le TAP (10 acides aminés) est hydrolysé en N-terminal, et rend ainsi le reste de la molécule active en entraînant une modification de sa conformation.

Au cours de la pancréatite aiguë expérimentale, la synthèse des enzymes par la cellule acinaire s'effectue normalement, mais leur sécrétion par exocytose est bloquée (30) conduisant à leur accumulation sous la membrane apicale de la cellule acinaire. D'autres phénomènes ont également été observés consistant à la fois en un défaut de ségrégation des zymogènes et des enzymes lysosomiales par le Goigi menant à leur co-localisation dans de larges vacuoles, et en un phénomène de crinophagie ou fusion des lyzosomes et des granules de zymogènes (29), (31),(32). Ceci conduit à l'activation intra-acinaire du trypsinogène par la cathepsine B (enzyme lysosomiale capable de cliver la protéine de trypsinogène en trypsine (28)), et secondairement à l'activation du trypsinogène par la trypsine ainsi formée.

Ces différents mécanismes ont été confirmés expérimentalement par réalisation de doubles

immunomarquages de la cathepsine B et du TAP qui sont effectivement co-localisés dans les

mêmes vacuoles intra-cytoplasmiques (33),(34). Néanmoins, la cathepsine B ne semble pas à

elle seule responsable de l'activation du trypsinogène puisque son absence génétique (35) ou

son inhibition (31) réduit, mais n'abolit pas le développement d'une pancréatite aiguë après

stimulation par la céruléine à doses supra-physiologiques chez la souris. Il semble donc que

d'autres facteurs d'activation du trypsinogène puissent jouer un rôle, comme la cathepsine D et

cathepsine H , des mutations du trypsinogène cationique ou du PSTI (comme dans la

pancréatite héréditaire (36),(31),(37)), ou qu'il faille reconsidérer le rôle de cofacteurs

d'activation tels que le calcium cytoplasmique (38) nécessaire à l'activation du trypsinogène, ou

enfin que seule l'activation du trypsinogène ne suffit pas à induire une pancréatite aiguë.

Stress oxydatif. radicaux libres intra-acinaires :

Les radicaux libres oxygène ou ROI (anion superoxyde, eau oxygénée, radical libre oxygène) jouent un rôle très précoce, simultané à la co-localisation enzymatique, et délétère au cours de la pancréatite aiguë. Leur origine est complexe (39): mitochondries acinaires lésées, dérivés de la xanthine oxydase (40) (dont l'activité est accrue (41)), polynucléaires neutrophiles (42),(43).

Le stress oxydatif a été mis en évidence au cours de la pancréatite aiguë tant expérimentale qu'humaine et ceci de diverses manières (méthodes directes et indirectes). Les ROI eux-mêmes ont été détectés dans les cellules acinaires par une technique de chemiluminescence, à la fois chez l'homme (44) et expérimentalement, et ceci dès les premières minutes d'induction de la maladie (45),(46). Des dérivés de peroxydation lipidique membranaire tels que diènes conjugués et malondiaidhéhyde (MDA) ont été mesurés dans le même temps, à la fois dans le tissu pancréatique de modèles expérimentaux (47),(48), mais également dans le sérum de patients (49). D'autres arguments indirects d'un stress oxydatif consistent en une diminution par consommation des anti-oxydants physiologiques tels que vitamines A, E et C et sélénium (50),(51),(49), et en une augmentation du glutathion oxydé intra-pancréatique (48),(52).

Les ROI exercent leur action délétère par plusieurs mécanismes. Ils induisent des lésions majeures du cytosquelette cellulaire avec perturbation du transport intra-cellulaire, responsables pour une grande partie du blocage sécrétoire et de la co-localisation observés au cours de la PA.

Ils conduisent également à des lésions membranaires (par peroxydation lipidique) avec augmentation de la perméabilité et oedème secondaire (53),(42), ainsi qu'à la mort cellulaire (54). Les dérivés de peroxydation lipidique engendrés induisent une production de prostaglandines, leukotriènes et thromboxanes conduisant eux-mêmes à une modification de la microcirculation pancréatique et à une augmentation de la perméabilité vasculaire (55).

Les ROI sont également de puissants agents pro-inflammatoires, induisant la translocation nucléaire du NF-

B et la transcription secondaire dlL-1, de TNF-a et d'IL-6 ainsi que de chimiokines telles l'IL-8, le MCP-1 et le MOB-1, et de celles d'autres gènes cibles (56),(57).

Enfin, ils sont également de puissants facteurs chimiotactiques des polynucléaires neutrophiles (notamment par production de leukotriènes et d'IL-8) (55),(58),(59).

