L’objectif principal de ce projet était d’évaluer si des défauts d’intégrité du génome chloroplastique de l’orge pouvaient être observés en condition de culture de microspores isolées (CMI) et expliquer l’origine des plantes albinos issues de cette technique. Les résultats obtenus ont permis d’invalider cette hypothèse pour les microspores au stade précoce de culture et de la valider pour les plantes albinos.
L’obtention de lignées homozygotes grâce aux techniques d’haplodiploïdisation, comme la culture de microspores, est un enjeu économique important. Mais, la CMI génère parfois une proportion importante de plantes albinos, laquelle peut atteindre 100 % chez certains cultivars. Le chloroplaste, et son génome en particulier, a fait l’objet de nombreuses études afin de mieux comprendre les processus impliqués dans l’albinisme. Avec les approches de séquençage de nouvelle génération et la disponibilité de la séquence complète du génome chloroplastique de l’orge, de nouvelles perspectives d’investigation étaient possibles.
Dans cette optique, nous avons réalisé un séquençage sur des microspores à un stade précoce de CMI. Cette approche n’avait jamais été réalisée auparavant. Afin de palier à un potentiel problème de couverture, les ADN des micropores et d’une feuille de la plante donneuse (témoin) ont été combinés de manière inégale (ratio 9:1) afin de favoriser une couverture plus élevée des microspores, car nous craignions que cet échantillon puisse présenter une plus faible abondance d’ADNcp. Ceci nous a permis d’obtenir suffisamment de reads afin de réaliser une analyse bioinformatique d’abondance et des variations structurales de l’ADNcp chez les microspores. Comparativement au témoin, les microspores présentent une réduction de l’ADNcp de 8X. Mais, bien qu’une investigation bioinformatique poussée ait été menée, aucunes délétions expliquant cette diminution n’ont été trouvées. Ainsi, nous avons conclu que les microspores présentaient une réduction généralisée d’ADNcp sans toutefois présenter de modifications structurales du génome chloroplastique. Ceci serait en adéquation avec la diminution d’ADNcp observé en microscopie électronique dans les phase précoce de CMI par Caredda et al. (2004).
La deuxième partie de nos travaux a été d’appliquer notre approche d’analyse bio- informatique d’abondance et de variations structurales de l’ADNcp chez des plantes albinos. Notre objectif était de dresser un portrait de l’ADNcp présent au sein de feuilles chez des plantes albinos issues de la CMI. En comparant les profils d’alignement obtenus à ceux de la plante témoin et des microspores, l’ADNcp des plantes albinos présentaient de nombreuses anomalies.
Ces altérations peuvent être résumées en quatre points :
- Une forte attrition de séquences dans les régions simple copie (SC).
- Une quantité de reads largement supérieure à nos attentes dans les régions inversées- répétées (IR)
- Une excès de séquences à l’intérieur des IR, au niveau des origines de réplication - Un gradient de couverture au niveau des régions SC en périphérie des IR.
Ces observations n’étant pas en adéquation avec un modèle circulaire du génome chloroplastique, nous avons examiné la littérature pour voir si des modèles différents avaient été proposés et si ceux-ci étaient davantage conformes avec nos observations. Dans leurs travaux, Oldenburg et Bendich (2004) ont rapporté que la majorité (>95 %) des molécules d’ADNcp seraient linéaires et organisées sous forme de nucléoïde, un amas de génomes chloroplastiques.
Inspiré directement de ces travaux, le modèle que nous proposons est donc le suivant : les molécules d’ADNcp seraient linéaires et regroupées en structures nucléoïdaires connectées entre elles au niveau des origines de réplication au sein des IR. Cette architecture procurerait une protection contre une activité nucléolytique pour les régions incluses dans le cœur du nucléoïde. De plus, une activité de réplication répétée pour ces régions (origine de réplication et IR) expliquerait leur relative abondance à l’issue de la CMI. Enfin, si on imagine que la réplication peut s’interrompre avant d’avoir répliqué la totalité de l’ADNcp, il est facile de concevoir l’apparition de molécules linéaires de tailles différentes : ceci corroborait l’observation des gradients de couverture. Ainsi, ce modèle d’un génome
D’autre part, les gènes photosynthétiques rapportés non amplifiables chez les albinos par Mozgova et al. (2012) étaient situés au sein des régions SC présentant de fortes attritions de séquence. Il devenait possible d’expliquer l’impossibilité d’amplifier ces gènes chez certaines plantes albinos par une forte réduction de l’abondance de ces séquences plutôt que par des délétions touchant des régions spécifiques du génome. Afin d’explorer cette hypothèse, nous avons réalisé une amplification PCR des quatre gènes qui s’étaient avérés les plus sujets à un tel échec de l’amplification. En faisant appel aux mêmes amorces et aux mêmes conditions d’amplification, tous les gènes ont été amplifiés avec succès chez chacune de nos plantes albinos ainsi que chez le témoin, Nous en avons déduit que, malgré les fortes pertes de séquences dans les régions SC, il persiste une quantité suffisante d’ADNcp dans ces régions pour amplifier ces gènes chez des plantes albinos.
Ainsi, il semblerait que, même si l’ADNcp souffre d’une importante perte de séquences dans les régions SC, certaines copies, potentiellement complètes, persisteraient à l’issue de la CMI. Ce fait saillant pourrait être traduit biologiquement par un déficit de génome chloroplastique complet responsable d’une insuffisance du nombre de copies d’ADNcp fonctionnel par chloroplaste. Autrement dit, en dessous d’un certain niveau de quantité d’ADNcp, le chloroplaste ne peut plus assurer ses fonctions, et les plantes régénérées seront albinos à l’issue de la CMI. Une future étude pourrait s’intéresser au taux d’expression de ces gènes localisés dans les régions souffrant d’une forte attrition génomique. Une approche par qRT-PCR permettrait de vérifier s’il existe une corrélation entre la faible présence de séquences génomiques dans les SC et un faible taux d’expression de gènes essentiels à la photosynthèse.
De précédentes études avançaient qu’il se produisait une dégradation de l’ADNcp dans les stades précoces de la CMI ; notre étude vient invalider ces hypothèses et corrobore les théories de dégradation tardive, c’est-à-dire dans la phase de régénération. C’est dans la multitude de stades existant entre le stade des microspores prétraitées et les plantes albinos que se trouve la clef des processus biologiques de dégradation de l’ADNcp conduisant à l’albinisme en CMI. Des études ultérieures, employant notre approche de séquençage de nouvelle génération, couplée à une analyse d’abondance et de variation structurales de l’ADNcp, pourraient être réalisées systématiquement à plusieurs stades de la CMI afin de
dresser un portrait précis de ces phénomènes d’altération du génome chloroplastique de l’orge en CMI. Cette démarche pourrait être employée conjointement avec une investigation du génome nucléaire. En effet, de nombreuses fonctions chloroplastiques sont codées par des gènes nucléaires, et de récentes études ont montré que le phénotype de l’albinisme était en partie sous contrôle nucléaire (Krzewska et al., 2015) .
En conclusion, ce projet, avec son approche novatrice où un séquençage du génome chloroplastique de microspores a été réalisé pour la toute première fois, a révélé que l’ADNcp de microspores prétraitées, bien que moins abondant, est intact à ce stade précoce de la CMI. De plus, l’étude sur les albinos a permis de mettre en évidence de nouvelles connaissances quant aux dommages de l’ADNcp en condition de CMI. Finalement, d’un point de vue biologique, la régénération de plante verte ou albinos est condition de la survie d’une population suffisante d’ADNcp intact, à l’issu de la CMI.
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