Par
TULLER Sylvain GUILLOT Sandrine
L’alimentation des animaux de laboratoire
Dominique MARTEL Ingénieur Zootechnicien
Responsable Technique et Qualité SAFE dmartel@safe.evls.net
Introduction
Contraintes de l’alimentation d’un animal de laboratoire :
– Couvrir ses besoins nutritionnels
– Consommer un produit appétant et constant dans le temps
– Lui fournir un produit stable au stockage
– Consommer un produit n’interférant pas avec les protocoles (contaminants,…)
Lewis en 2006 « Le statut nutritionnel des
animaux utilisés dans les protocoles a beaucoup
d’influence sur les résultats de l’essai »
Introduction
Pour faire un aliment répondant à ces critères, il faut le :
1) Formuler (créer la recette alimentaire) 2) Fabriquer la recette alimentaire
3) Contrôler la fabrication jusqu’au produit fini
Un aliment constant et sécurisé
1. Quelques rappels sur l’environnement de l’aliment pour animaux de laboratoire
1.1 Le paquet « hygiène »
1.2 Les exigences clients
1.3 Conséquences
Vue d’ensemble de la réglementation « Hygiène »
1.1 Le paquet « hygiène » alimentations humaine et animale
Objectif d’assurer la sécurité des aliments pour animaux et des denrées alimentaires,
de la « fourche à la fourchette ».
Objectif :
assurer la sécurité des aliments pour animaux et des denrées
alimentaires,
de la « fourche à la fourchette »
Donc garantir les mêmes exigences aux animaux de laboratoire
Traité CE
« Règles fondamentales »
Règl. 178/2002 Obligation des Etats
« Contrôles officiels » Règl. 882, 854/2004,…) Obligation des entreprises
« Food » : Règl/ 852 et 853 /2004
« Feed » : Règlement 183/2005Quelques mots sur l’HACCP…
HACCP : Méthode d’analyse des risques…
… visant à déterminer les points critiques essentiels à maîtriser… … pour garantir la sécurité alimentaire.
Réalisation d’une analyse des dangers
(physiques, chimiques, biologiques)
Après évaluation du risque, détermination des points critiques
Maîtrise des points critiques identifiés.
1.1 Le paquet « hygiène »
1.2 Les exigences clients
F
ormule alimentaire stable :
- Pérennité des fournisseurs - Constance de la formule - Neutralité de la formule
- Adaptation des formules aux enjeux régimes spéciaux
Process de fabrication:
- Constant
- Sécurisé et maîtrisé
- En ligne avec les exigences BPL/ BPF - Non contaminant
1.3 Conséquences - La réglementation Feed doit être appliquée : identification et traçabilité des produits
Le site fabricant doit être agréé par les services vétérinaires : n°
d’agrément doit apparaître sur l’emballage (exemple SAFE Augy : α FR 89 023 01)
Étiquetage sur le sac de l’adresse responsable de la mise en marché du produit s’il est différent de l’adresse du fabricant
Étiquetage obligatoire : liste des ingrédients, valeurs
nutritionnelles (protéines, lipides…), date de péremption, mode d’emploi du produit
L’importation d’aliment d’un pays hors UE est soumis à la même réglementation
Transparence + Traçabilité = pré-requis à la
fourniture d’aliment
2.1 Les bases de la formulation
FORMULATION EXIGENCES DU MARCHE
DONNEES SCIENTIFIQUES
DONNEES INDUSTRIELLES
ACHATS
Matières premières
QUALITE
Matières premières
•Constance des incorporations des matières premières
•Constance de la qualité des matières premières
•Constance des nutriments
Formules fixes
•Répondre aux exigences nutritionnelles des animaux : pas de carence et pas d’excès (masquer ou activer des réactions
animales)
•Qualité et Sécurité Alimentaire
•Minimisation, voire absence d’interférence avec les protocoles expérimentaux
•Simplicité et praticité d’utilisation
Neutralité et sécurité des aliments
2.2 Les exigences du marché laboratoire
• Aliment standard sans préparation de l’animal via la voie alimentaire
Formules standards: A04, A03
•Aliment standard avec de faibles variations inter lot
Formules standards certified A04C
Aliment standard : satisfait aux besoins généraux avec la variabilité naturelle des matières premières
2.2 Les exigences du marché
•Préparation de l’animal par voie alimentaire : diabète, carence en sélénium,
Régime spécial
(ou Purified diet): high fat, vitamin deficient…
• Aliment support pour l’apport de principes actifs : médicaments, alicaments, arômes, toxines…
Régime spécial
Le régime permet d’augmenter la maîtrise de la
variabilité, mais possibilité d’induire des carences par l’incorporation de matières premières très ciblées, et
dépourvues de certains éléments (Chrome, Vanadium…)
2.2 Les exigences du marché
Composition comparée aliments standards et régimes 2.2 Les exigences du marché
Glucides
Lipides
Minéraux- Vitamines Céréales- Fourrages
8-15%
Huiles-graisse
Correcteur 2-3%
Soja, poisson, viande
Mélange Complet Caséine
Huiles- graisse Amidon, dextrose.