Ces divers effets des radicaux libres ont été démontrés dans plusieurs modèles expérimentaux,

et leur inhibition permet de limiter (sans abolir) la sévérité de la pancréatite aiguë expérimentale

(Tableau 5). Malgré leur rôle précoce et important dans le développement de la pancréatite

aiguë, ils ne suffisent pas à eux seuls à déclencher une pancréatite aiguë (60).

Tab/eau 5: Sommaire des études où la réduction de ia production ou ia chélation des radicaux libres ont été étudiées chez l'animal

Modulateur Modèle de PA Lésions Atteinte Auteur

« Scavenger » pancréatiques systémique Ilaire

SOD et catalase -céruléine/rat

-ND -Guice (61)

-céruléine/rat

-ND -Wisner (42)

-ischémie-reperfusion/rat

-ND -Koichiro (62)

-céruléine/rat

-ND -Schoenberg (63),(64)

-CDE/souris -pas effet -pas effet -Rutledge (65)

-taurocholate/rat

-ND -Schoenberg ( 66 )

OCT -céruléine/souris

-ND -Lüthen (67)

-céruléine/souris -pas effet -ND -Neuschwander-Tétri ( 68 )

Allopurinol -céruléine/rat

-ND -Wisner (69)

-CDE/souris

-ND -Niederau (70)

-CDE/souris -pas effet -ND -Lankisch (71)

Translocation nucléaire du NF- k B et régulation positive intra-acinaire de la transcription de chimiokines et cytokines ;

Une augmentation de la translocation nucléaire du NF-

B est observée précocement dans les cellules acinaires au cours de différents modèles expérimentaux de PA. In vivo, dès les dix à quinze premières minutes suivant l'induction d'une pancréatite aiguë par céruléine (72),(73), une phosphorylation de l'IxBa survient transitoirement dans un premier temps (après 30 minutes d'induction), et est suivie dans un second temps de la phosphorylation de I'I

BP (après trois heures). Il s'ensuit la translocation nucléaire du NF-

B1, de RelAp65 puis de NF-

B2. In vitro, ce phénomène est également objectivé dans les cellules acinaires isolées soumises à des stimulations supra-physiologiques de céruléine (72) ou de cholécystokinine (CCK) (74). Cette translocation est également objectivée durant la PA induite par ligature biliaire chez le rat (75) et de même pour celle induite par injection de taurocholate (76), et n'est donc pas liée directement à l'utiiisation de la céruléine ou de la CCK et semble survenir au cours de toute pancréatite aiguë.

Dans les cellules acinaires, cette translocation conduit essentiellement à une transcription de

TNF-a, dlL-1 et dlL-6 (observée dans l'heure (72)) mais également à celle de chimiokines

(observée dans les 30 minutes) telles MCP-1, MOB-1 et IL- 8 (plus tardivement) (74),(76), et de molécules d'adhésion comme ICAM-1 (77). Cette expression d'IL-1 et de TNF-a par la cellule acinaire pourrait être impliquée dans la stimulation des macrophages et leur propre production de cytokines pro-inflammatoires conduisant ainsi à l'amplification de la PA. La transcription de MCP-1 et MOB-1 pourrait être responsable du chimiotactisme des monomacrophages (voir chapitre 6 ) et celle d'IL -8 de celui des polynucléaires neutrophiles.

Il a été démontré récemment (78) que la transfection intra-pancréatique (via un adénovirus) de l'unité active (Adp65) du NF-

B suffit à induire des lésions acinaires, de l'oedème ainsi qu'une infiltration du pancréas et des poumons par des polynucléaires neutrophiles. Mais ces lésions inflammatoires pancréatiques ne sont pas accompagnées d'activation intra-acinaire du trypsinogène telle qu'on l'observe dans la pancréatite aiguë. De même l'activation sélective in vivo comme in vitro du NF-

B n'induit pas d'activation du trypsinogène (79). De plus, divers inhibiteurs de la translocation nucléaire du NF-

B testés in-vivo (NAC (72), PDTC (72), amobarbital (75)) réduisent la sévérité des différentes pancréatites aiguës expérimentales induites sans toutefois empêcher leur développement ni inhiber l'activation du trypsinogène (79). Ces différentes observations montrent que la translocation nucléaire du NF-

B seule ne suffit pas à expliquer toutes les étapes intra-acinaires qui surviennent au cours de la pancréatite aiguë. Enfin, la translocation du NF-

B n'est pas liée à l'activation du trypsinogène et peut survenir indépendamment de celle-ci (79).

Mort de la cellule acinaire:

L'étape finale de la lésion de la cellule acinaire est la mort. Elle peut survenir par deux mécanismes différents (80): nécrose (par les polynucléaires neutrophiles essentiellement) et apoptose (via le TNF-a, la voie Fas-Fas-Ligand et riFN-y).

