Rôle des interactions hydrophobes dans la construction des gels acides laitiers

HAL Id: hal-01454143

https://hal.archives-ouvertes.fr/hal-01454143

Submitted on 6 Jun 2020

HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers.

L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d’enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés.

Assiba Dekkari

To cite this version:

Assiba Dekkari. Rôle des interactions hydrophobes dans la construction des gels acides laitiers. 2011, pp.1-37. �hal-01454143�

FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES DE SAINT JERÔME

MASTER AGROSCIENCES

Spécialité « Management de la Qualité en Agroalimentaire »

STAGE DE FIN D’ETUDES

RÔLE DES INTERACTIONS HYDROPHOBES DANS LA CONSTRUCTION DES GELS ACIDES LAITIERS

UMR STLO

INRA Ŕ AGRO-CAMPUS OUEST

Dekkari Assiba Année Universitaire 2010/2011

Je remercie tout d’abord Mme Valérie Deyris, responsable de la formation Agrosciences à l’Université d’Aix-Marseille, qui m’a accompagnée durant mes deux années de Master, et m’a permis de poursuivre par une expérience en recherche quand ma formation semblait me destiner pourtant à une carrière de responsable qualité. Je la remercie donc de m’avoir permis de faire ce qui me tenait à cœur et pour sa constante disponibilité et son suivi.

Je remercie également Mme Sylvie Lortal directrice de l’UMR STLO qui m’a permis d’effectuer ce stage en m’accueillant au sein de son laboratoire, et Mme Joelle Léonil directrice adjoint, pour avoir accueilli ma candidature.

Je ne saurai lister tout ce que m’a apporté ce stage en termes de connaissances théoriques et pratiques certes, mais surtout en termes de savoir-être, et je dois cela à mes encadrantes. De par la place qu’elles ont occupée durant ces 6 mois, il me parait inenvisageable de leur témoigner une gratitude collective.

Je tiens donc tout d’abord à remercier chaleureusement Marion Morand. J’ose peu imaginer combien il doit être difficile de faire confiance à une personne étrangère dans les derniers mois de sa thèse.

Elle m’a pourtant témoigné immédiatement toute sa confiance, et c’est principalement ce qui m’a permis de développer mon autonomie, je lui en suis donc sincèrement reconnaissante. Mon stage étant pour elle sa première expérience d’encadrement je souhaiterais par mes remerciements la rassurer quant à ses qualités d’encadrante. Je tiens à la remercier également pour avoir facilité mon intégration au sein du laboratoire, pour sa disponibilité constante, la formation aux méthodes d’analyse qu’elle m’a dispensée, ses nombreux conseils et son écoute sur le plan professionnel comme personnel.

Je remercie ensuite chaleureusement Marie-Hélène Famelart qui m’a accueillie au sein de la petite unité rhéologie, considérée par certains comme ‘’l’antre sombre’’ de l’UMR. Je la remercie pour sa disponibilité permanente malgré sa quantité de travail faramineuse et ses préoccupations. Je tiens à lui témoigner toute ma gratitude pour m’avoir si chaleureusement recommandée auprès de collègues de Montpellier pour trouver une thèse, et souhaite lui faire part de mon regret de quitter une si belle équipe. Je la remercie enfin pour m’avoir encouragée et m’avoir poussée à positiver par sa simple bonne humeur.

Je remercie également chaleureusement Fanny Guyomarc’h pour ses encouragements, son

accompagnement, ses conseils et sa présence. Je la remercie aussi pour la confiance accordée

concernant ses deux merveilleuses filles Pauline et Maria.

agréable qui règne dans cette équipe et pour les moments de convivialité autour de délicieuses pâtisseries.

Je tiens à témoigner ma gratitude aussi à Frédéric Gaucheron, pour sa gentillesse et pour m’avoir permis de visiter la plateforme LAIT de l’UMR. Je remercie aussi Florence Rousseau pour son aide, son expertise en diffusion de la lumière et sa sympathie.

Merci également à l’ensemble des permanents de l’UMR STLO pour leur accueil et l’ambiance assez extraordinaire qui règne entre ses murs.

Je remercie enfin l’ensemble des stagiaires et non permanents : Ken et Coralie, mes deux colocataires de bureau qui m’ont successivement accompagnée durant ces 6 mois, l’une pour les sympathiques échanges linguistiques franco-chinois, l’autre pour les bons moments passés au bureau comme au labo, Taous pour son amitié et les moments passés au sein et à l’extérieur du laboratoire, Michèle, Namaan et Arlan pour leur bonne humeur brésilienne, et puis tous autres, compagnons de table au déjeuner ou compagnons au labo, Vincent, Redouane, Marion, Fabien, Marc, Livia, etc…

.

Les travaux exposés dans le présent document ont donné lieu aux communications suivantes :

- Article en cours de redaction, « Increasing the hydrophocity of the heat-induced whey protein complexes improves acid gelation of milk » (Marion Morand, Assiba Dekkari, Fanny Guyomarc’h et Marie-Hélène Famelart)

- Présentation orale au cours des « Cinquièmes Rencontres de Biologie-Physique du Grand Ouest » à Rennes, le 9 Juin 2011. « Ingénierie des nanoparticules protéiques et propriétés rhéologiques des gels acides laitiers » (Marion Morand, Assiba Dekkari, Fanny

Guyomarc’h et Marie-Hélène Famelart)

Table des matières

Abréviations ... 1

Présentation du laboratoire d’accueil ... 2

Introduction ... 4

I. Composition du lait ... 6

A. Composition générale ... 6

B. Les protéines du lait ... 6

II. La gélification du lait par acidification ... 8

A. Mécanisme de formation des gels acides ... 8

B. Fabrication du yaourt en industrie agroalimentaire ... 8

III. Le traitement thermique du lait ... 9

A. Effet du traitement thermique sur les protéines du lactosérum ... 9

B. Effet du traitement thermique sur les propriétés du gel acide ... 9

C. Rôle des complexes thermo-induits ... 10

D. Interactions et fonctionnalisation de la micelle de caséine ... 10

IV. Matériel et Méthodes ... 12

A. Matériel ... 12

B. Formation des WPIA 0 ... 12

C. Modification des complexes par acylation ... 12

D. Remplacement du solvant des complexes ... 14

E. Détermination des concentrations protéiques. ... 14

F. Caractérisation des propriétés physicochimiques ... 15

1. Détermination du degré de modification ... 15

2. Mesure de la taille des complexes ... 15

3. Dosage de la composition en groupements thiols ... 17

4. Mesure de l’hydrophobie de surface ... 18

5. Détermination du point isoélectrique apparent ... 19

G. Gélification par acidification ... 19

H. Caractérisation des propriétés mécaniques des gels ... 20

I. Caractérisation des propriétés structurales des gels. ... 21

V. Résultats et Discussion ... 23

A. Etude des propriétés physico-chimiques des complexes thermo-induits. ... 23

1. Degré de modification ... 23

2. Taille des complexes ... 23

3. Composition en groupements thiols ... 24

4. Relation entre point isoélectrique et hydrophobie de surface. ... 24

B. Etude de l’effet de la variation de l’hydrophobie de surface des complexes thermo-induits sur les propriétés des gels acides. ... 26

1. Gélifications acides des suspensions de complexes seuls ... 26

2. Gélifications acides des laits reconstitués. ... 28

Conclusion et Perspectives ... 35

Références bibliographiques ... 36

1

Abréviations

CNIEL : Centre national interprofessionnel de l’économie laitière D

: Diamètre hydrodynamique

DLS : Diffusion dynamique de la lumière DTNB : 5,5'-dithio-bis-2-nitrobenzoïc acide G’ : Module élastique

GDL : Glucono-δ-lactone

ISFPL : Interactions, structures, fonctionnalités des protéines et des lipides mb : Mobilité électrophorétique

MUF : Milk ultrafiltrat (Ultrafiltrat de lait) NaN

: Azide de sodium

pI : Point isoélectrique

PPCN : Phosphocaseinate natif

SEC-MALLS : Size-exclusion chromatography combined with multiangle laser light scattering (Chromatographie d’exclusion stérique couplé à un détecteur par diffusion de la lumière multiangle)

lim

: Contrainte limite

STLO : Science et technologie du lait et de l’œuf tan δ : Tangente delta

UMR : Unité Mixte de Recherche

WPI : Whey protein isolate (Isolat de protéines sériques)

WPIA: Whey protein isolate aggregated (Complexe thermo-induit)

2

Présentation du laboratoire d’accueil

Les travaux rapportés dans le présent document ont été conduits au sein de l’unité mixte de recherche Science et Technologie du Lait et de l’Œuf (STLO) de l’Institut National de la Recherche Agronomique (INRA) située à Rennes au sein de l’Agrocampus Ouest.

