Étude de l'intégrité du génome chloroplastique de l'orge (Hordeum vulgare) en culture de microspores isolées

Étude de l’intégrité du génome chloroplastique de l’orge

(Hordeum vulgare) en culture de microspores isolées

Mémoire

Rémi Maglione

Maîtrise en biologie végétale

Maître ès sciences (M. Sc.)

Étude de l’intégrité du génome chloroplastique de l’orge

(Hordeum vulgare) en culture de microspores isolées

Mémoire

Rémi Maglione

Sous la direction de :

Résumé

Un enjeu actuel en biotechnologie est d’obtenir des plantes haploïdes doublées par la technique de la culture de microspores isolées (CMI). Pourtant, la CMI génère parfois une proportion importante de plantes albinos, laquelle peut atteindre 100 % chez certains cultivars. Des travaux antérieurs ont indiqué que des remaniements du génome chloroplastique seraient à l’origine de cet albinisme. Afin de mieux comprendre ce processus menant à l’albinisme, nous avons entrepris d’étudier l’intégrité du génome chloroplastique au sein de microspores d’orge et de plantes albinos via une approche de séquençage à grande échelle. L’ADN total extrait de microspores à un stade précoce de la CMI, d’une feuille de la plante-mère (témoin), et de feuilles albinos, a été séquencé et les séquences chloroplastiques ont été analysées. Ceci nous a permis de documenter pour la première fois une diminution de l'ADN chloroplastique chez les microspores. De plus une étude de variations structurales a démontré un abaissement généralisé de la quantité de génomes chloroplastiques chez les microspores. Enfin, d’importants remaniements du génome chloroplastique ont été observés chez les plantes albinos, révélant une forte abondance de génomes chloroplastiques altérés de forme linéaire.

Table des matières

Résumé ... iii

Table des matières ... iv

Liste des tableaux ... vi

Liste des figures ... vii

Listes des abréviations ... viii

Remerciements ... ix

Avant-propos... x

CHAPITRE 1 : INTRODUCTION GÉNÉRALE... 1

1.1. L’orge : enjeu économique et défis scientifiques ... 1

1.2. Haploïdes doublés et culture de microspore ... 1

1.3. La problématique de l’albinisme ... 2

1.4. Hypothèse et objectifs ... 2

1.5. Structure du manuscrit ... 2

1.6. Résultats majeurs ... 3

CHAPITRE II : REVUE DE LITTÉRATURE ... 4

2.1. Orge : Enjeux économique et optimisation ... 4

2.2. Haploïde doublé ... 6

2.3. Développement du grain de pollen ... 6

2.3.1. In vivo ... 6

2.3.2. In vitro ... 7

2.4. Production des haploïdes doublés ... 8

2.4.1. Élimination spontanée d’un chromosome parental ... 8

2.4.2. Gynogenèse ... 9

2.4.3. Androgénèse ... 9

2.4.3.1. Culture d’anthères ... 9

2.4.3.2. Culture de microspores isolées ... 9

2.5. Albinisme ... 9

2.5.1. Phénotype ... 9

2.5.2. Albinisme, à quelle étape de la CMI ? ... 10

2.6. Albinisme et chloroplaste ... 11

2.6.1. Morphologie ... 11

2.6.2. Biochimie ... 12

2.6.3. Génomique ... 12

2.7. Méthode d’étude de la variation structurale ... 14

2.8. Problématiques, hypothèse et objectifs ... 16

CHAPITRE III : ARTICLE ... 17

Résumé article ... 17

Abstract ... 18

Introduction ... 19

Materials and methods ... 22

Plant materials ... 22

Illumina whole genome resequencing of microspore and green leaf DNA ... 22

Ion Torrent whole genome resequencing of albino leaf DNA ... 23

Mapping and depth of coverage ... 23

Detection of structural variation ... 24

Detection of genic deletions via PCR ... 24

Results ... 25

Abundance and structural integrity of the chloroplast genome in microspores 25 Deletions are not responsible for the low coverage of microspore cpDNA ... 28

Abundance and structural integrity of the chloroplast genome in albino plants28 PCR analysis of genes previously reported to be lost in albino plants ... 31

Deletions are not responsible for the low coverage of the LSC regions ... 32

Discussion ... 33

Reference ... 38

CHAPITRE IV : CONCLUSION GÉNÉRALE ... 40

Liste des tableaux

Table 1 Summary statistics of the Illumina reads mapped to the reference chloroplast genome. ... 25 Table 2 Summary statistics of the Ion Torrent reads obtained from six albino plants ... 29

Liste des figures

CHAPITRE II : REVUE DE LITTÉRATURE

Figure 1 : Temps de génération de lignées homozygotes par la voie traditionnelle ou en culture de microspores isolées. ... 5 Figure 2 : Développement d’une microspore en condition in vivo et in vitro. ... 8 Figure 3: Embryons, plantes vertes et plantes albinos d’orge issus de la culture de microspores.. ... 10 Figure 4 : Morphologie des structures chloroplastiques en microscopie électronique chez des embryons issues de la fécondation (à gauche) et de microspores à un stade de culture avancé (à droite). ... 12 Figure 5 : Génome chloroplastique de l’orge. ... 13 Figure 6 : Génomes linéaires chloroplastiques formant un nucléoïde (Oldenburg et Bendich, 2004) ... 13 Figure 7 : Principales méthodes d’analyse bio-informatique de différentes classes variations structurales. ... 16

CHAPITRE III : ARTICLE

Figure 1: Expected and observed depth of normalized coverage resulting from alignment of reads obtained from either microscopes or a green leaf ... 27 Figure 2: Depth of coverage of chloroplast reads in six albino plant ... 30 Figure 3: DNA amplification products of 4 photosynthetic key genes in albino plant ... 31

Listes des abréviations

ADNcp Génome chloroplastique

atpA/E Gène : sous-unité de l’ATP synthase (alpha/epsilon) CMI Culture de microspores isolées

HD Haploïde doublé

IR Inverted Repeat, Région inversée répétée LSC Large Single Copy, Région SC longue

Nud Gène de l’orge contrôlant l’état couvert/nu du caryopse Ori Origine de réplication

PCR Polymerase Chain Reaction, réaction de polymérisation en chaîne QRT Quantitative Real Time, quantitatif en temps réel

petA Gène : cytochrome f

psaA Gène : sous unité du photosystème I

QTL Quantitative Trait Locus, locus à effet quantitatif SC Single Copy, Région de l’ADNcp simple copie SSC Short Single Copy, Région SC courte

Remerciement

Je tiens tout d’abord à remercier le Dr. François Belzile pour m’avoir offert de travailler sur ce projet très enrichissant.

Dans un second temps, je souhaiterai remercier toutes les personnes qui ont contribué, de près comme de loin à la réussite de ce projet :

- Martine Jean pour ces nombreux conseils et réflexions prodigués tout au long de ma maîtrise.

- Patricio Esteves pour la culture in vitro et la transmission de ses connaissances sur le protocole de culture de microspore isolées, réalisée avec beaucoup de

pédagogie.

- Sébastien Bélanger pour ses échantillons d’ADN de microspore - Le service de séquençage de l’IBIS, dirigé par Brian Boyle.

