Évaluation in vitro de l'efficacité du peramivir
contre des variants du virus de l'influenza A(H1N1),
A(H3N2) et B contenant différentes mutations dans
le gène de la neuraminidase
Mémoire
Véronique Tu
Maîtrise en Microbiologie-Immunologie
Maître ès sciences (M.Sc.)
Québec, Canada
© Véronique Tu, 2017
Évaluation in vitro de l'efficacité du peramivir
contre des variants du virus de l'influenza A(H1N1),
A(H3N2) et B contenant différentes mutations dans
le gène de la neuraminidase
Mémoire
Véronique Tu
Sous la direction de :
Résumé
Les virus influenza sont des pathogènes respiratoires responsables d’épidémies saisonnières touchant 10 à 20% de la population mondiale chaque année, constituant donc un problème majeur de santé publique. La vaccination annuelle réduit l’impact des épidémies grippales; cependant, un mésappariement entre les souches vaccinales et circulantes peut parfois survenir et résulter en un échec de protection de la population. Dans ces cas, il est important d’avoir un traitement adéquat afin de traiter l’infection virale. Les inhibiteurs de la neuraminidase (INAs) constituent la principale classe d’antiviraux recommandée pour la prévention et le traitement des infections grippales. Les INAs lient de façon compétitive le site actif de la neuraminidase (NA), ce qui bloque la libération des virions des cellules hôtes inhibant de la sorte la dissémination du virus dans le tractus respiratoire. L’émergence sporadique de virus résistants à l’oseltamivir et/ou au zanamivir avec de faibles taux de transmission a été identifiée lors de traitements des souches saisonnières de l’influenza. Le développement de nouveaux antiviraux devient donc un sujet important d’investigation. Le peramivir, un nouvel INA disponible depuis peu en Amérique du Nord, exerce une activité sur des virus influenza A et B et son efficacité contre des mutants résistants à l’oseltamivir ou au zanamivir n’a pas encore été complètement caractérisée. À cause des différences dans la liaison des INAs avec l’enzyme cible, la nature des mutations de résistance peut varier d’un INA à l’autre bien que certaines mutations pourraient engendrer une résistance croisée à plusieurs INAs. Nous avons démontré que le peramivir s’avère très actif contre les différents sous-types de grippe saisonnière, quoique certains variants aient présentés des phénosous-types de multi-résistance à l’oseltamivir, au zanamivir ainsi qu’au peramivir. À cet égard, un nouveau mécanisme de résistance d’un variant menant à la résistance croisée aux INAs a été décrit (I427T/Q313R) dans le cadre de ce mémoire et a permis de comprendre comment des substitutions retrouvées hors du site actif de la NA peuvent affecter la capacité de réplication du virus et sa résistance aux antiviraux.
Abstract
Influenza viruses are respiratory pathogens responsible for seasonal epidemics affecting 10 to 20% of the world's population every year, thus constituting a major public health impact. Annual vaccination reduces the impact of influenza epidemics; however, a mismatch between the vaccine strain and the circulating strain can sometimes occur and result in an unsuccessful attempt in protecting the population. In such cases, it is important to have adequate treatment to treat influenza infections. Neuraminidase inhibitors (NAIs) are the primary class of antiviral agents recommended for the prevention and treatment of influenza infections. NAIs competitively bind the neuraminidase (NA) active site, blocking the release of virions from host cells and thereby inhibiting the spread of the virus into the respiratory tract. The sporadic emergence of oseltamivir- and/or zanamivir-resistant viruses with low transmission rates was identified in seasonal influenza strains. The development of new antivirals thus became an important subject of investigation. Peramivir, a new NAI recently available in North America, exerts its activity against influenza A and B viruses, but its effectiveness against mutations conferring resistance to oseltamivir or zanamivir has not yet been fully characterized. Due to differences in the binding of NAIs to the target enzyme, the nature of the resistance mutations may vary from one NAI to another, although some mutations could induce global NAI cross-resistance. We have demonstrated that peramivir is highly active against the different seasonal influenza subtypes, although some variants have shown multi-resistance phenotypes to oseltamivir, zanamivir as well as peramivir. In this regard, a new resistance mechanism by which a NA variant leads to NAI cross-resistance (I427T/Q313R) has been described in this thesis and has helped to understand how substitutions found outside the NA active site can affect the replication kinetics of the virus and its resistance to antivirals.
Table des matières
Résumé ... iii
Abstract ... iv
Table des matières ... v
Liste des tableaux ... viii
Liste des figures ... ix
Liste des abréviations et des sigles ... x
Remerciements ... xiii
Avant-propos ... xiv
Chapitre 1. Introduction ... 1
Section 1 : Introduction au virus influenza ... 1
1.1 Historique ... 1
1.2 Structure et classification ... 1
1.2.1 Segments 1, 2 et 3 : polymérases (PB1, PB2 et PA) ... 3
1.2.2 Segment 4 : hémagglutinine (HA) ... 4
1.2.3 Segment 5 : nucléoprotéine (NP) ... 4
1.2.4 Segment 6 : neuraminidase (NA) ... 4
1.2.5 Segment 7 : protéines de la matrice (M1 et M2) ... 5
1.2.6 Segment 8 : protéines non-structurales (NS1 et NEP/NS2) ... 6
1.3 Cycle réplicatif ... 7
1.3.1 Attachement et entrée du virus dans la cellule hôte ... 7
1.3.2 Fusion et décapsidation ... 8
1.3.3 Réplication du virus et synthèse des protéines virales ... 8
1.3.4 Assemblage du virion et détachement de la cellule hôte ... 8
1.4 Génétique du virus ... 9 1.4.1 Changements antigéniques ... 9 1.4.1.1 Glissement antigénique ... 9 1.4.1.2 Cassure antigénique ... 10 1.4.3 Génétique inverse ... 10 1.5 Aspects cliniques ... 11 1.5.1 Transmission ... 11 1.5.2 Symptomatologie ... 12 1.5.3 Diagnostic ... 13 1.5.4 Réponse immunitaire ... 14
Section 2 : Traitements et prévention ... 16 1.6 Vaccins ... 16 1.6.1 Vaccins inactivés ... 16 1.6.2 Vaccins atténués ... 17 1.6.3 Vaccins en développement ... 18 1.7 Antiviraux ... 19 1.7.1 Adamantanes ... 20 1.7.1.1 Mode d’action ... 21
1.7.1.2 Indications cliniques et pharmacocinétique ... 21
1.7.2 Inhibiteurs de la neuraminidase ... 21
1.7.2.1 Mode d’action ... 22
1.7.2.2 Indications cliniques et pharmacocinétique ... 23
1.7.2.2.1 Oseltamivir ... 23
1.7.2.2.2 Zanamivir ... 23
1.7.2.2.3 Peramivir ... 24
1.7.2.2.4 Laninamivir ... 25
1.7.3 Résistance aux antiviraux ... 25
1.7.3.1 Résistance aux adamantanes ... 26
1.7.3.2 Résistance aux inhibiteurs de la neuraminidase ... 27
1.7.3.2.1 Détection de la résistance aux INAs ... 27
1.7.3.2.2 Mutations de résistance au sein de la NA ... 28
1.7.3.2.3 Mutations de résistance au sein de la HA ... 32
1.7.4 Antiviraux en développement ... 33
Chapitre 2. Hypothèses et objectifs ... 34
2.1 Hypothèses ... 34
2.2 Objectifs ... 34
Chapitre 3. Article 1 ... 35
Peramivir susceptibilities of recombinant influenza A and B variants selected with various neuraminidase inhibitors. ... 35
3.1 Résumé ... 36
3.2 Abstract ... 37
3.3 Article ... 38
3.3.1 Introduction ... 38
3.3.2 Materials and methods ... 39
3.3.4 Discussion ... 41 3.3.5 Acknowledgments ... 43 3.3.6 Tables ... 44 3.3.7 References ... 47 3.3.8 Supplementary data ... 49 Chapitre 4. Article 2 ... 51
The I427T neuraminidase (NA) substitution, located outside the NA active site of an influenza A(H1N1)pdm09 variant with reduced susceptibility to NA inhibitors, alters NA properties and impairs viral fitness ... 51