Actuellement, 75 permanents, 25 doctorants et environ 10 stagiaires travaillent en étroite collaboration pour une approche pluridisciplinaire des sujets scientifiques. Ils sont répartis au sein de 6 équipes de recherche :

- Biodiversité bactérienne et interactions in situ (B2ISI) - Bioactivité et nutrition (BN)

- Dynamiques diffusionnelle et réactionnelle dans les matrices laitières (D2R) - Transferts et interactions dans les procédés de l’industrie laitière (TIPIL) - Microbiologie de l’œuf et des ovoproduits (MICOV)

- Interactions, structures, fonctionnalités des protéines et des lipides (ISFPL)

Chacune apporte ses compétences et son expertise dans les disciplines variées de la biochimie, physico-chimie, microbiologie et des procédés.

Le laboratoire comporte également 2 plateformes certifiées ISO 9001 :

- Une plateforme technologique dédiée au lait d’une surface de 800m², équipée en matériel de traitement et de transformation du lait permettant de conduire des essais à l’échelle pilote sur une large gamme d’opérations unitaires (homogénéisation, écrémage, séparation membranaire, transformation fromagère, séchage…).

- Une plateforme appelée Centre International de Ressources Microbiennes (CIRM), centre de ressource biologique dédié aux bactéries d’intérêt alimentaire, qui rassemble l’une des plus importantes collections consacrées aux bactéries d’intérêt laitier.

Le laboratoire entretient également de nombreux partenariats avec l’industrie dont 19 des 25 premières entreprises françaises de la filière laitière et l’ensemble des acteurs de la filière œuf. Les interprofessions, comme le Centre National Interprofessionnel de l’Economie Laitière (CNIEL) pour la filière laitière, sont les principaux partenaires. Le laboratoire établit aussi des partenariats avec des PME pour la réalisation de leur recherche et développement.

L’UMR est aussi très ouverte à l’international puisque 30% des publications sont co-signées avec des chercheurs étrangers, et 50% des doctorants proviennent de l’étranger.

Enfin, l’ensemble est soutenu par une équipe d’appui qui apporte un soutien en termes de

documentation, démarches administratives, maintenance et informatique.

3

Au cours de mon stage, j’ai été intégrée au sein de l’équipe « Interactions, structures, fonctionnalités des protéines et des lipides » (ISFPL). Constituée de 12 permanents et 6 doctorants lors de mon arrivée, cette équipe tente de comprendre comment les interactions moléculaires et les modifications de structure induites par les transformations affectent les propriétés fonctionnelles (et nutritionnelles) du lait, de l’œuf et de leurs dérivés. J’ai été encadrée par Marie-Hélène Famelart (chargée de recherche), Fanny Guyomarc’h (ingénieur de recherche) et Marion Morand (doctorante).

Un organigramme présente l’organisation du laboratoire et la place que j’ai occupée au sein de celui-

ci en Annexe 1.

4

Introduction

Les industries de transformation du lait font naître divers aliments de grande consommation tels que les fromages, les produits fermentés, les beurres et les crèmes. Elles fournissent également d’autres industries agro-alimentaires ou non alimentaires en ingrédients. L’industrie laitière est en France la deuxième industrie agro-alimentaire après l’industrie de la viande, puisque son chiffre d’affaire dépasse les 25.6 milliards d’euros en 2008 (CNIEL). La transformation compte 60 000 employés répartis dans près de 700 entreprises. Premier producteur de fromage et de beurre, et deuxième producteur de lait en Europe, la France compte également 6 grands groupes et coopératives laitiers parmi les 30 premiers acteurs mondiaux (Ministère de l’alimentation, de l’agriculture et de la pêche).

Les laits fermentés bien que ne représentant que 5% de la collecte de lait, génèrent à eux seuls près de 30% du chiffre d’affaire de l’industrie laitière. Les français en consomment 22 kg par personne et par an (CNIEL 2007). Secteur dynamique, il a vu naître de nombreuses innovations ces dernières années notamment dans le domaine de la santé avec les produits probiotiques et allégés. La diversification des produits fermentés et la recherche d’innovation poussent les industriels à développer des ingrédients davantage fonctionnels, pour conférer de nouvelles propriétés de texture aux produits ou pour garantir une qualité constante des produits.

Bien que le principe de fabrication des produits fermentés soit aujourd’hui bien connu, beaucoup reste à connaître, notamment sur le comportement et le rôle qu’occupent les protéines lors de la fermentation du lait. On trouve aujourd’hui une multitude de produits fermentés, nous nous sommes intéressés à la formation du réseau protéique par acidification du lait lors de la formation de gels tels que les yaourts.

L’ajout d’une opération de pasteurisation (95°C / 5 min) dans le procédé de fabrication pour éliminer

les souches indésirables a permis de révéler que le chauffage permettait d’obtenir un gel acide plus

ferme et qui se formait plus précocement qu’un lait cru. De plus, il est bien connu que le chauffage

du lait est responsable de la dénaturation des protéines solubles du lactosérum (Singh, 1995) et de la

formation de complexes protéiques dits «complexes thermo-induits». Des travaux ont suggéré que

ces complexes se fixent à la surface de la micelle de caséine pendant le traitement thermique

(Donato, & Guyomarc'h, 2009) et/ou au début de l’acidification (Guyomarc'h, Jemin, Le Tilly,

Madec, & Famelart, 2009). Ainsi, l’hypothèse proposée est que les complexes thermo-induits

interagissent avec la micelle de caséine et la fonctionnalisent pour permettre la formation d’un gel

acide ferme et précoce.

5

Dans de précédents travaux Morand et al. (2012) ont modifié le point isoélectrique de complexes thermo-induits dans le but d’étudier le rôle des interactions électrostatiques dans la formation des gels acides. Il a été montré que la neutralisation des répulsions électrostatiques entre les complexes au cours de l’acidification entraîne la déstabilisation du lait et a un effet sur le pH de gélification.

Toutefois, la gélification a parfois été observée alors que les complexes étaient toujours négativement chargés. Il a donc été suggéré que des interactions hydrophobes attractives s’établissent entre les complexes pour induire la gélification lorsque les répulsions électrostatiques sont faibles. Mes travaux de stage ont pour but de vérifier cette hypothèse en étudiant le rôle des interactions hydrophobes dans la déstabilisation du lait et la construction d’un réseau protéique dans le gel acide.

Ainsi, les missions qui m’ont été confiées ont été de :

1- Modifier l’hydrophobie de surface des complexes thermo-induits et contrôler les modifications.

2- Caractériser l’ensemble des propriétés physico-chimiques des complexes modifiés dans le but de vérifier que les autres propriétés n’ont pas été modifiées.