- Le support bioinformatique de Jérôme Laroche et Éric Normandeau

- Monique Turmel et Claude Lemieux pour leurs discussions sur les organelles et leur génome

- Dominique Michaud pour ses discussions en biotechnologie

Et finalement, je voudrais remercier spécialement les personnes qui m’ont apporté leur sympathie et ont contribué à mon enrichissement personnel, notamment, les membres de notre équipe de recherche mais aussi, plus largement, au niveau de la faculté :

- Équipe Belzile : Davoud Torkamaneh, Aurélie Tardivel, Sébastien Bélanger, Amina Abed, Romain Novaretti, Chiheb Boudhrioua, Maxime Bastien… - Équipe Bernatchez : Laura Benestan

- Équipe Derome : Jeff Gauthier, Bachar Cheib, Sarach El Kouhry - Équipe Aubin-Horth : Lucie Grecias, François-Olivier Gagnon Hébert - Équipe Bernier : Martha Nigg

Avant-propos

L’article inséré dans ce mémoire n’a pas encore fait l’objet d’une soumission. L’étudiant en est l’auteur principal, sous la supervision étroite de son directeur de recherche, le Dr. François Belzile. Enfin, les contributions méthodologiques du Dr. Patricio Esteves ont grandement permis l’élaboration de cet article.

CHAPITRE 1 : INTRODUCTION GÉNÉRALE

1.1. L’orge : enjeu économique et défis scientifiques

L’orge, Hordeum vulgare, de la famille des Poaceae, est une monocotylédone diploïde. En recherche, l’orge peut être considérée comme une plante modèle, notamment dans la compréhension de la biologie des graminées. Si l’orge suscite un intérêt certain de la communauté scientifique, c’est avant tout par son importance économique, de premier plan sur la scène internationale. Ainsi, une attention particulière lui est attribuée dans le cadre de programmes d’amélioration. En effet, de nombreux enjeux sont à relever en ce qui a trait à l’augmentation de rendement, notamment sous influence de sécheresse et de résistance à certains agents pathogènes et maladies. À l’issue de ces programmes de sélection, semenciers et chercheurs ont communément pour but d’obtenir des lignées homozygotes, dont chaque gène, chaque caractère, est identique à chaque locus du génome. L’intérêt principal est de se dispenser de la ségrégation des caractères chez les générations suivantes, et ainsi, de posséder un matériel végétal avec un phénotype homogène et donc, propice à l’étude et à la sélection.

1.2. Haploïdes doublés et culture de microspore

De nombreux outils sont à notre disposition pour produire des cultivars homozygotes. Parmi ceux-ci, l’un a démontré un fort potentiel et a créé une percée majeure en biotechnologie : le processus d’haplodiploïdisation. En effet, là où des techniques traditionnelles de croisement génèrent du matériel homozygote à 96 %, en 7 à 10 générations (7 années), la technique des haploïdes doublés permet de produire un matériel pur à 100 % en seulement une génération, une année environ. L’haplodiploïdisation est une technologie révolutionnaire impliquant de doubler le matériel chromosomique d’un gamétophyte haploïde. Différentes approches permettent d’obtenir des haploïdes doublés : in vivo, via l’élimination d’un chromosome parental après fécondation interspécifique, et in vitro, par les voies soit de la gynogenèse ou de l’androgenèse. Chez cette dernière, deux

des gamètes mâles immatures peuvent être prélevés et mis en culture. L’induction des microspores immatures les conduira sur la voie de l’embryogénèse sans fécondation. Durant cette phase, le matériel chromosomique haploïde sera spontanément doublé. Chez l’orge, la CMI a montré les plus forts taux de régénération par rapport à la culture d’anthères.

1.3. La problématique de l’albinisme

Cette technique d’obtention d’haploïdes doublés aurait donc un fort potentiel mais, elle fait face à un problème majeur avec l’albinisme. En effet, chez certains cultivars, ce phénomène peut être observé chez 100 % des plantes régénérées. Le phénotype albinos présente des plantes blanches. L’intégrité des chloroplastes a donc été explorée, afin de mieux documenter ce phénomène d’albinisme. Des études ont montré que ce chloroplaste subirait des altérations aux niveaux morphologique, biochimique et génomique. En effet, les recherches les plus récentes ont révélé, par approche PCR, que certains gènes essentiels à la photosynthèse pouvaient être sujets à des délétions. Depuis 2007, le génome chloroplastique de l’orge a été séquencé. Ainsi, avec l’avènement des technologies de séquençage de nouvelle génération, il est maintenant possible de conduire une investigation complète du génome chloroplastique de l’orge en condition de CMI.

1.4. Hypothèse et objectifs

Nous avons établi notre hypothèse selon laquelle il existerait un remaniement du génome chloroplastique en cours de CMI. Afin de mieux comprendre ce processus menant à l’albinisme, nous avons entrepris d’étudier l’intégrité du génome chloroplastique au sein de microspores d’orge et de plantes albinos via une approche de séquençage à grande échelle.

1.5. Structure du manuscrit

Après ce présent chapitre d’introduction générale, la bibliographie du chapitre II dresse un tableau complet et précis des différents éléments de littérature nécessaires à la lecture du chapitre III. Ce dernier se présente sous la forme d’un manuscrit en anglais et retrace l’ensemble des travaux effectués dans ce projet de maîtrise, leurs analyses ainsi que les résultats et les points de discussion associés. Enfin, la conclusion générale du chapitre IV met en avant les résultats apportés par nos travaux et les modèles proposés.

1.6. Résultats majeurs

Cette étude nous a permis de documenter pour la première fois une diminution de 8X de l'ADN chloroplastique chez les microspores. De plus une étude des variations structurales a démontré que cet abaissement généralisé était, toutefois, sans modifications génomiques. Ainsi, le génome chloroplastique des microspores est intact dans les phases précoces de la CMI. Si des modifications structurales de ce génome liées à l’albinisme existent, elles seraient observables dans les phases tardives de la CMI.

En effet, d’importants remaniements du génome chloroplastique ont été observés chez les plantes albinos, révélant une forte abondance de génomes chloroplastiques altérés vraisemblablement de forme linéaire. De plus, nous avons pu établir que les régions inversées-répétées étaient protégées pendant la CMI, et plus spécifiquement les régions proches des origines de réplication. En revanche, une analyse PCR a montré qu’il resterait une très faible proportion de génomes intacts. Finalement, il se pourrait que l’obtention de plante albinos, dépendrait d’un trop faible nombre de génomes chloroplastiques préservés et intacts à l’issue de la CMI.

CHAPITRE II : REVUE DE LITTÉRATURE

L’orge, Hordeum vulgare, de la famille des Poaceae, est une monocotylédone diploïde. Elle se décline en deux grands types en fonction du nombre de rangées de grains par épi : deux ou six rangs (Komatsuda et al., 2007). L’orge peut aussi être classée en deux sous-catégories suivant son cycle de culture : l’orge semée à l’automne ou au printemps (Ellis et Russell, 1984). La taille de son génome nucléaire est conséquent puisque estimé à 5,1 gigabases (Mayer et al., 2012). En recherche, l’orge peut être considérée comme une plante modèle d’étude expérimentale et plus particulièrement pour la compréhension de la biologie des Poaceae. À ce jour, les connaissances publiées ont pu être confirmées et généralisées à l’ensemble des graminées. Par exemple, d’importants gènes impliqués dans la floraison ont été caractérisés chez l’orge dont les plus connus sont Nud (Taketa et al., 2008) et VrsI (Komatsuda et al., 2007). Si l’orge suscite un intérêt certain pour la communauté scientifique, c’est avant tout par son importance économique de premier plan sur la scène internationale.

Cette plante est très largement cultivée puisque sa production mondiale qui avoisine les 145 millions de tonnes (United States Department of Agriculture (USDA) Foreign Agricultural Service, https://apps.fas.usda.gov/psdonline/ ). Ceci en fait la 4ème _{céréale la} plus cultivée après le maïs, le riz et le blé (Schulte et al., 2009). Sur une moyenne des 50 dernières années, le Canada en est le 3ème _{producteur mondial, derrière la Russie et} l’Allemagne (Food and Agricultural Organization of the United Nations (FAO), http://faostat3.fao.org/browse/Q/QC/E). Ainsi, la culture de l’orge représente un enjeu économique très important.

