Remerciements
Je tiens tout d’abord à remercier :
Les Professeurs Marc Van Damme et Baldé Mamadou Aliou respectivement Chef du service de Toxicologie de l’Institut de Pharmacie de l’ULB et Chef du Département de Pharmacie de la Faculté de Médecine Pharmacie Odonto-Stomatologie de l’UGANC, qui sont à l’origine de cette thèse et qui durant ces quatre années, m’ont fait bénéficier de leur expérience, leur compétence et encouragement.
Le Professeur Robert Kiss pour tout l’encadrement scientifique dont j’ai bénéficié de sa part.
Le Professeur Pierre Duez pour les avis et conseils en termes de chromatographie.
Les Professeurs Luc Pieters de l’Université d’Anvers et Sonia Piacente du département des Sciences Pharmaceutiques de l’Université de Salerno pour leur collaboration.
Je ne saurai jamais trop remercier les familles Baldé, Sow et Maghlout pour tout le soutien moral, matériel et technique qu’elles m’ont apporté durant ces quatre années.
L’expression de ma gratitude et ma reconnaissance vont également à :
Tous les membres de l’équipe des services de Toxicologie et de Toxicologie et de Biochimie Analytique,
A tous les professeurs du Département de Pharmacie de l’Université de Conakry,
A tous les Chercheurs du Centre de recherche de valorisation des plantes médicinales de Dubréka, A tous ce qui de près ou de loin m’ont apporté leur soutien lors de la réalisation de cette thèse.
Cette thèse a bénéficié du soutien financier de la CUD à travers le projet inter universitaire ciblé intitulé « Renforcement des capacités de formation et des formateurs au département des sciences pharmaceutiques de l’Université de Conakry ».
TABLE DES MATIERES
ABREVIATION ... 6
BUT DU TRAVAIL ... 8
RESUME ... 11
INTRODUCTION ... 12
I. Le cancer ... 12
1. Généralités ... 12
2. Epidémiologie ... 13
2.1. Dans les contrées industrialisées ... 13
2.2. Dans les pays en voie de développement ... 15
3. Traitements ... 16
3.1. La chirurgie ... 16
3.1.1. Dans les pays industrialisés ... 16
3.1.2. Dans les pays en voie de développement ... 18
3.2. La radiothérapie ... 20
3.2.1. Dans les pays industrialisés ... 20
3.2.2. Dans les pays en voie de développement ... 20
3.3. La chimiothérapie ... 21
3.3.1. Les molécules synthétiques ou hémisynthétiques ... 21
3.3.1.1. Dans les contrées industrialisées ... 21
3.3.1.2. Dans les pays en voie de développement ... 23
3.3.2. La phytothérapie ... 25
II. Les méthodes d’investigations pharmacologiques ... 27
1. Evaluation du pouvoir cytostatique / cytotoxique d’une molécule ... 27
2. Caractérisation du mécanisme d’action anti-tumorale d’une molécule ... 28
2.1. Analyse du cycle cellulaire ... 28
2.2. Analyse du taux et du type de morts cellulaires ... 28
2.3. Analyse du taux de migration cellulaire ... 30
III. Certaines substances d’origines naturelles présentent à la fois des propriétés antiparasitaire et anticancéreuse ... 32
IV. Les plantes et molécules analysées dans le cadre du présent travail ... 33
1. Pavetta crassipes K schum ... 33
1.1. Classificaction ... 33
1.2. Usage traditionnel et propriétés pharmacologiques ... 33
1.3. Notre stratégie d’investigation ... 35
2. Kalanchoe blossfeldiana Poelln ... 36
2.1. Classification ... 36
2.2. Usage traditionnel et propriétés pharmacologiques ... 36
2.3. Notre stratégie d’investigation ... 37
3. L’isostrychnopentamine ... 40
3.1. Origine ... 40
3.2. Propriétés pharmacologiques déjà connues ... 40
3.3. Notre stratégie d’investigation ... 42
4. Diverses phytotoxines d’origine fongique ... 43
4.1. Origine ... 43
4.2. Propriétés pharmacologiques déjà connues ... 45
4.3. Notre stratégie d’investigation ... 46
V. MATERIELS ET METHODES ... 48
1. Les modèles utilisés ... 48
2. Les plantes et produits testés ... 49
3. Les techniques utilisées ... 50
3.1. Réactifs et solvants ... 50
3.2. Techniques phytochimiques ... 51
3.2.1. Préparation des extraits du Pavetta crassipes (K Schum) ... 51
3.2.2. Fractionnement des extraits du Pavetta crassipes (K Schum) ... 51
3.2.2.1. Fractionnement liquide-liquide ... 51
3.2.2.2. Fractionnements par chromatographie ... 52
3.2.2.2.1. Chromatographie liquide à pression atmosphérique ... 52
3.2.2.2.2. Chromatographie sur couche mince ... 53
3.2.2.2.3. La Chromatographie Flash ... 54
3.2.3. Préparation des Extraits du Kalanchoe blossfeldiana (Poelln) ... 54
3.2.4. Fractionnement des extraits KaFMe2 et KaFMe3 ... 54
3.2.4.1. Fractionnement liquide-liquide ... 54
3.2.5.1.1. Test antibactérien ... 56
3.2.5.1.2. Test antifongique ... 56
3.2.5.2. Test antiprotozoaire ... 56
3.2.5.2.1. Activité antileishmaniale ... 56
3.2.5.2.2. Activité antitrypanosomiale ... 57
3.2.5.2.3. Activité antiplasmodiale ... 58
3.2.5.3. Evaluation du taux de croissance de la population cellulaire ... 59
3.2.5.3.1. Le test colorimétrique MTT ... 59
3.2.5.3.2. La vidéomicroscopie assistée par ordinateur ... 59
3.2.5.4. Détermination du type de mort cellulaire ... 61
3.2.5.5. Mesure de l’ATP cellulaire ... 62
VI. RESULTATS ... 64
1. Pavetta crassipes (K Schum) ... 64
1.1. Phytochimie ... 64
1.2. Activité antibactérienne et antifongique du Pavetta crassipes (K Schum) ... 65
1.3. Activité antiprotozoaire de Pavetta crassipes (K Schum) ... 66
1.4. Evaluation de l’activité anti-tumorale de Pavetta crassipes (K Schum) ... 66
2. Kalanchoe blossfeldiana (Poelln) ... 68
2.1. Feuilles de Kalanchoe blossfeldiana ... 68
2.2. Tiges de Kalanchoe blossfeldiana ... 68
2.3. Racines de Kalanchoe blossfeldiana ... 69
3. Activité anti-tumorale de l’isostrychnopentamine ... 71
3.1. Effet de l’isostrychnopentamine sur la croissance cellulaire ... 71
3.2. Détermination du type de mort cellulaire induite par l’ISP ... 73
3.3. Impact de l’isostrychnopentamine sur la consommation énergétique ... 73
4. Activité anti-tumorale des phytotoxines ... 74
4.1.Evaluation des phytotoxines sur la croissance globale de lignées cancéreuses humaines:74 4.2. Evaluation de la croissance globale ... 78
VII. DISCUSSION ... 79
1. Pavetta crassipes (K Schum) ... 79
1.1. Activité antibactérienne et antifongique ... 79
1.2. Activité antiprotozoaire ... 79
1.3. Activité anti-tumorale de Pavetta crassipes (K Schum) ... 80
2. Activité anti-tumorale de Kalanchoe blossfeldiana (Poelln) ... 82
3. L’isostrychnopentamine : activité anti-tumorale ... 83
4. Phytotoxines fongiques : activité anti-tumorale ... 85
CONCLUSION ET PERSPECTIVES ... 87
BIBLIOGRAPHIE ... 89
ABREVIATION
ACS: American Cancer Society
ADEPT: Antibody Directed Enzyme Prodrug Therapy ADN: Acide Désoxyribonucléique
AIEA : Agence Internationale de l’Energie Atomique AP-1 : Protéine activatrice 1
ART: Radiothérapie adaptive
ATCC: American type culture collection ATP: Adénosine triphosphate
BrdU : Bromodeoxyuridine CCD : Coupled charge device
CCM : Chromatographie sur couche mince
CICR : Centre International de Recherche sur le cancer CMF : Cytométrie de flux
DMSO: Dimethylsulfoxyde
DSMZ: Deutsche sammlung von mikroorganismen und zellkulturen ECACC: European collection of cell culture
GGR : Ratio de croissance globale GHP-1 : Growth hormone protein-1 IC : Concentration inhibitrice
IGRT : Radiothérapie guidée par l’image IKK : kinase inhibitrice de kinase
IS : Index de sélectivité ISP : Isostrychnopentamine
PDNF: Parasite-derived neurotrophic factor
PPAR : Récepteur activé par les proliférateurs de peroxisome PPRE : Elément de réponse aux proliférateurs de peroxisome PSA : Antigène spécifique de la prostate
MEM: minimum essential medium MIC: Concentration minimale inhibitrice
MTT: 3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-diphenyltetrazolium bromide NCI: National cancer institute
NF-κB: Facteur nucléaire kappa B
TdT: terminal desoxynucleotidyl TNF-α: Tumor necrosis factor alpha
TUNEL: Terminal deoxynucleotidyl transferase deoxyuridine triphosphate nick-end labeling RP-HPLC : Chromatographie liquide haute performance en phase inverse
SCC : Squamous cell carcinoma ou Carcinome spinocellulaire
BUT DU TRAVAIL
Le cancer est devenu un véritable problème de santé de par le monde : il représente la 2ème cause de mortalité dans les pays développés et devient également un problème majeur de santé dans les pays en développement.