3- Suivre et caractériser la gélification acide des suspensions de ces complexes et de systèmes laits reconstitués avec ces complexes (propriétés mécaniques et structurales des gels acides)

4- Conclure sur le rôle des interactions hydrophobes dans la formation du gel acide laitier.

Après un rappel des données bibliographiques sur la gélification acide et les connaissances acquises

sur les complexes thermo-induits, nous présenterons les méthodes expérimentales utilisées ainsi que

les résultats obtenus.

6

I. Composition du lait

A. Composition générale

Le lait est un milieu aqueux composé :

- D’une phase aqueuse qui contient des protéines solubles globulaires, des molécules solubles (azote non protéique, composés organiques), et des minéraux (phosphore, calcium…).

- D’une phase lipidique, sous forme d’émulsion.

- D’une phase colloïdale sous la forme d’une dispersion de micelles de caséines associées à des minéraux (phosphate de calcium).

- De micro-organismes et des cellules.

La stabilité de ces phases dépend des conditions physico-chimiques (pH, T°C, force ionique).

B. Les protéines du lait

Le lait contient deux catégories de protéines :

- Les protéines sériques qui sont globulaires et solubles à pH 4.6. Elles se retrouvent donc après coagulation acide du lait dans le lactosérum. De nature et fonction diverses elles sont aussi très sensibles aux traitements thermiques.

- Les caséines qui représentent 80% w/w des protéines du lait (Cayot, & Lorient, 1998) sont insoluble à pH 4.6. Ce sont des chaînes d’acides aminés à faible organisation secondaire (hélice α et feuillet β) qui s’organisent sous forme de particules colloïdales ou micelles de caséine. La structure exacte de la micelle de caséine reste inconnue mais plusieurs modèles sont aujourd’hui proposés pour tenter de l’élucider. Selon le modèle à « structure ouverte » (Figure 1) les caséines κ seraient situées à la surface de la micelle, liées par leur partie N- terminale aux parties hydrophobes des autres caséines et présenteraient une partie hydrophile à la surface de la micelle formant ainsi une couche de « chevelure ». Les caséines seraient maintenues les unes aux autres grâce aux interactions hydrophobes et à la présence de phosphate de calcium colloïdal.

La proportion et la nature de ces protéines sont résumées dans le tableau 1.

7 Caséines

29 g/L

Caséine α

Caséine β Caséine κ Caséine α

Caséine γ

11.1 10.4 3.7 2.9 0.9 Protéines sériques

~ 7 g/L

β-lactoglobuline α-lactalbumine Immunoglobulines Albumines de sérum bovin

Autres

2.5-4.5 1.2-1.7 0.5-1

0.5 0.2

Kurmann, 1978)

Figure 1 : Modèle à « structure ouverte » de la micelle de caséine (d’après Holt & Horne, 1996)

8

II. La gélification du lait par acidification

A. Mécanisme de formation des gels acides

La stabilité du lait dépend de différents facteurs physico-chimiques tels que le pH, la température, et la force ionique. La diminution du pH du lait est le principal facteur responsable de la réorganisation des protéines et de la formation du gel lors de la fabrication de yaourt. Lors de l’ensemencement du lait par des bactéries, celles-ci transforment le lactose en acide lactique, ce qui permet une acidification lente du milieu et la formation d’un gel homogène.

A pH ≤ 6, le phosphate de calcium micellaire se solubilise peu à peu ce qui affaiblit la structure interne de la micelle de caséine. Les caséines se dissocient peu à peu de la micelle. Lorsque le pH avoisine le point isoélectrique (pI) des caséines, soit ~4.6, les répulsions électrostatiques en partie responsables de la stabilisation des micelles diminuent et d’autres interactions attractives interviennent pour former un réseau protéique tridimensionnel (Lee, & Lucey, 2010).

B. Fabrication du yaourt en industrie agroalimentaire

En France, l’appellation « yaourt » est réservée aux produits réalisés à partir d’ingrédients laitiers et ensemencés avec les deux seules souches de bactéries lactiques :

ufc/g minimum (Codex Alimentarius, 2008).

En industrie agroalimentaire, le lait est d’abord standardisé en taux de matière grasse et protéique car

la composition varie selon l’origine ou l’alimentation des animaux. L’homogénéisation permet

ensuite de répartir les globules gras de manière homogène. Un traitement thermique (90-95°C

pendant 5 min) est généralement appliqué dans le but d’éliminer les bactéries pathogènes

potentiellement présentes. Puis le lait est refroidi avant d’être ensemencé à 45°C, incubé à 42°C pour

qu’il coagule, réfrigéré et stocké. D’autres opérations peuvent intervenir (brassage, ajout d’arôme, de

sucre et de fruits) selon le type de yaourt que l’on souhaite obtenir. Un exemple de diagramme de

fabrication des yaourts fermes et brassés est présenté en Annexe 2 (Walstra, Wouters, & Geurts,

2006).

9

III. Le traitement thermique du lait

A. Effet du traitement thermique sur les protéines du lactosérum

Les protéines sériques étant sensibles à la température, le chauffage du lait à des températures au- delà de 60°C provoque une dénaturation de leur structure secondaire et l’exposition de nouveaux sites réactifs (groupements thiols, zones hydrophobes) favorisant la formation de nouvelles interactions entre ces protéines dénaturées et avec la caséine κ soluble (Singh, 1995). Cette nouvelle organisation fait naître des complexes protéiques que l’on appelle « complexes thermo-induits ». Des études récentes ont permis de montrer que ces complexes étaient localisés, dans la phase soluble (lactosérum) et à la surface de la micelle de caséine (Donato et al., 2009).

B. Effet du traitement thermique sur les propriétés du gel acide

La fermeté d’un gel peut être représentée par le module élastique (G’, en Pa) obtenu par rhéométrie.

Il a été montré que chauffer des laits à des températures supérieures à 80°C pendant plus de 15 min augmentait la valeur du G’ par rapport à un lait non chauffé (Lucey, Van Vliet, Grolle, Geurts, &

Walstra, 1997). De plus le traitement thermique du lait permet d’obtenir des gels plus résistants à l’expulsion de sérum (Lucey, Tamehana, Singh, & Munro, 2001). Un exemple est montré pour un traitement thermique du lait à 90°C pendant 10 minutes dans les figures 2a et 2b.

a) b)

Figure 2 a)Evolution de la fermeté de gels au cours de l’acidification d’un lait cru ou chauffé 10 min à 90°C.

b) Photographies d’un gel acide généré à partir de lait cru (gauche), et à partir de lait chauffé au préalable 10 min à 90°C (droite)(Jemin, 2008).

10 C. Rôle des complexes thermo-induits

Les propriétés des gels acides obtenus après traitement thermique ont clairement été attribuées à l’apparition des complexes thermo-induits (Lucey et al., 1997). Aussi, si on ajoute des complexes isolés thermo-induits dans du lait qui n’a pas été traité thermiquement, on peut également produire des gels acides fermes et précoces (O'Kennedy, & Kelly, 2000; Schorsch, Wilkins, Jones, & Norton, 2001).

L’hypothèse est que les complexes solubles migrent et interagissent à la surface de la micelle de caséine au cours de l’acidification et avant la gélification et la fonctionnalisent pour permettre la formation d’un gel ferme et précoce (Donato et al., 2009).

Peu de connaissances ont été acquises en revanche sur les interactions qui s’établissent entre eux ou entre les micelles fonctionnalisées.