4.1 Résumé ... 52
4.2 Abstract ... 53
4.3 Article ... 54
4.3.1 Introduction ... 54
4.3.2 Materials and methods ... 55
4.3.3 Results ... 58 4.3.4 Discussion ... 60 4.3.5 Tables ... 62 4.3.6 Figures ... 63 4.3.7 References ... 67 4.3.8 Supplementary material ... 70 Chapitre 5. Discussion ... 71
Chapitre 6. Conclusions et perspectives ... 81
Liste des tableaux
Chapitre 1. Introduction ... 1 Tableau 1. Protéine encodées par les différents segments d’ARN du virus influenza ... 6 Tableau 2. Critères de classification de la sensibilité des virus influenza aux INAs tel que proposés par
l’OMS pour la surveillance et le rapport de résistance aux INAs ... 28
Chapitre 3. Article 1 ... 35 Table 1. Summary of neuraminidase (NA) and hemagglutinin (HA) substitutions selected for
cross-resistance analysis against NA inhibitors ... 44
Table 2. Phenotype of susceptibility to NA inhibitors for recombinant influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2)
and B proteins. ... 45
Table 3. Evaluation of IC50 values of recombinant influenza A and B HA mutant viruses by plaque size or viral yield assays. ... 46
Table S1. Summary of discordant phenotypes between this study and the literature. ... 50 Chapitre 4. Article 2 ... 51 Table 1. Susceptibility profiles of recombinant influenza A(H1N1)pdm09 viruses to neuraminidase inhibitors
(NAI). ... 62
Liste des figures
Chapitre 1. Introduction ... 1
Figure 1. Image du virus influenza purifié visualisé par microscopie électronique ... 2
Figure 2. Composition du virus influenza ... 3
Figure 3. Cycle réplicatif du virus influenza ... 7
Figure 4. Phénomènes de glissement antigénique et de cassure antigénique des virus influenza ... 9
Figure 5. Représentation du système de transcription bidirectionnelle pour le virus influenza ... 11
Figure 6. Comparaison des caractéristiques structurales des particules virales et des VLPs ... 19
Figure 7. Mode d’action des antiviraux sur différentes étapes du cycle de réplication du virus influenza ... 20
Figure 8. Représentation de l’adamantane et de ses dérivés aminés, l’amantadine et la rimantadine ... 20
Figure 9. Structures chimiques des inhibiteurs de la neuraminidase ... 22
Figure 10. Image par microscopie électronique à transmission de cellules MDCK infectées avec le virus influenza A, en absence et en présence des inhibiteurs de la neuraminidase ... 23
Figure 11. Sites d’interaction de la rimantadine et de l’amantadine au sein de la protéine M2 ... 27
Figure 12. Interactions différentes entre l’acide sialique et les inhibiteurs de la neuraminidase ... 29
Figure 13. Mécanisme de résistance à l’oseltamivir. ... 29
Chapitre 3. Article 1 ... 35
Figure S1. Representative pictures showing the impact of peramivir on viral plaque size in recombinant A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) (PR8) and B/Phuket/3073/13 (B/Phu) variants. ... 49
Chapitre 4. Article 2 ... 51
Figure 1. Cell surface expression/activity of recombinant A(H1N1)pdm09 neuraminidases (NAs). ... 63
Figure 2. Replicative properties of recombinant A(H1N1)pdm09 viruses in vitro ... 64
Figure 3. Kaplan Meier survival curve, body weight losses and lung viral titers of mice infected with recombinant A(H1N1)pdm09 viruses ... 65
Liste des abréviations et des sigles
ADN : acide deoxyribonucléique
ARN : acide ribonucléique
ARNc : ARN complémentaire
ARNm : ARN messager
ARNv : ARN viral
AS : acide sialique
BGH : hormone de croissance bovine – ‘bovine growth hormone’
CDC : Centre de contrôle et de prévention des maladies - ‘Center for Disease control and prevention’
CMV : cytomégalovirus
DANA : 2-deoxy-2,3-didehydro-N-acetylneuraminic acid
EC
50: concentration effectrice médiane – ‘half maximal effective concentration’
HA : hémagglutinine
HRI : inhibition hautement réduite - ‘highly reduced inhibition'
IC
50: concentration inhibitrice médiane - ‘inhibitory concentration at 50%’
IFN-α/β : interféron de type I alpha/beta
IL : interleukine
INA : inhibiteur de la neuraminidase
kg : kilogramme
LAIV : vaccins vivants atténués - ‘live attenuated influenza vaccine’
LNM : laboratoire national de microbiologie
LSPQ : laboratoire de santé publique du Québec
MDCK : Madin-Darby canine kidney
mg : milligramme
ml : millilitre
NA : neuraminidase
NEP/NS2 : protéine d'export nucléaire/non-structurale 2 - ‘nuclear export/non-structural protein’
NI : inhibition normale - 'normal inhibition’
NLRP3 : récepteur de type NOD contenant le domaine pyrine 3 - ‘NOD (nucleotide-binding oligomerization
domain) -like receptor family, pyrin-domain containing 3’
NP : nucléoprotéine
NS1 : protéine non-structurale 1
OMS : Organisation mondiale de la santé
PA : polymérase acide
PB1 : polymérase basique 1
PB2 : polymérase basique 2
polI : ARN polymérase I
polII : ARN polymérase II
PRR : récepteur de reconnaissance de motif – ‘pattern recognition receptor’
RBS : site de liaison du récepteur - ‘receptor binding site’
RI : inhibition réduite - ‘reduced inhibition’
RLR : récepteur de type RIG-I - ‘RIG-I (retinoic acid-inducible gene I) -like receptor’
RT-PCR : transcription inverse puis réaction de polymérisation en chaîne en temps réel - ‘reverse transcriptase
polymerase chain reaction’
S : sensible
SDM : simulations par dynamique moléculaire
TLR : récepteur de type Toll – ‘Toll-like receptor’
TNF-α : facteur de nécrose tumorale alpha - ‘tumor necrosis factor alpha’
VI : vaccin inactivé
VIH/SIDA : virus de l'immunodéficience humaine / syndrome d'immunodéficience acquise
VIQ : vaccin inactivé quadrivalent
VIT : vaccin inactivé trivalent
VLP : particules de type viral / ‘virus-like particule’
vRNP : complexe ribonucléoprotéique viral
µg : microgramme
À mes parents,
et à mon merveilleux mari,
Remerciements
Le mémoire présenté n’aurait pas été possible sans l’appui de plusieurs personnes dont j’aimerais prendre le temps de remercier.
Tout d’abord, je remercie mon directeur de recherche, Dr Guy Boivin, pour m’avoir accueilli dans son laboratoire, de m’avoir confié ce projet et pour sa patience infinie lors de nos rencontres. J’aimerais aussi remercier Dr Yacine Abed, qui a su me superviser au quotidien, m’aider à faire avancer mes projets, m’appuyer dans tous mes apprentissages et sans qui ma maîtrise n’aurait pas été aussi fructueuse. J’aimerais aussi remercier mes collaborateurs, Dr Patrick Lagüe et Xavier Barbeau, qui ont permis d’aller ajouter une expertise à mon projet.
J’aimerais remercier au passage Dr Gary Kobinger et Dre Caroline Duchaine d’avoir accepté d’évaluer ce mémoire.
Je remercie toute l’équipe du Dr Boivin (Natalie Goyette, Julie Carbonneau, Marie-Hélène Cavanagh, Chantal Rhéaume, Liva Checkmahomed, Mariana Baz, Marie-Eve Hamelin et Jocelyne Piret), qui constitue le coeur dynamique de l’équipe, ainsi que les étudiants du laboratoire que j’ai côtoyés lors de ma maîtrise, entre autres Clément Fage, Coraline Canivet, Karima Zarrouk et Martin Pilaev. Merci à mes chères amies Catherine Thériault et Stéphanie Hallée avec qui j’ai partagé tous mes bons et mes mauvais moments au laboratoire. Je remercie aussi les autres membres du centre de recherche qui ont permis de créer un environnement amical au sein du CRI.
Merci aussi à mon frère qui a toujours su soulager mon stress rattaché aux études avec un brin d’humour. Un énorme merci à mon mari, Hassan Nassour, qui m’a encouragé et avec qui je peux toujours discuter de recherche. Ma maîtrise n’aurait définitivement pas été la même sans sa patiente écoute, ses solutions pour mes ‘problèmes’ et tout son support.