Une attention particulière lui est attribuée dans le cadre de son amélioration dans des programmes de recherche. En effet, de nombreux enjeux sont à relever en matière d’augmentation de rendement, notamment sous influence de sécheresse (Araus et al., 2002), et de résistance à certains pathogènes et maladie, comme la fusariose de l’orge (McMullen et al., 2012). De nombreux programmes d’amélioration ont donc été mis en place afin de sélectionner des caractères d’intérêt. Dans ces démarches, de nombreux outils

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2.2. Haploïde doublé

L’haplodiploïdisation est une technologie révolutionnaire permettant d’obtenir une plante homozygote à partir d’un gamète immature haploïde en doublant son matériel chromosomique. Ce phénomène s’observe à l’état naturel ou peut être induit. Guha et Maheshwari (1964, 1966) ont été les pionniers dans l’induction et la production in vitro d’HD. Lors de la production de lignées homozygotes par la voie traditionnelle, la ségrégation des caractères est très importante à partir de la première génération d’autofécondation (F2). Cette ségrégation diminuera au fur et à mesure des générations suivantes, au gré de la fixation génétique qui en résulte. Au contraire, dès sa production, l’haploïde doublé n’est plus en ségrégation. L’intérêt principal de cette technologie est l’économie de temps, comparativement aux autres techniques menant à l’obtention de lignées homozygotes, puisqu’elle ne requiert qu’une seule génération (Jähne et Lörz, 1995). De plus, cette technique assure la génération d’un matériel chromosomique pur à 100%, ce qui permet de passer rapidement à l’évaluation des caractères d’intérêts comme la production ou la qualité, particulièrement chez l’orge (Devaux et Kasha, 2009).

Les applications des HD sont donc très variées : développement de cultivars, analyse de lignées issues de rétrocroisement couplé avec une sélection assistée par marqueurs (Toojinda et al., 1998), sélection de mutants (Szarejko et Forster, 2006), assistance à l’obtention de plante à stérilité mâle cytoplasmique (Ribarits et al., 2007), et production de plantes transgéniques (Chauhan et Khurana, 2011).

Différentes techniques permettent d’obtenir des haploïdes doublés. In vivo, par l’élimination d’un chromosome parental après fécondation interspécifique, et in vitro, via la gynogenèse ou l’androgénèse. Mais avant de plonger dans ces méthodes, intéressons-nous de plus près à la voie développementale qui mène à la production de grains de pollen.

2.3. Développement du grain de pollen 2.3.1. In vivo

Comme toutes les plantes supérieures, le cycle vital de l’orge est rythmé par l’alternance entre une phase sporophytique (nombre de chromosomes = 2n) et une phase

gamétophytique (nombre de chromosomes = n). Durant la phase gamétophytique, les gamètes, produits de la méiose, aboutiront à la formation d’un embryon après fécondation. Ainsi recommence la phase sporophytique, avec une nouvelle génération. Dans le cas du développement du pollen, celui-ci résulte de divisions asymétriques d’une microspore, en mitose I, en deux cellules distinctes : une petite cellule végétative et une grosse cellule générative (Figure 2). Cette dernière donnera deux cellules spermatiques pendant la mitose II (nombre de chromosomes = n). La dernière phase de maturation du pollen sera supportée par la croissance du tube pollinique (Goldberg et al., 1994).

2.3.2. In vitro

En culture in vitro, des gamètes immatures peuvent être reprogrammés et dirigés vers la voie de l’embryogénèse, plutôt que la gamétogénèse. Dans le cas du pollen, des gamètes compétents, c’est-à-dire à un stade de développement pré-mitotique, peuvent être réorientés par une induction (Figure 2). Durant la mitose I et II, des divisions symétriques aboutiront à la formation d’un nouvel embryon (Zaki et Dickinson, 1991). D’un point de vue du matériel génétique, les chromosomes se dupliqueront spontanément. Différents processus ont été proposés, comme l’endoréduplication ou encore la fusion nucléaire (Kasha et al., 2001). Au terme de ce processus d’embryogénèse, une nouvelle plante (souvent diploïde et fixée) sera obtenue.

Figure 2 : Développement d’une microspore en condition in vivo et in vitro. Gn ; noyau de cellule génératrice, N ; noyau, SC (sperm cell) ; cellule spermatique, St (starch) ; amidon, V ; vacuole, Vn ; noyau de cellule végétative. Adapté de (Daghma et al., 2014)

2.4. Production des haploïdes doublés

2.4.1. Élimination spontanée d’un chromosome parental

Lors d’un croisement interspécifique, des zygotes hybrides peuvent être générés. Au sein de ceux-ci cohabitent les chromosomes de chaque parent. Sous pression du programme développemental, un chromosome sera éliminé. Le chromosome subsistant dans l’embryon subira une duplication essentielle pour l’obtention des HD. L’embryon doit être sauvé par culture in vitro, car la division de l’endosperme échoue lors des étapes précoces du développement de la graine. Les embryons peuvent être sélectionnés avec une coloration par marqueur porté par le pollinisateur. Cette technique s’adresse à des croisements réalisés avec des espèces apparentées et a été utilisé pour produire des HD chez l’orge. En effet, l’orge appartenant au genre Hordeum, cette technique a permis de générer avec succès des HD par culture in vitro d’ovules extraites de plantes d’orges (Hordeum vulgare) pollinisé avec Hordeum bulbosum (Chen et Hayes, 1989).

2.4.2. Gynogenèse

Cette technique permet de générer des embryons HD après stimulation d’ovules non-pollinisés. L’induction peut se faire grâce à un milieu de culture contrôlé, avec un traitement de température, ou avec des grains de pollen irradiés. Cette technique a surtout été développée chez l’oignon (Allium cepa) et la betterave (Beta vulgaris) (Bohanec, 2009), mais aussi chez l’orge (Castillo et Cistué, 1993).

2.4.3. Androgénèse

2.4.3.1. Culture d’anthères

Pour l’androgénèse, il est possible de récolter et de mettre en culture des épis, au moment où les microspores sont au stade uni-nucléé médian. Le stade de récolte doit être optimisé afin d’obtenir un maximum de microspores compétentes. Les anthères récoltées sont tout d’abord prétraitées au froid ou en condition de stress hydrique avec une solution de mannitol (Cistué et al., 1994). Puis, ces anthères sont placées sur un milieu d’induction à une température contrôlée (26°C) et dans le noir. Quelques semaines plus tard, les microspores, sur la voie de l’embryogénèse, sont transférées en milieu de régénération. La quantité de plantes haploïdes générées dépendra du nombre de microspores par épi.

2.4.3.2. Culture de microspores isolées

La culture de microspores isolées est très semblable à la culture d’anthères. En effet, une étape préliminaire est nécessaire durant laquelle les microspores sont mécaniquement extraites des anthères. De plus, des étapes de rinçage des microspores sont requises dans le bon déroulement de ce protocole. Cette technique est tout particulièrement utilisée chez l’orge, puisque cette céréale a montré les meilleurs taux de régénération par rapport à la culture d’anthères (Li et Devaux, 2005). Cette technique d’obtention d’haploïdes doublés a donc un fort potentiel dans les programmes de sélection variétale. Mais, elle fait face à un problème majeur avec l’albinisme. En effet, chez certains croisements, ce phénomène peut être observé chez 100 % des plantes régénérées.

