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Caractérisation du transporteur de nitrate à double affinité, MtNPF6.8 (MtNRT1.3), de Medicago
truncatula : rôles dans le transport et la perception du signal nitrate
Anthoni Pellizzaro
To cite this version:
Anthoni Pellizzaro. Caractérisation du transporteur de nitrate à double affinité, MtNPF6.8 (Mt-
NRT1.3), de Medicago truncatula : rôles dans le transport et la perception du signal nitrate. Sciences
agricoles. Université d’Angers, 2015. Français. �NNT : 2015ANGE0011�. �tel-01491126�
Anthoni PELLIZZARO
Mémoire présenté en vue de l’obtention du grade de Docteur de l’Université d’Angers sous le label de L’Université Nantes Angers Le Mans
École doctorale : VENAM Discipline : Biologie
Spécialité : Biologie cellulaire végétale
Unité de recherche : UMR1345 Institut de Recherche en Horticulture et Semences (IRHS), UFR Sciences Université d’Angers, SFR4207 QUASAV, 2 Boulevard Lavoisier, 49045 Angers, France
Soutenue le 31 mars 2015 Thèse N° 1475
Caractérisation du transporteur de nitrate à double affinité, MtNPF6.8 (MtNRT1.3), de Medicago truncatula : rôles dans le transport et la perception du signal nitrate
JURY
Rapporteurs : Anne KRAPP, DR INRA, Institut Jean-Pierre Bourgin (IJPB), INRA-Agro ParisTech Florian FRUGIER, DR CNRS, Institut des Sciences du Végétal (ISV), Gif sur Yvette
Examinateurs : Françoise MONTRICHARD, MCU-HDR, IRHS, Université d’Angers
Philippe NACRY, CR INRA-HDR, Biochimie et physiologie moléculaire des plantes (B&PMP), Montpellier Soulaiman SAKR, PR, IRHS, Agrocampus Ouest
Directeur de Thèse : Anis LIMAMI, PR, IRHS, Université d’Angers
Co-directeur de Thèse : Marie-Christine MORERE – LE PAVEN, MCU, IRHS, Université d’Angers
2
3
Remerciements
En premier lieu, je tiens à remercier Marie-Christine Le Paven et Anis Limami pour m’avoir encadré lors de ce travail de thèse. La confiance qu’ils m’ont accordée m’a permis de progresser et d’être formé à la profession de chercheur. Par ailleurs, je remercie Marie- Christine Le Paven pour m’avoir encadré dès ma première année de master, formé aux techniques de biologie moléculaire et réexpliqué les bases de grammaire.
Je tiens à remercier les membres de mon CST, Abdelhak El Amrani, Jérome Bove, Mathilde Orsel-Baldwin et Philippe Nacry qui m’ont accompagné durant cette thèse, pour le regard extérieur et bienveillant qu’ils ont su poser sur mes travaux. Pour avoir accepté de juger ce travail, je remercie Anne Krapp, Florian Frugier, Françoise Montrichard, Philippe Nacry et Soulaiman Sakr.
Un grand merci à Philippe Nacry, encore une fois, pour m’avoir chaleureusement accueilli à Montpellier, pour m’avoir transmis ses compétences techniques de transformations d’Arabidopsis, ses connaissances sur les transporteurs de nitrate ainsi que pour son aide précieuse. Encore merci à Françoise Montrichard, avec qui j’ai et je collabore encore en recherche et en enseignement, pour son dynamisme et ses conseils précieux de formation au métier d’enseignant. Je remercie également Marjorie Juchaux pour m’avoir formé à l’utilisation du microscope confocal. Je remercie aussi le laboratoire RCIM pour m’avoir permis, durant 5 années, d’accéder à des xénopes. Tout particulièrement, un grand merci à Céline Bourdin pour m’avoir formé aux techniques liées aux ovocytes, de leur prélèvement jusqu’à leur injection, et pour ces nombreuses préparations et injections d’ovocytes.
Bien entendu, merci à mon équipe d’accueil qui m’a permis d’évoluer et de travailler
dans des conditions optimales. Si je détaille, je remercie : Thibault Clochard, mon collègue
avec qui j’ai réalisé en binôme la plupart des expérimentations et sans qui cette thèse ne
serait pas celle d’aujourd’hui, mon ami de tous les bons moments passés et mon hébergeur
pour cette fin de thèse. Caroline Cukier pour sa bonne humeur et son enthousiasme
constant et permanant et pour son aide au remplissage des boites de consommables.
4
Isabelle Verdu qui m’a supporté dans le bureau durant ces années où je n’ai pas toujours parlé et pour son aide lors de manipulations décisives. Hélène Bobille pour ces petites apparitions avec le sourire au laboratoire et avec laquelle nous partageons notre expérience de thèse. Elisabeth Planchet, pour son aide précieuse lors des rédactions, pour nos discussions scientifiques et autres, ainsi que pour m’avoir permis de largement l’embêter lors de mes petites pauses.
Merci à toutes les personnes avec lesquelles j’ai évolué, souvent ou occasionnellement, durant ces années de travail. Merci aux personnes de l’étage pour m’avoir permis de cohabiter avec eux en toute convivialité. Merci aux personnes de l’ARES et aux personnes d’IMAC avec lesquelles j’ai eu des échanges scientifiques très intéressants.
Je tiens à remercier pour leur soutien inconditionnel les membres de ma famille. Bien sûre, j’ai une pensée toute particulière pour ma mère, qui m’a offert la possibilité de faire des études aux prix de sacrifices, et qui m’a écouté parler de biologie moléculaire, et pour ma sœur parce que je peux compter sur elle en particulier pour mon avenir.
Je pense que je ne serais pas arrivé là sans mes belles années de licence, durant lesquelles le travail et la rigueur étaient les maîtres mots de ces trois années. Je remercie donc toutes ces personnes qui sont maintenant mes plus proches amis, Mick, Anne-Laure, Pti-Louis, Anaïs, Guib et Charlotte et votre jolie fille, Julie, Antoine, Benett, Marie, Annabelle, Claire et Guigui. Je remercie aussi Arnono, Mimi, Seb et, pour un moment, kéké pour être des amis toujours présents, ce qui m’a largement permis de me détacher de mon travail à de nombreuses reprises, ce qui n’est pas forcément évident ! Plus récemment, je remercie Tiphaine avec qui je passe, depuis peu de temps, de très bons moments…
Enfin, merci à mes amis sur Angers, Antoine, Thib, Youyou, Emiliane et Diane qui
m’ont permis de supporter, au début, et d’apprécier ensuite la vie angevine pendant plus de
5 années.
