Etude des propriétés physico-chimiques des complexes thermo-induits

1. Degré de modification

Le degré de modification des complexes modifiés a été déterminé pour chaque échantillon par la

méthode OPA. Il dépend de la quantité de réactif utilisé pour les réactions d’acylation - calculée en

équivalent molaire - mais également d’autres facteurs plus difficilement maîtrisables tels que la

solubilité des réactifs. Les résultats montrent que pour obtenir un degré de modification équivalent

entre chaque échantillon (60-90% de modification) 1 équivalent molaire d’anhydride acétique,

butanoique et succinique et 3 équivalents d’anhydride hexanoique sont nécessaires par mole de

lysine. Les pourcentages de modifications sont précisés pour chaque échantillon dans la figure 12.

2. Taille des complexes

2.1Mesure du Dh des complexes par diffusion dynamique de la lumière.

La taille des complexes pouvant jouer un rôle dans les propriétés mécaniques et structurales des gels

(Kalab, Allan-Wojtas, & Phipps-Todd, 1983; Parnell-Clunies, Kakuda, & Smith, 1987) elle peut

entrainer de ce fait un biais dans l’étude de l’effet de l’hydrophobie sur les propriétés des gels. Il a

donc été décidé que les complexes avec un D

supérieur à 130 nm ne seraient pas utilisés pour notre

étude (Morand et al., 2012). Les résultats montrent que la moyenne pondérée du D

des complexes

modifiés ne change par rapport à celle des complexes WPIA 0 et vaut environ 95 nm (±13 nm). La

moyenne des D

des complexes succinylés (C4-) est statistiquement plus élevée que celle des autres

complexes (127 nm ±0.9 ; P<10

). Cependant cette différence est considérée comme n’ayant pas de

conséquence sur la gélification acide, selon des travaux antérieurs (Morand et al., 2012). Tous les

complexes modifiés ont donc été utilisés dans la suite de l’étude.

2.2Mesure de la masse moléculaire et du rayon de gyration des complexes

Comme les mesures en DLS sont facilement biaisées par la polydispersité des particules des

échantillons, elles sont confirmées par la détermination de la masse moléculaire et du rayon de

gyration réalisée après purification des complexes. Les WPIA 0 sont élués à un temps médian de 215

minutes environ. Ce temps médian correspond au temps à 50% de l’aire du pic élué. Les WPIA 0 ont

une masse moléculaire variant entre 5.10

et 7.10

g/mol et un rayon de gyration entre 20 et 30 nm.

L’élution sur la colonne des échantillons de complexes greffés a permis de récolter des pics avec un

24

temps d’élution médian compris entre ~207 et 215 min. Ces pics correspondent à des complexes de

masse moléculaire et de rayon de gyration équivalents à ceux des WPIA 0.

L’ensemble des résultats obtenus en DLS et en SEC-MALLS nous permettent de confirmer qu’il n’y

a pas de variation majeure de la taille, de la masse moléculaire et du rayon de gyration entre les

complexes témoins et modifiés.

3. Composition en groupements thiols

La quantité totale de cystéine a été déterminée dans les complexes témoins et modifiés. Elle est

d’environ 152 ±30 μmol/g de protéine totale pour les WPIA 0, et varie entre 133 et 177 μmol/g de

protéine dans les complexes modifiés. Il n’y a pas de différence significative entre les échantillons

(P>0.4). Le dosage des SH libres totaux a montré que les complexes WPIA 0 en contiennent 11±1.7

μmol/g de protéine et les complexes modifiés entre 2 et 10 μmol/g de protéine. Elle s’explique par la

possibilité que le greffage ait eu lieu sur quelques groupements SH au lieu d’amines. Bien que la

quantité de SH totaux semblent significativement différente (P<0.02) entre les WPIA 0 et les

complexes modifiés, on peut considérer que l’effet de cette différence sur les propriétés de

gélification sera restreint compte tenu de la faible teneur en groupement SH libre totaux par rapport à

la teneur en résidu cystéine totaux (< 7%). Enfin, les résultats du dosage de SH de surface montrent

que les complexes contiennent une quantité négligeable de SH de surface, entre 0 et 6 μmol/g de

protéine.

4. Relation entre point isoélectrique et hydrophobie de surface.

Nous avons confirmé que plus les complexes sont modifiés (% de modification élevé) plus

l’hydrophobie de surface est élevée, sauf pour les C4- dont l’hydrophobie est inchangée par rapport

aux WPIA 0 (Figure 11). Pour un même pourcentage de modification les résultats confirment bien

les différences d’hydrophobie de surface recherchées entre les différents complexes (observé entre

60 et 90% de modification) : plus la chaîne greffée est longue plus l’hydrophobie est élevée. Enfin la

diminution du point isoélectrique est logiquement liée à l’augmentation du pourcentage de

modification puisque le greffage de chaînes carbonées sur les résidus lysine diminue le nombre de

charges positives des complexes. La figure 12 représente la variation de l’hydrophobie de surface en

fonction du point isoélectrique. Dans le but d’étudier l’effet seulement de la variation de

l’hydrophobie de surface sur les propriétés des gels, nous avons choisi d’étudier un groupe de

complexes dont le pI est compris entre 3.5 et 3.9 (zone grisée), gamme au sein de laquelle il est

considéré comme constant. On peut donc définir, dans cette gamme de pI, 4 groupes distincts de

25

complexes en fonction de leur hydrophobie. Le groupe WPIA 3200 a une hydrophobie moyenne de

3200, on définit de même les groupes WPIA 6400, WPIA 11000 et WPIA 15000.

Figure 11 : Effet de l’augmentation du degré de greffage des lysines des complexes sur leur hydrophobie de surface et leur point isoélectrique.

26

En conclusion, la caractérisation des propriétés physico-chimiques des complexes nous a permis de

nous assurer que l’acylation des complexes thermo-induits permet bien une modification de leur

hydrophobie de surface, sans impact sur leur taille, ou leur composition en thiols.

B. Etude de l’effet de la variation de l’hydrophobie de surface des complexes