Cellulose pure
Protéines
•Connaissance des exigences spécifiques des espèces
Chien : carnivore, amidon gélatinisé…
Lapin : qualité des fibres, faible niveau d’amidon, pas d’excès des protéines, caecotrophie….
Cobaye : vitamine C
Rongeurs : omnivores, niveau d’amidon, niveau des minéraux
•Connaissance des exigences des espèces animales :
Appétence
Digestibilité
Consommation journalière
2.3 Les données scientifiques
•Connaissance des stades des espèces
Animaux reproducteurs (allaitant, gestant)
Animaux en croissance
Animaux en maintenance
•Les prescriptions des différentes instances travaillant sur les animaux de laboratoire
Les tables NRC (National Research Council) :
http://www.nap.edu/catalog.php?record_id=4758, Nutrient Requirements of Laboratory Animals, Fourth Revised Edition, 1995
FELASA, AFSTAL, GV Solas, BCLAS, AALAS…
Les recommandations des organismes
spécialisés en zootechnie :
INRA, Universités…2.3 Les données scientifiques
2.3 Les données scientifiques : premiers critères de formulation des glucides
Glucides rapides : effet lipogénique engraissement des animaux
Glucides lents : bonne source énergétique
Carnivores : apporter des glucides faciles à digérer étant donné la durée de digestion (7 heures), capacité amylasique réduite
Herbivores Monogastriques : éviter les excès car risque de Dysmicrobisme caecal
Apport de glucides fibreux pour faciliter le transit intestinal Amidon et céréales
2.3 Les données scientifiques : premiers critères de formulation des lipides
Les matières premières riches en Glucides apportent 2-3% de lipides
Les matières premières riches en Protéines apportent 2-20% de lipides
Lipides d’origine végétale et / ou d’origine animale (poisson, farine de viande) saturés / insaturés
Herbivores Monogastriques : éviter les excès car risque de Dysmicrobisme caecal
Toutes les MP contribuent aux apports lipidiques,
grande diversité des sources de lipides
2.3 Les données scientifiques : premiers critères de formulation des protéines
Toutes les matières premières standardisées apportent des protéines, mais en quantité insuffisante
La forme de l’apport complémentaire dépend de l’espèce :
Monogastriques Herbivores : fourrage (luzerne) et tourteau (colza, tournesol, soja)
Monogastriques Omnivores : essentiellement tourteau et poisson
Carnivores : protéines animales (viande et poisson)
•En général, peu de modification des besoins alimentaires
•Modifications comportementales : sensibilité plus grande des animaux aux variations des facteurs de milieu
souches consanguines!•Si sous-consommation des animaux : enrichissement des niveaux nutritionnels et / ou modification du diamètre de l’aliment granulés
4 mm= meilleure préhension•Si sur-consommation : diminuer la disponibilité des aliments par le rationnement ou augmenter le diamètre de l’aliment granulé
dureté plus élevée2.3 Les données scientifiques :
Transgènes et Alimentation
Connaissance des fournisseurs :
Fiabilité et rigueur de leur process
sélection et audit, qualité microbiologique, stabilité du process Facilité des approvisionnements
proximité des marchés d’approvisionnement : régional ou national Capacité d’adaptation des fournisseurs : exigences spécifiques possibles
cahier descharges spécifiques au marché des animaux de laboratoire
2.4 La qualité des matières premières :
la clé du succès
Connaissance de la qualité nutritionnelle :
Facteur anti nutritionnel,
le coton-Gossypol, Seigle- ergot de seigle, facteurs allergènes…Substances indésirables liées au process de stockage, transformation :
mycotoxines, mélamine dans le gluten de blé, métaux lourds dans les oligo-éléments, …