5
Table des matières
LISTE DES ABREVIATIONS ... 7
I :ABREVIATIONS CLASSIQUES ... 7
II :ABREVIATIONS DE NOM DE GENES ... 8
PREAMBULE ... 10
PARTIE 1 : INTRODUCTION ... 12
CHAPITRE I :NUTRITION AZOTEE DES PLANTES SUPERIEURES ... 13
I.1 - Les sources d’azote chez les plantes supérieures ... 13
I.1.A - Source d’azote organique ... 13
I.1.B - Source d’azote inorganique ... 13
I.1.C - Azote atmosphérique ... 14
I.2 - Systèmes d’absorption du nitrate ... 15
I.2.A - Principe général de l’absorption du nitrate... 15
I.2.B - Le système HATS ... 16
I.2.C - Le système LATS ... 16
I.2.D - Régulation des systèmes de transport du nitrate ... 16
I.3 - Le devenir du nitrate dans la plante ... 17
I.3.A - Efflux du nitrate ... 18
I.3.B - Transport du nitrate à longue distance vers les parties aériennes / Translocation ... 18
I.3.C - Réduction du nitrate / Assimilation ... 19
I.3.D - Influx et stockage du nitrate dans la vacuole / Compartimentation ... 20
CHAPITRE II :BASE MOLECULAIRE DU TRANSPORT DE NITRATE ... 22
II.1 - Les transporteurs NRT2 ... 23
II.1.A - Rôle des transporteurs NRT2 ... 23
II.1.B - Régulation de l’activité de transport des NRT2s par NAR2 ... 25
II.2 - Les transporteurs NPF caractérisés et leur(s) substrat(s) ... 27
II.3.A - Sous-groupe NPF1 ... 28
II.3.B - Sous-groupe NPF2 ... 29
II.3.C - Sous-groupe NPF3 ... 30
II.3.D - Sous-groupe NPF4 ... 30
II.3.E - Sous-groupe NPF5 ... 31
II.3.F - Sous-groupe NPF6 ... 31
II.3.G - Sous-groupe NPF7 ... 32
II.3.H - Sous-groupe NPF8 ... 32
II.3 - Allocation du nitrate dans la plante ... 33
II.3.A - Acquisition du nitrate par les racines ... 34
II.3.A.a - Influx du nitrate... 34
II.3.A.b - Efflux du nitrate ... 35
II.3.B - Translocation de la racine vers les parties aériennes ... 35
II.3.C - Répartition dans les tissus végétatifs ... 38
II.3.C.a - Réallocation du nitrate dans la partie foliaire de la plante ... 38
II.3.C.b - Stockage dans la vacuole des cellules foliaires ... 39
II.3.C.c - Nitrate dans les cellules de garde ... 39
II.3.D - Mouvement vers les tissus reproducteurs ... 40
CHAPITRE III :SIGNALISATION PAR LE NITRATE ET IMPLICATION DES TRANSPORTEURS ... 41
III.1 - Régulation de l’expression des gènes en réponse au nitrate ... 42
III.1.A - Réponse primaire au nitrate ... 42
III.1.A.a - Le senseur du nitrate AtNPF6.3 et sa régulation post-traductionnelle ... 43
III.1.A.b - Les facteurs de transcription impliqués dans la réponse primaire au nitrate ... 44
III.1.B - Répression des transporteurs de nitrate à long terme ... 47
III.1.B.a - Les gènes cibles ... 47
III.1.B.b - Les acteurs molécules ... 48
IV.1.B.c - La nature du signal de satiété ... 49
III.2 - Régulation de l’architecture du système racinaire par le nitrate ... 50
III.2.A - La réponse systémique au nitrate ... 53
III.2.A.a - Aspect phénotypique de l’architecture du système racinaire ... 53
6
III.2.A.b - Interaction avec la voie de l’auxine ... 54
III.2.A.c - Interaction avec la voie de l’ABA ... 55
III.2.A.d - Interaction avec les autres hormones végétales... 56
III.2.B - La réponse locale au nitrate chez A. thaliana ... 57
III.2.B.a - Aspect phénotypique de l’architecture du système racinaire ... 57
III.2.B.b - Aspect moléculaire de la transduction du signal... 58
III.2.C - le rôle du nitrate et de ces transporteurs sur la mise en place des nodosités ... 61
III.2.C.a - Effet du nitrate sur la mise en place des nodosités ... 61
III.2.C.b - Rôle des transporteurs de nitrate dans la mise en place des nodosités ... 63
CHAPITRE IV :OBJECTIFS ET STRATEGIES ... 64
PARTIE 2 – RESULTATS ... 67
CHAPITRE I :ETUDE IN SILICO DES TRANSPORTEURS PUTATIFS DE LA FAMILLE MTNRT2/MTNAR2 ET MTNPF, ET ANALYSE DE L’EXPRESSION DES GENES MTNRT2/MTNAR2 ... 68
I.1 - Identification et caractérisation moléculaire des familles de gènes NRT2 et NAR2 ... 69
I.1.A - Résumé ... 69
I.1.B - Article n°1 : ... 70
CHAPITRE II :CARACTERISATION FONCTIONNELLE DE LA PROTEINE MTNPF6.8 DANS LES OVOCYTES DE XENOPE ... 90
II.1 - Introduction ... 90
II.2 - Matériels et méthodes ... 91
II.2.A - Extraction de plasmide et mutagénèse dirigée ... 91
II.2.B - Hydrolyse du plasmide et électrophorèse sur gel d’agarose ... 92
II.2.C - Synthèse d’ARNc in vitro et révélation sur gel dénaturant ... 92
II.2.D - Injection d’ARNc ou d’eau dans des ovocytes de xénope ... 92
II.2.E - Prétraitements pharmacologiques sur les ovocytes de xénopes ... 93
II.3 - Résultats – Discussion ... 94
II.3.A - Identification des sites potentiels de phosphorylation ... 94
II.3.B - Effet de la substitution de la thréonine 104 sur l’activité de transport du nitrate par la protéine ... 94
II.3.C - Implication potentielle d’un deuxième site de phosphorylation ... 97
II.3.D - Conclusion ... 99
CHAPITRE III :CARACTERISATION DU ROLE DE MTNPF6.8 IN PLANTA PAR UNE APPROCHE DE GENETIQUE INVERSE ... 101
III.1 - Résumé ... 101
III.2 - Article n°2 : ... 102
CHAPITRE IV :ETUDE DE LIGNEES D’A. THALIANA SUR-EXPRIMANT MTNPF6.8, ROLE DANS LA REGULATION DU SIGNAL NITRATE ... 119
IV.1 - Résumé ... 119
IV.2 - Article n°3 : ... 120
PARTIE 3 : DISCUSSION ET PERSPECTIVES ... 145
I :DISCUSSION GENERALE ... 146
I.1 - Rôle des transporteurs étudiés dans le transport du nitrate ... 146
I.1.A - Rôle des transporteurs dans les systèmes d’absorption du nitrate ... 146
I.1.A.a - Le système HATS ... 147
I.1.A.b - Le système LATS ... 148
I.1.B - Rôle des transporteurs dans le transport systémique ... 151
I.2 - Rôle des transporteurs étudiés dans le signal nitrate ... 152
I.2.A - Influence de MtNPF6.8 dans la mise place du système racinaire ... 153
I.2.B - MtNPF6.8, intermédiaire de la réponse au nitrate de la plante ... 155
I.2.C - MtNRT2.3 et son rôle possible dans la formation des nodosités ... 156
II :CONCLUSION -PERSPECTIVES ... 158
PARTIE 4 : REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ... 160
7
Liste des abréviations
I : Abréviations classiques
2,4-D : Acide 2,4-dichlorophenoxyacetique / Analogue de l’auxine ABA : Acide abscissique
aba : Mutant de synthèse de l’ABA AIA : Acide indole 3-acétique / Auxine AMT1 : Ammonium transporter 1;1 AON : Autorégulation de la nodulation APS : Persulfate d’ammonium
ARNc : Acide ribonucléique complémentaire AMPc : Adénosine monophosphate cyclique ATP : Adénosine triphosphate
CLE : Petits peptides CK : Cytokinine Ct : Cycle seuil
EDTA : Acide 2,2
’,2
’’,2
’’’-(éthane-1,2-diydinitrilo) tétra-acétique For : Sens
GA : gibbérelline
HATS : Système de transport à forte affinité
HEPES : Acide 4-(2-hydroxyétyl)-1-pipérazine éthane sulfonique Km : Constante de Michaelis
LATS : Système de transport à faible affinité LB : Bouillon de Lysogénie
LOD score : Score du logarithme de odds MES : Acide 4-morpholine éthane sulfonique NO : Monoxyde d’azote
PKA : Protéine kinase A QTL : Locus à effet quantitatif Rev : Antisens
RLs : Racines latérales
8 RSA : Architecture du système racinaire
RNAi : Acide ribonucléique interférent
RT-PCR : Transcription inverse et réaction de polymérisation en chaîne SOS : Solution saline standard pour ovocytes
TILLING : Criblage de lésions locales induites dans le génome Tris : 2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diole
UTR : Région non-traduite WT : Type sauvage
II : Abréviations de nom de gènes
ABI : ABA insensitive
AIT : ABA-importing transporter ANR1 : Arabidopsis nitrate regulated 1 ARB3 : Auxin receptor F-box 3
ARF8 : Auxin response Factors 8 AXR4 : Auxine-resistant 4 CHL1 : Chlorate-resistant 1
CIPK23 : CBL-interacting protein kinase 23 CLC : Chloride channels
CRE1 : Cytokinin response 1 GOGAT : Glutamate synthase.