Finalement, merci infiniment à mes parents, qui ont toujours insisté sur l’importance de mon éducation, en m’encourageant toutes ces années. Ils m’ont permis de me rendre jusqu’à ce point dans ma vie et dans mes études, et je leur en serai éternellement reconnaissante.
Avant-propos
Ce mémoire portant sur la caractérisation de la résistance des virus influenza aux inhibiteurs de la neuraminidase inclut deux articles qui ont été publiés en 2017. Le premier article, pour lequel je suis co-première auteure, a été accepté pour publication en Février 2017 dans le journal Antiviral Therapy. Le deuxième article, pour lequel je suis première auteure, a été publié dans le journal Antiviral Research en Janvier 2017. Quelques modifications ont été apportées aux articles afin d’assurer leur homogénéité au sein de ce mémoire.
Premier article: Peramivir susceptibilities of recombinant influenza A and B variants selected with various neuraminidase inhibitors.
Auteurs : Clément Fage#, Véronique Tu#, Julie Carbonneau, Yacine Abed and Guy Boivin Centre de recherche en infectiologie du CRCHU de Québec-Université Laval.
# Contribution équivalente de ces auteurs au projet.
Contribution dans l’article : Réalisation, analyse et comparaison avec littérature des expériences de susceptibilité des variants ayant des mutations dans leur gène de la neuraminidase.
Deuxième article: The I427T neuraminidase (NA) substitution, located outside the NA active site of an influenza A(H1N1)pdm09 variant with reduced susceptibility to NA inhibitors, alters NA properties and impairs viral fitness
Auteurs : Véronique Tua, Yacine Abeda, Xavier Barbeaub, Julie Carbonneaua, Clément Fagea, Patrick Lagüec, Guy Boivina
a Centre de recherche en infectiologie du CRCHU de Québec-Université Laval ; b Proteo et IBIS, Département de chimie, Faculté de sciences et génie, Université Laval ; c Proteo et IBIS, Département de biochimie microbiologie et bio-informatique, Faculté de sciences et génie, Université Laval.
Contribution dans l’article : Rédaction et relecture critique de l’article ; Réalisation et analyse de la majorité des expériences incluses dans l’article (susceptibilité aux inhibiteurs de la neuraminidase, capacité de réplication virale in vitro, cinétique enzymatique virale et expériences in vivo).
Chapitre 1. Introduction
Section 1 : Introduction au virus influenza
1.1 Historique
Le virus influenza est l’agent causal de la grippe et cause entre 3 et 5 millions de cas de maladies graves à chaque année au niveau international, menant à environ 250 000 à 500 000 décès (1). Au Canada, la grippe affecte environ 10-20% de la population, menant à 12 200 hospitalisations et 3 500 décès annuellement (2). Les épidémies surviennent annuellement dues à des changements antigéniques des souches virales en circulation, faisant de la grippe et des maladies associées à la pneumonie la 8e cause de décès au Canada (3). Les pandémies grippales quant à elles se produisent à des intervalles de 10 à 50 ans (environ trois fois par siècle) et sont causées par l’émergence de nouveaux sous-types viraux hautement transmissibles qui se propagent au niveau mondial et pour lesquels la grande majorité de la population n’a pas développé d’immunité. La première pandémie a été rapportée par Hippocrate en Grèce Antique et aurait eu lieu en 412 av. J.-C. (4). La grippe espagnole de 1918, causée par le sous-type viral A(H1N1), est la pandémie la plus importante rapportée jusqu’à ce jour, ayant occasionnée jusqu’à 50 millions de décès (5). Depuis, deux pandémies de moins grande envergure, causées par la grippe asiatique causée par le virus A(H2N2) et la grippe de Hong Kong causée par le virus A(H3N2), ont aussi émergé en 1957 et 1968, respectivement (6). Plus récemment, la pandémie de 2009 causée par une nouvelle lignée du virus influenza A(H1N1) d’origine porcine aurait été responsable d’environ 400 000 décès à l’international dans cette même année (7).
1.2 Structure et classification
Le virus influenza est un virus à ARN enveloppé appartenant à la famille des Orthomyxoviridae. Le genre influenzavirus affectant l’humain se divise en trois différents types sérologiques, soit les types A, B et C, qui se classifient selon l’antigénicité de leur nucléoprotéine (NP) ainsi que de leur protéine de matrice M1 (8,9). Seul le type A se divise davantage en différents sous-types, caractérisés par les glycoprotéines hémagglutinine (HA) et neuraminidase (NA) à la surface du virus. Jusqu’à présent, 18 types de HA (H1-H18) et 11 sous-types de NA (N1-N11) ont été rapportés (10) ; cette liste est susceptible d’évoluer avec la découverte de nouveaux sous-types. L’identification des virus influenza suit une nomenclature standardisée précisant le type viral, l’hôte d’origine si non humain, l’origine géographique de l’isolat, le numéro de la souche isolée ainsi que l’année d’isolation du virus. Dans le cas des virus influenza de type A, cette identification est ensuite accompagnée des sous-types HA et NA entre parenthèses, par exemple la souche pandémique de 2009 A/Quebec/144147/09 (H1N1), dont l’acronyme est A(H1N1)pdm09 (8).
Les différents sous-types des virus influenza A sont retrouvés dans différents hôtes, notamment chez l’humain, les oiseaux, les chevaux, les porcs et autres animaux. Bien qu’ils aient été décrits comme infectant d’autres mammifères, les virus influenza de type B infectent principalement les humains. Jusqu’à la fin des années 1970, ce type viral formait un groupe homogène, après quoi ils ont divergé dans deux lignées antigéniquement et génétiquement distinctes, de type B/Victoria/2/87 (‘B/Victoria-like’) et de type B/Yamagata/16/88 (‘B/Yamagata-like’), qui sont maintenant en co-circulation à l'échelle mondiale. De plus, les virus influenza de types A et B causent des épidémies annuelles, mais seul le type A mène à d’occasionnelles pandémies. Les virus de types A et B sont responsables des grippes humaines et par conséquent ce sont ces types qui sont représentés dans les vaccins annuels d’influenza (11). Présentement, les virus responsables des grippes saisonnières sont les virus A(H1N1)pdm09, A(H3N2) et B (B/Victoria-like et B/Yamagata-like). Les infections au virus influenza de type C ont été rapportées comme étant bégnines chez l’humain (12).
La particule virale du virus influenza est pléomorphe (plus souvent sphérique) avec un diamètre variant entre 80 et 120 nm (figure 1) (13). Les virus influenza de types A et B sont composés de huit segments d’ARN à polarité négative codant pour 12 et 11 protéines, respectivement, alors que les virus influenza de type C sont composés de seulement sept segments d’ARN codant pour 9 protéines (14). Le génome complet du virus influenza A contient environ 13 600 nucléotides, alors que celui du virus influenza B en contient 14 600 et le virus influenza C, 12 900 (15). Ces différents segments sont numérotés selon la longueur de leur brin (du plus grand au plus petit) et seront décrits dans les sections qui suivront (Tableau 1). Chaque segment d’ARN viral (ARNv) est compris dans un complexe ribonucléoprotéique viral (vRNP) transcriptionnellement actif. À l’intérieur de ce complexe vRNP, l’ARNv est associé aux NP virales ainsi qu’à un complexe d'ARN polymérases ARN-dépendant composé des protéines : polymérase basique 1 (PB1), polymérase basique 2 (PB2) et polymérase acide (PA) (figure 2).
Figure 2. Composition du virus influenza. Figure adaptée et traduite de (16).
1.2.1 Segments 1, 2 et 3 : polymérases (PB1, PB2 et PA)
Les protéines PB2, PB1 et PA formant le complexe polymérase sont codées par les segments 1, 2 et 3, respectivement, et sont responsables de la réplication ainsi que de la transcription de l’ARNv (voir section 1.3.3 plus bas). La protéine PB2 est majoritairement associée à l’initiation de la transcription virale grâce à sa capacité de reconnaissance des ARN pré-messagers (pré-ARNm) coiffés de l’hôte (17), qui seraient ensuite clivés par l’activité endonucléase de la protéine PA afin de créer une amorce de départ pour la transcription de l’ARNv (18). La polymérase PB1 assurerait quant à elle l’élongation en catalysant l’addition séquentielle de nucléotides au brin d’ARN (19).