En République de Guinée, les maladies parasitaires et infectieuses représentent la première cause de consultation et d’hospitalisation. Toutefois l’amélioration des indicateurs de santé a permis de constater que des maladies telles que le cancer et l’hypertension artérielle causent également des problèmes de santé majeurs. Ces pathologies nécessitent très souvent un traitement à vie, or le coût des médicaments les rend hors de portée pour la grande majorité des patients guinéens. Ces derniers ont dès lors recours à la médecine traditionnelle, qui utilise largement des recettes à base de plante. En s’appuyant sur les données ethno-phytothérapeutiques et/ou ethno- pharmacologiques, les chercheurs ont pensé à isoler puis identifier diverses substances d’origine naturelle possédant des propriétés pharmacologiques intéressantes et ce dans bien de domaines.
S’agissant du cancer, les produits naturels ont été à la base de bien des progrès dans les traitements appliqués. C’est notamment le cas de la Pervenche de Madagascar, de l’If et de la Pomme de mai. Dans cette approche des substances naturelles contre le cancer, les alcaloïdes ont fait l’objet d’investigations qui bien souvent ont démontré une activité remarquable. A cet égard, les alcaloïdes indolo-monoterpéniques comme la vincristine et la vinblastine de Catharanthus roseus L G Don ou Pervenche de Madagascar sont aujourd’hui utilisés respectivement dans le traitement des leucémies aigües infantiles et le traitement de la maladie de Hodgkin. C’est dans cette thématique que s’inscrit ce travail de thèse. Notre stratégie de recherche de nouvelles substances anticancéreuses est aussi liée au fait que la plupart des molécules anticancéreuses disponibles sur le marché sont pro-apoptotiques. Or les cancers métastasiques résistent de manière naturelle aux stimuli pro-apoptotiques. Nous avons donc utilisé des modèles de cancers apoptose-sensibles face à des modèles apoptose-résistants.
Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés au Pavetta crassipes K Schum, tant pour son usage traditionnel comme antiparasitaire que par la présence d’alcaloïdes indolo- monoterpéniques dans la composition chimique de ces feuilles. Les résultats biologiques liés au fractionnement réalisé sur cette plante ont confirmé que les effets anticancéreux observés in vitro pouvaient être liés à des alcaloïdes de type indolo-monoterpéniques. En parallèle aux études visant à caractériser les propriétés anticancéreuses in vitro, nous nous sommes également intéressé aux propriétés anti-protozoaires et anti-microbiennes du Pavetta crassipes K Schum, et
ceci grâce à une collaboration avec l’équipe dirigée par le Professeur Luc Pieters à l’Université d’Anvers. N’ayant plus assez de matière première à notre disposition pour terminer notre première étude liée à cette plante, et n’étant plus dans la période propice pour sa récolte, nous nous sommes intéressés à un autre arbuste africain le Strychnos usambariensis Gills. En effet la similitude biogénétique des alcaloïdes de Pavetta crassipes K Schum et de Strychnos usambariensis Gills nous a amené à poursuivre des travaux d’investigation sur le pouvoir anticancéreux in vitro de l’isostrychnopentamine (ISP), qui est l’un des principes actifs de l’espèce aussi traditionnellement employée dans le traitement du paludisme (Rwanda) et qui in vitro a aussi démontré une activité antipaludique. Ce travail a pu être réalisé grâce à une collaboration avec les Professeurs Luc Angenot et Michel Frederich de l’Université de Liège.
Un problème majeur lié à l’exploitation des propriétés thérapeutiques de molécules d’origine naturelle concerne leur complexité structurale. En effet, cette complexité rend impossible leurs synthèses chimiques totales en un nombre limité d’étapes en vue d’une exploitation industrielle rentable. Cet élément est un facteur limitant dans l’exploitation des substances extraites à partir des plantes dont la production standardisée est longue et complexe. Il semblerait que ce problème puisse être de moindre importance si l’on s’adresse à des champignons microscopiques facilement cultivables en grandes quantités et dont les métabolites secondaires bioactifs peuvent être aisément extractibles, en quantités importantes. Or très peu d’études à ce jour se sont intéressées aux propriétés anti-tumorales de champignons microscopiques. C’est la raison pour laquelle nous avons décidé d’investiguer dans un deuxième temps, le potentiel anticancéreux in vitro lié à 14 phytotoxines d’origine fongique, grâce à une collaboration établie avec l’équipe du Professeur Antonio Evidente de l’Université de Naples (Italie). L’une de ces phytotoxines fongiques, la dihydrotricodimérole, est connue pour induire d’autres effets biologiques, liés à l’activation de la cible PPAR. Cette dernière est aussi impliquée dans la biologie des cancers.
Or, aujourd’hui l’identification des cibles biologiques impliquées dans une activité anticancéreuse permet aux chercheurs d’orienter leur recherche vers certaines plantes en s’appuyant sur la chimiotaxonomie. En effet, les plantes d’un même genre renferment souvent des familles de molécules proches voire identiques, et donc susceptibles de posséder la même cible thérapeutique. L’unité de recherche au sein de laquelle j’ai effectué mon travail de thèse a montré que la classe chimique des cardénolides, appartenant à la famille des stéroïdes cardiotoniques, cible la pompe Na/K-ATPase pour exercer ses propriétés anticancéreuses, tant in vitro qu’in vivo.
Ait et d’introduire en 2008 un dérivé hémi-synthétique pour des essais cliniques de Phase I en oncologie, aussi bien en Belgique qu’aux Pays-Bas. Alors qu’il existe des centaines de publications décrivant les effets anticancéreux des cardénolides, il n’existe à ce jour que très peu de publications décrivant de tels effets pour les bufadiènolides.
C’est dans ce contexte que nous nous sommes intéressés également à une plante grasse ornementale, le Kalanchoe blossfeldiana Poelln. La littérature scientifique suggère que le genre auquel appartient cette dernière contient des stéroïdes cardiotoniques de la classe chimique des bufadiènolides. Nous avons donc choisi et entrepris des recherches sur cette plante, accessible en grande quantité auprès de pépiniéristes belges afin de ne pas rencontrer de problèmes d’approvisionnement de matière première comme ce fut le cas lors de notre étude se rapportant à la plante Pavetta crassipes K Schum. Grâce à la collaboration du Professeur Kiss avec le Professeur Sonia Piacente de l’Université de Salerno (Italie), nous avons pu bénéficier de son expertise pour tenter d’isoler ces bufadiénolides.