Nécrose:

La nécrose survient quand la cellule est soumise à des agents toxiques ou à l'action des polynucléaires neutrophiles notamment. Au cours de ce processus, les composants et fonctions cellulaires sont lésés: perte de l'intégrité de la membrane cellulaire, arrêt des fonctions métaboliques (surtout dysfonction mitochondriale et arrêt d'activité des divers transporteurs).

Surviennent alors un gonflement des organelles intra-cytoplasmiques, une condensation de la

chromatine qui devient pycnotique et finalement une rupture de la membrane cellulaire avec

libération de son contenu. Cette rupture entraîne une réponse pro-inflammatoire locale avec phagocytose des débris par les monomacrophages.

Apoptose ou mort cellulaire programmée:

Contrairement à la nécrose, l'apoptose est un processus cellulaire actif, consommant de l'énergie. L'engagement de la cellule dans un programme d'apoptose est secondaire à l'activation de signaux pro-apoptotiques par le TNF-a, le Fas-L, nFN-y, un stress oxydatif (81) ou des agents toxiques ou pathogènes.

L'activation du programme cellulaire d'apoptose conduit à l'hydrolyse de l'ADN et à sa condensation. Finalement, le noyau et le cytoplasme se fragmentent, sans créer de lésion des organelles ni des membranes, et forment des corps apoptotiques. Cette formation n'engendre pas ou peu de phénomènes inflammatoires secondaires (80).

Facteurs oro-apoptotiaues: TNF-TNFR, Fas-Fas-L et IFN^:

La liaison du TNF soluble sur le récepteur RI induit le recrutement des protéines TRADD (TNF- R-Associated Death Domain) et FADD (Fas-Associated Death Domain) sur la portion appelée

« death domain » de ce récepteur. Ceci conduit au signal apoptotique via une activation de la caspase 8 , au relargage du cytochrome c par les mitochondries induisant leur dysfonctionnement, et à l'activation de la caspase 3 (82).

La liaison du Fas-L sur son récepteur Fas ou CD95 induit une trimérisation de celui-ci et la liaison de son « death domain » à la protéine FADD qui active alors la caspase 8 et entraîne l'apoptose cellulaire (82).

Le récepteur Fas est exprimé de façon ubiquitaire à la fois sur les cellules lymphoïdes et non-

lymphoïdes, y compris les cellules acinaires. Le Fas-L quant à lui est essentiellement exprimé par

les lymphocytes T activés (CD4+ surtout et CD 8 - 1 -), les macrophages et les Naturel Killer ainsi

que constitutivement par les cellules des organes présentant un "privilège immun" soit la rétine

et les cellules de Sertoli. La liaison du Fas-L au Fas est importante dans le contrôle de

l'homéostasie du système lymphoïde: ainsi elle contrôle la croissance et l'expansion des clones

de lymphocytes T activés, des lymphocytes B, et enfin, en feed-back négatif, elle limite

l'expansion des cellules APC les ayant activés. Le Fas-L constitue une des voies de cytotoxicité

des lymphocytes T, CD4+ principalement et CD 8 + dans une moindre mesure.

L'Interféron gamma possède également des propriétés pro-apoptotiques qui s'exercent selon plusieurs mécanismes: activation directe des gènes impliqués, augmentation de l'expression du Fas en surface des lymphocytes T et des macrophages, production de NO via une augmentation de la transcription de la NO synthase inductible.

Mort acinaire au cours de la pancréatite aiauë:

Au cours de la pancréatite aiguë, des cellules acinaires meurent en apoptose et en nécrose suivant des proportions variables. De nombreux arguments expérimentaux démontrent que plus la pancréatite est sévère plus la nécrose est importante et inversement (83). Ainsi, dans des modèles de sévérité modérée (obstruction du canal pancréatique et administration de céruléine chez le rat), on observe majoritairement de l'apoptose acinaire. Au contraire, dans les modèles plus sévères (ligature du canal pancréatique chez l'opposum, induction par céruléine ou diète CDE chez la souris), la nécrose acinaire est prépondérante et peu de cellules apoptotiques y sont détectées. De plus, le blocage expérimental de l'apoptose acinaire dans un modèle de sévérité modérée chez le rat aggrave de façon significative les lésions pancréatiques avec une augmentation de la nécrose acinaire et de l'infiltrat polynucléaire (84) .

Les polynucléaires neutrophiles jouent un rôle prépondérant dans la nécrose des cellules acinaires. En effet, la déplétion en polynucléaires par injection d'anticorps monoclonaux (85) et l'inhibition de l'invasion pancréatique par ces derniers (soit par injection d'anticorps anti-ICAMl ( 86 ) ou par l'usage de souris ICAM-1 knock-out (87)) résultent en une diminution de la sévérité de la pancréatite aiguë, de l'infiltrat par PMN, de la nécrose acinaire et en une augmentation du nombre des cellules acinaires apoptotiques.