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1994). À ce jour, l’étape où interviendraient les modifications irréversibles des chloroplastes reste inconnue.

2.6. Albinisme et chloroplaste

Les processus biologiques conduisant à l’albinisme sont toujours inconnus. Pourtant, de nombreuses études ont permis de mieux décrire ce phénomène en portant leurs investigations à différents niveaux de résolution : morphologique, biochimique et génomique.

2.6.1. Morphologie

Le chloroplaste, lieu de la photosynthèse, possède des structures internes, comme les thylakoïdes, assurant des fonctions vitales comme le transport d’électrons et la production d’énergie via l’interception de la lumière. Des études cytologiques en microscopie électronique, conduites chez le blé en condition d’androgénèse, ont montré l’existence d’importantes perturbations morphologiques des chloroplastes (Caredda et al., 1999). La figure 4 montre des structures chloroplastiques bien développées dans un embryon issu de la fécondation. Elle contraste avec les fortes malformations identifiables chez les chloroplastes observés au sein de microspores à un stade avancé de culture. Ces anomalies prennent la forme d’une forte perturbation des membranes et d’une faible présence de structures thylacoïdales. De plus, il semblerait que, chez des cultivars susceptibles à l’albinisme, la quantité de chloroplastes soit inférieure chez les microspores en régénération (4,5 à 28 fois moins, d’après Caredda et al., 1999).

Figure 4 : Morphologie des structures chloroplastiques en microscopie électronique chez des embryons issues de la fécondation (à gauche) et de microspores à un stade de culture avancé (à droite). g (granum) : empilement de thylakoïdes, S (Starch): amidon, P (Plastid) : plaste. Étoile noire : malformation de structures chloroplastiques.

2.6.2. Biochimie

Le chloroplaste est l’organite assurant la photosynthèse et joue donc un rôle essentiel dans la synthèse de la chlorophylle. À l’échelle de la biochimie du chloroplaste, une analyse du contenu chlorophyllien par spectrométrie a révélé l’absence de chlorophylle a et b chez des plantes albinos issues de l’androgénèse (Asakaviciute et al., 2006). Pourtant, Manninen et al (1997) ont montré que la pré-chlorophylle était toujours présente. La biochimie du chloroplaste des plantes albinos est donc altérée. De nombreuses fonctions clé de la photosynthèse sont codées par le génome du chloroplaste. Considérant la dégradation de l’ADNcp avant le prétraitement des microspores, intérêt particulier est porté à l’étude de ce génome en contexte d’androgénèse

2.6.3. Génomique

Le génome chloroplastique de l’orge, habituellement représenté sous forme circulaire, contient 83 gènes pour 136 462 paires de bases (Saski et al., 2007). Il possède deux régions

LQYHUVpHVUpSpWpHV GH VpTXHQFH LGHQWLTXH GpOLPLWDQW XQH JUDQGH HW XQH FRXUWH UpJLRQ VLPSOHFRSLH)LJXUH )LJXUH*pQRPHFKORURSODVWLTXHGHO¶RUJH,5UpJLRQVLQYHUVpHUpSpWpH66&UpJLRQ FRXUWHVLPSOHFRSLH/6&UpJLRQORQJXHVLPSOHFRSLHRUL$HWRUL%RULJLQHVGH UpSOLFDWLRQ %LHQTXHVRXYHQWGpFULWFRPPHFLUFXODLUHOHJpQRPHFKORURSODVWLTXHVHPEOHSRXUWDQWrWUH UHSUpVHQWpSDUGHVPROpFXOHVOLQpDLUHV(QHIIHW2OGHQEXUJHW%HQGLFKRQWPRQWUp TXHSOXVGHGHVPROpFXOHVG¶$'1FSpWDLHQWOLQpDLUHVOLpHVHQWUHHOOHVGDQVXQHVXSHU VWUXFWXUHDSSHOpH©QXFOpRwGHª)LJXUH

En contexte d’androgénèse, ce génome chloroplastique suscite beaucoup d’intérêt car il est soumis à des contraintes fragilisant sa structure. Une étude par Southern blot a révélé qu’il existait des altérations dans l’ADNcp extrait de plantes albinos (Dunford et Walden, 1991). D’autre part, Caredda et al., (2004) ont établi par une approche de microscopie électronique, que le nombre de copies d’ADNcp par chloroplaste diminuait de façon très significative chez les microspores de cultivars sensibles à l’albinisme. Enfin, les travaux les plus récents à ce jour ont décrit, par PCR, que certains gènes clés de la photosynthèse n’étaient plus amplifiables chez certaines plantes albinos (Mozgova et al., 2012). Mais ces études ont un spectre d’exploration limité, puisque l’approche ne fait appel qu’à des amplifications ponctuelles du génome.

Dans la mesure où la séquence complète du génome chloroplastique de l’orge est disponible (Saski et al., 2007), les techniques de séquençage de nouvelle génération offrent des perspectives d’étude innovante. En effet, celles-ci permettraient d’élargir grandement le champ d’investigation des réarrangements structuraux de l’ADNcp en contexte d’androgénèse, par une étude de ce génome dans son entier.

2.7. Méthode d’étude de la variation structurale

Grâce au pouvoir de résolution conféré par les méthodes de séquençage de nouvelle génération, la capture d’informations sur les réarrangements structuraux est devenue très précise (Zhao et al., 2013). Dans un séquençage en paires, l’ADN source est fragmenté et séquencé aux extrémités. Les lectures de séquences, communément appelées « reads », permettent de capturer de nombreux types d’altérations du génome : délétion, insertion, inversion et transposition. L’approche principale se base sur la capture de séquences en périphérie ou en chevauchement direct avec ces réarrangements structuraux (Alkan et al., 2011). La figure 7 illustre les différentes classes de variation structurale et les informations d’alignement permettant de les détecter. En A, dans le cas d’une délétion, un espacement trop important entre les deux reads d’une même paire sera interprété comme une délétion. En effet, au moment du séquençage les reads d’une même paire sont physiquement espacées par 300 paires de bases. Si la paire de séquence chevauche une jonction de délétion présente dans le génome source, l’espacement entre les séquences sera supérieur à la normale après alignement sur le génome de référence. Dans la même logique, à

l’échelle d’une séquence unique, si celle-ci porte en son sein un point de jonction de délétion, chaque partie de cette séquence, bordant cet évènement de délétion, sera alignée séparément dans le génome de référence, aux bordures de la séquence délétée. Enfin, une délétion peut-aussi être détectée par une perte locale de profondeur de couverture, qui est une mesure du nombre de fois que chaque position du génome de référence a été séquencée. Dans le cas d’une insertion, en B, l’espacement entre les reads d’une même paire sera cette fois diminué après alignement. De même, pour une séquence unique comportant une insertion, seules les extrémités bordant cette insertion pourront être alignées sur le génome de référence. Enfin, tel que présenté en C, un défaut dans l’orientation des reads d’une même paire, couplé avec une augmentation locale de couverture, peut-être la signature d’une duplication. En effet, le read droit de la paire 2 peut s’aligner à gauche du read gauche de la paire 1, puisque séquencée, dans le génome source au niveau de la duplication. Au moment de l’alignement, toute séquence issue de la duplication contribuera à augmenter, d’autant de fois que la séquence est dupliquée, la profondeur de couverture de cette même séquence sur le génome de référence. Tel que montré dans les points A, B et C, le séquençage de nouvelle génération semble donc offrir de nouvelles perspectives performantes pour réaliser une étude complète des remaniements du génome chloroplastique de l’orge en condition d’androgénèse.