RESUME
Les molécules actuellement utilisées dans la chimiothérapie anticancéreuse sont pour la majorité d’origine végétale mais peuvent aussi provenir d’organismes marins ou de microorganismes. Ces molécules bien qu’ayant des cibles moléculaires différentes, induisent dans la majorité des cas une mort cellulaire par apoptose. Or ces dernières années le développement d’une chimiorésistance des cellules cancéreuses vis à vis de ce type de molécules s’est particulièrement accru. Face à cette situation le besoin de trouver de nouvelles molécules avec des mécanismes d’action différents se fait de plus en plus pressant. Dans cette perspective nous avons évalué le potentiel anticancéreux des alcaloïdes du Pavetta crassipes K Schum, du Kalanchoe blossfeldiana Poelln, de l’isostrychnopentamine (ISP) isolée du Strychnos usambarensis Gills et de 14 phytotoxines d’origine fongique. Nous avons évalué leurs activités inhibitrices de croissance in vitro sur des lignées humaines cancéreuses de glioblastome (U373), d’oligodendrogliome (Hs-683), de poumon non à petite cellule (A549), de prostate (PC3), de sein (MCF7), d’œsophage (OE21), de mélanome (SKMEL-28) et des lignées murines de mélanome (B16F10) et de carcinome mammaire (MXT). Ces différentes lignées sont décrites dans la littérature comme ayant des niveaux variables de sensibilité aux molécules inductrices d’apoptose. Nous montrons ainsi dans notre travail que l’isostrychnopentamine ou encore des extraits issus de Pavetta crassipes K Schum ont in vitro des activités anticancéreuses intéressantes quelque soit la sensibilité de la lignée cellulaire aux stimuli pro-apoptotiques. De surcroit les lignées connues pour avoir un certain niveau de résistance à l’apoptose sont plus sensibles (IC50 ~ 1µM) aux effets de ces deux fractions que les lignées cancéreuses ou normales habituellement sensibles à l’apoptose (IC50 ~ 2,5µM). Les taux comparatifs d’apoptose induite par l’isostrychnopentamine dans 2 lignées dites résistantes à l’apoptose (U373 et A549) montrent une complète indépendance du taux de sensibilité à l’apoptose de ces lignées. Cette situation laisse penser que l’apoptose n’est pas le mécanisme d’action principale de la molécule.
L’évaluation du potentiel anticancéreux des 14 phytotoxines d’origine fongique sur des lignées cellulaires de cancer humain et murin nous a permis de retenir deux phytotoxines (le bislongiquinolide et le dihydrotricodimerol) pour des investigations plus poussées. En effet les résultats obtenus en vidéomicroscopie indiquent que ces deux phytotoxines ont un effet cytostatique qui in fine conduit à un effet cytotoxique.
INTRODUCTION I. Le cancer
1. Généralités
Le cancer est une pathologie maligne, qui implique trois étapes distinctes mais interconnectées : l’initiation (cellule normale qui se transforme en cellule initiée), la promotion (cellule initiée qui devient une cellule pré-néoplasique), la progression (cellule pré-néoplasique qui devient une cellule néoplasique) [Thangapazham et coll., 2006]. Le cancer est une maladie caractérisée par une croissance et une propagation incontrôlées des cellules anormales. Il perturbe les activités cellulaires qui sont nécessaires au développement et au maintien des organismes multicellulaires : notamment la croissance, la différentiation, la mort cellulaire programmée et l’intégrité des tissus [Mareel et Leroy, 2003].
L’observation au microscope d’un tissu cancéreux par des pathologistes en 1929 révèle une certaine ressemblance entre le tissu embryonnaire et le tissu cancéreux. Cohnhein suggère en 1967 que les tissus adultes contiennent des vestiges embryonnaires normalement dormants qui peuvent être réactivés pour devenir cancéreux [Sell, 2004].
En 1976, Nowell publie l’hypothèse que les néoplasmes surviennent à partir d’une simple cellule normale ayant subi une altération génétique. Pour lui, la progression tumorale serait alors le résultat des variabilités génétiques acquises à l’intérieur d’une population clone d’origine, permettant la sélection séquentielle de plusieurs sous populations clonales [Nowell, 1976].
De ces constats, deux grandes théories émergent. L’une, prônée par Pierce et ses collègues, propose que le cancer résulte d’un défaut du processus de la mort cellulaire programmée des cellules embryonnaires [Pierce et Speers, 1988]. Dans ce cas le microenvironnement embryonnaire serait alors capable de reprogrammer les cellules cancéreuses dérivées d’une lignée [Hendrix et coll., 2007].
L’autre implique les cellules normales. Cette théorie prône l’idée que l’initiation du cancer et sa progression se déroulent en plusieurs étapes d’altérations génétiques successives qui dirigent la transformation des cellules normales en cellules malignes [Tynes et Bjerkvig, 2007].
La progression génétique précédant ainsi la progression tumorale, Calabrese et ses collègues défendent l’hypothèse selon laquelle le phénotype du progéniteur des cellules cancéreuses est une cellule souche [Calabrese et coll., 2004].
De ces différentes théories, nous retenons que tout cancer a une étape d’initiation. Cette étape met en cause non seulement des facteurs extérieurs (cigarette, produits chimiques, radiations, infections par des micro-organismes etc.…) mais aussi des facteurs internes (mutations génétiques, hormones, conditions immunitaires etc.…) [Jemal et coll., 2007]. L’étiologie des cancers n’est pas la même au sein des pays développés et des pays en voie de développement.
Dans les pays développés les cancers les plus fréquents reflètent les profils hormonaux et diététiques de leur population, on note une forte incidence pour les cancers du sein, colorectal et de la prostate. Par contre dans les pays en voie de développement l’origine est surtout infectieuse et une forte prévalence est enregistrée pour les cancers du cerveau, du foie, et de l’estomac [Mellstedt, 2006].
2. Epidémiologie
2.1.
Dans les contrées industrialisées
Le cancer a engendré 7,6 millions de décès en 2007 et pourrait être la première cause de mortalité en 2010 dans le monde [Seffrin, 2008]. L’American Cancer Society (ACS) estime à 1,5 millions le nombre de nouveaux cas de dépistés en 2009, et à 560.000 le nombre de malades mort de leur cancer en 2009 [Jemal et Coll., 2009].
En 2008, aux Etats-Unis, chez l’homme, la plus forte incidence est notée dans les cancers de la prostate (25%), les cancers du poumon et des bronches (15%), les cancers colorectaux (10%) et de la vessie (7%). Chez la femme, la plus forte incidence est notée dans les cancers du sein (26%), les cancers du poumon et des bronches (14%), les cancers colorectaux (10%) et de l’utérus (6%). Les autres types de cancer, aussi bien pour l’homme que pour la femme, ayant des incidences variant entre 2% et 4% [Jemal et Coll., 2008].
En Europe, le Centre International de Recherche sur le Cancer (CIRC) a estimé, en 2005, le
Les cancers du poumon sont les plus fréquents (13,3%) suivis des cancers colorectaux (13,2%) et du sein (13%) ; la mortalité due au cancer suit la même tendance [Boyle et Ferlay, 2005].
Selon l’étude EUROCARE-4 data (2000-2002) l’incidence annuelle du cancer est de 338 cas pour 100.000 habitants en Europe de l’Est et de 447 cas pour 100.000 habitants en Europe de l’Ouest. La même étude révèle que le taux de survie au cancer en Europe de l’Ouest est supérieur à celui de l’Europe de l’Est, mais globalement ce taux a nettement augmenté ces dernières années [Verdecchia et coll., 2007].
Toutefois on note une grande variabilité des taux de survie à 5 ans au niveau mondial (figure 1).