Le segment 2 code également pour les protéines PB1-F2 et PB1-N40 dans différents cadres de lecture. La protéine PB1-F2 a été retrouvée au niveau des mitochondries et serait impliquée dans l’altération de la morphologie mitochondriale, la dissipation du potentiel membranaire de la mitochondrie ainsi que la mort cellulaire (20). La protéine PB1-N40 a été découverte plus récemment (21) et son rôle n’est pas encore clair, bien qu’il semblerait qu’elle soit impliquée dans le maintien d’une balance entre l’expression de PB1 et PB1-F2 (22).
Enveloppe lipidique dérivée des cellules hôtes
Protéines non-structurales
Complexe polymérase
ARNv
1.2.2 Segment 4 : hémagglutinine (HA)
L’hémagglutinine (HA) constitue l’antigène majeur retrouvé à la surface du virus influenza. Le nom de cette glycoprotéine provient de son habilité d’agglutiner les érythrocytes, un processus nommé l’hémagglutination. Le 4e segment du virus encode pour la protéine précurseur HA0 qui s’associe de façon non-covalente en homotrimère. Des modifications post-traductionnelles de HA0 permettant de produire les sous-unités HA1 et HA2 sont nécessaires afin d’activer le potentiel de fusion membranaire de la HA. Le clivage de ce précurseur est donc essentiel pour l’activité de cette protéine et donc au potentiel infectieux du virus (23). La sous-unité HA1 constitue la partie globulaire retrouvée à la face externe du virus et joue un rôle primordial dans les interactions entre le virus et la cellule hôte. Entre autres, la sous-unité HA1 contient le site de liaison de la protéine au récepteur d’acide sialique (AS) retrouvé à la surface des cellules hôtes (receptor binding site, RBS), est reconnue par les anticorps de l’hôte et permet l’évasion du système immunitaire de l’hôte grâce à des modifications au niveau d’épitopes spécifiques, alors que la sous-unité HA2, aussi connue comme ‘peptide de fusion’, forme quant à elle la tige de la protéine HA ancrée dans l’enveloppe virale et contient une séquence beaucoup plus conservée que celle de la HA1. Cette sous-unité permet la fusion de la membrane virale à la membrane de l’endosome lors des stades initiaux de l’infection (24).
1.2.3 Segment 5 : nucléoprotéine (NP)
La nucléoprotéine (NP) est une des protéines virales les plus abondantes, comptant ~1000 NP par virion (25). Chacune des unités de NP se lie à ~24 nucléotides d’ARNv ou d’ARN complémentaire (ARNc) (26) via leur squelette de sucre phosphate, laissant ainsi les nucléotides facilement accessibles pour la synthèse d’ARN par les polymérases (27). Les NP ont aussi la capacité de s’oligomériser entre elles (homo-oligomérisation) (28) facilitant de la sorte le repliement de l’ARNv en structure de double hélice au sein du complexe vRNP (29). Cette protéine joue aussi un rôle important dans la translocation du complexe vRNP au noyau, dans la transition de la transcription des ARN viraux vers leur réplication ainsi que dans le bourgeonnement des virions via son interaction avec la protéine matricielle M1 (30).
1.2.4 Segment 6 : neuraminidase (NA)
Encodée par le 6e segment, la neuraminidase (NA) constitue la seconde glycoprotéine majeure retrouvée à la surface du virus influenza. Un intérêt spécifique sera apporté à cette protéine dans ce mémoire, étant donné qu’elle est la cible de la seule classe d’antiviraux recommandés par l’Organisation mondiale de la santé (OMS), soit les inhibiteurs de la neuraminidase (INA). La NA est une protéine intégrale de type II due à son ancrage à la membrane via son domaine N-terminal. Cette protéine est un homotétramère en forme de champignon et est composée d’une tête globulaire contenant le site actif et plusieurs sites antigéniques, d’une partie tige contenant un segment membranaire et d’une partie cytosolique (29).
L’activité sialidase de l’enzyme NA catalyse l’hydrolyse de l’AS, soit les récepteurs des virus, retrouvés à la surface des cellules hôtes et en partie à la surface des virions, en clivant la liaison entre α-glycosidique de l’AS et du d-galactose/d-galactosamine de la HA (32). Cette activité enzymatique permet donc à la NA de jouer un rôle majeur dans la propagation virale en agissant sur le relâchement du virus de la cellule hôte, la prévention de l’agrégation des virions entre eux et le nettoyage de l’environnement respiratoire riche en mucus contenant une haute concentration en AS (31,32).
Les différents sous-types de la NA du virus influenza A se divisent phylogéniquement en deux groupes : le groupe I englobant les sous-types N1, N4, N5 et N8 et le groupe II, les sous-types N2, N3, N6, N7 et N9 (33,34). Étant très conservé parmi les virus influenza A et B, le site actif de la NA constitue la cible de choix pour les INAs. Il est composé de 8 résidus catalytiques responsables de l’activité enzymatique de la NA (R118, D151, R152, R224, E276, R292, R371 et Y406) et 11 résidus structuraux assurant la stabilisation de la structure du site actif (E119, R154, W178, S179, D198, I223, E227, H275, E277, N294 et E425), numérotation N2 (35). De plus, le groupe I aurait une cavité additionnelle au niveau du site actif, localisée entre les résidus 147 et 152 de l’enzyme, due à la présence d’une thréonine au lieu de l’asparagine en position 347 modifiant de la sorte les ponts H au niveau du site catalytique (38). Cette différence dans la structure de la NA des différents sous-types des virus influenza pourrait expliquer la modulation de la réponse entre ces différents sous-types aux traitements antiviraux (décrit davantage à la section 1.7.3.2).
1.2.5 Segment 7 : protéines de la matrice (M1 et M2)
Les protéines matricielles M1 et M2 du virus influenza sont exprimées à partir de deux différents cadres de lectures du 7e segment d’ARN du virus (36). Reposant sous la membrane lipidique virale, la protéine M1 est la protéine la plus abondante dans la particule virale, liant à la fois la membrane lipidique et les vRNP (37,38), assurant ainsi un rôle structural au sein du virus, permettant entre autres la rigidité de la structure virale. La protéine M1 a aussi été retrouvée comme jouant un rôle important dans le bourgeonnement de virions nouvellement formés (39,40). En forme d’homotétramère, la protéine M2 est un canal ionique sélectif de protons H+ dépendant du pH situé dans la membrane lipidique à la surface virale (41). Bien qu’elle soit exprimée en grandes quantités, seulement 20 à 60 protéines M2 sont incorporées dans chaque particule virale (42). Lors de l’entrée du virus dans la cellule cible (voir section 1.3 ci-dessous), le pH acide au sein de l’endosome active la protéine M2 qui a pour rôle de transporter les ions H+ à l’intérieur du virus (diminution du pH). De cette façon, la protéine M2 joue un rôle important dans la décapsidation du virus, facilitant la fusion de la membrane virale à la membrane de l’endosome et permettant la libération des vRNP en dissociant la liaison entre les protéines M2 et NP (46,47). La protéine M2 constitue de plus la cible d’une classe antivirale contre le virus influenza, soit les adamantanes, décrits davantage dans la section 1.7.1 plus bas.
1.2.6 Segment 8 : protéines non-structurales (NS1 et NEP/NS2)
Le 8e segment du virus influenza encode pour deux protéines, soit NS1 et NEP/NS2. Exprimée en très grandes quantités dans les cellules infectées, la protéine NS1 est dite non-structurale car elle n’est pas retrouvée dans les particules virales (48). Cette protéine possède diverses fonctions dans la traduction des ARNm viraux, régulant entre autres l’épissage, le transport des ARNm viraux vers le cytoplasme et la stimulation de leur traduction. Pourtant, au cours de l’infection virale, le rôle majeur de NS1 est son inhibition de la réponse antivirale de la cellule infectée, en bloquant entre autres la réponse immunitaire par l’interféron de type I (IFN-α/β) (49). La protéine NEP/NS2 est produite via l’épissage de l’ARNm de NS1 (50). Il a été longtemps pensé que cette protéine jouait un rôle non-structural (d’où son nom ‘NS2’). Toutefois, il a été démontré récemment que la protéine NEP/NS2 est retrouvée au sein des particules virales (51) et, en interaction avec la protéine matricielle M1 (52), aurait un rôle important dans la formation de nouveaux virions en permettant l’export des vRNP du noyau au cytoplasme, d’où sa plus récente appellation ‘NEP’ (nuclear export protein) (53).