2.4 La qualité des matières premières :
la clé du succès
Connaissance de la qualité nutritionnelle :
Valeurs nutritionnelles : digestibilité des
matières premières
tourteau soja > tourteau tournesol ou colza…Variabilité des valeurs nutritionnelles :
les sous- produits de l’alimentation humaine sont plus variables que les ingrédients destinés au marché spécifique del’alimentation animale, …tourteau soja > tourteau
secondaire (colza, tournesol…), gluten de maïs > germes de maïs….
2.4 La qualité des matières premières :
la clé du succès
Les besoins nutritionnels des animaux : protéines, calcium, …
Le bien être des animaux : adaptation stade physiologique, nutri-santé…
L’environnement : qualité des fèces pour les litières
Les contraintes et exigences de l’expérimentation animale : maximaliser la neutralité de l’aliment sur les études
Les capacités industrielles du site de fabrication
Qualité et disponibilité des matières premières : contaminants, variabilité, digestibilité, mycotoxines…
Les exigences réglementaires
L’aliment n’est pas qu’une simple recette alignant des matières premières et des nutriments
2.6 Conclusion : à retenir
Un aliment neutre dans le protocole expérimental c’est :
Interdiction de reformulation (changement d’ingrédients)
Matières premières stables biochimiquement
Interdiction d’incorporer des produits susceptibles de « souiller » la chaîne de fabrication : pas de graisses, pas de liquides, pas
d’enzymes, mélasse…
Interdiction d’incorporer des principes actifs induisant des effets : enzymes, arômes, colorants…
2.6 Conclusion :
3.1 les xénobiotiques
3.2 les xénobiotiques surveillés en alimentation des animaux de laboratoire
3.3 un xénobiotique non nutritif des MP : les phyto-œstrogènes 3.4 les mycotoxines : un contaminant des MP
3.5 les principes actifs : des xénobiotiques issus du process de fabrication
3.6 L’acrylamide : un xénobiotique issu du process d’autoclavage 3.7 un biais sous estimé : la technologie des aliments
3.8 les biais alimentaires au cours du protocole
3. Les principaux biais dans les aliments
pour animaux de laboratoire
•Il s’agit de substances étrangères à l’organisme
•Leur origine peut être naturelle (théobromine) ou accidentelle (contamination)
•Leur expression est variable pour chacun : effet dose,
accumulation dans l’organisme, élimination facile ou pas…
•Effets très divers :
perturber le comportement de l’animal (excitant, perte d’appétence…)
créer des troubles physiologiques ou métaboliques (avortement, néphrologie, neurotoxique…)
provoquer des pathologies (cancer…)
activer ou inhiber les effets d’autres composés
3.1 Les xénobiotiques
•Matières premières : au champ, au stockage, au process de transformation (contaminant chimique, biologique ou
physique sélection fournisseur, et choix des équipements de récolte et de stockage)
•Transport : contaminant physique ou biologique sélection et suivi des transporteurs
•Process de fabrication : contaminant chimique aménagement des process et site dédié
•Au stockage : contaminant chimique ou biologique
aménagement des process et surveillance des produits
3.1 Les xénobiotiques :
différentes sources possibles
•Substances suivies dans le cadre de la réglementation animale UE (substances indésirables) : métaux lourds, aflatoxines, pesticides, facteurs anti-nutritionnels, nitrates, nitrites…
•Substances dont le suivi est recommandé par la FDA (Food and Drug Administration) / NCTR (National Center of
Toxicological Research) avec des seuils maximum d’acceptation. Exemple :
Arsenic 1 ppm
Nitrosamines 10 ppb