GS : Glutamine synthetase
HAR1 : Hypernodulation aberrant root formation 1 HK3 : Histidine kinase 3
HNI : High nitrogen insensitive
IPT : Adenosine phosphate-isopentenyltransferase IWS1 : Interact-with-Spt6
LABI : Lateral root ABA insensitive
LATD/NIP : Lateral root defective / Numerous infections and polyphenolics LBD : Calcineurin B-like
NARK : Nodule autoregulation receptor kinase
9 NAXT1 : Nitrate excretion transporter 1
NIN : Nodule inception proteins NiR : Nitrite réductase
NIT : Code pour un régulateur positif de la voie d'assimilation du nitrate chez Chlamydomona Nitr1 : Nitrite transporter
NLP : NIN –like protein
NPF : Nitrate transporter 1 / Peptide transporter family NR : Nitrate reductase
NRT : Nitrate transporter
NRT1/PTR : Nitrate transporter 1 / Peptide transporter PKA : Protein kinase A
SLAC1 : Slow anion channel-associated 1 SLAH3 : SLAC1-homolog protein 3
SPL9 : Squamosa promoter-binding-like protein 9
10
Préambule
L’accroissement de la production agricole française et mondiale s’est effectué, depuis les années 1950, dans le cadre d’un modèle intensif de production qui a permis d’assurer la sécurité alimentaire. Il a, par contre, induit des effets contestés sur l’environnement, compte tenu de l’emploi de techniques dégradantes. En effet, 85 à 90 millions de tonnes d'engrais azotés sont ajoutés à la terre à travers le monde chaque année (Good et al., 2004). Ce modèle est ainsi de plus en plus remis en cause. La politique agricole, autant sur le plan français que sur le plan européen, cherche à promouvoir des systèmes de production plus respectueux de l’environnement. Les engagements du Grenelle de l’environnement portent notamment sur la maîtrise de la fertilisation azotée.
Dans cette optique, l’utilisation d’engrais vert est en constante augmentation lors de rotation de culture. En effet, il est considéré que les engrais verts sont des cultures dérobées, c'est-à-dire des cultures dont l'introduction dans la rotation n'entraîne pas de perte de place pour les cultures principales. Ainsi, les espèces apparentées à la famille des Fabacées, ou plus communément appelées les légumineuses, lors d’une rotation de culture sont semées et destinées à être par la suite broyées et enfouies superficiellement dans le sol. Ainsi, elles se décomposent et participent à l'enrichissement en matière organique du sol, d'où leur appellation d'engrais vert. Par ailleurs, les légumineuses, tels le pois (graines) et la luzerne fourragère (tourteau), sont l’un des supports de l’agriculture européenne et française comme source de protéines pour la nutrition humaine et animale (632 000 hectares en France en 2007). Depuis les années 1960, une forte diminution de la culture des légumineuses est observée. Une volonté de relance de cette culture a été mise en place en France au travers de la loi n° 2009-967 du 3 août 2009. L’un des enjeux pour relancer cette production, dans le cadre d’une agriculture plus respectueuse de l’environnement, est de comprendre les mécanismes fondamentaux de la croissance des légumineuses.
Les études fondamentales sur la majeure partie des légumineuses sont limitées par la
grande taille de leur génome. Toutefois, Medicago truncatula (luzerne) est diploïde (2n=16) et
possède un petit génome. Durant ces dernières années, cette espèce a émergé comme
11
modèle pour étudier différents aspects biologiques des légumineuses. Le projet international de séquençage du génome de M. truncatula (M. truncatula Genome Sequencing Initiative) a généré le séquençage et l’annotation (Tang et al., 2014) presque complet du génome (plus de 80%). De plus, une banque de mutants TNT et de mutants TILLING (criblage de lésions locales induites dans le génome) est d’ores et déjà disponible. De plus, de nombreuses études détaillent des outils moléculaires mis en place pour l’étude de cette plante tels que la régénération de plante à partir de cals ou la régénération de systèmes racinaires transformés (plantes composites). Par ailleurs, M. truncatula est phylogénétiquement proche des légumineuses majeures pour l’agriculture (Choi et al., 2004), ce qui en fait un modèle approprié pour étudier la biologie de cette plante et transférer les informations à d’autres légumineuses.
Comprendre l’absorption du nitrate et le contrôle du développement racinaire sont des
challenges importants pour l’optimisation de la croissance des légumineuses en contrôlant
l’apport d’azote. Les transporteurs de nitrate ont été peu étudiés chez les légumineuses,
peut-être parce que ces plantes sont capables de développer des symbioses avec des micro-
organismes fixateurs d’azote gazeux. Cependant, l’absorption du nitrate demeure une étape
importante, notamment en début de croissance de la plantule, alors qu’elle n’a pas encore la
capacité de capter l’azote atmosphérique. De plus, en dépit de la capacité des légumineuses à
former des symbioses fixatrices d'azote, il y a de nombreuses raisons (facteurs
environnementaux) pour que la nodulation ne se produise pas ou ne soit pas suffisante pour
assurer une bonne nutrition de la plante. C'est pourquoi les sources d'azote inorganique telles
que le nitrate préférentiellement et l’ammonium, sont indispensables pour les non-
légumineuses mais aussi pour les légumineuses (Woodall et Forde, 1996). C’est donc dans ce
contexte et avec comme modèle d’étude M. truncatula, que se sont orientés ces travaux de
thèses qui vont être détaillés à travers ce manuscrit.