L’étude CONCORD, qui a concerné 1,9 millions de malades vivant sur les 5 continents, rapporte un taux de survie à 5 ans très élevé et de l’ordre de 80%, en Amérique du nord, en Australie, au Japon et en Europe de l’Ouest. En Amérique du Sud, en Europe de l’Est et en Afrique ce taux varie entre 40 et 60% [Coleman et coll., 2008].
Figure1 : Tirer de Coleman et coll., taux de survie à 5 ans à un cancer suivant la région géographique du malade.
Source étude CONCORD [Coleman et coll., 2008].
Le contrôle du cancer apparait donc comme une nécessité mondiale. L’OMS estime qu’en 2020 le nombre de nouveaux cas de cancer par an sera de 16 millions, dont 60% surviendront dans les pays en développement [Lingwood et coll., 2008]. Les changements démographiques à eux seuls engendreront une augmentation de la prévalence actuelle du cancer de 50% en 2020 [Ngoma ; 2006].
2.2.
Dans les pays en voie de développement
Dans les pays en voie de développement le cancer est un problème de santé publique émergeant.
Le nombre de nouveaux cas de cancer entre les années 2000 et 2020 est estimé à 150 millions [Magrath, 2007], d’où la nécessité pour ces pays d’avoir des plans de contrôle du cancer [Lingwood et coll., 2008]. Cependant même dans les pays disposants de ces plans, la survie reste faible (figure 2) [Yeole et coll., 2001]
Figure 2 : Tirer de Yeole et coll. ; taux de survie à 5 ans à Bombay en Inde des patients souffrant d’un cancer colorectal. Ce taux est de 28,4%, 30,9% et 29,7% respectivement pour le cancer du colon, du rectum et colorectal [Yeole et coll., 2001].
En Afrique plus particulièrement, les prévisions de l’incidence annuelle du cancer en 2020 sont évaluées à 804.000 cas et le nombre de morts suite à un cancer, à 626.000 [OMS, 2007]. Face à cette situation l’OMS a initié et encouragé la mise en place de registres de cancer dans ces pays, afin de mieux en contrôler l’expansion [Valsecchi et Steliarova-Foucher, 2008]. Malgré l’existence de ces registres de cancer en Afrique, l’enregistrement des cas de cancer reste très peu développé ; ce qui a un impact sur la fiabilité des données collectées. Il existe donc très peu d’études épidémiologiques sur le cancer dans les pays en voie de développement [Gondos et coll., 2005]. La survie à long terme, la première détection et de bonnes données sur le traitement efficace sont annoncés comme des défis à relever dans la plupart des études africaines [Alatise et
En 2002, le nombre de nouveaux cas de cancer en Afrique était estimé à 650.000 dont 530.000 cas en Afrique subsaharienne. Chez l’homme, le sarcome de Kaposi (12,9%), le cancer du foie (11,5%), de la prostate (9,5%), de la vessie (6,1%), le lymphome non hodgkinien (5,7%) et le cancer de l’œsophage (5,2%) sont les plus fréquents.
Chez la femme, le cancer du col de l’utérus (23,3%), du sein (19,3%), le sarcome de kaposi (5,1%), le cancer du foie (5%), le lymphome non hodgkinien (3,8%) et le cancer de l’ovaire (3,7%) sont les plus courants [Parkin, 2008].
La répartition des cancers est inégale en Afrique et varie d’une région à l’autre [Pezzatini et coll., 2007]. En 2002, la prévalence des mélanomes était de 3,2% en Guinée, 1,4% au Mali et au Sénégal, 2,8% au Nigéria, 9,7% au Libéria, 5,8% en Zambie et de 4,7% au Soudan [Cissé, 2004].
En Egypte et dans les pays de l’Afrique du Nord le carcinome spinocellulaire (SCC) atteint surtout les hommes qui sont plus exposés aux travaux de l’agriculture et à l’eau infectée de schistosomiase [Heyns et Van der Merwe, 2008]. En Afrique subsaharienne, ce type de cancer est fréquent dans les deux sexes [Heyns et Van der Merwe, 2008].
Les cancers du col de l’utérus et du sein, qui représentent respectivement 12% et 10 % des cas de cancer répertoriés, sont les plus fréquents et figurent actuellement parmi les principaux problèmes de santé publique en Afrique [Dangou et coll., 2009].
3. Traitements
3.1.
La chirurgie
3.1.1.
Dans les pays industrialisés
La chirurgie est le traitement de première intention pour guérir les patients souffrant de tumeur solide. Toutefois, même dans le cas d’une tumeur bien localisée et délimitée, le seul traitement par chirurgie reste souvent bien insuffisant. Par exemple, les deux tiers des patients souffrant d’un cancer colorectal sont traités par la chirurgie dans un but curatif. Malheureusement près de 50 % de ces patients développent un cancer sur d’autres sites après l’intervention : foie, poumons, etc. Cette seconde atteinte survient dans 90% des cas endéans les 5 années post opératoires [Tjandra et coll., 2007]. Dans les cancers gastriques tout comme dans ceux du poumon, la chirurgie est utilisée à des fins curatives, mais le taux de survie reste toujours faible [Oba, 2009 ; Haasbeek et coll., 2008].
Auparavant, la chirurgie curative était synonyme de chirurgie mutilante pour le patient atteint d’une tumeur solide. Avec l’avènement de la chirurgie laparoscopique et de la microchirurgie endoscopique transanale tel n’est plus le cas pour le patient [Kahnamoui et coll., 2007;
Bemelman, 2005]. Ainsi, suivant le type d’intervention chirurgicale réalisée (résection partielle, résection totale avec transplantation/ablation, ablation), il semble que la survie à 5 ans soit améliorée. Cependant Buunen et ses collègues rapportent dans une étude comparative entre la chirurgie ouverte et la chirurgie laparoscopique que la différence en termes de survie n’est pas statistiquement significative (figure 3) [Buunen et coll., 2009]
Ces progrès ont certes permis de diminuer le nombre de récidives locales mais ne permettent pas de traiter des cancers ayant déjà développé des métastases. C’est pourquoi dans bien des cas, on adjoint la radiothérapie et/ou la chimiothérapie à la chirurgie ; des études récentes ont montré que l’on peut atteindre un taux de survie à 5 ans pour 50% des patients souffrant d’un cancer de poumon non à petite cellule si l’on adjoint à la chirurgie une chimiothérapie à base de platine [Horn et Sandler, 2009].
Figure 3: Comparaison des survies à 3 et 5 ans entre la chirurgie et la chirurgie laparoscopique. L’étude à couvert la période de Mars 1997 à Mars 2003 ; 29 Hôpitaux européens ont participé et tout les patients souffraient de cancer du colon. Les patients sont divisés en deux groupes : le groupe ayant subit une chirurgie laparoscopique et celui ayant subi une chirurgie ouverte. Les survies à 3 et 5 ans sont dans le groupe chirurgie laparoscopique respectivement de 81,8 % et 73,8%. Dans le groupe chirurgie ouverte, ces taux sont respectivement de 84,2% et 74,2%. Ces taux varient légèrement suivant le stade de la maladie [Buunen et coll., 2009]
3.1.2.
Dans les pays en voie de développement
La chirurgie reste le traitement de référence pour beaucoup de cancers dans les pays en voie de développement où la radiothérapie et la chimiothérapie ne sont souvent pas disponibles ou accessibles [Sanogo et coll., 2004]. C’est le cas dans la prise en charge du cancer de la prostate [Olapade-Olaopa et coll., 2008].
En Guinée, pour les cancers du col utérin et du sein, deux des cancers les plus fréquents chez la femme africaine, le traitement reste également essentiellement chirurgical. La radiothérapie
n’étant pas disponible, pour les stades inopérables, les patientes ne bénéficient que d’un traitement symptomatique sous forme d’antalgiques ou d’antibiotiques pour les formes infectées [Sy, 2004]. Le matériel requis pour un traitement conservateur des pathologies myelo et lymphoproliférative n’étant pas disponible, la splénectomie est totale ; elle est réalisée par laparotomie conventionnelle avec un curetage ganglionnaire, mais 40% des patients traités ont un pronostic défavorable [Touré et coll., 2005].