D. Interactions et fonctionnalisation de la micelle de caséine

Les interactions complexes-complexes et complexes-micelles établies au cours de l’acidification modifieraient les interactions colloïdales et déstabiliseraient la micelle de caséine. Dans le but de rechercher la nature de ces interactions, Morand et al. (2012) ont utilisé des complexes thermo- induits modèles afin d’observer l’effet de la modification de leurs propriétés physico-chimiques sur la gélification acide du lait. Deux critères sont particulièrement observés : le pH auquel le lait devient instable et gélifie, et les propriétés mécaniques (fermeté, structure) du gel final.

Dans une première approche, le rôle de la caséine κ présente dans les complexes sur les propriétés de gélification a été étudié à différentes compositions en caséine κ. L’hypothèse est qu’au cours de l’acidification la présence de caséine κ dans les complexes influence la gélification en facilitant les interactions des complexes avec la micelle de caséine. Les résultats ont montré que la caséine κ n’a pas d’influence sur les propriétés de gélification du lait et sa présence dans les complexes n’apporte pas de fonctionnalité (Morand, Guyomarc'h, Pezennec, & Famelart, 2011).

Dans une seconde approche, le rôle des interactions électrostatiques a été étudié en caractérisant l’effet des modifications du point isoélectrique des complexes thermo-induits sur les propriétés structurales et mécaniques des gels acides. Il a été montré que l’augmentation du point isoélectrique permet une augmentation du pH de gélification des laits reconstitués (Morand, Guyomarc'h, Legland,

& Famelart M.H., 2012). Ces résultats mettent en évidence que la diminution des répulsions

électrostatiques entraine la déstabilisation des micelles de caséine à un pH moins acide et que ce pH

est déterminé par la charge des complexes alors qu’ils ne représentent que 20% w/w des protéines

11

totales. Cependant aucun effet du point isoélectrique n’a pu être observé sur la fermeté du gel. La diminution des répulsions électrostatiques ne participe donc pas à la construction du gel.

Il a été observé qu’au pH de gélification les complexes thermo-induits étaient toujours faiblement chargés négativement. Donc, la gélification a lieu bien que les répulsions électrostatiques ne soient pas totalement annulées. Pour expliquer ces résultats, l’équipe de recherche a envisagé que d’autres interactions interviennent dans la gélification. L’établissement d’interactions hydrophobes lorsque les répulsions électrostatiques sont faibles est une hypothèse envisagée. C’est cette hypothèse que nous avons testée, et dont les résultats sont exposés dans le présent document.

Des complexes thermo-induits modèles ont été produits, puis chimiquement modifiés pour moduler une de leurs propriétés physico-chimiques (hydrophobie de surface). Ces complexes ont été introduits dans du lait écrémé sans protéine sérique. Ces laits ont été acidifiés et les propriétés mécaniques et structurales des gels formés ont été caractérisées. Ainsi, la stratégie est d’établir une relation directe entre les modifications physico-chimiques des complexes et les fonctionnalités qu’ils apportent, soit sur la déstabilisation des protéines du lait modèle (pH de gélification), soit sur le nombre et/ou les forces d’interactions (propriétés rhéologiques et structurales) (Figure 3).

Figure 3 Représentation schématique de la stratégie expérimentale : établir une relation entre les modifications physico-chimiques des complexes et leur effet sur les propriétés des gels acides.

12

IV. Matériel et Méthodes

A. Matériel

De la poudre de caséine micellaire native (PPCN) est utilisée pour reconstituer un lait sans protéine sérique. Elle est obtenue par microfiltration tangentielle de lait écrémé sur membrane de taille de pores 0.1 µm, puis diafiltré. Le rétentat est concentré par évaporation, puis séché par pulvérisation (Schuck et al., 1994).

Le microfiltrat du lait écrémé est ensuite ultrafiltré sur une membrane de taille de pores 8 kDa, puis diafiltré et lyophilisé, pour donner de la poudre d’isolat de protéines sériques (WPI) (Fauquant, Maubois, & Pierre, 1988). Cette poudre contient 970 g de protéines par kg d’extrait sec.

Le perméat de l’ultrafiltration (MUF) du microfiltrat de lait est également utilisé et stocké à 4°C avec 0.2 g/kg d’azide de sodium (NaN

), un agent bactériostatique qui inhibe la prolifération bactérienne, utilisé donc ici comme agent de conservation. Le MUF, les poudres de PPCN et de WPI sont directement produits à la plateforme technologique de l’UMR STLO. Tout autre produit chimique utilisé au cours de ces travaux est acheté chez des fournisseurs (Sigma-Aldrich-Fluka, Riedel de Haen, Interchim). L’ensemble du protocole expérimental est représenté en Annexe 3.

B. Formation des WPIA 0

La poudre de WPI est reconstituée dans de l’eau distillée à une concentration de 90 g/kg avec 0.2 g/kg de NaN

. La solution est placée sous agitation pendant 2 h. La solution est ajustée à pH 7.5 et stockée 24 h à 4°C. La solution reconstituée de WPI est filtrée sur des filtres 0.45 μm afin d’éliminer les grosses particules mal solubilisées, puis chauffée 2 h à 68.5°C. Ce traitement thermique permet la dénaturation des protéines sériques, leur agrégation et la formation de complexes protéiques modèles (WPIA 0).

C. Modification des complexes par acylation

Afin de modifier les propriétés physico-chimiques des complexes, une réaction d’acylation selon la méthode décrite par Gerbanowski et al. (1999) a été effectuée.

On utilise dans cette réaction des anhydrides purifiés. Les complexes thermo-induits sont acylés par attaque nucléophile des terminaisons ε-NH2 des résidus lysines des protéines sur les anhydrides.

L’anhydride se scinde en deux parties, l’une sera greffée sur la protéine du complexe sous forme

d’une chaîne carbonée, l’autre partie constituera un coproduit acide (Figure 4a). L’utilisation de

différents types d’anhydrides permet de greffer des chaînes carbonées plus ou moins longues sur les

13

complexes et donc d’obtenir des complexes plus ou moins hydrophobes. Cette réaction modifie également le point isoélectrique des complexes puisque à pH 8 les groupements amine des résidus lysine sont sous forme ε-NH3+ (pKa ~10.2) et que le greffage d’une chaîne carbonée fait disparaître la charge positive et rend donc les complexes plus électronégatifs.

Nous utilisons 4 types d’anhydrides - acétique, butanoique, hexanoique et succinique - qui permettent de greffer des chaînes carbonées respectivement de 2, 4, 6 carbones et 4 carbones avec une charge négative. Nous produisons ainsi 4 types de complexes modifiés que nous nommerons C2, C4, C6 et C4- dans la suite de cet exposé.

Il convient de préciser que la réaction d’acylation par l’anhydride succinique porte aussi le nom de succinylation. Ce réactif est en effet particulier car étant sous la forme cyclique la totalité du réactif est greffée sur la protéine, sans production d’acide. (Figure 4b)

Les réactions s’effectuent sur les solutions de complexes protéiques diluées au 1/3, à température ambiante. Le pH diminuant au cours de la réaction avec la production d’acide, il est manuellement ajusté au pH optimum de réaction soit 8-9 jusqu’à ce qu’il se stabilise et que la réaction soit complète (2 h). De 1 à 3 équivalents d’anhydride sont utilisés par résidu lysine, ce qui permet d’obtenir des complexes modifiés avec différents taux de modification.

Figure 4 : a) Réaction d’acylation sur un résidu lysine par un anhydride. L’anhydride utilisé est acétique si R=CH3 ; butanoique si R= CH2-CH2-CH3 ; hexanoique si R= (CH2)₄-CH3. b) Réaction de succinylation sur un résidu lysine par un anhydride succinique, d’après Morand et al. (Morand, Dekkari, Guyomarc'h, & Famelart, 2012).

14

Afin d’éliminer les coproduits acides et l’excès éventuel de réactif d’anhydride, les solutions de complexes modifiés sont abondamment dialysées contre de l’eau distillée.