Les cellules acinaires sont capables in vivo mais également au cours de la pancréatite aiguë

expérimentale de synthétiser le TNF-a ainsi que ses récepteurs. La liaison du TNF-a sur ses

récepteurs induit l'apoptose acinaire tant en culture in vitro qu'in vivo au cours de la pancréatite

aiguë ( 88 ).

2.2 PHENOMENES EXTRA-ACINAIRES ;

Invasion du parenchyme pancréatique par les monomacrophaaes et polynucléaires neutrophiles :

Secondairement à la production de chimiokines (MCP-1, MOB-1), des monomacrophages vont envahir le parenchyme pancréatique. Ils y seront activés notamment par les ROI, le TNF-a, l'IL- 1 et deviendront le siège d'une augmentation de la translocation nucléaire du NF-

B suivie d'une transcription des gènes cibles. Ceux-ci incluent des chimiokines et des cytokines pro­

inflammatoires (IL-1, TNF-a, IL- 6 , MCP-1, IL- 8 ) qui seront à leur tour responsables de chimiotactisme et d'activation d'autres mono-macrophages, de chimiotactisme des polynucléaires neutrophiles (via l'IL- 8 ) (voir chapitres 4, 5, 6 ). Tous ces facteurs jouent un rôle primordial dans l'amplification de la cascade pro-inflammatoire de la pancréatite aiguë au niveau local, mais également dans le développement de la réponse systémique inflammatoire.

Plusieurs études expérimentales ont montré que la pacification des monomacrophages (en administrant prophylactiquement du CNI1493 (89), un bloquant de la production de NO et de la transcription de TNF-a et d'IL-ip par les monomacrophages) diminuait significativement la sévérité des pancréatites aiguës ainsi que celle des lésions pulmonaires secondaires et de la mortalité induite.

L'invasion du parenchyme pancréatique par les polynucléaires neutrophiles est également observée dès les premières heures suivant l'induction d'une pancréatite aiguë expérimentale.

Celle-ci est principalement exercée par les radicaux libres, les dérivés de peroxydation membranaires, le PAF, llL -8 mais nécessite également l'expression de molécules d'adhésion intra-pancréatiques (notamment ICAM-1). Ces polynucléaires seront responsables en grande partie de la nécrose acinaire, mais également d'une libération de NO et de radicaux libres entraînant une boucle pro-inflammatoire d'activation des cellules précédemment décrites, non seulement au niveau du pancréas mais aussi du foie et des poumons.

Piatelet-Activatinq Factor :

Le PAF ou Platelet-Activating Factor est un médiateur phospholipidique, produit de la

transformation de phospholipides membranaires par la phospholipase A2 principalement au

niveau des plaquettes, des cellules endothéliales, des monomacrophages, des polynucléaires

neutrophiles et des éosinophiles (90),(91). Son expression précoce au cours de la pancréatite

aiguë, dans un premier temps par les cellules acinaires et par les plaquettes a été démontrée expérimentalement (92),(85). Des taux accrus de PAF sont également mesurés dans le sang et dans le parenchyme pulmonaire (92).

Le PAF a plusieurs mécanismes d'action (90). Il conduit à des altérations vasculaires (lésions endothéliales, augmentation de la perméabilité vasculaire, vasodilatation) ainsi qu'à l'activation de la coagulation et la CIVD (coagulation intra-vasculaire disséminée). Il est également un puissant agent chimiotactique, activateur (dégranulation, notamment d'élastase) et inducteur de l'adhésion des polynucléaires. Il induit également la translocation nucléaire du NF-

B et la transcription de cytokines pro-inflammatoires telles le TNF-a et l'IL-1.

Son rôle délétère, tant au niveau local que systémique (SIRS, lésions pulmonaires), a été démontré expérimentalement. Ainsi, l'administration prophylactique et thérapeutique d'antagonistes du PAF réduit expérimentalement la sévérité (locale et systémique) de la pancréatite aiguë (93),(94), et diminue l'infiltrat par polynucléaires (85). Inversement, l'injection intra-artérielle de PAF exogène induit des lésions similaires à la pancréatite aiguë (95), et son administration intraveineuse simultanée à l'induction d'une pancréatite en aggrave les lésions (96).

Chez l'homme, l'utilisation d'antagonistes du PAF (Lexipafant) dans la pancréatite aiguë sévère a été testée dans une étude multicentrique (97), sur base de résultats préliminaires encourageants. Dans l'ensemble, les résultats ont été négatifs mais suggèrent que si efficacité il y a, c'est dans les premières heures après le début des symtomes.

Activation du complément et de la bradvkinine :

Le système du complément peut être activé par la trypsine, et conduit entre autres à la formation de C3a et C5a qui augmentent la perméabilité vasculaire et la libération d'histamine par les mastocytes et basophiles. La trypsine peut également activer le système kallikréine- kinine .