En Ouganda, pays où la radiothérapie et la chimiothérapie sont disponibles, Gakwaya et ses collaborateurs rapportent que 75 % des cancers du sein chez la femme sont traités par chirurgie suivie d’une radiothérapie ou d’une chimiothérapie. Ils estiment ainsi que le taux de survie à 5 ans est de 74 % pour les cancers du sein bien localisé et de 39 % pour les cancers du sein à un stade avancé (figure 4) [Gakwaya et coll., 2008].
Figure 4: Survie à 5 ans dans un Hôpital d’Ouganda. Pourcentage de survie des patientes ayant souffert d’un cancer de sein en fonction du stade de diagnostic de la maladie. Le pourcentage est établi par la méthode de Kaplan Mayer.
La survie à 2 ans pour les stades précoce et avancé est respectivement de 94% et 56%. A 5 ans ces pourcentages sont respectivement de 74% et 56%. D’une manière générale la survie à 5 ans d’un cancer du sein est estimée à 56% en Ouganda [Gakwaya et coll., 2008].
3.2.
La radiothérapie
3.2.1.
Dans les pays industrialisés
La radiothérapie consiste à traiter le cancer et d’autres maladies au moyen de rayonnements ionisants. Ces derniers lèsent ou détruisent les cellules de la zone traitée (le « tissu cible »), quelles soient cancéreuses ou normales, en endommageant leur matériel génétique ce qui les empêche de se multiplier. La nécessité de préserver l’ADN des cellules normales a conduit au développement de techniques plus performantes regroupées sous l’appellation IGRT (Image Guided Radiation Therapy) et radiothérapie adaptive (ART) [Lefkopoulos et coll., 2007]. Malgré les effets bénéfiques de la radiothérapie, tous les patients n’ont pas la même sensibilité aux radiations et leurs effets adverses limitent leur utilisation [Pollard et Gatti, 2009 ; Birgisson et coll., 2007].
Plus d’un million de patients par an sont traités par radiothérapie dans les pays industrialisés [Tubiana, 2009], seule ou en combinaison avec d’autres types de traitement, il en résulte cependant une amélioration de la survie des patients à 5 ans de plus de 50% (figure 5) [Ceelen et coll., 2009]. Elle reste le traitement de choix des pathologies urologiques malignes et offre des opportunités de combinaison avec la chirurgie pour le traitement des tumeurs à un stade avancé [Coleman et coll., 1996]. Au niveau des tumeurs où il n’est pas possible de faire une chirurgie, elle reste le traitement de premier choix et peut être associée à une chimiothérapie [Corvo, 2007].
3.2.2.
Dans les pays en voie de développement
Si dans les pays développés, à peine la moitié des cancers diagnostiqués nécessite une radiothérapie, dans les pays en voie de développement ce chiffre est nettement plus élevé, du fait notamment de la localisation et du stade avancé des cancers au moment du diagnostic [Bhadrasain, 2005]. D’une manière générale, dans les pays en voie de développement, la radiothérapie est confrontée à deux problèmes : l’insuffisance du nombre de machines et de professionnels qualifiés (Radio-oncologues, techniciens de radiothérapie…). Alors que les besoins actuel en machines de radiothérapie sont estimés à 5000 unités, les pays en voie de développement n’en disposent au total que de 2100. Or les besoins des pays émergeants en 2015 sont évalués à 10.000 unités [Candelaria et coll., 2006]. De plus, selon une enquête du
département santé de l’AIEA (Agence Internationale de l’Energie Atomique), la répartition des machines est irrégulière dans ces pays [Kepka et coll., 2009]. Dans les pays où la radiothérapie est disponible, l’absence de professionnels qualifiés est souvent à la base du non respect des protocoles conventionnels établis [Kepka et coll., 2007].
En Afrique plus de 55% des cancers diagnostiqués nécessitent une radiothérapie, qui malheureusement n’est pas toujours disponible [Sitas, 2008]. Lorsqu’elle est disponible, elle est très souvent d’un coût inaccessible pour la majorité des patients. A l’Institut du cancer de Dakar, sur 616 patientes pour lesquelles le carcinome épidermoïde du col utérin fut diagnostiqué seules 221 patientes ont pu bénéficier d’une radiothérapie pré ou post opératoire [Dem et coll., 2008]. La même étude révèle cependant que malgré l’usage de la radiothérapie, le pourcentage de survie à 5 ans est inférieur à 1% (Figure 6) [Dem et coll., 2008].
Malgré cette déficience en services de radiothérapie dans les pays africains, celle-ci reste un élément majeur dans le traitement palliatif des cancers [Sharma et coll., 2008].
3.3.
La chimiothérapie
3.3.1.
Les molécules synthétiques ou hémisynthétiques
3.3.1.1.
Dans les contrées industrialisées
La chimiothérapie est un traitement de choix pour les cancers avancés; cependant utilisée seule, elle est rarement curative [Lake et Robinson, 2005]. Elle est également utilisée pour la radio- sensibilisation des cellules cancéreuses [Heney et coll., 2009]. Dans les pays développés, les associations chirurgie – chimiothérapie adjuvante et radiothérapie - chimiothérapie adjuvante sont les combinaisons standards utilisées pour traiter la majorité des cancers [Oba, 2009]. Une récente méta-analyse concernant des patients atteints d’un cancer du poumon et recevant une chimiothérapie postopératoire à base de platine, a montré non seulement une augmentation du taux de survie des patients de près de 5.4% mais aussi une survie à 5 ans évaluée à plus de 50%
[Horn et Sandler, 2009].
Classiquement, les chimiothérapies incluent des familles qui sont définies par leur structure
métabolites, inhibiteurs de la topoisomérase I et II, inhibiteurs de la mitose, pro-apoptotique etc.… [Raina et Agarwal, 2007].
Les anti-métabolites : Ils inhibent la synthèse des précurseurs de l’acide nucléique en inhibant une ou plusieurs enzymes tels que la dihydrofolate réductase, la thymidilate transférase, la formyltransférase, la ribonucléotide réductase ou l’adénosine déaminase. Ce sont les antifolates, les fluoropyrimidines (5-Fluorouracile, Ftorafur, Capecitabine), le Pemetrexed, la cytarabine, la fludarabine, la gemcitabine et les analogues de l’adénosine [Espinosa, 2003].
Les agents agissants sur l’ADN : Ils inhibent les topoisomérases (I et II), ou altèrent la structure de l’ADN.
Ils regroupent l’étoposide, la doxorubicine, le mithoxanthrone et leurs dérivés [Azarova et coll., 2007]. Les camptothécines (Topotecan et Irinotecan) qui inhibent la topoisomérase I, une enzyme intervenant dans la réplication de l’ADN [Mann, 2002]. Ou encore les agents alkylants tels les dérivés du moutarde (cyclophosphamide, chlorambucil, procarbazine), les composés dérivés du platine (Cisplatine, Carboplatine) ainsi que des antibiotiques (Bléomicine, Mitomycine C) qui altèrent l’ADN [Chabner et Roberts Jr, 2005 ; Espinosa, 2003 ; Mann ; 2002].
Les agents agissant sur les fonctions cellulaires : Ils agissent soit en inhibant la polymérisation de la tubuline en microtubules, soit en stabilisant ces même microtubules, empêchant ainsi leur dépolymérisation. Ceci contribue au maintien de la forme cellulaire, au transport intracellulaire et tout particulièrement à la mitose. Ce sont des antimitotiques tels les alcaloïdes du vinca et les diterpènes des taxanes [Lake et Robinson, 2005 ; Chabner et Roberts Jr, 2005].