Pour rappel, la dialyse est un procédé de purification sélective par la taille qui implique la diffusion à travers une membrane poreuse de molécules suivant un gradient de concentration (déplacement des molécules du compartiment le plus concentré au moins concentré). La membrane sélective est caractérisée par un seuil de coupure (MWCO) au-delà duquel les molécules ne peuvent pas passer.

Nous avons utilisé des sacs de dialyse avec un domaine MWCO de 6-8 kDa. Les sacs remplis de solutions de complexes ont été placés dans un grand volume d’eau distillée, mis sous agitation et renouvelé 4 fois toutes les 30 minutes, avant d’être placé sous agitation avec 0.2 g/kg de NaN

à 4°C pendant 12 h.

D. Remplacement du solvant des complexes

Une partie des solutions dialysées est récupérée et stockée à 4°C pour caractériser l’ensemble des propriétés physico-chimiques des complexes. Les complexes doivent être stabilisés dans la phase aqueuse du lait avant d’être ajoutés aux laits. Pour cela, le reste des solutions est abondamment dialysé contre du lait UHT demi-écrémé provenant du commerce. Les sacs de dialyse sont placés dans un grand volume de lait sous agitation à 4°C avec 0.2 g/kg de NaN

toute la nuit. Une partie des complexes modèles (WPIA 0) est également dialysée dans les mêmes conditions.

E. Détermination des concentrations protéiques.

Les concentrations protéiques sont déterminées par spectrophotométrie. En effet, la concentration d’une espèce est déterminée par sa capacité à absorber la lumière dans les limites de proportionnalités selon la loi de Beer-Lambert :

A

= ε l C ⁽¹⁾

Où A est l’absorbance ou densité optique à une longueur d’onde donnée λ (nm), ε le coefficient d’extinction massique (cm²/g), l la longueur du trajet optique (cm), et C la concentration de la solution (g/cm

).

Les concentrations des solutions dialysées dans l’eau et dans le lait sont ainsi calculées par mesure de

l’absorbance à 280 nm et avec un coefficient d’extinction massique de 1.046 cm²/g (Morand et al.,

2012).

15

F. Caractérisation des propriétés physicochimiques

Parmi les objectifs de ces travaux, le premier est de pouvoir modifier l’une des propriétés physico- chimiques des complexes sans que les autres propriétés ne soient altérées, ceci dans le but d’observer l’effet d’une et une seule modification sur les propriétés des gels acides. Une caractérisation complète des propriétés physico-chimiques est donc nécessaire pour s’en assurer (mesure des tailles des complexes, de leur point isoélectrique, de leur composition en groupements thiols), et pour garantir la réussite de la modification chimique effectuée (détermination du degré de modification, hydrophobie de surface).

1. Détermination du degré de modification

Le degré de modification des complexes a été déterminé par une méthode dite OPA (ortho- phthaldialdehyde) (Church, Swaisgood, Porter, & Catignani, 1983).

Cette méthode permet de déterminer la quantité de groupements ε-NH

libres dans une protéine. En effet, en déterminant la quantité de NH

libres avant et après acylation, on peut en déduire le taux de modification.

Le dosage est basé sur la réaction entre l’OPA et le groupement amine qui en présence de 2- diméthylaminoéthanothiol hydrochloride (DMA) permet la production d’un dérivé iso-indole, composé aromatique qui absorbe la lumière à 340 nm. Le taux de modification est calculé par la relation (Gerbanowski, Rabiller, Larre, & Gueguen, 1999) :

% Modification = (AG nm Ŕ AG m )x 100 (2) AG nm

Où AG m est le nombre de groupements amines libres pour les complexes modifiés et AG nm pour les complexes non modifiés. Le coefficient d’extinction molaire a été déterminé par calibration sur de la leucine (Annexe 4) et varie entre 0.0246 et 0.0419 cm²/g.

2. Mesure de la taille des complexes

La taille des complexes est mesurée par deux méthodes, la diffusion dynamique de la lumière (DLS)

et la chromatographie d’exclusion stérique couplée à un détecteur à diffusion de lumière laser multi-

angles (SEC-MALLS).

16 2.1 Diffusion dynamique de la lumière

La DLS est une technique spectroscopique qui permet de déterminer la taille de particules en suspension. Le dispositif simplifié est composé d’une source laser monochromatique éclairant une cellule de mesure contenant l’échantillon. Lorsque le laser va rencontrer les particules de l’échantillon, la lumière va diffuser dans toutes les directions, le rayonnement sera alors recueilli au cours du temps par un détecteur, puis traité par un système informatique doté d’un corrélateur (Figure 5a). L’intensité de lumière au temps t est d’autant moins corrélée avec l’intensité de la lumière à un temps t+dt que la particule a diffusé rapidement pendant ce temps dt, c'est-à-dire qu’elle est petite. On calcule donc ce qu’on appelle la fonction d’auto corrélation de l’intensité au cours d’un temps total considéré. On en déduit le coefficient de diffusion de la particule qui est corrélé au diamètre hydrodynamique (Figure 5b) de la particule par la relation de Stokes-Einstein :

D

= k T (3) 3πηD

Où D

est le diamètre hydrodynamique (m), T la température absolue en degré Kelvin (K), k la constante de Boltzmann (J.K

), η la viscosité dynamique (m

.kg.s

) et D le coefficient de diffusion (m

.s

).

Les D

apparents des complexes modifiés ont été déterminés à l’aide d’un instrument Zetasizer nano Z de chez Malvern à 20°C sur les suspensions de complexes diluées au 1/20

dans du MUF et avec un angle de 173°.

a) b)

Figure 5 : a) Dispositif simplifié de la diffusion dynamique de la lumière (pour une détection à un angle de 90°). b) Représentation du diamètre hydrodynamique (Dh) d’une molécule.

17 2.2 Chromatographie par exclusion stérique

La chromatographie par exclusion stérique (SEC) est une technique qui permet de séparer les molécules par leur taille. La solution de complexes est injectée dans une colonne contenant un matériau poreux, les molécules les plus grosses sortent en premier de la colonne alors que les plus petites, pénétrant dans les pores effectuent un trajet plus long et sont ralenties. Un détecteur à diffusion de lumière multiangle (MALLS) mesure la lumière diffusée par les particules en sortie de la colonne, et à l’aide d’un logiciel, la masse moléculaire (Mw - g/mol) et le rayon de gyration (Rg - nm) des particules sont directement calculés à chaque temps d’élution.

Les valeurs de Mw et Rg pour le complexe considéré sont déterminées pour le temps d’élution à 50% de l’aire total du pic correspondant au complexe (Figure 6).

Figure 6 : Chromatogramme d’une solution de complexes injectée sur une colonne de SEC. Le temps d’élution pour la détermination de la Mw et du Rg est choisi à 50% de l’aire du pic correspondant aux complexes.

3. Dosage de la composition en groupements thiols

Les cystéines sont des acides aminés qui comportent des groupements thiols (SH) susceptibles de

s’oxyder et de former des liaisons avec d’autres groupements thiols pour constituer des ponts

disulfures (SS). Les groupements thiols peuvent être enfouis et non réactifs, démasqués ou de

surface, ou engagés dans des ponts SS. Ces liaisons sont responsables du maintien de la structure

tertiaire dans de nombreuses protéines et sont également responsables de la formation des complexes

thermo-induits par échange SS/SH. On leur attribue donc l’origine probable de la fermeté accrue des

gels acides de laits chauffés. Dans le but de contrôler que les modifications n’ont pas induit de

variation de la composition en différents groupements thiols, un dosage des résidus cystéine totaux

18

(SH + SS), des groupements SH libres totaux et des SH de surface a été effectué selon la méthode d’Ellman (Ellman, 1959). Pour doser les résidus cystéines totaux (SH + SS), les protéines sont soumises à des agents réducteurs, précipitants, et dissociant, et à des agents dissociant seulement pour le dosage des SH totaux. Du DTNB (acide 5,5-Dithiobis 2-nitrobenzoic) est ajouté aux protéines qui réagit avec les groupements thiols et le coproduit de cette réaction (2-nitro-5- thiobenzoate ou TNB) est dosé par spectrophotométrie à 412 nm. Pour le dosage des SH de surface, le DTNB est ajouté aux protéines sans dissociation (Annexe 5).