Figure 7 : Principales méthodes d’analyse bio-informatique de différentes classes variations structurales. A ; Délétion, B ; Insertion, et C ; Duplication. ref. ; Génome de référence. Source ; Génome source pour le séquençage. Les flèches indiquent l’orientation des séquences avant ou après leur alignement sur le génome de référence. Adapté de Alkan et al. (2011)

2.8. Problématiques, hypothèse et objectifs

L’article de Makowska et Oleszczuk (2014) dresse un portrait de l’ensemble des questions à ce jour non résolues concernant l’albinisme. Plus spécifiquement, les éléments apportés par notre revue de littérature ont montré que la biologie des phénomènes conduisant à l’albinisme en condition d’androgénèse est encore inconnue. De nombreuses évidences, pointées par la littérature, semblent indiquer que des altérations du génome chloroplastique seraient à l’origine de ce phénomène. D’autre part, l’étape à laquelle interviennent les altérations du chloroplaste reste non résolue. Dans ce contexte, nous avons posé l’hypothèse selon laquelle il existerait des modifications du génome chloroplastique de l’orge en condition de culture de microspores isolées. Afin de mieux comprendre ce processus menant à l’albinisme, nous avons entrepris d’étudier l’intégrité du génome chloroplastique au sein de microspores d’orge et de plantes albinos via une approche de séquençage à grande échelle.

CHAPITRE III : ARTICLE

Résumé article

L’albinisme, phénomène résultant en des plantes incapables d’accomplir la photosynthèse et donc non viables, est un des inconvénients de l’androgénèse. Des études antérieures ont révélé que l’albinisme est associé à des anomalies morphologiques du chloroplaste et à la perte de certaines parties du génome chloroplastique (ADNcp). Dans ce travail, notre objectif était d’examiner l’abondance et l’intégrité structurale de l’ADNcp au sein de microspores et de plante albinos d’orge (Hordeum vulgare) avec une approche de séquençage de nouvelle génération. L’ADN total a été extrait d’une feuille verte de la plante donneuse (témoin), de microspores en phase précoce d’androgénèse, et de feuilles albinos. Ces ADN ont été séquencés et les reads ont été alignés sur le génome de référence chloroplastique. Nous avons observé une diminution de 8X dans l’abondance de reads d’ADNcp dans les microspores comparativement au contrôle (feuille verte) ; aucune preuve de réarrangement structural n’a été trouvée. Dans les feuilles albinos, contrairement à la situation observée dans les feuilles vertes et les microspores, la profondeur de couverture de l’ADNcp variait considérablement, les régions inversées-répétées (IR) bénéficiant d’une abondance moyenne seize fois plus élevée que dans les régions simples copies (SC). Dans les SC, la couverture était très variable et semble suivre un gradient diminuant à mesure que l’on s’éloigne des IR. Un tel profil de couverture chez les plantes albinos n’est pas consistant avec un génome chloroplastique circulaire.

Deep sequencing of the chloroplast genome in barley (Hordeum vulgare) microspores and albino plants derived from androgenesis

Rémi Maglione, François Belzile and Patricio Esteves

Département de Phytologie and Institut de biologie intégrative et des systèmes, Université Laval, Quebec City, Quebec, Canada

Abstract

Albinism, a condition that results in plants that are incapable of performing photosynthesis and are thus unviable, is a drawback of androgenesis. Past studies have revealed that albinism is associated with morphological anomalies of the chloroplast and the loss of certain portions of the chloroplast genome (cpDNA). In this work, our goal was to examine the abundance and structural integrity of the cpDNA in microspores and albino plants of barley (Hordeum vulgare) using next-generation sequencing. Total DNA was extracted from green leaves of the donor plant (control), microspores undergoing androgenesis, and albino leaves. These DNAs were sequenced and reads were aligned against the chloroplast reference genome. We observed an eight-fold decrease in the abundance of cpDNA reads in microspores relative to the green leaf control; no evidence of any structural rearrangement was found. In albino leaves, contrary to the situation in green leaves and microspores, depth of coverage of the cpDNA varied widely, with inverted repeats (IRs) enjoying a mean abundance 16 fold higher than the single copy region. Even across the single copy regions, coverage was highly variable and seemed to follow a gradient sloping downward with increasing distance from the IRs. Such a profile of coverage in albino plants is inconsistent with a circular chloroplast genome.

Key words: microspores, albino plant, chloroplast genome, shotgun sequencing, structural rearrangement, barley

Introduction

Plant breeding in selfing species can be viewed as occurring in two distinct phases. In a first phase, genetic variation is generated by crossing two parental lines that differ at a number of loci and recombination ensures that a vast number of novel combinations of alleles will be obtained. In a second phase, the breeder will perform selection on these new allelic combinations in the hope of identifying a superior genotype. For this second phase to be effective, the genotype of each line must be sufficiently fixed to allow these to breed true. Unfortunately, producing such fixed lines through selfing will take many generations.

In vitro culture techniques have allowed researchers to efficiently produce homozygous

plants in a single generation through various procedures leading to the production of doubled haploid (DH) progeny (Jähne and Lörz, 1995). These fixed lines can then immediately be subjected to selection as they will obviously breed true.

Not all crop species, however, are amenable to the production of DH plants (Thomas et al., 2003). Fortunately, cereals such as rice, maize, wheat and barley, in addition to being key crops contributing to food security, are among the most amenable. In barley, Hordeum

vulgare, this technology has been widely used by the breeding community and hundreds

of cultivars are known to have been developed through the production of DHs (Devaux and Kasha, 2009).

Several methods are available for DH generation, including wide crosses, gynogenesis and androgenesis. Wide crosses often result in chromosome elimination in hybrid endosperm derived from a cross between wheat (female) and distantly related species such as Hordeum

bulbosum. Although the male parent pollinates the egg cell, its chromosomes will be

subsequently eliminated from the nucleus. DH embryos will be rescued by in vitro culture (Maluszynski and 1941-, 2003). For gynogenesis, non-pollinated ovules are stimulated and induced through controlled culture medium or irradiated pollen (Castillo and Cistué, 1993).

anthers or isolated immature microspores are put in culture and initiate the production of embryos. Usually in barley, DHs are obtained using isolated microspore culture (IMC) rather than anther culture (Caredda et al., 2000). As mentioned above, the key element in IMC is the stress applied on microscopes (Huang and Sunderland, 1982). This stress can be a chemical or temperature treatment (Roberts-Oehlschlager and Dunwell, 1990) of immature spores (Sunderland and Dunwell, 1974). Influenced by that stress, the microscope genome can be spontaneously doubled. The resulting DH lines are, thus, entirely homozygous. Finally, androgenesis techniques are very useful to efficiently produce genetically fixed lines.

Despite the many desirable features of androgenesis for DH production in barley, in all genotypes, there is always a certain proportion of progeny that suffer from albinism, and this proportion can be very high (up to 100%) in some genotypes (Caredda et al., 2000). For obvious reasons, the chloroplast has been at the center of investigations into albinism (Mouritzen and Holm, 1994) and much of this work aiming to investigate the causes of albinism in cereals has been conducted in barley (Dunford and Walden 1991; Mouritzen and Holm 1994; Caredda et al. 1999, Caredda et al. 2004). Such studies have revealed that, in genotypes prone to albinism, microspore-derived embryos are characterized by the presence of small, abnormal chloroplasts containing low amounts of thylakoid and DNA (Caredda et al. 2004). At a biochemical level, it has been described that low amounts of pre-chlorophyll a and b are present in albino plants (Asakaviciute et al., 2006), but that chlorophyll a is not synthesized (Manninen, 2008).