NO :

La production intra-pancréatique de NO ou oxyde nitrique est augmentée dans la pancréatite

aiguë. Cette augmentation provient d'une part d'une libération par les polynucléaires

neutrophiles et les macrophages mais également d'une induction de la transcription de la NO

synthase inductible (iNOS ou NOS-2) intra-pancréatique (98). Cette augmentation de

l'expression de la INOS est essentiellement observée dans les cellules endothéliales et est exercée par la translocation nucléaire du NF-

B et probablement par l'IFN-y (99), Le NO secondairement libéré semble jouer un rôle protecteur puisqu'en bloquant sa synthèse dans des modèles expérimentaux (notamment par administration de LNAME, ou par utilisation de souris génétiquement déficientes en iNOS), on aggrave la sévérité de la pancréatite aiguë (100),(101).

A l'opposé, l'administration de donneurs de NO diminue les lésions pancréatiques (102). Cet effet protecteur du NO semble être lié au maintien d'une micro-perfusion pancréatique contrecarrant les phénomènes d'ischémie-reperfusion, et à l'inhibition de l'adhésion et du chimiotactisme des polynucléaires (103),(104).

Cellules étoilées;

Les cellules étoilées du pancréas (voir chapitre 3.4) jouent un rôle majeur dans le développement de la fibrose de la pancréatite chronique (PC). Récemment (105),(106), la démonstration expérimentale in vitro de leur capacité à produire des chimiokines telles MCP-1 , IL -8 et RANTES et des cytokines telles TNF-a, IL-ip et IL -6 dans les quatre heures suivant une stimulation par TNF-a et IL-ip donne ainsi à ces cellules un rôle potentiel dans la cascade pro­

inflammatoire de la pancréatite aiguë.

Enfin, leur synthèse des composants de la matrice extra-cellulaire après activation par le PDGF, le TGF-p et les ROI les impliquent dans la phase de régénération qui suit la pancréatite aiguë.

Substance P:

La substance P est un petit peptide composé de onze acides aminés. Il est sécrété par les terminaisons nerveuses de tous les tissus et agit via des récepteurs membranaires appelés NKIR. Ces récepteurs sont présents sur la membrane des cellules acinaires (mais pas chez toutes les espèces animales) et y stimulent la production de zymogènes (107). Le rôle majeur de la substance P est la médiation de la douleur, mais elle possède également des propriétés pro-inflammatoires. En effet, au niveau des cellules endothéliales, la substance P induit la création de pores entre les cellules adjacentes conduisant à une extravasation, à un œdème interstitiel et à une infiltration polynucléaire ( 21 ).

Au cours de la pancréatite aiguë expérimentale, on observe à la fois une augmentation de la

production de la substance P intra-pancréatique et de l'expression de ses récepteurs sur les

cellules acinaires (107),(108). Elle joue un rôle important dans le développement de la cascade

pro-inflammatoire puisque la déficience en récepteur NKRl (souris KO) diminue la sévérité des

lésions pancréatiques et pulmonaires (107). A l'inverse l'inhibition de la dégradation de la

substance P aggrave ces lésions.

2.3 REPONSE SYSTEMIQUE ;

L'activation des différents types cellulaires et la libération des médiateurs pro-inflammatoires précités, principalement dans la circulation portale puis systémique, conduit à une réaction systémique inflammatoire et éventuellement à une faillite multi-organique. Cette amplification semble être essentiellement réalisée par les cellules de Kupffer hépatiques (ou macrophages résidents du foie) qui sont activées par les médiateurs pancréatiques précités, et fabriquent à leur tour des protéines de la phase inflammatoire (IL -6 et CRP) et des cytokines pro- inflammatoires (surtout TNF-a et IL-1), impliquées dans le développement du SIRS et de l'ARDS.

La transcription intra-hépatique de TNF-a et dlL-1 a été objectivée expérimentalement dans divers modèles d'induction et survient après la transcription intra-pancréatique de ces cytokines (109). Expérimentalement, le blocage des cellules de Kupflfer par du Gadolinium diminue les taux sériques de cytokines pro-inflammatoires ainsi que les lésions pulmonaires sans modifier la sévérité des lésions pancréatiques ( 110 ),( 111 ); de même, la réalisation d'un shunt porto-cave réduit l'ARDS (112).

Le PAF joue également un rôle important dans le développement du SIRS et de l'ARDS, en augmentant la perméabilité capillaire, en induisant une vasodilatation (avec hypotension secondaire) et en amplifiant la cascade pro-inflammatoire (113).

La principale complication pulmonaire secondaire à une pancréatite aiguë est l'ARDS. Comme pour le choc septique, c'est le foie qui est le principal relais impliqué dans le développement de ces lésions (112),(110),(111). En effet, les différents médiateurs libérés dans la circulation systémique sont responsables de la transcription dlCAM-1 par les cellules endothéliales, d'activation des macrophages alvéolaires, d'invasion et d'activation des polynucléaires neutrophiles au sein du parenchyme pulmonaire. Ces derniers sont responsables en majeure partie des lésions d'ARDS.