12
Partie 1 : Introduction
13
Chapitre I : Nutrition azotée des plantes supérieures
L’azote est un élément nutritif essentiel au développement des plantes, entrant notamment dans la composition des acides nucléiques, des acides aminés et des protéines.
Une carence en cet élément dans le sol est un facteur limitant pour la croissance et peut se traduire par une baisse du rendement et de la qualité des récoltes des plantes cultivées.
L’une des sources essentielles d’azote des plantes est le nitrate (NO
3-). Pour répondre à la disponibilité en nitrate dans le sol, dont les concentrations varient du µM au mM, la plante adapte son système d’absorption.
I.1 - Les sources d’azote chez les plantes supérieures
I.1.A - Source d’azote organique
Il existe différentes formes d’azote organique dans le sol, dont les protéines, les peptides, les acides aminés et l’urée (Schulten et Schnitzer, 1998 ; Näsholm et al., 2009). De nombreuses espèces végétales forment des symbioses avec les champignons sous forme de mycorhizes. La capacité de ces champignons à dégrader des composés polymères d’azote est bien établie, de même que la fonction d'absorption d'acides aminés pour la plante (Näsholm et al., 2009). De plus, des expérimentations de suivi d’acides aminés marqués apportés dans le sol ont permis d’obtenir des preuves solides de l’absorption de l'azote organique par les plantes, jusqu’à maintenant étudiées (Schulten et Schnitzer, 1998 ; Näsholm et al., 2009).
Toutefois, elles n'ont pas réussi à fournir des informations sur l'importance quantitative de ce processus. Ainsi, la preuve directe que l'azote organique contribue de manière significative à la nutrition azotée de la plante est encore sujet à débat (Näsholm et al., 2009).
I.1.B - Source d’azote inorganique
La minéralisation de l'azote est le processus par lequel l’azote organique est converti
en forme inorganique par les micro-organismes du sol. L'azote est alors présent dans
14
l'environnement sous une large variété de formes chimiques, dont l'ammonium (NH
4+), le nitrate (NO
3-), le nitrite (NO
2-) et le protoxyde d'azote (N
2O). En dépit de la capacité des plantes à utiliser une large gamme de formes d’azote, la recherche sur la nutrition azotée des plantes s’est portée principalement sur l’étude de l’absorption des formes inorganiques de l’azote. Cette orientation a été motivée par l'abondance de l'azote inorganique ajouté en masse sous forme d’engrais pour la production agricole. Les plantes supérieures obtiennent la majorité de leur azote de l'assimilation du nitrate et de la réduction de celui-ci. En effet, la concentration en NO
3-dans le sol est généralement nettement plus importante que celle du NH
4+(Crawford et Glass 1998; von Wirén et al., 2000a). Toutefois, la plante possède également un système d’absorption du NH
4+; il est crucial de considérer l'acquisition du NH
4+aux côtés de celle du NO
3-, compte tenu de l'utilisation de l'urée en tant qu’engrais azoté qui est rapidement dégradé en NH
4+.
I.1.C - Azote atmosphérique
L’azote de la plante peut donc être acquis sous plusieurs formes, non seulement organique ou minérale, mais aussi en tant que N
2, la source d’azote la plus abondante dans la biosphère (78% de l’air). Ceci est alors possible grâce à l'interaction symbiotique avec des bactéries du genre Rhizobium notamment pour les légumineuses (Marquez et al., 2005;
Ohyama et al., 2012). La capacité à établir la fixation symbiotique a un impact important sur
l'adaptation des légumineuses lorsque la disponibilité en azote dans le sol est faible,
d’autant que le N
2est une source illimitée qui est continue et uniforme dans
l'environnement de la plante. Cependant, parce que la fixation symbiotique nécessite une
allocation importante de carbone vers les nodosités et est très sensible aux contraintes
locales généralement trouvées dans le sol (variations de concentrations en macroéléments N
et P, conditions stressantes...), la capacité de fixation du N
2des racines de légumineuses est
souvent limitée (Kouas et al., 2005 ; Marquez et al., 2005 ; Ohyama et al., 2012). La
compréhension des mécanismes liés à la formation de l’interaction et à la mise en place des
structures symbiotiques fonctionnelles est alors un enjeu de recherche à différentes échelles
d'investigation : moléculaire, physiologique et écophysiologique.
15
I.2 - Systèmes d’absorption du nitrate
I.2.A - Principe général de l’absorption du nitrate
L’absorption du nitrate au niveau des racines nécessite un transport dont l'activité dépend du gradient électrochimique de protons (donc négatif) et contre un gradient de concentration. En effet, le cytosol des cellules racinaires est chargé négativement (-100 à - 250 mV) par rapport au milieu extérieur et la concentration en nitrate des cellules racinaires (de l'ordre du mM) est généralement plus élevée que dans le milieu extérieur (Crawford, 1995 ; Miller et al., 2009). L’utilisation d’inhibiteurs métaboliques a permis de mettre en évidence que le transport du nitrate est actif et nécessite de l’énergie (Bloom et al., 1992 ; Forde, 2000). Celle-ci est fournie par une hydrolyse d’ATP, avec, chez l’orge un coût énergétique globale de 1 à 3 moles d’ATP pour une mole de nitrate (Bloom et al., 1992). Une alcalinisation du milieu extérieur ainsi qu’une dépolarisation transitoire de la membrane durant l’absorption racinaire de NO
3-suggèrent que cette absorption nécessite un co- transport H
+/NO
3-ou OH
-/NO
3-(Ullrich et Novacky, 1990). L’utilisation de différents
inhibiteurs des pompes H
+-ATPases réduit l’absorption du nitrate et la repolarisation de la
membrane plasmique démontrant ainsi que le transport du nitrate est un symport couplé
aux protons (Ourry et al., 1997). Il semblerait donc que ce soit un symport impliquant 2
H
+/NO
3-(Glass et al., 1992), ce qui expliquerait la dépolarisation de la membrane. Cette
propriété est utilisée pour caractériser les transporteurs de nitrate en électrophysiologie par
une mesure du courant membranaire voltage-dépendant généré par un transport actif du
nitrate dans un système hétérologue : les ovocytes de xénope (Tsay et al., 1993 ; Morère-Le
Paven et al., 2011). Sur la base de leur cinétique, les systèmes d'absorption de nitrate ont
été classés en deux groupes : le système de transport à haute affinité (HATS : High-Affinity
Transport System) et le système de transport à faible affinité (LATS : Low-Affinity Transport
System).
16 I.2.B - Le système HATS
Le système de transport à haute affinité (HATS; Km <200 µM) fonctionne à de faibles concentrations en nitrate externe, en général [NO
3-] ≤500 μM, et possède une composante inductible (iHATS) ainsi qu’une composante constitutible (cHATS) (Siddiqi et al., 1989 ; Siddiqi et al., 1990). Ce HATS est saturable et son activité peut être modélisée à l'aide de l’équation de Michaelis-Menten (Aslam et al., 1992 ; Wang et al., 1993 ; Filleur et al.. 2001).