4. Mesure de l’hydrophobie de surface

L’hydrophobie de surface des complexes est déterminée afin de s’assurer que le greffage de chaines carbonées de différentes longueurs permet d’obtenir des complexes avec une hydrophobie variable.

La méthode consiste en un dosage fluorimétrique, à l’aide d’une sonde fluorescente hydrophobe et non chargée, le PRODAN. Une quantité constante de PRODAN est ajoutée aux complexes dilués à différentes concentrations, et l’intensité de fluorescence, If, est mesurée pour une longueur d’onde d’excitation de 365 nm et d’émission de 465 nm. Compte tenu de la proportionnalité entre la concentration d’une molécule et l’intensité de lumière qu’elle émet lorsqu’elle est excitée, la quantité de PRODAN liée aux complexes dépendra de l’hydrophobie de ceux-ci. Plus les complexes seront hydrophobes, plus la quantité de PRODAN liée et excitée sera élevée, et plus l’intensité lumineuse émise mesurée sera de même élevée. La valeur de l’hydrophobie est donnée par la pente de la droite If = f(C) où C est la concentration en complexes thermo-induits (g/kg), et If l’intensité de fluorescence (Figure 7). Le protocole de la méthode est présenté en Annexe 6.

Figure 7 : Détermination de l’hydrophobie de surface des complexes thermo-induits par un dosage fluorimétrique.

19 5. Détermination du point isoélectrique apparent

Le point isoélectrique apparent (pI) d’une molécule est le pH où cette molécule présente une charge électrique résiduelle nulle. Nous avons déterminé le pI apparent de nos échantillons en mesurant la mobilité électrophorétique (mb) des complexes à différentes valeurs de pH. La mb est en effet proportionnelle à la charge nette, ainsi, lorsque la charge nette des complexes approche la neutralité, la mb approche 0 (Figure 7). Les mesures sont effectuées sur le même instrument Zetasizer que pour la mesure en DLS. Les suspensions de complexes sont diluées au 1/10

. La mb dépend des conditions du milieu, elle a donc été mesurée dans du MUF acidifié à 6 pH différents (2.1, 3.5, 4.1, 4.8, 5.3 et 6.7) complété avec du chlorure de calcium (0g; 0.07g; 0.14g; 0.16g; 0.17g; et 0.18g respectivement).

Figure 8 : Détermination du pI des complexes par la mesure de la mobilité électrophorétique à différents pH : lorsque la mobilité est nulle, le complexe est à son pI.

G. Gélification par acidification

Après une caractérisation complète des propriétés physico-chimiques des complexes modifiés, nous avons étudié l’effet des modifications de ces propriétés sur les caractéristiques structurales et mécaniques de gels acides. Deux types de gélification ont été effectués :

- Des gélifications à 35°C de suspensions de complexes seuls dans du MUF à une concentration de 20 g/kg.

- Des gélifications à 35°C ou 25°C de complexes (10 g/kg) introduits dans un lait sans protéine sérique, constitué de micelle de caséine (PPCN- 40 g/kg) reconstituées dans du MUF. Ce lait

« reconstitué » est une modèle de lait traité thermiquement.

20

La poudre de PPCN est reconstituée dans du MUF à une concentration de 65 g/kg sous agitation à 40°C pendant 4 h avec 0.2 g/kg de NaN

, puis stockée une nuit à 4°C. Le PPCN reconstitué est mélangé aux complexes pour une concentration totale en protéine de 50 g/kg à raison de 20% de complexes et 80% de PPCN, comme dans du lait standard (Tableau 1).

Les solutions sont d’abord équilibrées à la température d’expérimentation (35°C ou 25°C) puis elles sont acidifiées avec de la glucono-δ-lactone (GDL) à 17 g/kg pour les suspensions de complexes seuls et à 18.5 g/kg ou 19 g/kg pour les laits gélifiés à 35°C ou 25 °C respectivement. La GDL est solubilisée sous agitation à température d’expérimentation pendant 2 min. Elle s’hydrolyse en acide gluconique ce qui acidifie lentement le milieu. La vitesse d’hydrolyse augmente avec la température, la quantité nécessaire de GDL a donc été déterminée en effectuant des gammes de concentrations afin que le pH souhaité dans le temps souhaité soit atteint à chaque température (~6 h à 35°C et ~15 h à 25°C).

H. Caractérisation des propriétés mécaniques des gels

Immédiatement après dispersion de la GDL, la solution est placée dans un rhéomètre afin de mesurer les propriétés mécaniques du gel au cours de sa formation. Deux types de rhéomètre ont été utilisé, un rhéomètre AR 1000 à géométrie cylindre-coaxiaux, et un AR 2000 à géométrie cône-plan de chez TA Instruments. Chacun d’eux est utilisé en oscillation à une fréquence de 1 Hertz (Hz) et une contrainte de 0.1%.

En rhéologie, le module élastique G’ en Pascal (Pa) d’un milieu viscoélastique décrit la part solide de la résistance de ce milieu à une contrainte ou une déformation. Autrement dit, plus le G’ est élevé, plus le milieu gagne en fermeté. On mesure également le module visqueux, G’’(Pa) qui peut être décrit comme la résistance de type liquide du milieu. Le pH de gélification est défini lorsque la valeur de G’ est supérieure à 1.

Ainsi, on définit la tangente (tan δ) par le rapport entre ces deux composantes liquides et solides : tan δ = G’’ (4)

G’

La valeur finale de la tan δ est déterminée à pH 4.5 : plus elle est élevée, plus le gel est de type visqueux. Le pH est mesuré toutes les minutes par un pH-mètre programmable (Inlab 415 de chez Mettler Toledo) au cours du temps de la gélification.

Lorsqu’on atteint pH 4.5, un balayage en contrainte est éventuellement effectué sur le gel. Cette

opération permet de déterminer la contrainte limite,

(Pa), pouvant être définie comme la

contrainte à laquelle les gels ne se déforment plus de manière élastique et où les liaisons sont cassées.

21

Plus cette valeur est faible, plus le gel est considéré comme cassant et peu résistant. Cette mesure permet de caractériser la résistance des interactions qui forment le gel.

Enfin, des mesures de résistance en compression ont été effectuées sur des gels acides stockés à 4°C pendant 20 h sur une machine de traction-compression INSTRON équipée d’un capteur de force de 10 Newton, et d’une géométrie cylindrique en matière plastique (diamètre extérieur = 1.1 cm ; hauteur = 4.5 cm). Au fur et à mesure que la géométrie s’enfonce dans le gel, la force utilisée (N) et la distance d’enfoncement (cm) sont mesurées. Une représentation graphique de ces deux valeurs nous permet de déterminer la pente de la courbe jusqu’à la rupture qui représente la rigidité du gel (Figure 9). En d’autres termes, plus la pente est élevée plus le gel est défini comme rigide.

Figure 9 Mesure de la force en fonction de la distance d’enfoncement d’un dispositif de compression dans un gel acide à pH 4.5. La pente P (en N/cm) de l’augmentation de la force en fonction de la distance est déterminée.