Les 2 textes sont proches sur les critères à suivre, mais pas sur les tolérances d’acceptation
3.2 Les xénobiotiques surveillés en alimentation des
animaux de laboratoire
•Source de phyto-œstrogènes : le soja, la luzerne et tous les végétaux
•Effet sur le fonctionnement d’hormones
(Boettger-Tong et al, 1998, Odum et al, 2001)•Les aliments « free œstrogènes » ne sont pas nécessairement mieux
(Ciana et al, 2005):d’autres composants de l’aliment peuvent activer les récepteurs œstrogéniques
des développements anormaux de souris ont été observés avec ces aliments
3.3 Un xénobiotique non nutritif des MP :
les phyto-œstrogènes
3.4 Les mycotoxines : un contaminant des MP
Facteur Au champ A la récolte Au stockage Physique
Humidité
Rapidité de séchage Réhumidification Humidité relative Température
Dommage mécanique Mélange des grains Zone chaude Temps
+ - + + + - - +
+ + + + + + - +
+ + + + + + + + Chimique
CO2
O2
Nature du substrat Nutrition minérale Traitement chimique
- - + + -
- - - - -
+ + + + + Biologique
Stress de la plante Blessures d’insectes Invasion fongique Variété de plante Espèce fongique Charge de la sporée Ecosys tème microbien
+ + + + + + +
- - - - - +
-
+ + + + + + +
Mycotoxine Effet Mécanisme d’action Organes cibles
Aflatoxines
!!Hépatotoxique
!!Cancérogène
!!Tératogène
!!Immunotoxique
!!Formation d’adduits à l’ADN
!!Peroxydation lipidique
!!Bioactivation par CYP
!!Conjugaison aux glutathion -S- transférases
!!Foie
!!Reins
!!Système nerveux
!!Glandes endocrines
Fumonisines
!!Lésion système nerveux central
!!Hépatotoxique
!!Tératogène
!!Immunotoxique
!!Inhibition de la synthèse de cér amide
!!Altération du rapport sphinganine/sphingosine
!!Altération du cycle cellulaire
!!Foie
!!Système immunitaire
!!Système nerveux
!!Système digestif
Patuline !!Neurotoxique
!!Tératogène !!Inhibition indirecte d’enzymes !!Système nerveux
Ochratoxine
!!Neurotoxique
!!Cancéro gène
!!Néphrotoxiqe
!!Tératogène
!!Immunotoxique
!!Impact sur la synthèse des protéines
!!Inhibition de la production d’ATP
!!Détoxication par les peptidases
!!Foie
!!Reins
!!Système immunitaire
!!Système nerveux
Trichothécène
!!Immunotoxique
!!Toxicité cutanée
!!Hématotoxique
!!Ind uction de l’apoptose sur cellules immunitaires
!!Inhibition de la synthèse protéique
!!Altération des immunoglobulines
!!Système immunitaire
!!Système nerveux
!!Système digestif
!!Peau et muqueuses
Zéaralénone !!Œstrogénique
!!Liaison aux récepteurs œstrogénique
!!Bioactiv ation par des réductases
!!Conjugaison aux
glucuronnyltransférases
!!Reins
!!Glandes endocrines
3.4 Les mycotoxines : un contaminant des MP
• Rigueur du choix des ingrédients (favoriser des MP moins contaminées)
• Rigueur des fournisseurs (maîtrise du process, création de spécifications…)
• Suivre analytiquement les ingrédients
• Diversifier les ingrédients dans la formule
3.4 Les mycotoxines : un contaminant des MP
•Contamination par une substance présente dans le process
•Il peut s’agir :
d’arômes,
de principes actifs médicamenteux,
d’anti-parasitaire (flubendazole),
de molécules actives utilisées pour d’autres espèces cibles
3.5 Les principes actifs : des xénobiotiques issus du
process de fabrication
•Cas des anti coccidiens de la nutrition animale
Anorexie
Ataxie
Diarrhée
Augmentation du risque cardiaque
Chien et lapin réagissent dès 0,32 mg/ kg de salinomycine
Maîtrise du process et connaissance du fournisseur d’aliment : engagement et traçabilité 3.5 Les principes actifs : des xénobiotiques issus du
process de fabrication
•Substance à effets neurotoxique et carcinogène
•Formation lors de la cuisson des amidons (via autoclavage !)