Dans une gamme de concentrations plus élevées (typiquement > 0,5-1 mM), l'activité du LATS devient superposée à celle des HATS.
I.2.C - Le système LATS
Le système LATS fonctionne à de fortes concentrations en nitrate externe, supérieures à 1 mM, et ne présente aucun signe de saturation dans la plante, même à une concentration en nitrate aussi élevée que 50 mM (Siddiqi et al., 1990). En effet, une relation linéaire entre l'augmentation de la concentration en nitrate exogène et l’augmentation du nitrate incorporé a été mise en évidence (Wang et al., 1993 ; Touraine et Glass, 1997). Au même titre que le système HATS, le système LATS possède une composante constitutive (cLATS) et une composante inductible (iLATS) (Faure-Rabasse et al., 2002).
I.2.D - Régulation des systèmes de transport du nitrate
L’absorption du nitrate par la plante est un processus fortement régulé par le nitrate lui-même, le statut physiologique de la plante ainsi que par les fluctuations environnementales (Crawford et Glass, 1998). Ces régulations vont être brièvement introduites ci-dessous.
Contrairement à l’absorption du phosphate et du sulfate, l’absorption du nitrate est
induite par son propre substrat. Les composantes inductibles des systèmes HATS et LATS
sont induites par la présence du nitrate dans le milieu. Cette augmentation de l’absorption
du nitrate est liée à l’augmentation de novo des transporteurs de nitrate (Hole et al., 1990 ;
Siebrecht et al., 1995). L’effet de l’induction est un phénomène transitoire lié à un
17
rétrocontrôle négatif des systèmes de transport par le statut nutritionnel de la plante (King et al., 1993 ; Crawford et Glass, 1998). En effet, de nombreuses études ont montré que la capacité d'absorption du nitrate par les racines est régulée à la baisse lorsque les plantes sont soumises à un fort approvisionnement en azote, et à la hausse en situation limitante ou de carence (Crawford et Glass, 1998 ; von Wirén et al., 2000a ,b ; Kojima et al., 2007; Tsay et al., 2007; Gojon et al., 2009). Des expériences de split-root (division de la racine en deux parties) ont démontré que cette régulation de la capacité d’absorption est sous le contrôle de voies de signalisation systémique. Par exemple, le côté du système racinaire soumis à une absence d’azote dans le milieu, conduit à une stimulation compensatoire de l’absorption du nitrate de l'autre côté du système racinaire (Burns, 1992 ; Ohlen et Larsson, 1992 ; Robinson, 1994 ; Gansel et al., 2001). Tant que la proportion du système racinaire soumis à une privation d’azote n’est pas trop élevée, ne dépasse pas 50-75 %, l'autre côté du système racinaire peut en quelques jours compenser entièrement le manque de nitrate absorbé (Gansel et al., 2001 ; Ruffel et al., 2008). Par ailleurs, il est possible que des produits du métabolisme, tels que les acides aminés, aient un rôle de signal systémique impliqué dans la régulation de l’absorption du nitrate par la plante (Aslam et al., 2001).
L’ammonium, deuxième source d’azote inorganique majeure des plantes agit aussi sur la régulation de l’absorption du nitrate. En effet, à faible concentration, l’ammonium a un effet inducteur rapide et transitoire (Bloom et Sukrapanna, 1990). Par contre, à des concentrations plus élevées, l’ammonium inhibe rapidement mais de façon réversible l’absorption du nitrate. (Lee et Drew, 1989). En outre, la régulation des systèmes d’absorption du nitrate est aussi soumise au rythme circadien, avec un maximum d’absorption la journée et donc soumise à la balance C/N de la plante (Glass et al., 2002).
I.3 - Le devenir du nitrate dans la plante
Après absorption du nitrate par les racines depuis le milieu exogène vers le
cytoplasme ou plus précisément dans le symplasme racinaire, le nitrate incorporé a quatre
sorts possibles : (I) son efflux à travers la membrane plasmique de l’apoplasme, (II) son
transport à longue distance vers les parties aériennes, (III) sa réduction ou (IV) son influx et
stockage dans la vacuole (Crawford et Glass, 1998 ; Marquez et al., 2005).
18 I.3.A - Efflux du nitrate
Le nitrate absorbé peut rapidement retourner au sol par un efflux à travers la membrane plasmique de l’apoplasme. En général, les systèmes d'efflux sont moins bien caractérisés que les systèmes d’influx. L’influx net du nitrate est l'équilibre entre l’influx (absorption) et l'efflux du nitrate (Morgan et al., 1973). Bien que le rôle physiologique de l'efflux de nitrate reste incertain, on sait qu'il augmente lors de variations environnementales telles que les stress ; il pourrait alors être un des acteurs possibles de la régulation de l’homéostasie cellulaire des ions nutritifs (Wang et al., 2012). Il est généralement admis que l’influx de nitrate est un processus actif, nécessitant de l’énergie obtenue à partir d'un couplage avec des protons, alors que l'efflux de nitrate est un processus passif ne dépendant que de la diffusion et des gradients de concentration (Morgan et al., 1973). Il est alors plus susceptible d'être médié par des canaux d'anions, des aquaporines ou des transporteurs de nitrate de la famille NPF (Nitrate transporter 1 / Peptide transporter Familly) qui permettent la diffusion passive du nitrate tels qu’AtNAXT1 d’Arabidopsis thaliana (Nitrate Excretion Transporter 1) (Miller et al., 2009 ; Segonzac et al., 2007). Hormis l’efflux du nitrate vers le sol, l’efflux du nitrate est retrouvé au niveau des organes d’échange de flux tels que le chargement et le déchargement des vaisseaux conducteurs, fonctions médiées par les transports de nitrate de la famille NPF ainsi qu’au niveau des stomates des feuilles (Lin et al., 2008 ; Léran et al., 2014). De façon surprenante, il a été démontré que cet efflux, médié par les transports de nitrate de la famille NPF, nécessite un transport actif (Lin et al., 2008).
I.3.B - Transport du nitrate à longue distance vers les parties aériennes / Translocation
Le nitrate peut être assimilé au niveau de la racine ou des parties aériennes de la
plante. Des considérations théoriques semblent indiquer que l'azote assimilé dans les
feuilles est énergétiquement plus efficace que l'azote assimilé dans les racines quand la
plante est en photopériode et que la compétition entre le dioxyde de carbone et le nitrate
19
pour l’énergie photochimique est minimisée (Smirnoff et Stewart, 1985 ; Marquez et al., 2005). De ce fait, le nitrate doit donc être chargé dans les vaisseaux du xylème. Le nitrate, transporté depuis le milieu exogène vers le rhizoderme, transite par l’apoplasme et le symplasme de la zone corticale de la racine
(Steudle et al., 1993 ; Gojon et Gaymard, 2010).
L’épiderme et le cortex délimitent un espace où les ions, qui ne passent pas la membrane plasmique des cellules, peuvent diffuser librement dans l’apoplasme (Steudle et al., 1993 ; Gojon et Gaymard, 2010). Au niveau de l’endoderme, la bande de Caspari est un obstacle à la diffusion libre des ions à travers l’apoplasme pour ensuite rejoindre les vaisseaux du xylème, suggérant alors un transport actif au niveau de l’endoderme et du xylème assuré par des transporteurs (Steudle et al., 1993 ; Gojon et Gaymard, 2010). Le potassium, K
+, cation majoritaire des cellules végétales est généralement considéré comme l’ion accompagnateur du NO
3-qui permet de maintenir l’électro-neutralité du transport du nitrate dans la plante.