La plupart des molécules anticancéreuses communément utilisées en chimiothérapie présentent deux inconvénients majeurs. Le 1er est la résistance primaire ou acquise développée par les cellules cancéreuses lors du traitement par ces molécules. Cette résistance survient à travers différents mécanismes, comme la mutation de la β-tubuline ou la sur-expression des pompes P-gp multi-drogue résistante ou pompes à efflux [Perez, 2009]. Le 2ème est une toxicité non spécifique ayant pour corolaire un faible index thérapeutique, alors que la majorité des molécules de la chimiothérapie sont utilisées à la dose maximale tolérée afin d’obtenir un effet thérapeutique [Chari ; 2008].
Les avancées récentes dans la compréhension de la biologie du cancer ont permis d’identifier plusieurs molécules cibles avec des rôles clés dans le développement et la progression du cancer [Toschi et Cappuzzo, 2007]. Les traitements ciblés représentent une stratégie qui s’appuie sur des cibles moléculaires capables de différencier les cellules malignes des cellules bénignes [Cleator et
coll., 2007]. De petites molécules et des anticorps monoclonaux capables d’interférer avec des cibles moléculaires spécifiques (récepteur de facteur de croissance, molécules de signalisation, protéine du cycle cellulaire, modulateur de l’apoptose de l’invasion ou de l’angiogenèse) ont ainsi été développés [Widakoviwich, 2007].
L’évènement marquant le début des traitements ciblés a été le développement par Novartis de l’Imatinib, un inhibiteur de kinase développé à partir de la protéine de fusion BCR-ABL.
L’Imatinib est utilisé dans le traitement des leucémies myéloïdes chroniques [Ikediobi et coll., 2006]. L’introduction de l’imatinib a permis d’augmenter de façon significative les taux de rémission (95%), de diminuer les taux de rechute et la toxicité engendrés par les traitements disponibles auparavant [Boissel, 2006]. La Gefitinib et l’Erlotinib, deux autres inhibiteurs de kinases sont utilisés chez des patients présentant un adénocarcinome pulmonaire [Ikediobi et coll., 2006].
Actuellement un nombre important d’agents anticancéreux font l’objet d’essais cliniques, ces agents ciblent plus spécifiquement l’ADN, les récepteurs de membrane, les voies intracellulaires, la tubuline, l’endothélium ou encore la matrice extracellulaire [Neidle et Thurston, 2005].
Les progrès dans la chimie de synthèse et l’identification des cibles ont permis le développement des thérapies ciblées et la production d’un grand nombre de pro-drogues à travers les technologies ADEPT (Antibody Directed Enzyme Pro-drug Therapy). Le Mylotarg commercialisé depuis le moi de mai 2002, en est un exemple. Il renferme un recombinant humain de l’anticorps IgG4 conjugué à la calichéamicine une pro-drogue naturelle qui n’atteint que les cellules leucémiques [Neidle et Thurston, 2005 ; Mann, 2002].
La chimiothérapie conventionnelle utilisée en association avec les thérapies ciblées permet un traitement beaucoup plus spécifique avec une amélioration de la survie à 5 ans (Figure 8) [Joensuu et coll., 2009 ; Labrosse et coll., 2007].
3.3.1.2.
Dans les pays en voie de développement
Alors que 90% des cas de cancer nécessitent une chimiothérapie [Tewari et coll., 2009], dans les pays en voie de développement, le diagnostic et la prise en charge des patients souffrant de cancer restent difficiles, notamment dans les zones rurales où les ressources médicales sont très limitées
Les moyens nécessaires à la recherche et au développement des produits de la chimiothérapie ne sont pas disponibles dans les pays en voie de développement. Les pays industrialisés ont donc un monopole complet quant à la distribution et/ou commercialisation de ces traitements. De plus, la mise en place des protocoles de chimiothérapie indiqués est souvent laborieuse et limitée par le manque de personnel compétant, de structures ou d’investissement propre du patient [Magrath, 2003].
Figure 9: Disponibilité et accéssibilité de la chimiothérapie dans les pays en voie de développement. Les données qui ont permis la réalisation de cette figure sont tirées de « Cancer initiative in developing countries » [Mellstedt, 2007].
Face à cette situation, un groupe franco-africain d’oncologie pédiatrique s’est constitué depuis octobre 2000, avec pour objectif de tester la faisabilité des protocoles européens adaptés dans le traitement de certaines tumeurs de l’enfant. Il apparait que l’application de ces protocoles établis dans les pays occidentaux pose un problème de tolérance et justifie les tentatives d’adaptation des protocoles au contexte local. Malheureusement, la fréquence des problèmes liés aux infections, à la malnutrition, et aux faibles ressources matérielles ont engendré un manque d’intérêt pour la pathologie cancéreuse chez l’enfant dans ces pays [Harif et coll., 2005].
Toutefois dans les pays en développement, quand elle est disponible, la chimiothérapie est utilisée en combinaison avec la chirurgie [Mayi-Tsonga et coll., 2009]. Les produits utilisés à cet effet sont les taxanes, l’irinotecan, la vinorelbine, la vincristine, la bléomycine, la gencitabine et les produits à base de platine [Candellaria et coll., 2006]
3.3.2.
La phytothérapie
La phytothérapie connait une présence historique partout dans le monde que ce soit dans les pays industrialisés ou en voie de développements. Les produits de la phytothérapie ont acquis une part de marché importante et en constante progression en Europe et aux Etats-Unis, avec des chiffres d’affaire annuels atteignant 19 milliard en 2006, et qui, selon les estimations, devraient atteindre les 26 milliards en 2011 [Saklani et Kutty 2008].
Les produits de la phytothérapie sont généralement des préparations à base de plantes médicinales, parfois standardisées, utilisées dans divers pays pour traiter diverses pathologies, souvent dans le domaine des médicaments dits "de confort". Elles sont utilisées pour soulager ou pour préserver de la maladie [Wargovich et coll., 2001], mais leur intégration dans les traitements modernes, en ce y compris dans le traitement du cancer, pose encore des problèmes de qualité, d’efficacité et surtout d’innocuité [Fong, 2002]. C’est pourquoi les produits de la phytothérapie font l’objet d’une grande attention de la part des scientifiques, notamment dans le domaine du cancer. En effet les phytomédicaments doivent être pris en compte, tant pour leurs éventuels effets bénéfiques, que pour les toxicités (dose-dépendantes ou idiosyncratiques) ou les échecs thérapeutiques qu’ils sont susceptibles d’engendrer, via soit leurs constituants propres, une altération de la préparation et/ou une interaction contre-indiquée avec la chimiothérapie anticancéreuse [Routledge, 2008]. Ainsi, bien que souvent controversée par les médecins, on estime que plus de 50% des patients diagnostiqués avec un cancer recourent, de façon suivie ou individuelle, à la phytothérapie durant ou après une chimiothérapie [Boon et Wong, 2004]. Trois raisons semblent motiver les patients à choisir la phytothérapie : le contrôle des symptômes, l’amélioration de la qualité de vie, la récurrence des cancers [Cassileth et coll., 2008]. Les patients cancéreux recourent le plus souvent à la phytothérapie dans le but de prévenir une hépatotoxicité, de potentialiser la chimiothérapie ou de traiter une hépatotoxicité après chimiothérapie [Greenlee et coll., 2007]. La principale question qui se pose est : les produits de la phytothérapie manifestent-ils réellement des propriétés chimiopréventives et chimiothérapeutique ? Ces produits qui peuvent être doués à la fois de propriétés antioxydante, anti-inflammatoire et proapototique, offriraient l’avantage d’agir simultanément et de manière synergique sur diverses cibles moléculaires (figure 10) [Treasure, 2005 ; Liu 2004].
Une discussion ouverte entre patients cancéreux et médecins traitants quant à l’utilisation des
Du fait de la pauvreté et des difficultés d’accès à la médecine conventionnelle, selon l’OMS 65%
à 80% des populations dans les pays en voie de développement recourent à la phytothérapie à travers la médecine traditionnelle [Calixto, 2005]. Face à cette situation certains pays en voie de développement, notamment l’Asie et l’Amérique latine, ont développé à partir des plantes, des phytomédicaments standardisés qui ont prouvé leur efficacité et leur sécurité d’emploi [Calixto, 2005].