Expérimentalement, la transcription pulmonaire d'ICAM-1 précède l'infiltration du parenchyme

par les PMN (114),(115). La neutralisation d'ICAM-1 par anticorps monoclonaux (116),(114) ou

la déficience en ICAM-1 (87) réduisent l'invasion parenchymateuse par les polynucléaires ainsi

que la sévérité de l'ARDS. Les polynucléaires exercent leur toxicité par différents

mécanismes via la libération de ROI et d'élastase. Cette dernière est une protéase qui en plus

de ses propriétés enzymatiques (lésions endothéliales, lyse de la matrice extracellulaire, clivage

de protéines plasmatiques (117)) induit la phosphorylation de IKB-p et secondairement la translocation nucléaire du NF-

B dans les macrophages (118),(119).

Les macrophages intra-alvéolaires activés au cours de la pancréatite aiguë synthétisent des cytokines et chimiokines pro-inflammatoires perpétuant le cercle vicieux inflammatoire et incluant notamment de nL-8 impliqué dans l'invasion par les PMN (120). Le blocage (par le PDTC) de la translocation nucléaire du NF-

B secondaire à l'injection d'élastase (118) ou à une pancréatite induite par taurocholate (121) diminue la sévérité de TARDS.

Le PAF participe également à la physiopathogénie de TARDS (122),(123) en augmentant la

perméabilité capillaire (avec oedème secondaire), en induisant une vasodilatation, et surtout par

chimioattraction, activation et dégranulation d'élastase par les polynucléaires neutrophiles (117).

2.4 PHASE DE REGENERATION:

La phase de régénération ou de réparation du pancréas, secondaire aux dommages causés par un épisode de pancréatite aiguë, n'est pas encore bien connue, mais consiste en l'extinction de la cascade pro-inflammatoire et en la restauration du parenchyme détruit. Cette phase pourrait constituer un continuum vers le développement de la pancréatite chronique en cas de non contrôle ou d'exacerbation des phénomènes qui s'y produisent.

Expérimentalement, les phénomènes de régénération ont été les plus étudiés après un épisode de pancréatite aiguë sécrétagogue induit par administration de céruléine (voir chapitre 9.1).

Après un seul épisode de cette PA chez la souris, on observe une restauration complète du parenchyme pancréatique dans les quinze jours qui suivent.

Au cours de cette phase, on observe une phagocytose des cellules acinaires nécrosées par les monomacrophages et une prolifération des cellules acinaires résiduelles. Celle-ci survient dès le deuxième jour avec un pic maximal de mitoses entre le quatrième et le septième jour (124).

Cette activité mitotique est concomitante à une augmentation de l'expression de l'Insulin Growth Factor ou IGF par les cellules étoilées et de l'Epidermal Growth Factor ou EGF ainsi que de leurs récepteurs sur les cellules acinaires (125),(126). Un pic tardif (au septième jour) de TGF-p, produit par les cellules acinaires elles-mêmes ainsi que les cellules étoilées et ductales, pourrait être un signal de contrôle négatif de cette prolifération, évitant son emballement et assurant une restitution adéquate du nombre des cellules acinaires (127).

Deux pics successifs de TGF-p sont observés au cours de la phase de régénératbn. Le premier, survenant après 24 à 48 heures, est constitué par une libération plaquettaire (sans transcription) suivie de sa transcription par les cellules acinaires, ductales, inflammatoires et étoilées (128). Une prolifération des cellules étoilées est observée de façon maximale dans les 48 premières heures après l'induction de la pancréatite aiguë et est le plus probablement attribuable au PDGF ainsi qu'au CTGF ou « downstream factor » du TGF-p. Le second pic de TGF-p survient au septième jour et est majoritairement constitué d'une transcription par les cellules étoilées (126),(127). Parallèlement aux pics d'expression du TGF-p, une activation des cellules étoilées ainsi qu'une synthèse de collagène I, III et de fibronectine survient (129),(128).

En réponse au stimulus par le TGF-p les cellules étoilées produisent non seulement du TGF-p

mais également ses récepteurs de type I et II constituant ainsi une boucle auto-stimulatrice

(130). Enfin, le TGF-p possède aussi des propriétés anti-inflammatoires, notamment la

désactivation des macrophages, par lesquelles il pourrait amener l'extinction de la cascade pro­

inflammatoire.

La destruction du collagène nouvellement synthétisé débute dès le septième jour pour disparaître complètement dans les quinze jours (129). Cette destruction est réalisée notamment par les métalloprotéinases MMP2 et 3 dont on observe un pic d'expression entre 2 et 4 jours après l'induction d'une PA (131).