Les efflux de K
+et de NO
3-sont donc fortement corrélés, en particulier lors de l’étape de translocation vers les parties aériennes (Frost et al., 1978 ; Rufty et al., 1981).
I.3.C - Réduction du nitrate / Assimilation
La proportion de nitrate, qui peut être assimilé dans les racines ou dans les parties aériennes, varie considérablement selon les espèces (Andrews, 1986 ; Marquez et al., 2005).
Trois principaux groupes de plantes existent à cet égard : (i) celles qui assimilent de façon significative le nitrate à la fois dans les racines et les parties aériennes (espèces non légumineuses annuelles des climats tempérés), (ii) celles qui assimilent le nitrate préférentiellement dans les feuilles (les espèces non légumineuses et légumineuses des climats tropicaux et subtropicaux), (iii) celles qui assimilent le nitrate préférentiellement dans les racines (espèces de légumineuses vivaces et annuelles des climats tempérés).
La transformation du nitrate comprend trois étapes enzymatiques successives
(Marquez et al., 2005) : la réduction du nitrate en nitrite (étape 1) puis du nitrite en
ammonium (étape 2), par l'action successive de la nitrate réductase (NR) et de la nitrite
réductase (NiR), et pour terminer par l'assimilation de l'ammonium en azote organique
(étape 3) (Figure 1). La glutamine synthétase (GS) et la glutamate synthase (GOGAT) sont les
enzymes clé responsables de l'assimilation d'ammonium chez les plantes supérieures (étape
3), via le cycle GS / GOGAT, pour donner de la glutamine ou du glutamate. Ces acides aminés
20
sont donc les précurseurs du métabolisme azoté et des macromolécules. Le nitrate peut aussi être réduit en monoxyde d'azote (NO) par l’action de la NR. Le NO est alors un composé volatile considéré comme une molécule signale (Lamattina et al., 2003 ; Mur et al., 2013). Il intervient dans de nombreuses réponses du métabolisme de la plante aussi bien en condition normale non stressante qu’en réponse à des stress biotiques et abiotiques (Mur et al., 2013 ; León et al., 2014).
Certaines plantes, et plus particulièrement les légumineuses, peuvent également avoir comme source d'azote le N
2atmosphérique. L'interaction symbiotique de ces plantes avec les bactéries symbiotiques du genre Rhizobium permet la réduction du N
2assimilé en NH
4+dans les nodosités par l'action de la nitrogénase (Figure 1). Le N
2réduit est ensuite transféré à l’ensemble de la plante par la voie GS-GOGAT (Gordon et al., 2002 ; Marquez et al., 2005). L’ammonium est, par conséquent, la forme réduite de l'azote inorganique disponible pour les plantes, quelle que soit la source d'azote utilisée.
Figure 1 : Représentation schématique du processus d'assimilation de l’azote chez les végétaux, d’après Marquez et al., 2005. Abrévations : NR nitrate réductase, NiR nitrite réductase, GS glutamine synthetase, GOGAT Glutamate Synthase.
I.3.D - Influx et stockage du nitrate dans la vacuole / Compartimentation
Le nitrate transporté depuis la racine, organe source, vers les parties aériennes, qui
représentent les organes puits, doit quitter le xylème et entrer dans l’apoplasme des feuilles
21
pour atteindre les cellules du mésophylle. Il est alors de nouveau absorbé pour être soit réduit, soit stocké dans la vacuole (Crawford et Glass, 1998). Les vacuoles des plantes cultivées en présence de nitrate ont un contenu en nitrate représentant environ 60% du nitrate total cellulaire, valeur pouvant atteindre 99% chez l’orge (Martinoia et al., 1981 ; Granstedt et Huffraker, 1982). La vacuole représente donc le principal compartiment de stockage du nitrate des plantes (Martinoia et al., 1981 ; Granstedt et Huffraker, 1982). Chez A. thaliana, un canal, AtCLCa (Chloride channels), a été mis en évidence ; c’est un échangeur spécifique nitrate/proton situé au niveau du tonoplaste des cellules de feuilles permettant le stockage du nitrate (Geelen et al., 2000 ; De Angeli et al., 2006). Les mutants knock-out présentent un phénotype avec une diminution de 50% du nitrate accumulé par rapport à la plante sauvage (WT), suggérant l’implication d’autres transporteurs dans cette étape du devenir du nitrate dans la plante (De Angeli et al., 2006 ; Miller et al., 2009). Trois autres membres de cette famille ont été mis en évidence, AtCLCe, situé dans les membranes des thylacoïdes, AtClCd et AtCLCf, situés tous les deux dans l'appareil de Golgi (Marmagne, 2007 ; Von der Fecht-Bartenbach et al., 2007 ; Monachello et al., 2009). Leur fonction de transport de nitrate n’a toutefois pas encore été mise en évidence (Marmagne, 2007 ; Von der Fecht- Bartenbach et al., 2007).
Le nitrate ainsi que l'azote organique, stockés dans une feuille âgée, peuvent ensuite être remobilisés pour les jeunes feuilles au cours de la croissance végétative de la plante et pour les semences au cours de la phase de reproduction (Diaz et al., 2008; Fan et al., 2009).
En fonction de l’espèce, l'absorption d'azote peut être partiellement ou totalement inhibée
au cours de la phase de reproduction (Masclaux-Daubresse et al., 2010). La remobilisation
de l’azote des feuilles, devenues organes source, est alors nécessaire pour surmonter la forte
demande en azote du remplissage des graines. Cet aspect physiologique est un enjeu majeur
pour la production de graines d’intérêt agronomique telle que celles du colza. En effet, une
partie non négligeable de l’azote du colza, qui pourrait être remobilisée pour le remplissage
des graines, est perdue par la plante et retourne aux champs après sénescence foliaire. En
outre, une forte carence en azote va accélérer la sénescence des feuilles pour améliorer la
remobilisation de cet élément chez Arabidopsis (Guiboileau et al., 2012). Au cours de la
sénescence foliaire, cet organe est devenu une source en azote ; les protéines subissent une
protéolyse et les acides aminés libérés sont remobilisés vers les jeune feuilles et les graines
via le phloème (Masclaux-Daubresse et al., 2010). En plus des acides aminés, de l'azote
inorganique sous la forme de nitrate peut également être remobilisé à partir des feuilles
22
source. Il s’agit alors d’un transport actif par des transporteurs qui permet d’assurer la charge du phloème en nitrate.