En Afrique, bien que les plantes médicinales jouent un rôle clé dans le système de santé, très peu de phytomédicaments disponibles sur le marché sont présentés sous une forme standardisée [Steenkamp, 2003]. En effet, les conditions pour développer la recherche et la production sont rarement réunies en Afrique. Toutefois on assiste de plus en plus à la création et à la production de spécialités simples à partir de plantes utilisées traditionnellement et susceptibles de remplacer dans certains cas des médicaments importés. C’est le cas au Mali où sept médicaments traditionnels améliorés ont obtenu une autorisation de mise sur le marché [Pousset, 2006].
La phytothérapie africaine étant une partie inhérente de la médecine traditionnelle africaine reste pour beaucoup de personnes une médecine basée sur le fétichisme et la sorcellerie. Toutefois, la prise de conscience de ces populations sur le caractère incertain de la préparation, du conditionnement, de la présentation et de l’administration des phytomédicaments entraîne de nos jours une perte de confiance en ce type de médication [Missiakila, 2004]. Cependant, les performances limitées des systèmes de santé font que le diagnostic des tumeurs est tardif, le traitement disponible étant jugé inutile à ce stade, voire dangereux au regard de l’extension tumorale, les patients sont alors tentés par un traitement traditionnel [Ayite et coll., 1996] et malgré les améliorations des systèmes de santé de nos jours, les patients ont toujours recours à la médecine traditionnelle du fait de l’inaccessibilité économique des traitements anticancéreux.
Bien que la liste des médicaments issus de la pharmacopée africaine soit loin d’être exhaustive (Tableau1), il n’est pas encore signalé à ce jour la mise sur le marché africain de médicaments traditionnels améliorés utilisés comme anticancéreux. Et même si les tradithérapeutes africains se sont adaptés à l’introduction de la médecine moderne dans leur culture, le concept et le traitement des pathologies inflammatoires et du cancer sont encore largement imprégnés de superstition.
Cependant les informations ethno médicales obtenues par les chercheurs sur certaines plantes permettent souvent de poursuivre sur des bases scientifiques, l’extraction et l’isolement de principes actifs en vue de leur usage en thérapie anticancéreuse. Restent, toutefois, les problèmes liés à leur production [Abubakar et coll., 2007].
II. Les méthodes d’investigations pharmacologiques
1. Evaluation du pouvoir cytostatique / cytotoxique d’une molécule
Les principales techniques utilisées pour déterminer le pouvoir cytostatique ou cytotoxique d’une molécule ou d’un extrait de plante sont le test MTT, la vidéomicroscopie quantitative assisté par ordinateur, et l’essai clonogénique.
Le test MTT et la vidéomicroscopie quantitative seront abordés dans le chapitre des matériels et méthodes.
L’essai clonogénique est un test de survie décrit pour la première fois par Pucket et Markus en 1955, et basé sur la capacité d’une cellule viable à se multiplier et à former une colonie d’au- moins 50 cellules (Figure 11) [Franken et coll., 2006 ; Herzot et coll., 2007]. En mesurant d’une part la taille et le nombre de colonie formée et en comparant d’autre part les données obtenues sous différentes conditions (traitées et contrôle), des informations sur d’éventuel dommage entraînant une réduction de la fréquence des divisions cellulaires peuvent être obtenues [Guda et coll., 2007 ; Herzot et coll., 2007]. En oncologie, le test clonogénique est également utilisé pour déterminer le potentiel cytotoxique d’un composé sur des cellules tumorales. Le principe du test repose sur l’aptitude d’une cellule tumorale à former une colonie cellulaire sur un gel d’agar contenant différentes concentrations du produit testé. Les cellules tumorales qui ne sont pas en mesure de former des colonies sont considérées comme mortes [Chattopadhyay et coll., 2003].
Figure 11 : illustration des résultats d’un test clonogénique. Les images a et b représentent des conditions avec respectivement 70 et 115 colonies formées à la suite d’ensemencement de 100 et 200 cellule respectivement [Franken et coll., 2006].
2. Caractérisation du mécanisme d’action anti-tumorale d’une molécule
2.1. Analyse du cycle cellulaire
Le cycle cellulaire représente l’intégralité de la période de division cellulaire, c’est à dire l’ensemble des événements biochimiques et morphologiques qui sont responsables de la prolifération cellulaire.
La cytométrie de flux (CMF) est définie comme l’étude précise de cellules isolées entraînées par un flux liquide. Les méthodes utilisant des intercalants fluorescents (tel l’iodure de propidium) et une détection par CMF sont les plus utilisées pour étudier le cycle cellulaire [Bading and Shields, 2008]. Elles basent leurs résultats sur la capacité à diviser le cycle cellulaire en trois phases selon la teneur en ADN des cellules au cours de ces phases: G0/G1 (2n), phase d’activation des cellules, S (2n à 4n), phase de synthèse de l’ADN, G2/M (4n) phase de mitose. Les cellules étant analysées individuellement, l’intensité de chaque fluorescence est proportionnelle à la quantité d’ADN présent dans la cellule (figure 12) [Numez, 2001]. Toutefois la CMF ne permet pas de distinction entre les phases G0 (phase quiescente) et G1 (phase de préparation à la synthèse d’ADN) ainsi qu’entre les phases G2 (préparation à la mitose) et M (mitose).
Récemment en s’appuyant sur les caractéristiques morphologiques des cellules adhérentes lors des mitoses (arrondissement par perte de la plupart des points de contact avec le support et réfringence) (figure 13), la vidéomicroscopie quantitative depuis peu est utilisée pour détecter les cellules en mitose. En effet un logiciel capable de détecter un événement de mitose parmi une population cellulaire et de le suivre tout au long de sa durée (phase M) à été développé à partir d’image obtenue par vidéomicroscopie [Debeir et coll., 2008a].
2.2. Analyse du taux et du type de morts cellulaires
Les nouvelles approches génétiques et biochimiques ont permis de comprendre qu’à coté de la mort cellulaire par apoptose, les cellules pouvaient mourir par d’autres voies non apoptotiques.
Plusieurs voies de mort cellulaires ont été ainsi décrites dont l’apoptose, l’autophagie, la nécrose, l’anoïkose, ou les catastrophes mitotiques (figure 14).
Ces morts cellulaires étant souvent accompagnées de changements structurels et moléculaires, différentes méthodes de détection de la mort cellulaire sont développées, mais la plus utilisée est la cytométrie de flux utilisant différents marqueurs.
Parmi les changements structurels, le plus exploité est la détection des fragments d’ADN internucléaires des cellules apoptotiques. Un test basé sur la détection de ces fragments d’ADN in situ suite à la fixation d’un fluorochrome, a été ainsi développé pour identifier et quantifier les cellules apoptotiques par microscopie à fluorescence ou cytométrie de flux. Le test couramment utilisé est le TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase deoxyuridine triphosphate Nick and Labelling).
Lors de ce test, la fixation et la perméabilisation des cellules sont les étapes initiales critiques pour la réussite du test. La fixation préserve l’extraction des fragments d’ADN des cellules lors des centrifugations répétitives et la perméabilisation permet le passage du fluorochrome à travers les membranes. Le fluorochrome est fixé par une réaction catalysée par la transferase terminal desoxynucléotidyl à la partie hydroxyle terminal (3’-OH). La détection par immunocytochimie a lieu en rajoutant un anticorps spécifique au fluorochrome fixé aux fragments d’ADN (figure 15) [Darzynkiewicz et coll., 2008].
Il existe divers fluorochromes utilisables avec la méthode TUNEL mais le fluorochrome le plus utilisé est la bromodésoxyuridine. Cette méthode donne des informations sur le cycle cellulaire des cellules non apoptotiques mais aussi des informations sur la phase du cycle à partir de laquelle la cascade apoptotique est activée.