I. Caractérisation des propriétés structurales des gels.

La structure des gels est analysée en microscopie confocale à l’aide d’une sonde fluorescente de couleur rouge, la rhodamine-B-isothiocyanate (RITC) qui se fixe sur les protéines. Cette méthode de visualisation optique permet d’obtenir des représentations du gel à différents niveaux de profondeur.

La RITC (4 g/L de RITC solubilisée dans du diméthylsulfoxide) est ajoutée à la solution protéique 15 minutes environ avant l’ajout de GDL, et à température d’expérimentation. Après solubilisation de la GDL une goutte d’échantillon est déposée sur une lame cuvette recouverte d’une lamelle fixée avec du vernis (Figure 10). La lame est retournée et incubée à la même température d’expérimentation (25°C ou 35°C).

L‘observation se fait à pH 4.5, avec un microscope confocal inversé à balayage laser TE2000-E

équipé d’un système d’imagerie (Nikon Cli). La source d’excitation est un laser hélium-néon qui

22

émet à une longueur d’onde de 543 nm et la lumière émise est enregistrée à 590 nm par un détecteur.

L’image est traitée à l’aide d’un logiciel EZ-C1 (Nikon). On observe en grossissant 100 fois à l’aide d’un objectif à immersion dans l’huile x 100 et à une distance de 5 µm par rapport au fond de la lamelle. Les images obtenues sont traitées de sorte que l’on puisse définir pour chaque échantillon la taille des pores créés lors de la formation du réseau protéique.

Figure 10 : Disposition de l’échantillon par rapport à l’objectif dans un microscope confocal inversé. Dans un système inversé l’objectif immergé dans l’huile est placé en dessous de l’échantillon à analyser.

23

V. Résultats et Discussion

A. Etude des propriétés physico-chimiques des complexes thermo-induits.

1. Degré de modification

Le degré de modification des complexes modifiés a été déterminé pour chaque échantillon par la méthode OPA. Il dépend de la quantité de réactif utilisé pour les réactions d’acylation - calculée en équivalent molaire - mais également d’autres facteurs plus difficilement maîtrisables tels que la solubilité des réactifs. Les résultats montrent que pour obtenir un degré de modification équivalent entre chaque échantillon (60-90% de modification) 1 équivalent molaire d’anhydride acétique, butanoique et succinique et 3 équivalents d’anhydride hexanoique sont nécessaires par mole de lysine. Les pourcentages de modifications sont précisés pour chaque échantillon dans la figure 12.

2. Taille des complexes

2.1 Mesure du D

des complexes par diffusion dynamique de la lumière.

La taille des complexes pouvant jouer un rôle dans les propriétés mécaniques et structurales des gels (Kalab, Allan-Wojtas, & Phipps-Todd, 1983; Parnell-Clunies, Kakuda, & Smith, 1987) elle peut entrainer de ce fait un biais dans l’étude de l’effet de l’hydrophobie sur les propriétés des gels. Il a donc été décidé que les complexes avec un D

supérieur à 130 nm ne seraient pas utilisés pour notre étude (Morand et al., 2012). Les résultats montrent que la moyenne pondérée du D

des complexes modifiés ne change par rapport à celle des complexes WPIA 0 et vaut environ 95 nm (±13 nm). La moyenne des D

des complexes succinylés (C4-) est statistiquement plus élevée que celle des autres complexes (127 nm ±0.9 ; P<10

). Cependant cette différence est considérée comme n’ayant pas de conséquence sur la gélification acide, selon des travaux antérieurs (Morand et al., 2012). Tous les complexes modifiés ont donc été utilisés dans la suite de l’étude.

2.2 Mesure de la masse moléculaire et du rayon de gyration des complexes

Comme les mesures en DLS sont facilement biaisées par la polydispersité des particules des échantillons, elles sont confirmées par la détermination de la masse moléculaire et du rayon de gyration réalisée après purification des complexes. Les WPIA 0 sont élués à un temps médian de 215 minutes environ. Ce temps médian correspond au temps à 50% de l’aire du pic élué. Les WPIA 0 ont une masse moléculaire variant entre 5.10

et 7.10

g/mol et un rayon de gyration entre 20 et 30 nm.

L’élution sur la colonne des échantillons de complexes greffés a permis de récolter des pics avec un

24

temps d’élution médian compris entre ~207 et 215 min. Ces pics correspondent à des complexes de masse moléculaire et de rayon de gyration équivalents à ceux des WPIA 0.

L’ensemble des résultats obtenus en DLS et en SEC-MALLS nous permettent de confirmer qu’il n’y a pas de variation majeure de la taille, de la masse moléculaire et du rayon de gyration entre les complexes témoins et modifiés.

3. Composition en groupements thiols

La quantité totale de cystéine a été déterminée dans les complexes témoins et modifiés. Elle est d’environ 152 ±30 μmol/g de protéine totale pour les WPIA 0, et varie entre 133 et 177 μmol/g de protéine dans les complexes modifiés. Il n’y a pas de différence significative entre les échantillons (P>0.4). Le dosage des SH libres totaux a montré que les complexes WPIA 0 en contiennent 11±1.7 μmol/g de protéine et les complexes modifiés entre 2 et 10 μmol/g de protéine. Elle s’explique par la possibilité que le greffage ait eu lieu sur quelques groupements SH au lieu d’amines. Bien que la quantité de SH totaux semblent significativement différente (P<0.02) entre les WPIA 0 et les complexes modifiés, on peut considérer que l’effet de cette différence sur les propriétés de gélification sera restreint compte tenu de la faible teneur en groupement SH libre totaux par rapport à la teneur en résidu cystéine totaux (< 7%). Enfin, les résultats du dosage de SH de surface montrent que les complexes contiennent une quantité négligeable de SH de surface, entre 0 et 6 μmol/g de protéine.

4. Relation entre point isoélectrique et hydrophobie de surface.

Nous avons confirmé que plus les complexes sont modifiés (% de modification élevé) plus

l’hydrophobie de surface est élevée, sauf pour les C4- dont l’hydrophobie est inchangée par rapport

aux WPIA 0 (Figure 11). Pour un même pourcentage de modification les résultats confirment bien

les différences d’hydrophobie de surface recherchées entre les différents complexes (observé entre

60 et 90% de modification) : plus la chaîne greffée est longue plus l’hydrophobie est élevée. Enfin la

diminution du point isoélectrique est logiquement liée à l’augmentation du pourcentage de

modification puisque le greffage de chaînes carbonées sur les résidus lysine diminue le nombre de

charges positives des complexes. La figure 12 représente la variation de l’hydrophobie de surface en

fonction du point isoélectrique. Dans le but d’étudier l’effet seulement de la variation de

l’hydrophobie de surface sur les propriétés des gels, nous avons choisi d’étudier un groupe de

complexes dont le pI est compris entre 3.5 et 3.9 (zone grisée), gamme au sein de laquelle il est

considéré comme constant. On peut donc définir, dans cette gamme de pI, 4 groupes distincts de

25

complexes en fonction de leur hydrophobie. Le groupe WPIA 3200 a une hydrophobie moyenne de 3200, on définit de même les groupes WPIA 6400, WPIA 11000 et WPIA 15000.

Figure 11 : Effet de l’augmentation du degré de greffage des lysines des complexes sur leur hydrophobie de surface et leur point isoélectrique.

Figure 12 : Relation entre l’hydrophobie et le point isoélectrique des complexes modèles et modifiés.

26

En conclusion, la caractérisation des propriétés physico-chimiques des complexes nous a permis de nous assurer que l’acylation des complexes thermo-induits permet bien une modification de leur hydrophobie de surface, sans impact sur leur taille, ou leur composition en thiols.

B. Etude de l’effet de la variation de l’hydrophobie de surface des complexes thermo-induits sur les propriétés des gels acides.