Tableau 1. Protéine encodées par les différents segments d’ARN du virus influenza. Traduit et adapté de (14).
Segment Protéines encodées Fonctions protéiques
1 PB2 Sous-unité de l’ARN polymérase ; Reconnaissance des pré-ARNm
2
PB1 Sous-unité de l’ARN polymérase ; Élongation PB1-F2 Activité pro-apoptotique
PB1-N40 Rôle proposé : maintien de balance d’expression de PB1 et PB1-F2 3 PA Sous-unité de l’ARN polymérase ; Activité endonucléase
4 HA Glycoprotéine de surface ; Antigène majeur ; Liaison au récepteur cellulaire et permet fusion virale 5 NP Protéine de liaison à l’ARNv ; Import nucléaire du vRNP
6 NA Glycoprotéine de surface ; Activité sialidase, Relâchement du virion
7 M1
Protéine matricielle ; Interaction avec le vRNP ; Régulation de l’export nucléaire et du bourgeonnement viral
M2 Canal ionique ; Décapsidation du virion et assemblage
8 NS1 Antagoniste de l’interféron ; Régulation de l’expression génique de l’hôte NEP/NS2 Export nucléaire des ARNv ;
1.3 Cycle réplicatif
Il est important de décrire le cycle réplicatif du virus influenza afin de bien comprendre les mécanismes d’action des agents antiviraux, qui seront le sujet principal de ce mémoire. Bien que ce soit un processus continu, ce cycle peut être divisé en plusieurs étapes décrites ci-dessous et illustrées à la figure 3.
Figure 3. Cycle réplicatif du virus influenza. Figure adaptée et traduite de (16). 1.3.1 Attachement et entrée du virus dans la cellule hôte
La HA permet l’attachement du virus influenza à la cellule hôte dans le système respiratoire en liant les récepteurs d’AS de type α-2,3 ou α-2,6. Cette glycoprotéine joue un rôle important dans le tropisme de l’hôte, car la prédominance en récepteurs AS α-2,3 ou α-2,6 diffère selon les espèces, et les différents types viraux lient préférentiellement les AS α-2,3 ou α-2,6 bien que cette spécificité ne soit pas absolue (16). Chez l’humain, les récepteurs α-2,6 sont prédominants dans le tractus respiratoire supérieur, alors que les récepteurs α-2,3 sont plutôt retrouvés dans le tractus respiratoire inférieur. Les oiseaux possèdent plutôt les récepteurs α-2,3, les virus aviaires ont donc une plus grande spécificité à ce type de récepteurs. Ce virus sont donc capables d’infecter l’humain mais leur efficacité d’infection sera diminuée comparativement à l’infection des oiseaux. On retrouve toutefois autant les récepteurs de type α-2,3 qu’α-2,6 chez le porc, c’est pourquoi si ces animaux sont infectés simultanément par des virus aviaires et humains il peut y avoir réassortiment des virus qui peuvent mener à des pandémies (16,54) (tel que décrit à la section 1.4.1.2). Suite à son attachement, le virus influenza est internalisé par endocytose médiée par la clathrine (55), quoiqu’il y ait d’autres mécanismes d’internalisation qui ont été décrits (56,57).
Récepteur d’AS α-2,3 ou α-2,6 Endocytose pH acide Fusion et décapsidation Apoptose Réponse antivirale
médiée par l’interféron Modifications post-traductionnelles Assemblage Traduction ARNm ARNv (-) ARNc (+) pARNv (-) Noyau
1.3.2 Fusion et décapsidation
Une fois le virus internalisé dans la cellule hôte, le pH acide de l’endosome (entre 5 et 6) mène à un changement conformationnel de la HA qui initie ensuite la fusion de la bicouche lipidique de l’enveloppe virale avec la paroi de l’endosome (58). Le pH acide active aussi l’activité de la pompe ionique de la protéine M2 du virus qui mène à l’entrée des ions H+ de l’endosome dans la particule virale, ainsi causant la dissociation entre la protéine matricielle M1 contenue à l’intérieur de la particule virale et les vRNP (59). Ces derniers, alors libérés dans le cytoplasme de la cellule hôte, contiennent des signaux de localisation nucléaire leur permettant d’être redirigés au noyau (60,61).
1.3.3 Réplication du virus et synthèse des protéines virales
Lorsque les complexes vRNP atteignent le noyau de la cellule hôte, le virus peut alors commencer sa traduction ainsi que la réplication de son génome. L’ARNv de polarité négative (-) est d’abord transcrit en ARN messager (ARNm), qui est ensuite modifié par la machinerie cellulaire : épissage, ajout d’une coiffe d’une quinzaine de nucléotides à l’extrémité 5’ ainsi qu’une queue polyA en 3’ (62,63). L’ARNm peut alors être exporté au cytoplasme afin d’être traduit. Les protéines virales alors synthétisées peuvent être renvoyées au noyau, si nécessaire, ou envoyées à la surface cellulaire, tel qu’est le cas pour les protéines virales HA, NA et M1 (64). La protéine virale NS1 permet la traduction préférentielle des ARNm viraux en inhibant la production d’ARNm cellulaires en bloquant leur épissage (65,66). En parallèle, l’ARNv (-) est répliqué en ARNc de polarité positive, qui sert à son tour de matrice pour générer de nouveaux ARNv (-) (19). Lors de la réplication, de petits ARNv d’une vingtaine de nucléotides sont produits et leur accumulation au sein du noyau permettrait de réguler le passage entre la transcription et la réplication (67,68). Il est important de noter que les polymérases virales jouent un rôle autant dans la transcription et que dans la réplication des ARN viraux (69).
1.3.4 Assemblage du virion et détachement de la cellule hôte
L’assemblage de virions nouvellement formés et leur bourgeonnement est un processus de plusieurs étapes se produisant au niveau des radeaux lipidiques à la membrane apicale des cellules infectées (70). Les différents segments d’ARNv au noyau doivent d’abord être exportés au cytoplasme via des complexes vRNP-M1-NEP/NS2 (53). Lors de leur traduction, les protéines HA et NA sont repliées en trimère et homotétramère, respectivement, et sont envoyées à la membrane à la surface cellulaire, où elles s’accumulent et causent une déformation de la membrane, initiant ainsi le bourgeonnement du virion (71,72). Le protéine M1 s’accumule sous la surface, où elle lie les queues cytoplasmiques de la HA et de la NA, et les polymérise afin de former l’intérieur du nouveau virion émergent (73). Cette protéine matricielle sert également de site d’attachement des complexes vRNP en médiant le recrutement de M2 au site de bourgeonnement (59,74,75). La protéine M2 permet quant à elle de finaliser le bourgeonnement viral en promouvant la scission membranaire (76). Étant
des virus enveloppés, les virions nouvellement formés sont recouverts d’AS et restent ancrés à la membrane de la cellule hôte via l’interaction de ce récepteur avec la HA virale. L’activité enzymatique de la NA est donc nécessaire afin de cliver cet attachement et de libérer le virus de la cellule hôte (77). Les effets opposés de la HA et de la NA par rapport au même récepteur (AS) exigent qu’il y ait un équilibre délicat entre ces deux glycoprotéines afin d’optimiser l’infectivité virale.
1.4 Génétique du virus
1.4.1 Changements antigéniques
Lors du cycle réplicatif du virus influenza, plusieurs mutations peuvent être introduites au sein de son génome, affectant entre autres les glycoprotéines NA et HA à la surface virale. Des changements au niveaux de ces antigènes majeurs du virus sont responsables du comportement imprévisible du virus et permettent la circulation continuelle du virus dans la population. Deux types de changements antigéniques sont observés chez le virus influenza : le glissement antigénique (‘antigenic drift’ en anglais) pour les virus influenza de type A et B, ainsi que la cassure antigénique (‘antigenic shift’ en anglais) affectant les virus influenza A seulement.
Figure 4. Représentation des phénomènes de glissement antigénique et de cassure antigénique des virus
influenza. Figure adaptée et traduite de (78).