•L’autoclavage augmente de 14 fois le niveau d’acrylamide (17 ppb 240 ppb)
•Aliment irradié : stable à 10 ppb
Action génotoxique par dommage cumulatif sur l’ADN !
3.6 L’acrylamide : un xénobiotique issu du process
d’autoclavage
(Nathan C Tadwalle et all, J Agric Food Chem., 2004)•La dureté, diamètre et longueur du granulé caractérise un aliment
•Ces paramètres doivent respecter des niveaux mini- maxi
•La variation de la dureté peut expliquer :
du gaspillage (dureté trop faible ou trop dure;grattage chez le lapin)
des problèmes de consommation et digestion (granulé trop dur chez le chien entraîne la diarrhée)
perturbation du comportement
3.7 Un biais sous estimé : la technologie des aliments
•La variation de la dureté peut expliquer :
le comportement de certains rats
(Sako et Al, 2002)modifie l’expression du diabète de type 2 sur des souris
(Nojima et al 2006)modifie la courbe de croissance des souriceaux sous la mère
(Koopman, 1989)Extrudé / granulés (bouchons)
Importance de connaître le produit : maîtrise des paramètres technologiques impérative
3.7 Un biais sous-estimé : la technologie des
aliments
•Le mode de distribution de l’aliment influence le métabolisme des rongeurs
•Une distribution ad libitum favorise l’engraissement et le
développement des tumeurs, exemple : Effect of the AIN-93M Purified Diet and Dietary Restriction on Survival in Sprague-Dawley Rats: Implications for Chronic
Studies, http://jn.nutrition.org/cgi/content/full/132/1/101
•Les rongeurs consomment 60-80% de leur ration la nuit : de
nombreux paramètres biochimiques de l’animal peuvent varier entre jour et nuit, ex. insuline (Rubin et Al, 1988)
•Une distribution ad libitum, le jour ou la nuit chez la souris modifie le fonctionnement des récepteurs œstrogéniques du foie (Ciana et Al, 2002)
3.8 Les biais alimentaires au cours du protocole :
mode de consommation de l’aliment
Les conditions de stockage optimum :
à l’abri de l’air
à l’abri de la lumière
une atmosphère tempérée
à l’abri de l’humidité
rapidement après ouverture (10 jours)
fraîcheur de l’aliment (éviter le sur-stockage prolongé)
3.8 Les biais alimentaires au cours du protocole :
la conservation de l’aliment
Effet sur la qualité du produit :
la dureté du granulé (attention autoclavage)
les niveaux de vitamines
la qualité des lipides
la qualité bactériologique et mycotoxique
3.8 Les biais alimentaire au cours du protocole :
la conservation de l’aliment
•Le choix de l’aliment dépend de
des orientations du protocole
la qualité de la formulation
des connaissances disponibles par rapport aux spécificités du protocole
•D’autres facteurs peuvent influencer les résultats sur l’animal :
mode de distribution (ad libitum ou rationnement)
animaux en colonie
l’eau de boisson
le rythme de consommation des animaux
(le rongeur se nourrit la nuit effet sur les paramètres biochimiques)…3.9 Conclusion
4. Le contrôle qualité des aliments pour animaux de laboratoire
4.1 Les analyses chimiques et microbiologiques
Des plans d’échantillonnage établis sur les MP & PF
Suivi de la conformité nutritionnelle et de la variabilité des lots
Suivi des niveaux de certains contaminants et substances indésirables
Suivi de l’homogénéité des lots