1. Gélifications acides des suspensions de complexes seuls

Nous avons dans un premier temps suivi des gélifications acides de suspensions de complexes seuls (sans PPCN) dans le but d’évaluer l’influence des interactions hydrophobes établies entre eux dans la formation et la construction d’un gel acide. Cette approche a été utilisée par Alting et al. (Alting, De Jongh, Visschers, & Simons, 2002) et Morand et al (2012) pour étudier le rôle du pI des complexes sur le pH de gélification, et a aussi un intérêt pour maîtriser l’application en alimentation de WPI comme ingrédient de texture.

La mesure simultanée du pH et du G’ permet d’obtenir une cinétique de l’évolution du module élastique au cours de l’acidification (Figure 13).

Figure 13 : Profil type de gélification acide à 35°C de suspension de complexes seuls (20g/kg).

On peut clairement observer que le pH de gélification des complexes augmente avec l’augmentation

de l’hydrophobie. Les complexes du groupe WPIA 3200 gélifient à pH ~4.8, ceux du groupe WPIA

6400 à pH ~5.2, et les complexes des groupes WPIA 11000 et 15000 gélifient à pH ~5.6 et ~5.7

respectivement. Autrement dit, plus les complexes sont hydrophobes, plus ils gélifient tôt (R

= 0.9).

27

La valeur maximum du G’ (G’ max) des systèmes de complexes du groupe WPIA 3200 ne dépasse pas 100 Pa, alors que les systèmes du groupe WPIA 6400 atteignent des valeurs comprises entre 260 et 460 Pa. Les suspensions de complexes les plus hydrophobes (WPIA 11000 et WPIA 15000) gélifient rapidement mais finissent par se contracter au point d’expulser du sérum, ce qui cause l’effondrement de la valeur du module élastique. On peut imaginer cependant, d’après l’allure de la courbe de gélification, que sans cet effondrement, la valeur du G’ max pour ces complexes aurait été bien supérieure. On peut donc établir une relation entre l’augmentation de l’hydrophobie des complexes et l’augmentation du G’ (R

= 0.7) (Figure 14b).

Il semble donc que l’augmentation de l’hydrophobie de surface des complexes favorise une gélification précoce des systèmes de complexes seuls (Figure 14a), et permette la formation d’un gel acide plus ferme.

Ces conclusions nous permettent de confirmer l’importance du rôle des interactions hydrophobes dans le comportement des gélifications acides des complexes. Mais il est nécessaire de les vérifier dans un système plus proche du lait.

Figure 14 : a) Evolution du pH de gélification de suspensions de complexes modifiés seuls (20 g/kg) en fonction de l’hydrophobie de surface des complexes. b) Evolution du module élastique à pH 4.5 des mêmes suspensions en fonction de l’hydrophobie de surface des complexes.

28 2. Gélifications acides des laits reconstitués.

2.1 Gélifications acides à 35°C

Des gélifications de complexes mélangés aux micelles de caséines reconstituées dans du MUF ont été effectuées à une concentration en complexes protéiques de 10 g/kg et une concentration en PPCN de 40 g/kg. Cet assemblage correspond à un lait écrémé chauffé.

A 35°C les systèmes gélifient si tôt, que cela rend difficile la mesure du pH de gélification. De plus, les gels les plus hydrophobes s’effondrent au-delà de pH 5.2. A cette température, les gélifications sont très rapides, aléatoires et peu répétables, ce qui rend la détermination du G’ final impossible.

Il est donc difficile à 35°C de conclure quant à l’effet de l’hydrophobie de surface des complexes à pI constant, sur le pH de gélification et la fermeté des gels acides. Il semble qu’une cinétique d’acidification trop rapide puisse être responsable de cette instabilité, or la vitesse d’acidification dépend de la température du milieu.

Afin de définir plus précisément l’effet de l’hydrophobie des complexes dans la formation (pH de gélification) et la construction (fermeté) des gels acides, nous avons donc effectué les mêmes mesures à 25°C.

2.2 Gélifications acides à 25°C

Le pH, la valeur du G’ et la tan δ ont été mesurées au cours de l’acidification. Un profil type des courbes de gélification est présenté en figure 15.

On observe que les systèmes avec les complexes du groupe WPIA 3200 gélifient autour de pH 4.9, ceux avec les complexes du groupe WPIA 6400 à des pH compris entre 5.7 et 6.1 et ceux avec les complexes des groupes WPIA 11000 et WPIA 15000 gélifient à pH ~6.2. Il apparait donc clairement que le pH de gélification des systèmes augmente avec l’augmentation de l’hydrophobie des complexes modifiés. Cependant nous avons rencontré une limite puisque la valeur du pH de gélification n’excède pas 6.2 pour les systèmes avec les complexes les plus hydrophobes (Figure 16).

En déterminant la mobilité électrophorétique (mb) des complexes au moment du pH de la

gélification, on peut déterminer leur état de charge à ce pH. Il apparaît que les systèmes qui gélifient

à pH 6.2 sont ceux générés avec les complexes dont la mb au pH de gélification est la plus élevée (-1

µm.cm/Vs). Par conséquent, une hypothèse est que la charge négative élevée des complexes entraine

la stabilisation du milieu par des répulsions électrostatiques si fortes que malgré l’hydrophobie

élevée des complexes, cela ne suffise pas à induire une gélification.

29

Une seconde hypothèse est que nous rencontrons certainement une limite expérimentale. En effet les systèmes les plus hydrophobes gélifient aussitôt qu’ils sont placés dans la géométrie. La première valeur de G’ mesurée pour ces systèmes est comprise entre 1.2 et 1.4 Pa pour un pH < 6.2.

Autrement dit, il est possible que la gélification ait lieu à un pH en réalité plus élevé que pH 6.2, mais impossible à mesurer dans ces conditions expérimentales.

Figure 15 : Profil type de gélifications de complexes modifiés dans des systèmes lait à 25°C et de l’évolution de la tangente au cours de l’acidification.

30

Figure 16 : Effet de l’hydrophobie de surface de complexes protéiques thermo-induits modifiés sur le pH de gélification des systèmes lait à 25°C.

La mesure de la tan δ permet également de visualiser les différences de pH de gélification en fonction de l’hydrophobie, il correspond sur la figure 15 au premier point des courbes. La valeur finale de la tangente nous informe sur les propriétés mécaniques du gel. A pH 4.5, la tan δ des systèmes du groupe WPIA 3200 (~ 0.29 ±0.01) n’est pas significativement différente de la tan δ des systèmes des autres groupes (P>0.16). Cependant les laits reconstitués avec les complexes du groupe WPIA 3200 sont ceux qui gélifient le plus tardivement, donc à pH 4.5 le gel est tout juste formé, et il se peut que la tan δ mesurée puisse encore évoluer, suite à des réorganisations du gel.

On observe également que les valeurs du G’ final des systèmes du groupe WPIA 3200 ne dépassent pas 100 Pa, alors que les systèmes du groupe WPIA 6400 ont des valeurs de G’ considérablement plus élevées, jusqu’à ~ 2700 Pa. Cependant la trop forte hydrophobie du groupe WPIA 11000 semble déstabiliser le système au-delà de pH ~5.4, bien que celui-ci ait gélifié plus tôt et plus rapidement.

Par ailleurs, les systèmes des complexes WPIA 15000, encore plus hydrophobes, gélifient moins

bien que les précédents. La valeur du G’ augmente donc avec l’augmentation de l’hydrophobie de

surface des complexes, mais avec l’effondrement des valeurs de G’ pour les plus hydrophobes on

peut envisager un optimum d’hydrophobie des complexes permettant une construction efficace du

gel acide, et dont la valeur serait comprise entre 5000 et 10000 (Figure 17).