Chapitre II : Base moléculaire du transport de nitrate
Avec l’essor des techniques de biologie moléculaire, l’identification des bases
moléculaires du transport d’azote des plantes supérieures a connu une avancée fulgurante
depuis l’identification du premier gène codant pour un transporteur de nitrate nommé
initialement CHL1 (Chlorate resistant 1, Tsay et al., 1993). A présent, de nombreux
transporteurs ont été caractérisés pour le transport d’azote inorganique et organique aussi
bien chez les plantes modèles que chez certaines plantes d’intérêt agronomique. La plante
possède deux systèmes d’absorption du nitrate, HATS pour des concentrations inférieures à
0,5 mM et LATS pour des concentrations supérieures à 1 mM (Tsay et al., 2007). Les
transporteurs correspondant à ces deux systèmes sont divisés en deux familles de protéines
appelées respectivement NRT2 (Nitrate Transporter 2) et NPF. Les transporteurs de ces deux
familles, bien qu’ayant une même fonction de transport de nitrate, n’ont pas d’homologie de
séquence. Ils ont été identifiés chez différentes espèces telles qu’Arabidopsis thaliana, le riz
(Oryza sativa), le lotier (Lotus japonicus), le colza (Brassica napus), l’orge (Hordeum vulgare),
le blé (Triticum aestivum), ou encore la luzerne (Medicago truncatula) (Tsay et al., 2007 ; Yin
et al., 2007 ; Léran et al., 2014). Les transporteurs de ces deux familles ont des
caractéristiques communes ; ils sont tous composés de douze domaines transmembranaires
putatifs et d’une longue chaîne peptidique cytoplasmique entre les domaines
transmembranaires 6 et 7. De plus, tous les transporteurs NRT2 et NPF sont localisés au
niveau de la membrane plasmique de la cellule, à l’exception d’AtNRT2.7 qui est localisé sur
le tonoplaste et d’un transporteur caractérisé chez le concombre (Cucumis sativus)
CsNPF3.2-L localisé au niveau de la membrane du chloroplaste (Figure 2 ; Wang et al., 2012 ;
Léran et al., 2014 ) . Ces transporteurs sont présents dans l’ensemble des organes de la plante,
avec pour certains, des spécificités spatiales et de substrats.
23
Figure 2 : Schéma illustrant le sens de transport du NO3- dans la cellule d’A. thaliana par les transporteurs de nitrate NRT1 et NRT2, les canaux chlorure CLCa et CLCb ainsi que le canal d’anion SLAH3, leur localisation cellulaire, leur régulation post-traductionnelle, le type de transport et les protéines associées à leur fonction de transport, d’après Wang et al., 2012.
II.1 - Les transporteurs NRT2
II.1.A - Rôle des transporteurs NRT2
L’identification du premier transporteur de la famille NRT2 a été obtenue chez des mutants résistants au chlorate d’Aspergillus nidulans ; ce transporteur a été nommé NRTA.
Les études, qui ont suivi sur A. thaliana, ont permis d’identifier sept gènes AtNRT2s (Orsel et al., 2002a,b ; Okamoto et al., 2003). Parmi ces sept gènes, AtNRT2.1 et AtNRT2.2 sont principalement exprimés dans la racine (Filleur et al., 2001). AtNRT2.1 a été montré comme étant le contributeur majeur de l’activité totale HATS (Filleur et al., 2001 ; Li et al., 2007).
Deux autres membres de la famille, AtNRT2.2 et AtNRT2.4, sont impliqués dans cette action mais ils jouent un rôle mineur comparé à celui d’AtNRT2.1 (Li et al., 2007; Kiba et al., 2012).
En effet, AtNRT2.2 représente moins de 20 % de l'activité HATS. En revanche quand
AtNRT2.1 est muté (mutant KO), l’expression d’AtNRT2.2 augmente trois fois pour
compenser la perte fonctionnelle d’AtNRT2.1 (Li et al., 2007). AtNRT2.4 a été caractérisé
comme un transporteur à très haute affinité, contribuant de manière significative à
l'ensemble de l'activité HATS à des concentrations en nitrate inférieures à 25 µM (Kiba et al.,
2012), alors que AtNRT2.1 et AtNRT2.2 sont des acteurs importants à des concentrations
supérieures à 50 µM (Cerezo et al., 2001). A la différence de ces transporteurs, le gène
24
AtNRT2.7 est exprimé uniquement dans la graine, présentant un pic d'expression au cours de la maturation de celle-ci. La protéine est localisée sur le tonoplaste et semble être responsable de l'accumulation de nitrate dans les vacuoles des graines (Chopin et al., 2007).
AtNRT2.5 et AtNRT2.6, caractérisés comme transporteur de nitrate à forte affinité, seraient impliqués dans la même voie de signalisation jouant un rôle important dans l’interaction bénéfique entre A. thaliana et la bactérie Phyllobacterium brassicacearum pour une meilleure croissance de la plante. Ils interviennent dans la réponse à un signal systémique régulé par le statut azoté de la plante, permettant le remodelage de biomasse entre la racine et les parties aériennes (Dechorgnat et al., 2012). Actuellement, il n'existe pas de données fonctionnelles sur AtNRT2.3.
La famille NRT2 a également été bien décrite et caractérisée chez le riz. A ce jour, 4 gènes et 5 transcrits, codant pour des transporteurs de nitrate à forte affinité, ont été identifiés et nommés OsNRT2.1, OsNRT2.2, OsNRT2.3a/b et OsNRT2.4 (Araki et Hasegawa, 2006 ; Cai et al., 2008 ; Feng et al., 2011). Les transporteurs OsNRT2.3a et OsNRT2.3b possèdent plus de 94 % de similarité entre eux et sont décrits comme étant les produits d’un épissage alternatif d’un ARNm (Feng et al., 2011 ; Yan et al., 2011). En effet, le gène OsNRT2.3 code une protéine de 516 acides aminés, qui a été renommée OsNRT2.3a, mais code aussi pour une protéine de 486 acides aminés nommée OsNRT2.3b. De façon étonnante, OsNRT2.1 et OsNRT2.2 ont la même séquence codante et présentent seulement des différences dans les régions non transcrites, les UTR en 5’ et 3’ (Cai et al., 2008).
OsNRT2.1 et OsNRT2.2 sont exprimés au niveau de la racine primaire et des RLs (Feng et al.,
2011). Par ailleurs, l’expression d’OsNRT2.1 est particulièrement forte dans les pointes
racinaires (racine primaire ou RLs) et les méristèmes, tandis que l'expression d’OsNRT2.2 est
relativement faible dans le méristème. L’expression de ces deux transporteurs est également
retrouvée au niveau des parties aériennes, de l’appareil reproducteur et de la graine. Peu de
données sur la caractérisation fonctionnelle in planta de ces deux transporteurs ont été
obtenues ; il a toutefois été montré que la sur-expression du gène OsNRT2.1 n'augmente pas
l'absorption du nitrate chez le riz (Katayama et al., 2009). OsNRT2.3a est exprimé
principalement dans les racines tandis qu’OsNRT2.3b s'exprime faiblement dans les racines
mais principalement dans les parties aériennes (Feng et al., 2011). De façon plus précise,
OsNRT2.3a est exprimé dans les cellules du parenchyme du xylème, tandis qu’OsNRT2.3b a
été principalement détecté dans les cellules du phloème de feuilles (Tang et al., 2012). La
caractérisation fonctionnelle in planta d’OsNRT2.3a montre que ce transporteur est impliqué
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dans le transport longue distance du nitrate depuis les racines vers les parties aériennes, en particulier à basses concentrations en nitrate exogène (Tang et al., 2012). OsNRT2.4 reste encore un transporteur putatif de nitrate, qui a pour homologue le plus proche AtNRT2.7.