As the chloroplast harbors its own genome, alterations or rearrangements of the plastid DNA may be linked to albinism. Previous work has suggested that cpDNA is subject to nucleolytic attack from metallo-nucleases (Sodmergen et al., 1991) or oxidative stress (Kumar et al., 2014). Furthermore, early work using Southern blot analysis revealed that plastid DNA extracted from albino plants exhibits deletions and alterations (Dunford and Walden, 1991). These rearrangements seem to occur during the early stages of androgenesis (Mouritzen and Holm, 1994; Cistué et al., 1995). Finally, a recent study has revealed that some key photosynthetic genes could no longer be amplified by PCR in up to

38% of albino plants of wheat and triticale (Mozgova et al., 2012), thus again suggesting that albinism is at least in part attributable to deletions in the cpDNA.

To date, no studies have reported on the abundance and integrity of the entire chloroplast genome during the process of androgenesis and in albino plants. As the entire sequence of the barley chloroplast genome is available since 2007 (Saski et al., 2007) and next generation sequencing (NGS) has shown huge potential to study structural rearrangements (Zhao et al., 2013), we combined these tools to explore cpDNA abundance and integrity in barley microspores and albino plants.

Materials and methods

To examine the integrity of the barley chloroplast genome in the early stages of isolated microspore culture, immature barley microspores were isolated from a six-row barley F1 (UL143 X Myriam) and used to initiate microspore culture as described in Esteves et al. (2014). Isolated microspores were collected following application of a stressful treatment meant to induce embryogenesis. As a control, a young green leaf from the F1 donor plant was collected and frozen in liquid nitrogen. To investigate the structural integrity of the chloroplast genome in albino plants, young leaves of albino plants, obtained at the term of isolated microspore culture, were collected and frozen in liquid nitrogen.

DNA extraction

All plant materials, including microspores and green or albino leaves, were subjected to a total DNA extraction. DNA was extracted from approximately 500,000 microspores or 100 mg of ground leaf tissue using the Qiagen Plant DNeasy Mini Kit (QIAGEN Inc, Toronto, Canada) according to the manufacturer’s protocol. DNA was quantified on a NanoDrop spectrophotometer and examined for integrity by gel electrophoresis.

Illumina whole genome resequencing of microspore and green leaf DNA

For each of the first two samples (microspores and green leaf from the same F1), one μg of total DNA was added to 500 μl of nebulization buffer and fragmented at 30 psi during 2 minutes with a Roche nebulizer. This solution was purified on Qiagen MiniElute columns and fragmented DNA was eluted in 60 μl. Illumina paired-end libraries were constructed using the Illumina TruSeq™ DNA Library Prep Kit at the Plateforme d'Analyses Génomiques (Institut de biologie intégrative et des systèmes (IBIS), Laval University, Quebec, QC, Canada). The two resulting DNA libraries (each with a distinct barcode) were combined in a 90:10 ratio (microspores:green leaf) and sequenced on a single lane of an

Illumina HiSeq 2000 machine at the McGill University and Génome Québec Innovation Center (Montreal, QC, Canada).

Ion Torrent whole genome resequencing of albino leaf DNA

For each of six albino leaf samples, 500 ng of total DNA were fragmented using a Covaris M220 with settings optimized to yield 250 to 350-bp fragments. Ion Torrent single-end libraries were prepared using the KAPA Hyper Prep Kit (Kapa Biosystems, Wilmington, MA, USA) at the Plateforme d'Analyses Génomiques (IBIS, Laval University, Quebec, QC, Canada). All six libraries were barcoded and combined in equimolar fashion prior to sequencing on a single Ion PI Chip (v3) using an Ion Proton System (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).

Mapping and depth of coverage

Illumina and Ion Torrent reads were aligned onto the barley (cv Morex) reference chloroplast genome (accession number EF115541) using Bowtie 2 (version 2.1). Illumina libraries were aligned with the following parameters: --very-sensitive -k2. Due to the large number of indels generated by the Ion Torrent technology, these reads were aligned with the following parameters: --very-sensitive --mp7,3 –score-min L, -0,-0.2 --rdg1,5 --rfg1,5 -k2. In both cases, the -k2 option allowed reads to map to both copies of the IRs. Depth of coverage was computed from the BAM files using Pysamstats (version 0.23, https://pypi.python.org/pypi/pysamstats). To avoid discarding reads with more than one alignment, the SAM flag was manually set to 8. Depth of coverage on all reads was initially plotted with RStudio (version 0.99). To facilitate comparisons, normalization was performed either on the number of reads (43M total reads for microspores and green leaf) or on the number of reads aligned to the chloroplast genome (151K reads aligned to cpDNA). Also, to more easily discern each region of the chloroplast genome (LSC, SSC, IRs), a sliding window analysis was performed on each of them separately with a window

Detection of structural variation

The detection of structural variation was performed by both a paired-end mapping approach (using Breakdancer-max v1.2) and a split-read approach (using Pindel v0.2.5). In both cases, default parameters were used.

Detection of genic deletions via PCR

Polymerase chain reactions were carried out with one ng of total DNA extracted from albino leaves. Amplification was performed on four genes (psaA, atpB, atpE and petA) using the same primers as Mozgova et al. (2012). PCR products were separated on a 2.5% agarose gel in 1X TAE-buffer and revealed by ethidium bromide.

Results

Abundance and structural integrity of the chloroplast genome in microspores

To explore possible structural changes occurring in the barley chloroplast genome in the course of isolated microspore culture (IMC), we sequenced a genomic library prepared from total DNA extracted from immature microspores, bound for IMC, and leaf tissue, as a control. In total, 290 and 43 million reads were obtained for these two samples, respectively (Table 1). These were mapped onto the barley chloroplast reference genome to select the subset of reads originating from cpDNA. As expected, a smaller proportion of reads from the microspore library were derived from cpDNA than was the case for the leaf library (1.6% vs 6.4%, respectively). Nonetheless, a very high depth of coverage was achieved in both cases: 3,496X for microspores and 2,043X for the leaf. Thus, despite a four-fold smaller fraction of reads being of chloroplastic origin in the microspore library, the larger sequencing effort devoted to this library resulted in high coverage.

Table 1 Summary statistics of the Illumina reads mapped to the reference chloroplast genome.

Sample Total reads (x 106₎ Reads mapped on reference (x 106₎ Fraction of chloroplast reads Mean depth of coverage Mean depth of normalized coverage Green Leaf 43 2.8 6.4% 2,043 2,043 Microspore 290 4.8 1.6% 3,496 542

We then examined the depth of coverage in each of the components of the chloroplast genome. As illustrated in the theoretical expectations shown in Figure 1a, we expected the

depth of coverage obtained with the same number of total reads (43M) from either the microspores or the green leaf (Figure 1b), the results were only partially in agreement with our expectations. Normalized read depth was obviously much higher in the green leaf sample relative to the microspore sample as indicated above (Table 1, Mean depth of normalized coverage). Although depth of coverage was not perfectly uniform, no segment of the chloroplast genome exhibited a complete lack of reads. Generally speaking, single copy regions enjoyed a fairly uniform mean coverage that was clearly inferior to the coverage seen in the IRs. This was true both for the leaf and microspore samples. Also, the abundant read coverage seen across the entire genome is incompatible with there being any deletions of a detectable size (>100 bp) shared among all copies of the chloroplast genome (as has been reported in albino plants derived from microspore culture). Some striking discrepancies were however noted. Firstly, the depth of coverage in the IRs was on average 2.8-fold higher than that in the single copy regions. Secondly, among the IRs, there was a clear difference in the coverage with the “internal” portion of the IR (immediately bordering the SSC) enjoying a notably higher coverage than the “external” portion. Finally, in both the leaf and microspore, a 7-kb segment of the LSC region (from 126 kb to 133 kb) was also covered by an exceptionally large number of reads. This was especially notable in the microspore.