Tous ces événements aboutissent à une restauration ad integrum du parenchyme pancréatique, par une balance équilibrée entre ces différents phénomènes.

En revanche, si ces mécanismes de réparation perdurent, s'ils sont exagérés ou si des épisodes

répétés de lésions acinaires surviennent avant la restitution (modèle de pancréatite chronique

expérimentale induit par PA sécrétagogues à répétition, chapitre 9.3), on assiste à un

emballement des phénomènes de réparation conduisant aux lésions de pancréatite chronique.

3 PANCREA TITE CHRONIQUE ET FIBROSE PANCREA TIQUE /

La pancréatite chronique est une entité complexe dont les mécanismes ne sont à ce jour que partiellement élucidés et encore sujets à controverse. De plus, la mise en évidence des cellules étoilées, ces « new stars of chronic pancreatitis (132)» (voir chapitre 3.4), dans le parenchyme pancréatique bouleverse en partie certaines théories et ouvre de nouvelles perspectives, notamment thérapeutiques.

La pancréatite chronique est caractérisée par des critères à la fois histo-morphologiques et fonctionnels. Morphologiquement, la PC se caractérise par une atrophie acinaire (focale ou diffuse), une fibrose péri-acinaire, péri-ductale et interlobulaire associées à des dilatations des canaux pancréatiques (elles-mêmes le plus souvent secondaires à des sténoses de ces canaux ou à des bouchons protéiques plus ou moins calcifiés obstruant ceux-ci), ainsi qu'à un infiltrat inflammatoire (mono-macrophages, polynucléaires neutrophiles, lymphocytes T, NK). Ces lésions acinaires et ductales conduisent à une insuffisance exocrine et endocrine (133).

Les principales causes de PC sont: éthylique (surtout dans les pays occidentaux), héréditaires (mutations du trypsinogène cationique, mutations de SPINK-1, mutations du CFTR), obstructives (anomalie congénitale, tumeur bénigne ou maligne, fibrose, cicatrice), tropicale, toxiques ou encore idiopathiques (forme juvénile et forme du sujet âgé) quand aucune étiologie n'a pu être identifiée,...

Les diverses hypothèses physiopathogéniques reconnues actuellement ne sont pas exclusives et

jouent probablement des rôles complémentaires et plus ou moins simultanés dans le

développement des lésions de pancréatite chronique. Ces diverses hypothèses sont exposées ci-

après et impliquent toutes de façon primaire ou secondaire différents acteurs cellulaires intra-

pancréatiques (Figure 2, modifiée d'après une illustration de Freedman (134)).

Figure 2: Acteurs cellulaires intra-pancréatiques impliqués dans le développement de la

pancréatite chronique

3.1 LITHOGENESE CANALAIRE ET SEQUENCE « NECROSE-FIBROSE

Ces deux théories, les plus anciennes, émettent des hypothèses physiopathogéniques diamétralement opposées.

La théorie de la lithogenèse canalaire pose l'hypothèse que le primum movens est la formation de bouchons protéiques dans les canaux pancréatiques survenant à la faveur d'une modification de la composition du suc pancréatique, par exemple secondairement à la consommation d'alcool, ou à un déficit de production de bicarbonate dans la mucoviscidose. Ces bouchons finissent par obstruer les canaux, engendrant ainsi une réaction inflammatoire péri-ductale qui aboutit à la destruction de son épithélium et à la fibrose péricanalaire secondaire. Cette théorie défend un mécanisme n'impliquant en rien la pancréatite aiguë dans le développement de la pancréatite chronique (135).

A l'inverse, la théorie de la séquence « nécrose-fibrose » postule que la nécrose du parenchyme survenant au cours de la pancréatite aiguë conduit à des mécanismes de réparation excessifs et à la formation de cicatrices et de fibrose intra-parenchymateuses (136),(137). Les canaux enserrés par la fibrose (induisant leur sténose et leur dilatation secondaire) n'évacuent plus normalement le suc pancréatique, conduisant ainsi à des précipitations de bouchons protéiques qui peuvent secondairement se calcifier. Cette théorie est basée sur l'observation au sein du parenchyme de patients présentant une pancréatite chronique éthylique de zones de lésions histologiques correspondant à la fois à celles de pancréatites aiguë et chronique (138), et est également étayée par des données épidémiologiques. Cette hypothèse est actuellement renforcée par les mécanismes invoqués dans le développement de la pancréatite chronique héréditaire secondaire à une mutation du gène du trypsinogène cationique ou à une mutation du gène du SPINK-1 entraînant une activation intra-acinaire prématurée du trypsinogène, induisant des épisodes répétés de pancréatite aiguë puis l'évolution vers la pancréatite chronique (139).