La détection de la mort cellulaire autophagique repose généralement sur l’usage de la microscopie électronique qui permet de visualiser la formation et l’augmentation du taux de vacuoles autophagiques. D’autres techniques permettant d’examiner l’activité des enzymes lysosomales, de mesurer le nombre, la taille et la localisation des lysosomes après fixation par une molécule fluorescente (l’acridine orange par exemple) peuvent être utilisées mais restent non spécifique car elles ne permettent pas de différencier le type de vacuoles acides (lysosomes, autophagosome ou autolysosomes). Il existe également des méthodes indirectes permettant de détecter et de mesurer l’autophagie par Western Blot, immunocytochimie ou immunohistochimie, en s’appuyant sur des marqueurs moléculaires plus spécifiques mis en jeu lors de la formation des autophagosomes, tel le clivage et l’activation de la protéine LC3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3), il est possible de déterminer le clivage et l’activation des protéines impliquées dans le processus d’autophagie [Zakeri et coll., 2005].
Figure 15 : détection des fragments d’ADN des cellules apoptotiques par le test TUNEL. La bromodeoxyuridine (fluorochrome) est fixée au fragment d’ADN à travers une réaction catalysée par la transférase terminal deoxynucleotidyl (TdT). La détection a lieu suite à la fixation d’un anticorps spécifique au fluorochrome. Ici la détection est faite avec un système conjuguant la biotine à l’anticorps anti-bromodeoxyuridine et à la streptavidin
2.3. Analyse du taux de migration cellulaire
La migration cellulaire est caractéristique des cellules cancéreuses lors du processus d’invasion et de développement des métastases. Les méthodes utilisées pour l’analyse de la migration cellulaire sont de deux types : les méthodes analysant le comportement migratoire d’une population cellulaire et celle analysant la migration individuelle des cellules.
Pour l’analyse du comportement migratoire et prolifératif d’une population cellulaire, le test du scratch_wound ou test de la cicatrice est fréquemment utilisé. Ce test est basé sur la création d’une zone exempte de cellule (cicatrice) au sein d’une fine couche de population cellulaire. Une prise d’image à intervalle régulier est ensuite effectuée durant la recolonisation de la cicatrice (figure 16). En comparant toutes les images en terme de condition et au cours du temps, il est possible de quantifier le taux de recolonisation des cellules. Ce test offre l’avantage d’être à la fois peu coûteux et bien approprié pour étudier les interactions cellule-matrice (par un coating préalable) et cellule-cellule durant la migration et la prolifération [Liang et coll., 2007 ; Debeir et coll., 2008].
www.rndsystems.com/dam_public/6324.gif
Un autre test utilisé pour l’étude du comportement migratoire est le test de l’anneau. Lors de ce test les cellules sont confinées sur une plaque de culture dans une région centrale délimitée par un anneau. Une fois que la zone est confluente l’anneau est retiré et les cellules, colorées avec du bleu de toluidine, peuvent migrer sur la surface pendant une douzaine d’heure. La migration cellulaire est mesurée à l’aide d’un logiciel utilisant les images digitales numérisées obtenues lors des observations, soit en déterminant la surface couverte par les cellules ou à partir de la distance linéaire couverte par les cellules migrantes [Decaestecker et coll., 2007].
D’une manière générale, les tests évaluant le comportement migratoire d’une population cellulaire ne permettent pas d’obtenir des informations précises sur l’effet d’une molécule car ils ne peuvent pas différencier les processus migratoires et de prolifération dans la recolonisation.
C’est pour cette raison que des tests analysant uniquement la migration cellulaire ont été développés.
Avec ces tests, les cellules sont cultivées à faible densité afin de pouvoir suivre individuellement chaque cellule se trouvant dans le champ. La migration de chaque cellule est observée pendant un temps relativement long (~ 48 h) par vidéomicroscopie assisté par ordinateur dans le but d’établir la trajectoire individuelle de chaque cellule. Dans les modèles utilisant un environnement 2D, les cellules migrent sur un substrat rigide et planaire ce qui exclu la prise en compte d’une composante invasive dans ce processus migratoire, par contre elle devient possible dans un environnement 3D où les cellules migrent à travers une matrice en gel [Debeir et coll., 2008b, Adanja et coll., 2010].
Figure 16 : test de la cicatrice. Illustration de la recolonisation après 48h d’une cicatrice réalisée sur une population cellulaire confluente (Glioblastome). La figure A représente la condition contrôle et la figure B la condition traitée (4-IBP).
Mégalizzi et coll., 2009
III. Certaines substances d’origines naturelles présentent à la fois des propriétés antiparasitaire et anticancéreuse
Les infections parasitaires engendrent une réponse biochimique de l’hôte, qui peut se traduire par une ou plusieurs des manifestations suivantes : une modulation du métabolisme énergétique, une inflammation, une anémie ou une déficience en nutriment [Saric et coll., 2010]. Ces réactions sont à la fois, une conséquence du développement du parasite et nécessaire à son développement.
Prenons l’exemple du parasite Trypanosoma cruzi, qui est responsable de la maladie de Chagas ; il se différentie dans le cytosol des cellules hôtes, où il va se multiplier et étendre son infection aux cellules avoisinantes pour enfin atteindre les cellules des organes distants à travers la circulation sanguine [Chuenkova et Pereiraperrin, 2009]. Ce processus requière une durée de survie à long terme des cellules infectées et donc une capacité de résistance à l’apoptose. Il a ainsi été démontré que Trypanosoma cruzi adoptait une stratégie anti-apoptotique en ciblant spécifiquement la kinase thréonine-serine Akt des cellules hôtes. C’est par le biais d’une trans- sialidase exprimée à la surface du Trypanosoma cruzi, la PDNF (parasite-derived neurotrophic factor) qui est à la fois un substrat et un activateur d’Akt, que le parasite transmet les signaux fonctionnels qui protègent les cellules hôtes de l’apoptose. L’apoptose est induite, dans le cas de ce parasite, par un stress oxydatif, la cytokine pro-inflammatoire TNF-alpha et le TGF-beta (transforming growth factor–β) [de Melo-Jorge and PereiraPerrin, 2007]. Ce processus de développement du trypanosome, rappelle tout à fait celui du cancer qui comprend également des phases d’initiation, de prolifération et d’invasion, dans lesquelles Akt est un acteur majeur [Yang et coll. 2010].
Ainsi l’on voit que le développement de la recherche des cibles moléculaires dans la biologie de différentes pathologies peut permettre d’identifier des molécules susceptibles d’activitées dans des domaines différents de ceux pour lesquels elles ont été initialement étudiées ou exploitées.
C’est le cas de l’artemisinine et ses dérivés, molécules largement utilisées dans le traitement du paludisme de nos jours, pour lesquelles la littérature fait état de diverses activités anticancéreuses.
Ces activités impliqueraient différents mécanismes d’action comme l’induction de la mort par apoptose, l’arrêt du cycle cellulaire, l’inhibition de l’angiogenèse et de la migration [Gravett et coll., 2010].
IV. Les plantes et molécules analysées dans le cadre du présent travail
1. Pavetta crassipes (K schum)
1.1. Classificaction Règne : Plantae
Sous règne : Tracheobionta Division : Magnoliophyta
Classe : Magnoliopsida Sous classe : Asteridae
Ordre : Rubiales
Famille : Rubiaceae Genre : Pavetta
Espèce : Pavetta crassipes (K Schum) Synonymes : Pavetta barteri Dawe, Pavetta utilis Hua
Noms vernaculaires : lammoukhö Djawlê (Pular), pimperémani (Malinké)
Distribution géographique : Benin, Burkina Faso, Burundi, République Centrafricaine, Côte d’ivoire, Ethiopie, Ghana, Guinée, Malawi, Mali, Mozambique, Niger, Nigeria, Tanzania, Zambia
1.2. Usage traditionnel et propriétés pharmacologiques
Pavetta crassipes K Schum est un arbuste de 2 à 3 mètres de hauteur largement distribué en Afrique de l’ouest et du centre (figure 17).