Épidémies
Glissement antigénique
Pandémies
Cassure antigénique
1.4.1.1 Glissement antigénique
La polymérase virale, dépourvue d’activité enzymatique de ‘lecture d’épreuve’ (‘proofreading’), peut introduire des mutations dans les gènes du virus lors de sa réplication causant de grandes variations génétiques (79). De telles mutations ponctuelles dans les gènes de la HA ou de la NA ont lieu à une fréquence d’environ <1% de substitutions dans leur gène respectif par an et mènent à un changement graduel du phénotype du virus et ainsi au phénomène de glissement antigénique (80). Permettant l’évasion du système immunitaire, ces changements causent de nouvelles épidémies et contournent l’activité vaccinale, représentant donc la raison principale pour laquelle la composition des vaccins doit être révisée annuellement (81,82) (voir section 1.6). Il est intéressant de noter toutefois que le virus A(H1N1)pdm09 ne semble pas avoir subi de glissement antigénique majeur depuis son apparition (83–85).
1.4.1.2 Cassure antigénique
Lorsque deux ou plus différents virus de différents sous-types viraux infectent une même cellule simultanément, il est possible que leurs génomes soient mélangés et que le virus réassortissant ait un génome composé des différents segments des différents virus. Une cassure antigénique consiste en un tel réassortiment génétique affectant au final les antigènes HA et NA à la surface d’un virus nouvellement formé. Souvent, ces réassortiments se déroulent entre les virus aviaires et humains, à travers un hôte intermédiaire, tel que décrit à la section 1.3.1. Advenant qu’un virus réassorti soit virulent et se transmette de façon efficace, il possèderait alors un avantage sur les autres virus en circulation, le système immunitaire préexistant étant inefficace contre le nouveau virus, et pourrait donc mener à l’éclosion d’une pandémie (4,78,86). Bien que le réassortiment soit le processus principal menant à une cassure antigénique, ce processus pourrait aussi se produire suite à une adaptation continuelle d’un virus influenza aviaire vers l’humain (87,88).
1.4.3 Génétique inverse
Le système de génétique inverse est un outil très important dans les études du virus influenza, permettant entre autres l’expression de protéines virales et la génération in vitro de particules virales entières. Le système de génétique inverse présentement utilisé consiste en une transfection cellulaire avec huit différents plasmides contenant chacun les différents segments du génome du virus influenza (89). Grâce à une transcription bidirectionnelle de ces plasmides (figure 5), il est possible de produire efficacement des virus recombinants. Dans chacun des plasmides, les séquences d’ADN complémentaires virales sont flanquées de séquences promotrices, soit celle de l’ARN polymérase de type I (pol I) d’un côté et celle du cytomégalovirus (CMV) (polymérase de type II – pol II) de l’autre, qui permettent la production d’ARNv et d’ARNm, respectivement, à partir d’un seul plasmide. Le système de génétique inverse a prouvé entre autres son efficacité dans des
réplication virale, l’expression d’antigènes, ainsi que dans la production de potentiels vaccins (90). Dans ce mémoire, le système de génétique inverse a été utilisé afin de caractériser les virus influenza contenant des mutations de résistance aux inhibiteurs de la neuraminidase.
Figure 5. Représentation du système de transcription bidirectionnelle pour le virus influenza. Chacune des
huit séquences du virus influenza sont flanquées par des séquences promotices (pII du CMV et pIh) et leurs séquences terminatrices (aII de l’hormone de croissance bovine (BGH; bovine growth hormone) et tI) respectives permettant la lecture bidirectionnelle des gènes et la production des ARNv à polarité négative et des ARNm à polarité positive par les polymérases I et II, respectivement. Figure adaptée et traduite de (89).
1.5 Aspects cliniques
1.5.1 TransmissionLa transmission est très importante pour la virulence et l’épidémiologie du virus influenza. Il peut être transmis par voies aériennes via des gouttelettes aérosolisées infectieuses provenant surtout de la toux, des éternuements et en partie de la respiration, survivant jusqu’à 24 heures suite à son aérosolisation lorsque le taux d’humidité relative demeure faible (91,92). Le virus peut aussi être transmis via des surfaces inertes, survivant jusqu’à 48 heures après s’être déposées sur certaines surfaces lorsqu’il y de faibles taux d’humidité relative et de rayons ultraviolets (92,93).
pIICMV aIIBGH pIh tI 8 ARNv (-) 10 ARNm (+) ADNc viral Traduction
ARN polymérase II (pol II) (épissage)
ARN polymérase I (pol I) Protéines virales : PB1, PB2, PA, HA, NP, NA, M1, M2, NS1, NS2/NEP
La transmission du virus est plus élevée lors de l’hiver et du début printemps. Ces périodes sont donc décrites comme étant les saisons grippales. Ces saisons sont inversées dans les hémisphères Nord (Octobre à Mai) et Sud (Avril à Septembre). Lors de ces saisons, les conditions environnementales changent (baisse des taux d’humidité relative et de rayons ultraviolets) et permettent une meilleure survie du virus. De telles conditions obligent aussi de se retrouver plus souvent dans des endroits clos, menant à une plus grande proximité entre individus. Ces saisons présentent donc les conditions idéales pour la transmission virale, car la distance traversée par les aérosols et la durée de vie du virus hors de l’hôte dépendent grandement de leur environnement (92,94,95). Ceci met ainsi de l’avant l’importance du maintien d’une bonne hygiène et du port du masque lors des infections au virus influenza (96).
Les souches en circulation ne sont pas habituellement hautement contagieuses, avec chaque individu infecté transmettant seulement à environ 1 ou 2 autres individus (taux de transmission de base étant d’environ 1,4). Néanmoins, les excrétions virales persistent jusqu’à 7 jours post-infection chez les individus en santé, mais cette durée peut s’étendre plus longtemps chez les individus immunocompromis (97–101). Les épidémies atteignent ainsi habituellement un plateau après seulement deux mois de transmission et se dissipent ensuite après trois mois (102).
1.5.2 Symptomatologie
Les signes cliniques d’une infection au virus influenza apparaissent environ 1 à 4 jours suite à l’exposition initiale de l’individu au virus, le temps de latence étant en moyenne de deux jours dépendamment de la souche virale, la concentration virale d’infection ainsi que l’état du système immunitaire de la personne infectée (100). La grippe est caractérisée par des symptômes non-spécifiques, tels que la fièvre (>90% des cas), la toux (>80%), la congestion nasale (>80%), l’asthénie, la céphalée, la myalgie ainsi que l’anorexie, et est aussi accompagnée parfois par des nausées et des vomissements (103,104). Les symptômes causés par les virus influenza A(H1N1), A(H3N2) et B sont généralement très similaires, quoi que le virus A(H3N2) ait été associé à une fréquence plus élevée d’infections sévères (105–107). Suite à une infection initiale à une certaine souche virale, des réinfections avec des variants relativement similaires sont possibles, mais les symptômes sont habituellement moins sévères que l’infection primaire (108,109).
Chez les individus en santé, les symptômes grippaux disparaissent environ 5 à 7 jours suite à l’infection, en absence de traitements. Certains groupes d’individus (les enfants de moins de 5 ans, les personnes âgées, les femmes enceintes, les individus immunosupprimés et les individus avec des problèmes médicaux sous-jacents) sont pourtant à risque de complications suite à l’infection, pouvant ainsi résulter à leur hospitalisation et menant parfois au décès (110). Les complications modérées associées à la grippe incluent entre autres les sinusites et les otites. Des pneumonies peuvent aussi être provoquées par la grippe résultant soit d’une
infection au virus influenza, d’une co-infection virale et bactérienne, ou d’une infection bactérienne secondaire. D’autres complications sévères incluent l’inflammation du cœur (myocardite), du cerveau (encéphalite) ou des muscles (myosite, rhabdomyolyse). Une réponse inflammatoire exagérée suite à l’infection grippale peut aussi mener à la défaillance polyviscérale (tel que l’insuffisance respiratoire ou rénale) et à la septicémie. Chez les femmes enceintes, les complications liées à l’infection grippales surviennent principalement lors des 2e et 3e trimestres, où les risques pour le fœtus sont plutôt associés à la réponse inflammatoire maternelle qu’à l’infection virale en tant que tel (111). La grippe peut aussi aggraver des problèmes médicaux chroniques déjà présents, notamment chez les individus atteints de l’asthme ou de maladies cardiaques chroniques.