Son expression est retrouvée à la base du méristème des RLs et au niveau des parties aériennes du riz (Araki et Hasegawa, 2006 ; Feng et al., 2011).
La famille NRT2 a également été bien décrite chez deux autres espèces, l’orge (Hordeum vulgare) et le lotier (Lotus japonicus). Chez l’orge, il semblerait qu’il y ait au moins la présence de 10 gènes codant pour des transporteurs de nitrate putatifs (Trueman et al., 1996). Quatre gènes ont été clonés et nommés HvNRT2.1, HvNRT2.2, HvNRT2.3 et HvNRT2.4 (Trueman et al., 1996 ; Vidmar et al., 2000a), mais seul HvNRT2.1 a été caractérisé comme un transporteur de nitrate à forte affinité dans un système hétérologue (Tong et al., 2005).
L’étude de l’expression de ces gènes a montré qu’ils sont exprimés dans les racines de l’orge mais pas dans les tissus foliaires (Vidmar et al., 2000a). Chez le lotier, espèce de la famille des légumineuses, l’accès au séquençage du génome a permis d’identifier 4 séquences de transporteurs NRT2s putatifs, qui semblent tous être exprimés dans les racines de plantes non-nodulantes ou nodulantes (Criscuolo et al., 2012).
Il a été noté que les transporteurs NRT2 des herbacées et des céréales sont phylogénétiquement éloignés de ceux d’A. thaliana. Ainsi, il est difficile de spéculer sur les orthologues possibles de ces transporteurs NRT2, caractérisés chez A. thaliana, et de transposer les connaissances acquises vers ces espèces d’intérêt agronomique (Plett et al., 2010 ; Nacry et al., 2013). Toutefois, chez le blé (Triticum aestivum), espèce peu étudiée en ce qui concerne les bases moléculaires du transport de nitrate, un transporteur à faible affinité, nommé TaNRT2.1, a été cloné et caractérisé (Yin et al., 2007).
II.1.B - Régulation de l’activité de transport des NRT2s par NAR2
La fonction des transporteurs NRT2s des plantes supérieures dépend de la présence d’une petite protéine d’environ 200 acides aminés (aa), nommée NAR2 (ou NRT3), qui interagit directement avec les transporteurs NRT2s (Krapp et al., 2014). Les protéines NAR2 n’ont a priori aucune activité catalytique ou de transport propre connue, mais chez A.
thaliana, AtNAR2.1 (AtNRT3.1) est strictement requis pour l'expression et l'activité de
transport d’AtNRT2.1 (Orsel et al., 2006 ; Wirth et al., 2007). Seuls AtNRT2.7 et OsNRT2.3b,
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transporteurs de nitrate à forte affinité caractérisés dans un système hétérologue, font exception et n’ont pas besoin de NAR pour permettre le transport du nitrate (Chopin et al., 2007 ; Feng et al. 2011).
Chez Arabidopsis, deux gènes AtNAR2s ont été mis en évidence, nommé AtNAR2.1 et AtNAR2.2, mais seul AtNAR2.1 semble être nécessaire pour le bon fonctionnement du système d’absorption du nitrate à haute affinité (Orsel et al., 2006 ; Li et al., 2007). En effet, la co-expression d’AtNAR2.1 avec l’un ou l’autre des gènes codant les transporteurs de nitrate AtNRT2s augmente significativement le transport de nitrate dans les ovocytes. Il a été démontré que la protéine AtNRT2.1 interagit physiquement avec AtNAR2.1 au niveau de la membrane plasmique (Yong et al., 2010 ; Kotur et al., 2012). Cela suggère que le système de transport actif peut être un hétéro-oligomère, qui pourrait être un complexe composé de deux sous-unités d’AtNRT2.1 liées à deux sous-unités d’AtNAR2.1 au niveau de la membrane plasmique (Yong et al., 2010 ; Kotur et al., 2012). Ce modèle pourrait alors être transposé à l’ensemble des transporteurs NRT2s car ils interagissent tous avec AtNAR2.1, à l’exception d’AtNRT2.7 (Kotur et al., 2012).
Des gènes NAR2s ont été identifiés chez d’autres espèces ; par exemple 3 gènes chez
l'orge, HvNAR2.1, HvNAR2.2 et HvNAR2.3 (Trueman et al., 1996 ; Vidmar et al., 2000b) et 2
gènes chez le riz, OsNAR2.1 et OsNAR2.2 (Araki et Hasegawa, 2006 ; Plett et al, 2010 ; Feng
et al., 2011). La caractérisation fonctionnelle dans les ovocytes de xénope a montré que, de
façon similaire à A. thaliana, seule la protéine OsNAR2.1 est requise pour le bon
fonctionnement d’OsNRT2.1, OsNRT2.2 et OsNRT2.3a (Feng et al., 2011). In planta,
OsNAR2.1 est exprimé dans les mêmes types de tissus que les transporteurs OsNRT2.1,
OsNRT2.2 et OsNRT2.3, ce qui rend d’autant plus plausible une interaction entre ces
protéines dans la plante (Feng et al., 2011).
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II.2 - Les transporteurs NPF caractérisés et leur(s) substrat(s)
La nomenclature des transporteurs de la famille NPF a évolué depuis l’identification du premier transporteur de nitrate de cette famille jusqu’à récemment. De nombreuses études de prédiction et de caractérisation des transporteurs ont été réalisées cette dernière décennie surtout chez A. thaliana et le riz. Les transporteurs NPF appartiennent à une famille très représentée chez les plantes ; les études de prédiction bioinformatique par homologie de séquence ont permis de quantifier 53 gènes NPF chez A.
thaliana et 80 chez le riz (Tsay et al., 2007). De cette étude basée sur deux espèces dont le
génome était accessible, 4 sous-groupes de transporteurs nommés alors NRT1/PTR avaient
émergés (Tsay et al., 2007). Léran et al. (2014) ont proposé, en concertation avec l’ensemble
de la communauté scientifique travaillant sur le sujet, de renommer les transporteurs de la
famille NRT1/PTR, NPF. Les relations phylogénétiques, établies entre les NPF de 31 espèces
séquencées, ont permis l'identification de nouveaux clades, définissant huit sous-familles
(Figure 3). Par rapport à leurs homologues bactériens et animaux, ces protéines végétales
transportent une grande variété de substrats ; selon le transporteur, il s’agit de nitrate, de
nitrite, de peptides, d’aa, de dicarboxylates, de glucosinolates, d’auxine (AIA), ou d’acide
abscissique (ABA). Il apparait que chacun des huit sous-groupes est représenté par au moins
un membre caractérisé comme transportant un substrat précis (Figure 3).
28
Figure 3 : Arbre phylogénétique de la famille de gènes NPF chez les plantes. L’analyse comprend 2398 séquences de 33 génomes de plantes supérieures entièrement séquencés, identifiant huit sous groupes dans la famille NPF. Dans les cases sont mis en avant les transporteurs de nitrate actuellement caractérisés et leurs différents noms associés dans la littérature, adapté de Léran et al., 2014.