)LJXUH  ([SHFWHG DQG REVHUYHG GHSWK RI QRUPDOL]HG FRYHUDJH UHVXOWLQJ IURP DOLJQPHQW RI UHDGV REWDLQHG IURP HLWKHU PLFURVFRSHV RU D JUHHQ OHDI $ ([SHFWHG

GHSWK RI FRYHUDJH SURILOH IRU UHDGV PDSSLQJ WR WKH FKORURSODVW JHQRPH $V UHDGV RULJLQDWLQJIURPRQHRUWKHRWKHULQYHUWHGUHSHDWUHJLRQ,5DDQG,5E FDQPDSWRERWK ORFDWLRQVGHSWKRIFRYHUDJHLQWKHVHUHJLRQVLVH[SHFWHGWREHWZLFHDVKLJKDVLQWKHODUJH VLQJOHFRS\/6&RUVPDOOVLQJOHFRS\66&UHJLRQV%2EVHUYHGGHSWKRIFRYHUDJHIRU UHDGV REWDLQHG IURP JUHHQ OHDI JUHHQ RU PLFURVSRUHV EURZQ 3URILOHV ZHUH REWDLQHG

Deletions are not responsible for the low coverage of microspore cpDNA

Despite the fact that we saw no evidence of sizeable deletions common to all copies of the cpDNA, we could not exclude the possibility that there be deletions in some copies of the cpDNA and that these had eluded detection based on a simple examination of the depth of coverage of mapped reads. To determine if deletions had occurred in some copies of the chloroplast genome, we performed further analyses relying on particular features of paired reads. In a first approach called paired-end mapping, we used BreakDancer to look for paired reads with an overly large insert size when aligned on the reference cpDNA. This would occur if a cpDNA molecule bearing a deletion produced a fragment with paired reads originating from two regions located at an unexpectedly large distance in the reference genome. Although BreakDancer successfully and accurately detected simulated deletions on an altered reference genome in which “foreign” sequences had been introduced (data not shown), it did not find any evidence of deletions in our paired-read data. In another approach, we used Pindel to look for direct evidence of deletions in the form of split reads, i.e. reads that overlap a deletion breakpoint. In such a case, one portion of the read maps to a particular region of the genome that is not immediately adjoining the region to which the other portion of the read maps. None of the candidate deletion junctions identified by Pindel were strongly supported (<5 reads). From these analyses, we concluded that although the cpDNA in microspores was much less abundant than in green leaves, this loss of cpDNA did not seem to arise through deletions.

Abundance and structural integrity of the chloroplast genome in albino plants To investigate the abundance and structural integrity of the chloroplast genome in albino plants obtained at the end of IMC, we sequenced a genomic library prepared from total DNA extracted from young leaves of six albino plants. On average, 11M reads were obtained for these albino samples (Table 2). After alignment against the barley reference chloroplast genome, an average of 3.4% of reads were found to map to cpDNA and this provided a mean depth of coverage of 372 reads (range = 151 to 720).

Table 2 Summary statistics of the Ion Torrent reads obtained from six albino plants Total reads represent the total of reads sequenced after trimming and filtering.

Albino sample Total reads ₍₁₀6₎ Reads mapped on _{reference (10}5₎

Fraction of chloroplast reads (%) Mean reference coverage (X) 1 24 7.1 2.95 720 2 9.3 2.9 3.07 286 3 8.6 4 4.67 402 4 10 3.5 3.39 352 5 9.7 3.2 3.27 321 6 5.7 1.5 2.72 151 Mean 1.13±0.43 3.7±1.25 3.35±0.46 372±126 Green leafR _{43 27 6.4 2,042}

R_{: the previous green leaf Illumina sequencing has been added as control}

To examine the uniformity of chloroplast genome coverage across the different albino plants, we normalized by analyzing the same number of reads that had been mapped to the reference genome (151K, as found in albino #6). As can be seen in Figure 2, the resulting depth of coverage showed several differences relative to both the expected coverage and the coverage previously observed for a green leaf and for microspores (Fig. 1). Read depth in the single copy region was not uniform. Although no sizeable region of the chloroplast genome was completely lacking coverage, on average, the single copy regions exhibited extremely low coverage. More specifically, mean coverage across all samples was 44x, and it ranged broadly going from as few as 0 reads to as many as 469 reads. In contrast, the IR regions enjoyed a much higher coverage (711x on average) but also exhibited a broad range of depths of coverage (8 to 1982 reads). Again, within the IRs, coverage was the deepest in the “internal” regions bordering the SSC region. Strikingly, the portions of the LSC region exhibiting the highest coverage were almost systematically adjoining one or the other IR, but not both in any given albino. At the same time, the transition in depth of coverage from one IR to a flanking LSC region could be very abrupt. For example, in

Figure 2: Depth of coverage of chloroplast reads in six albino plant. Distribution of reads along the barley chloroplast genome. The top track is displaying the different regions of the chloroplast genome.

3&5DQDO\VLVRIJHQHVSUHYLRXVO\UHSRUWHGWREHORVWLQDOELQRSODQWV $VLWKDGEHHQSUHYLRXVO\UHSRUWHGWKDWVRPHJHQHVZHUHXQGHWHFWDEOHLQWKHFKORURSODVW JHQRPHVRIVRPHRUPRVWDOELQRSODQWVDQGWKDWWKHVHJHQHVZHUHW\SLFDOO\ORFDWHGLQWKH /6&UHJLRQVZHZDQWHGWRGHWHUPLQHLIWKHYHU\ORZGHSWKRIFRYHUDJHZHREVHUYHGLQWKH /6&UHJLRQVZRXOGUHVXOWLQDQLQDELOLW\WRDPSOLI\WKHVHJHQLFUHJLRQV)RUWKLVSXUSRVH ZHVHOHFWHGIRXUSUHYLRXVO\VWXGLHGJHQHVDWS%SHW$SVD$DWS(0R]JRYDHWDO EDVHGRQWKHLUUHSRUWHGKLJKUDWHRIXQVXFFHVVIXODPSOLILFDWLRQDQGWKHLUORFDWLRQLQSRUWLRQV RIWKHJHQRPHGLVSOD\LQJDYHU\KLJKGHFUHDVHLQGHSWKRIFRYHUDJHLQWKHDOELQRSODQWV VWXGLHGKHUH$OWKRXJKZHXVHGWKHH[DFWVDPHSULPHUSDLUVDQGYHU\VLPLODUDPSOLILFDWLRQ FRQGLWLRQV DOO IRXU JHQHV ZHUH VXFFHVVIXOO\ DPSOLILHG LQ DOO DOELQR VDPSOHV )LJXUH  7KXVRXUDQDO\VLVRIWKHVHJHQHVVXJJHVWVWKDWDOWKRXJKWKHLUFRS\QXPEHUZRXOGEHPXFK GHFUHDVHGLQDOELQRSODQWVWKH\ZHUHQRWFRPSOHWHO\ORVWRUXQGHWHFWDEOHLQWKHVHSODQWV

Deletions are not responsible for the low coverage of the LSC regions

For a circular genome, the markedly reduced depth of coverage seen in the LSC region would need to occur through deletions preferentially involving such regions and should leave traces in the form of deletion breakpoints that would result in split reads. To explore this possibility, we used Pindel to look for split reads. Again, no evidence could be found for the existence of deletion breakpoints. We therefore conclude that the large decrease in the depth of coverage of segments of the chloroplast genome that is a unique signature of the chloroplast genome in albino plants is not due to a simple process whereby deletions eliminate portions of the genome.