1.5.3 Diagnostic
Les symptômes associés aux infections au virus influenza étant non-spécifiques, le diagnostic de la grippe est important autant pour les laboratoires cliniques que de santé publique, à des fins de décisions de traitement, de données par rapport aux éclosions ainsi que de surveillance afin de guider les lignes directrices en matière de santé publique. Les spécimens utilisés à des fins de diagnostic proviennent habituellement de lavages nasopharyngés, de frottis de la gorge ou de prélèvements sanguins (sérologie) (112).
Les multiples tests de diagnostic existants (revus dans (113)) varient en termes de sensibilité et de spécificité selon les différents types de spécimens. La culture virale sur les cellules MDCK (Madin-Darby canine kidney) a longtemps été considéré comme étant le ‘gold standard’ pour le diagnostic des virus respiratoires, permettant l’isolation virale et l’observation des effets cytopathiques associés au virus après environ 2 à 4 jours (114). Pourtant, la durée de ce diagnostic étant considérablement longue, des tests à diagnostic rapide permettant de donner une réponse à l’intérieur de 5 à 15 minutes ont été développés. Ces tests consistent en la détection des antigènes viraux par système de chromatographie par immunobuvardage. Ils ont toutefois démontré une sensibilité et une spécificité diminuées, donnant souvent de faux négatifs et devant être confirmés avec un deuxième test (114,115). Des tests diagnostiques beaucoup plus spécifiques et sensibles de transcription inverse puis réaction de polymérisation en chaîne (RT-PCR, ‘reverse transcriptase polymerase chain reaction’) ont plus récemment été développés pour détecter les ARN viraux (116). Permettant de donner une réponse à l’intérieur d’une journée, les RT-PCR peuvent être multiplexés, c’est-à-dire plusieurs couples amorces jumelées afin de déterminer différents ARN à l’intérieur d’un même échantillon. Cette méthode de diagnostic permet donc d’identifier le virus ainsi que son type, grâce à des amorces amplifiant le segment 7 hautement conservé chez les virus influenza (protéines matricielles). Le test permet aussi de déterminer le sous-type viral dans le cas des virus influenza de type A avec des amorces reconnaissant la HA. Des tests sérologiques d’inhibition de l’hémagglutination ou de microneutralisation sont aussi utilisés afin de détecter les anticorps dirigés contre le virus influenza dans les échantillons sanguins de patients (116). Ces tests sont surtout utilisés dans les laboratoires de santé publique, tels que le laboratoire de
santé publique du Québec (LSPQ) et le laboratoire national de microbiologie (LNM) au Québec et au Canada ainsi que le Centre de contrôle et de prévention des maladies (CDC, ‘Center for Disease Control and Prevention’) et l’OMS à l’international, pour leur fiabilité, leur capacité de typage et de sous-typage ainsi que leur capacité de caractérisation antigénique.
1.5.4 Réponse immunitaire
Lorsque les virus influenza se rendent jusqu’à leurs cellules hôtes, ils sont reconnus par au moins trois récepteurs de reconnaissance de motifs moléculaires (PRR; ‘pattern recognition receptors’) retrouvés chez les cellules cibles, soit les récepteurs de type Toll (TLR; ‘Toll-like receptors’), les récepteurs de type RIG-I (RLR; ‘RIG-I (retinoic acid-inducible gene I) -like receptors’) ainsi que les récepteurs NLRP3 (‘NOD (nucleotide-binding oligomerization domain) -like receptor family, pyrin-domain containing 3’) (117). Le TLR7 reconnaît l’ARNv simple brin au sein de l’endosome, alors que le RLR reconnaît l’ARNv simple brin marqué d’un groupement triphosphate en 5’ au sein du cytosol. Le NLRP3, quant à lui, a été rapporté comme reconnaissant entre autres les protéines M2 et PB1-F2 virales ainsi que l’ARNv (118–120). Suite à leur reconnaissance des composantes virales, ces trois récepteurs déclenchent des voies de signalisation qui leur sont spécifiques menant au final à la production de cytokines et chimiokines associées à la réponse immunitaire innée provoquée par l’infection au virus influenza (tel que décrit ci-bas).
Chez les individus immunocompétents, l’immunité innée constitue la première ligne de réponse contre l’infection au virus influenza. Caractérisée par la production d’interleukine-6 (IL-6) et d’interférons de type I, soit les IFN-α/β, par les cellules épithéliales infectées ainsi que les monocytes et les macrophages, cette réponse immunitaire pro-inflammatoire atteint habituellement son pic deux jours post-infection, ce qui corrèle avec le pic de fièvre et autres symptômes observés (121). Il est à noter que la protéine virale NS1 a une activité spécifique d’inhibition de l’action d’IFN-α/β, tel que décrit à la section 1.2.6, reflétant ainsi l’importance de cette cytokine dans la réponse antivirale de l’hôte (122). Un peu plus tard après l’infection, les cytokines IL-1β, IL-8 ainsi que le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α, ‘tumor necrosis factor’) produits par les monocytes et les macrophages peuvent être détectés dans les sécrétions respiratoires et/ou les sérums de patients (123).
En plus de la réponse non-spécifique de l’immunité innée, l’immunité adaptative cellulaire et humorale est nécessaire chez l’hôte afin de contrôler et éliminer l’infection au virus influenza. La réponse immunitaire cellulaire est initiée par les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques, qui détectent et lysent les cellules infectées. Cette réponse antivirale est détectable dans le sang des patients 6 à 14 jours post-infection, persistant jusqu’à 21 jours, et dépend grandement de la capacité des lymphocytes T CD8+ à se rendre aux poumons ainsi qu’au tractus respiratoire (124–126). Les lymphocytes T CD8+ sont majoritairement dirigés contre les protéines
virales HA, NP, M et PB2 qui ont des épitopes hautement conservés (127). La réponse cellulaire joue donc un rôle important dans le contrôle de l’infection en permettant l’élimination des cellules infectées et le relâchement de cytokines. Les lymphocytes T CD4+ lysent les cellules infectées de manière moins efficace que les lymphocytes T CD8+, mais ont plutôt un rôle de cellules « auxiliaires » en facilitant la réponse et la prolifération des lymphocytes T CD8+ ainsi qu’en participant dans la production d’anticorps par les lymphocytes B (128,129). À cet égard, la réponse immunitaire humorale joue un rôle important dans la réduction de la charge virale, permettant de neutraliser le virus, et de prévenir une réinfection (souche spécifique). Ces anticorps ainsi produits par les lymphocytes B sont sécrétés dans les muqueuses des voies respiratoires : les anticorps IgA sont retrouvés majoritairement dans les voies respiratoires supérieures, tandis que les IgG et IgM, dans les voies respiratoires inférieures. Ces anticorps sont principalement dirigés contre la HA, et son détectables dans les sérums d’adultes environ une semaine suite à une primo-infection (130,131). La réponse humorale constitue un outil important afin de mesurer la réponse immunitaire des individus contre le virus influenza, entre autres par le test d’inhibition de l’hémagglutination (tel que décrit à la section 1.5.3).
Section 2 : Traitements et prévention
Tel que mentionné précédemment, le virus influenza cause des épidémies annuellement et peut causer jusqu’à 3 pandémies par siècle, présentant ainsi un défi de taille pour la communauté scientifique quant à la prévention et au traitement de la grippe. Les vaccins et les antiviraux sont les deux types d’intervention utilisés présentement pour contrôler les infections au virus influenza.
1.6 Vaccins
La vaccination constitue le moyen de contrôle le plus efficace contre les infections au virus influenza. Disponibles depuis 1945, les vaccins contre la grippe permettent de protéger toute la population et permettent surtout la protection des individus à risque de développer des complications majeures, soit les enfants de bas âge (<5ans), les personnes âgées (>65ans), les femmes enceintes, les personnes avec de conditions de santé sous-jacentes (VIH/SIDA, asthme, maladies chroniques cardiaque ou pulmonaire), les travailleurs de la santé, ainsi que les personnes ayant un système immunitaire compromis (1). Compte tenu des variations antigéniques des souches circulantes (voir section 1.4.1.1), ainsi que du temps de production et l’inefficacité des vaccins, l’OMS a mis en place un programme de surveillance afin de pouvoir prédire les souches en circulation lors des saisons grippales et émettre des recommandations des souches virales à inclure dans les vaccins. Étant donné que les saisons grippales diffèrent entre les hémisphères Nord et Sud, l’OMS doit émettre des recommandations de compositions vaccinales différentes pour chaque hémisphère. L’efficacité des vaccins dépend donc grandement de la ressemblance des souches inclues dans le vaccin et des souches circulantes (appariement ou mésappariement vaccinal). De plus, l’OMS recommande la vaccination annuelle chez les populations à risque et chez les individus fréquentant des individus à risque (1). Deux types de vaccins saisonniers sont présentement disponibles sur le marché, soit les vaccins inactivés et les vaccins vivants atténués. D’autres types de vaccins sont encore en cours de développement (11,132).