3.2 TOXICITE DE L'ALCOOL ET DE SES METABOLITES :

Le facteur le plus fréquemment associé à la pancréatite chronique dans les pays occidentaux est

l'alcool, et sa toxicité s'exerce via plusieurs mécanismes. Elle est liée à la fois à la cytotoxicité

de l'alcool lui-même, de son principal métabolite l'acétaldhéhyde, des radicaux libres que son

métabolisme génère ainsi que par la peroxydation des lipides membranaires. La consommation

d'alcool induit également une diminution du débit sanguin intra-pancréatique qui conduit non

seulement à l'ischémie du parenchyme mais aussi aux phénomènes d'ischémie-reperfusion.

Ceux-ci entraînent une stimulation des cellules inflammatoires, induisent une cytotoxicité directe via les radicaux libres produits et stimulent les cellules étoilées. L'alcool modifie également la composition du suc pancréatique aboutissant à une précipitation de carbonate de calcium intra­

canalaire, et ceci à la fois via une diminution de la transcription et de la sécrétion de lithostatine (protéine synthétisée par la cellule acinaire et dont le rôle est de prévenir la précipitation du carbonate de calcium (140),(141)), via une diminution de la concentration en citrates et bicarbonates, et via une augmentation de la sécrétion acinaire protéique basale (142). Enfin, l'alcool, l'acétaldhéhyde et les radicaux libres générés par son métabolisme sont de puissants stimulateurs des cellules étoilées du pancréas entraînant leur activation et la synthèse de collagène (143).

L'alcool seul ne semble pas suffire à induire une pancréatite chronique. Il nécessite la présence d'un terrain de susceptibilité ou celle de co-facteurs, comme démontré épidémiologiquement chez l'homme, puisque tous les patients en abusant chroniquement ne développent pas de pancréatite chronique.

3.3 ISCHEMIE ET ISCHEMIE-REPERFUSION PANCREATIQUES :

Plus récemment, des travaux expérimentaux ont démontré que l’ischémie pancréatique (par atteinte vasculaire directe ou par hyperpression intra-parenchymateuse) jouait un rôle important dans la physiopathogénie de la pancréatite chronique.

L'ischémie pancréatique peut induire des lésions de pancréatite chronique : en effet, dans un modèle expérimental de micro-embolisation de l'artère splénique chez le rat, l'ischémie pancréatique induit dans un premier temps une pancréatite aiguë sévère avec nécrose acinaire et graisseuse, évoluant ensuite en pancréatite chronique sans récidive de poussée aiguë (144).

Mais l'ischémie semble être plus importante dans la perpétuation des lésions chroniques que

leur phase initiale. Dans un modèle de pancréatite chronique obstructive chez le chat

(145),(146), le débit intra-pancréatique basal est réduit presque de moitié, et chute encore lors

de la stimulation sécrétoire des acini, en opposition au pancréas normal où le débit augmente

pour faire face à la demande métabolique accrue. A l'état basal, la réduction du débit intra-

pancréatique peut s'expliquer à la fois par une diminution de la vascularisation au sein des

zones fibrotiques (par diminution de la densité des vaisseaux dans la fibrose) et à une

augmentation de la résistance vasculaire secondaire à une élévation de la pression intra­

parenchymateuse du pancréas fibrosé qui perd sa compliance (phénomènes également observés dans la pancréatite chronique humaine (147),(H8),(149)). La pression intra-pancréatique s'élève encore durant la stimulation sécrétoire (repas, CCK) par manque de compliance et de distensibilité du parenchyme, et induit ainsi une nouvelle augmentation de la résistance vasculaire avec diminution secondaire du débit. « Plus on stimule, plus on ischémie », une observation à mettre en rapport avec les douleurs post-prandiales typiques de la PC humaine.

Cette hypoperfusion pancréatique entraîne à son tour une ischémie cellulaire et perpétue ainsi la cascade pro-inflammatoire de la pancréatite chronique. La reperfusion du parenchyme ischémié entraîne la formation et la libération de radicaux libres, de dérivés de peroxydation lipidique membranaire, de TNF, d'IL-1, d'IL -6 et d'IL -8 entre autres responsable de la chimioattraction de polynucléaires neutrophiles dans le tissu reperfusé.

3.4 CELLULES ETOILEES :

Les cellules étoilées du pancréas, similaires aux cellules étoilées du foie encore dénommées cellules de Ito, ont été récemment mises en évidence dans le parenchyme pancréatique à l'état basal mais également au sein des lésions de pancréatite chronique où elles semblent jouer un rôle majeur dans le développement de la fibrose (150),(151). Ces cellules, résidentes du pancréas, sont localisées autour des acini qu'elles enserrent, ainsi que dans les espaces inter­

lobulaires (Figure 3 d'après Apte (150)).

Figure 3: Immunomarquage par desmine des cellules étoilées du pancréas (ou PSC)