Discussion

Despite the widespread use of androgenesis in many major crops and the common occurrence of albinism, our understanding of the molecular and genetic causes of this anomaly remains poor. In this work, we used deep sequencing to investigate the abundance and integrity of cpDNA in leaves of the donor plant, treated microspores and in leaves of albino plants derived from androgenesis.

A first observation brought by this study is the lower abundance of cpDNA in treated microspores. We found that the fraction of chloroplast reads was four-fold lower in treated microspores than in green leaves (1.6% vs 6.4%). When we take into account that the amount of nuclear DNA in haploid microspores is half that found in diploid leaf cells, the true decline in cpDNA abundance is probably closer to eight fold. This decline in reads mapping to the chloroplast genome is in good agreement with the previously described decline in the number of plastids found in barley microspores undergoing androgenesis. Indeed, Caredda et al. (1999) documented that, in anther culture, the most common treatments used to induce embryogenesis in barley microspores (thermal and osmotic stress) both lead to a marked reduction in the number of plastids (4.5-fold and 28-fold, respectively). Thus, from a quantitative point of view, the lower abundance of chloroplast DNA is in line with the cytological observations on chloroplast abundance. Moreover, using electron microscopy to assess the abundance of DNA in chloroplasts, Caredda et al (2004) reported that DNA was 4-7 times less abundant in chloroplast sections in microspores of barley varieties highly prone to albinism. Thus, based on cytological observations, both a reduction in the number of chloroplasts and a reduction in the amount of DNA in these chloroplasts contribute to a decreased amount of DNA in these microspores. When comparing these different methods for estimating the reduction in the amount of cpDNA in barley microspores, we feel that the assessments based on read abundance likely provides the most accurate measure.

treated microspores were detected by analyzing the depth of coverage of mapped reads. To further probe for possible genomic alterations in the cpDNA, two routinely used approaches were employed: paired-end mapping and split-read analysis. Neither of these approaches yielded any convincing evidence of deletions or other types of rearrangements. Based on all of these analyses, the cpDNA in treated microspores, although much less abundant than in green tissues, does not seem to have been altered structurally following microsporogenesis and stressful treatment of these to induce androgenesis. These conclusions seem consistent with the results of a previous study where Mouritzen and Holm (1994), using Southern blot analysis, reported that the plastid genome apparently remained intact during microspore culture. Such a deep sequencing approach, however, provides the most compelling evidence obtained to date for the structural integrity of the chloroplast genome in treated microspores used to derived DH plants in barley.

As whole genome sequencing had proven quite powerful in providing detailed information on both the abundance and integrity of the chloroplast genome in treated microspores, we reasoned that it could similarly shed light on the situation in albino plants. A first observation was that cpDNA abundance in leaves of albino plants was lower than in green leaves. Whereas in the latter 6.4% of the reads mapped to the chloroplast genome, this proportion was almost halved (3.4%) in the leaves of albino plants. To the best of our knowledge, these are the first data comparing cpDNA abundance in albino vs green plants. The most striking difference with our observations on treated microspores, however, concerned the depth of coverage of the chloroplast genome in albinos. Indeed, the genome coverage was extremely uneven, with the mean coverage of the IRs being many fold deeper than that of the SC regions. On average, the mean depth of coverage in the IRs was 16 fold higher than the mean coverage in the SC regions. Even within these broad regions themselves, depth of coverage varied quite markedly. Strikingly, the internal portion of the IRs (immediately flanking the SSC region) enjoyed a disproportionately high depth of coverage relative to other segments of the IRs. Similarly, the portions of the LSC most distant from the IRs exhibited much lower coverage than those bordering on the IRs. Finally, there seemed to be a directional gradient in the observed decline in depth of coverage with increasing distance from the IRs. In most cases, the LSC region to the right

of IRb had the highest coverage while, in one case, the LSC region to the left of IRa seemed to benefit from the most extensive coverage. Taken together, these observations do not fit well with a circular model of replication in which all SC regions are expected to be even in coverage at a level half of that seen in the IRs.

One possible explanation for this differential depth of coverage of among the various segments of a circular chloroplast genome would be that some segments (in this case the LSC region) are the targets of frequent deletions leading to a multitude of incomplete copies. If such were the case, we expected to find evidence of such rearrangements in the form of deletion breakpoints. Despite our efforts, we were not able to find any split reads supporting the existence of such deletion derivatives of a circular genome.

Previous work has also shed doubt on the circular nature of the chloroplast genome. Using microscopy, Oldenburg and Bendich (2004) have shown that cpDNA is mainly present in a linear form. Indeed, their pulsed-field gel electrophoresis coupled to restriction fragment mapping, and fluorescence microscopy of individual DNA molecules allowed them to work with unfractionated cpDNA and revealed that only 3-4% of these molecules are present in circle form. They described that 95% of the cpDNA was found in a complex where all linear fibers, of uneven lengths, were branched together. They called this supra-structure a “nucleoid”. Many of the features of such a supra-structure provide a better fit with the observations derived from our deep sequencing of the chloroplast genome in albino plants. Firstly, the massive difference observed between the low mean coverage (44x) in the LSC region and the high mean coverage (771x) in the IRs highly suggest either that the LSC region was replicated less effectively or that it was more often subject to degradation. As explained above, in a circular model, smaller circular cpDNA molecules would be expected to generate breakpoints, but none were found through split-read analysis. In contrast, with linear cpDNA, it is much easier to imagine how the linear fibers of uneven length described by Oldenburg and Bendich (2004) could result in the pattern of read coverage observed in this work. Secondly, an internal portion of the IR showed the highest coverage and,

and leaf samples. This is consistent with the existence of a nucleoid structure where linear molecules are branched. Furthermore, in the stressful environment, caused by the switch of microspore, from a gametophyte to a sporophytic pathway, the cpDNA may be subjected to many structural alterations, such as deletions. As replication frequently takes place in the internal portion of the IRs, we presume that the replication machinery will be abundantly organized around such regions. Taken together, we anticipate that this replication machinery will result in a protection against deletion by structural hindrance. Thus, the region close to the replication origin will be less subject to degradation during androgenesis. Thirdly, we observed a directional gradient of coverage in the LSC with the highest depths of coverage occurring immediately next to the IRs and coverage decreasing as we move away from the IRs. Again, such a gradient is difficult to reconcile with a circular genome in which no internal deletions could be detected. In contrast, the “nucleoids” described by Oldenburg and Bendich (2004) would produce the type of coverage we observed due to the relative scarcity of long linear fibers.

Finally, we wanted to test if the great reduction in read depth in some portions of the LSC could result in an inability to amplify some genic regions as reported in albino plants of wheat and triticale reported by Mozgova et al. (2012). Using primers for the genes that had showed the highest frequency of unsuccessful amplification (atpB, petA, psaA, atpE), we observed that we could successfully amplify all of these in our six albino barley plants. Nonetheless, from the data presented in Figure 3, it is clear that the copy number (per cell) of the different genes coded by the chloroplast genome would differ markedly, and that this could lead to severe imbalances between the gene products needed to make a functional chloroplast, be they coded in the nucleus or the chloroplast.

To summarize, we have provided evidence for major changes in the structure of the chloroplast genome in albino plants derived from androgenesis. As the circular model for the organization of the chloroplast genome proved incompatible with our observations, whereas a linear model proved much more compatible, we are led to believe that a linear form of the chloroplast genome may be more prevalent than previously realized. No such disturbance was observed among microspores or leaf samples. At the same time, this study provides, for the first time, the profile of the entire chloroplast genome at early and final