Suivi de la qualité microbiologique : absence d’agents pathogènes
- les exigences réglementaires - les exigences « client »
- nos exigences internes
MP
)4. Le contrôle qualité des aliments pour animaux de laboratoire
4.2 Les analyses chimiques et microbiologiques : Suivi de la variabilité des lots A04 (rongeur) : 22 échantillons et 20 mois
MP
)Moyenne écart type min max CV %
humidité % 12.05 0.48 10.90 12.80 3.98
min tot 4.58 0.08 4.50 4.70 1.74
lipides % 3.05 0.14 2.90 3.30 4.61
protéines %
16.00 0.39 15.00 16.80 2.42 Cellulose
WEENDE % 4.30 0.40 3.60 4.90 9.21
glucides ENA % 60.03 0.60 58.80 61.00 0.99 phosphore mg/kg 5729.55 352.09 4600.00 6300.00 6.15 calcium en mg/kg 7550.00 591.81 6300.00 9600.00 7.84 sodium en mg/kg 2150.00 230.42 1800.00 2500.00 10.72
patassium en
mg/kg 6413.64 289.98 6000.00 7000.00 4.52
amidon % 44.46 1.17 41.80 46.20 2.63
sucre réducteur 3.28 0.30 2.80 4.00 9.10
4. Le contrôle qualité des aliments pour animaux de laboratoire
4.3 Les analyses chimiques et microbiologiques :
Suivi de la variabilité des lots A04 (rongeur) : 22 échantillons et 20 mois
Conséquence sur l’aliment : faible variabilité inter lots
Mode de formulation (diversité des MP, formule fixe)
Mode d’approvisionnement
Maîtrise et standardisation du process
Contrôle du Produit Fini
Niveau de contrôle du process et des MP
Maîtrise de l’aliment
= Maîtrise de tous les paramètres aboutissant au produit fini
MP
)5. L’Assurance Qualité pour les aliments des animaux de laboratoire
MP
)5.1 Rappel des principes de l’ISO 9001 (V 2000)
5.2 Améliorer la Démarche ISO 9001
5. L’Assurance Qualité pour les aliments des animaux de laboratoire
MP
)5.1 Rappel des principes de l’ISO 9001 (V 2000)
1. Disposer d’un système structuré permettant d’apporter une réponse à chaque exigence.
2. Disposer d’un système basé sur la maîtrise des risques (HACCP).
3. Implication et Responsabilité de la Direction dans le
fonctionnement de la démarche ISO (Politique Qualité, Définition des responsabilités,…).
4. Le système doit être contrôlable (audits, indicateurs,…).
5. Le système doit permettre d’améliorer la situation
ISO 9001 : obligation d’une organisation mais pas de
résultat sur la qualité du produit !
5. L’Assurance Qualité pour les aliments des animaux de laboratoire
MP
)5.2 Améliorer la démarche ISO 9001
•Objectifs :
Répondre aux exigences clients
Standardiser le process
Assurer la traçabilité
• Moyens :
Mettre en place une démarche type BPL / PPF
Former le personnel
Contrôler le fonctionnement du système : Contrôle Qualité et Assurance Qualité
Audits tiers : clients, organisme extérieur, DSV…
MP
)6. Conclusion
MP
)La Maîtrise de l’aliment dans le protocole de Recherche :
•Maîtrise du fournisseur :
agrément, démarche Qualité, étiquetage, certification…
•Maîtrise des modalités de formulation et fabrication :
formule fixe, et sécurisation du process (MP, fabrication)
•Maîtrise de la traçabilité et transparence :
audit•Maîtriser des biais selon le protocole :
bibliographie(exemple : antériorité alimentaire, anti-oxydants, orientation de la flore…)
•Le fabricant d’aliment ne peut pas être exhaustif sur
les biais :
cas par cas7. Bibliographie
MP
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