1.6.1 Vaccins inactivés
Les vaccins inactivés (VI) saisonniers contiennent les antigènes des souches virales circulantes, tel que prédites par l’OMS. Les types de VI disponibles sont : les VI trivalents (VIT) incluant les antigènes de trois types viraux, soit A(H1N1), A(H3N2) et B, ainsi que les VI quadrivalents (VIQ) incluant les antigènes de quatre types viraux, soit A(H1N1), A(H3N2) et deux lignées du virus influenza de type B (Yamagata et Victoria) (133). Au Canada, le Fluviral (VIT) et le FluLaval Tetra (TIQ) sont distribués par la compagnie GlaxoSmithKline (134,135).
Ces vaccins sont le produit de la réplication de grandes quantités de virus dans des œufs embryonnés de poule, desquels le liquide allantoïque est récolté, concentré et purifié. Les virus sont ensuite inactivés avec le
formaldéhyde ou le β-propriolactone, ou fragmentés avec des détergents ou agents chimiques (séparation des antigènes). Les VI contiennent habituellement 15µg des antigènes des différentes souches virales (60µg lorsqu’à haute dose). Les VI adjuvantés et non-adjuvantés sont disponibles sur le marché. En effet, les adjuvants, tel que les sels d’aluminium (alum), de types émulsion huile dans l’eau (ex : AS03 et MF59) et autres, peuvent être ajoutés dans la composition vaccinale afin d’amplifier la réponse immunitaire face à l’antigène en amplifiant sa livraison et sa présentation et en stimulant le recrutement des cellules inflammatoires au site de l’injection (136).
Bien que les VI soient sécuritaires et aient une certaine efficacité, certains inconvénients leur sont associés. Premièrement, les souches recommandées pour le vaccin sont sélectionnées 9 mois avant la saison grippale et la production des VI nécessite par la suite environ 3-6 mois. Considérant le glissement antigénique des virus influenza, cette considérable période de temps augmente les chances qu’il y ait mésappariement entre les souches vaccinales et les souches circulantes, résultant ainsi à un échec vaccinal. Deuxièmement, étant donné leur moyen de production, les VI ne peuvent être administrés chez les individus allergiques aux oeufs. Une alternative intéressante afin de réduire le temps de production ainsi qu’éviter les réactions allergiques liées aux œufs serait la production des VI en culture cellulaire (cellules MDCK et Vero (singe vert d’Afrique)). Bien que ce moyen de production doive encore être développé davantage, la production de tels VI dans des cellules mammifères permettraient potentiellement d’offrir un vaccin plus efficace (137).
1.6.2 Vaccins atténués
Les vaccins vivants atténués (‘live influenza attenuated vaccine’, LAIV) permettent d’offrir une réponse immunitaire plus large et une protection contre le virus plus longue que les VI. En effet, les LAIV permettent de stimuler la réponse humorale, tout comme les VI, mais permettent en plus d’induire une réponse cellulaire. Administrés par voie intranasale, les LAIV permettent donc de mimer l’infection naturelle par le virus influenza (125).
Tout comme les VI, la production des LAIV se fait dans des œufs embryonnés de poule, à la différence que le produit final n’est pas inactivé, mais est un virus réassortant atténué. Ce dernier contient 6 gènes (PB1, PB2, PA, M, NP et NS) d’une souche virale atténuée et les antigènes (HA et NA) des souches virales circulantes prédites par l’OMS. Atténué suite à des passages à de faibles température (25°C), ce virus est adapté au froid et sensible à la température, se répliquant efficacement dans le nasopharynx (33°C) et non dans les voies respiratoires inférieures (37°C). Les souches virales atténuées habituellement utilisées sont la souche A/Ann Harbor/6/60 (H2N2) pour les virus influenza de type A et la souche B/Ann Harbor/1/66 pour les virus influenza de type B (125). Les LAIV sont habituellement quadrivalents, contenant les antigènes des virus A(H1N1), A(H3N2) et de deux lignées des virus influenza de type B (Yamagata et Victoria).
Bien qu’ils aient démontré une protection supérieure aux VI, les LAIV présentent certains inconvénients. En effet, les LAIV sont recommandés seulement chez les individus en santé de 2 à 49 ans. Malgré qu’ils soient atténués, le fait que les virus inclus dans les vaccins soient encore vivants et conservent leur potentiel infectieux, les LAIV sont contre-indiqués chez personnes ayant un système immunitaire affaibli, c’est-à-dire les individus les plus à risques de développer des complications suite à l’infection, soit chez les enfants de moins de 2 ans, les gens avec des conditions médicales, les femmes enceintes, les personnes âgées et les personnes immunocompromises, ce qui présente un souci de taille (138,139).
1.6.3 Vaccins en développement
Palliant aux inconvénients des vaccins saisonniers sur le marché, des vaccins présentement en développement sont très prometteurs entre autres dû à leur temps de production plus rapide, réduisant le temps de réponse lors d’une pandémie et diminuant les probabilités d’échec vaccinal, ainsi qu’à leur capacité d’induire à la fois l’immunité cellulaire et humorale (140). Les vaccins de particules de type viral (‘virus-like particule’, VLP) sont des nanoparticules similaires au virus vivant exprimant seulement à leur surface certains antigènes viraux. Dépourvus de matériel génétique, les vaccins VLP sont incapables d’infecter les cellules et sont donc sécuritaires (figure 6) (141). Une méthode qui a été mise au point pour obtenir des VLP est le clonage de gènes antigéniques du virus influenza (surtout la HA) dans des vecteurs d’expression du baculovirus, puis l’infection de cellules d’insecte par ces baculovirus (142). Une seconde méthode mise au point est l’infection des plantes Nicotiana benthamiana par Agrobaterium contenant des plasmides dans lequel est inséré le gène de la HA du virus influenza (143). Les vaccins à ADN sont un autre type de vaccin présentement en développement. Ce vaccins sont des plasmides bactériens contenant les gènes des antigènes viraux d’intérêts, habituellement administrés avec des adjuvants par injection intramusculaire ou par électroporation avec pistolet à gènes (144).
Le développement d’un vaccin universel conférant la protection croisée contre les différents types viraux permettrait la protection idéale contre les virus influenza tant lors d’épidémies que de pandémies. À cette fin, le but serait de cibler soit des protéines antigéniques stables, ou des parties stables de protéines antigéniques hautement variables. Étant donné le fait que les protéines hautement antigéniques des virus influenza mutent beaucoup, des études présentement en cours se concentrent plutôt sur la reconnaissance de la protéine de surface M2 qui est hautement conservée entre les différents types viraux, ainsi que sur la reconnaissance de la partie stable de la HA, soit la queue HA2, qui est beaucoup plus stable et conservée que la tête globulaire de cette glycoprotéine (82).
Figure 6. Comparaison des caractéristiques structurales des particules virales et des VLPs par
représentations schématiques des caractéristiques externes (a) et internes (b), et tel qu’observés par microscopie électronique (c). Figure traduite de (143).
1.7 Antiviraux
Bien que la vaccination reste le meilleur moyen de prévention et de contrôle des infections au virus influenza, l’efficacité vaccinale varie grandement d’une saison grippale à l’autre, variant entre 10-60% d’efficacité lors des dix dernières années (145), dû entre autres au mésappariement entre les souches vaccinales et circulantes ainsi qu’à la réponse immunitaire inadéquate chez les individus dans les groupes à risque. Lors de tels échecs vaccinaux, les antiviraux jouent un rôle important dans la prévention et le traitement des infections au virus influenza lors d’épidémies et de pandémies. Deux classes d’antiviraux sont présentement approuvés pour l’usage en clinique, soit les adamantanes et les inhibiteurs de la neuraminidase (INAs).
Particules virales VLPs (a)
(b)
