Étude du métabolisme des androgènes et implications dans la lutte contre le dopage

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Thesis

Reference

Étude du métabolisme des androgènes et implications dans la lutte contre le dopage

STRAHM, Emmanuel

Abstract

Les stéroïdes androgènes anabolisants endogènes sont des substances couramment utilisées à des fins de dopage. Ceci tient certainement à leur nature endogène qui en font des composés dont l'abus est plus difficile à mettre en évidence que celui de composées exogènes. Ce travail cherche à approfondir les connaissances du métabolisme des stéroïdes endogènes comme la testostérone et la nandrolone afin d'améliorer la détection d'un abus.

Ceci se fait en particulier sur la matrice urinaire en utilisant des outils analytiques comme la LC-MS/MS, la GC-MS ou la GC-C-IRMS pour l'analyse des isotopes stables du carbone. Un suivi individuel de l'athlète a donc été proposé pour la lutte contre l'abus de stéroïdes endogènes. Cette stratégie permet de s'affranchir des variations interindividuelles aussi bien génétiques qu'environnementales. D'autre part, un ensemble de facteurs urinaires et sanguins a été déterminé pour mettre en évidence un dopage à une substance connue pour modifier le profil stéroïdien. Dans ce cas, l'utilisation du profile stéroïdien comme outil diagnostique ouvre la voie à [...]

STRAHM, Emmanuel. Étude du métabolisme des androgènes et implications dans la lutte contre le dopage. Thèse de doctorat : Univ. Genève, 2010, no. Sc. 4185

URN : urn:nbn:ch:unige-85695

DOI : 10.13097/archive-ouverte/unige:8569

Available at:

http://archive-ouverte.unige.ch/unige:8569

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UNIVERSITE DE GENEVE UNIVERSITE DE GENEVEUNIVERSITE DE GENEVE

UNIVERSITE DE GENEVE FACULTE DES SCIENCESFACULTE DES SCIENCES FACULTE DES SCIENCESFACULTE DES SCIENCES

Section des Sciences Pharmaceutiques Professeur Jean-Luc VEUTHEY

UNIVERSITE DE LAUSAN UNIVERSITE DE LAUSANUNIVERSITE DE LAUSAN

UNIVERSITE DE LAUSANNENENENE FACULTE DE BIOLOGIE FACULTE DE BIOLOGIE ET DE MEDECINEFACULTE DE BIOLOGIE FACULTE DE BIOLOGIE ET DE MEDECINEET DE MEDECINE ET DE MEDECINE

Laboratoire suisse d’Analyse du Dopage PD, MER Martial SAUGY

Etude du métabolisme des androgènes Etude du métabolisme des androgènes Etude du métabolisme des androgènes Etude du métabolisme des androgènes

et et et et

implications dans la lutte contre le dopage implications dans la lutte contre le dopage implications dans la lutte contre le dopage implications dans la lutte contre le dopage

THÈSE

présentée à la Faculté des sciences de l’Université de Genève

pour obtenir le grade de Docteur ès sciences, mention sciences pharmaceutiques

par

Emmanuel STRAHM Emmanuel STRAHM Emmanuel STRAHM Emmanuel STRAHM

de

Vuitebœuf (VD)

Thèse n°4185

Genève

2010

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A mes parents, à mes proches…

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Remerciements Remerciements Remerciements Remerciements

Ce manuscrit est le résultat d’un travail de synthèse et de réflexion qui n’a été possible que grâce au concours de nombreuses personnes. Je tiens ici à les remercier.

Tout d’abord, ce travail n’aurait pas été possible sans le soutien scientifique du Professeur Jean-Luc Veuthey qui m’a permis de réaliser ce travail sous sa direction. Je le remercie pour sa grande disponibilité lors des moments critiques de ma thèse, ceci m’a souvent permis d’avancer et d’avoir un regard extérieur et complémentaire sur mon travail. Je tiens également à remercier le Docteur Martial Saugy pour m’avoir donné l’opportunité d’effectuer cette thèse dans son laboratoire. Son expérience du domaine de l’antidopage m’a grandement aidé à comprendre l’étendue ainsi que l’évolution de cette problématique.

Il est également important pour moi d’évoluer dans une atmosphère de travail agréable et stimulante. En premier lieu, je tiens donc à remercier les doctorants pour la capacité partagée à se motiver et le respect de chacun pour le travail de l’autre. Merci à Norbert, pour avoir ouvert la voie, mais aussi à Carine, Laurent et Pierre-Edouard pour leur aide et leurs conseils. Merci également à Mélanie pour son travail et pour les mythiques missions passées en sa compagnie. Merci encore à tous les autres collaborateurs du LAD pour leur soutien et leur bonne humeur. Merci aussi aux diplômants dont j’ai eu la chance de m’occuper, en particulier Isabelle et Alexandre pour l’excellence de leur travail. J’ai beaucoup appris à leurs côtés.

D’autres personnes ont collaboré de manière substantielle à ce travail, je tiens donc à remercier le Professeur François Pralong du service d’endocrinologie, diabétologie et métabolisme du CHUV ainsi que ses collaboratrices, Mme Françoise Secretan et Mme Christiane Pellet du Centre d’Investigation Clinique du CHUV. Je tiens également à remercier M. Pedro-Manuel Marques-Vidal de l’Institut universitaire de médecine sociale et préventive du CHUV pour son aide dans le traitement de données.

Ce travail a été rendu possible par le soutien financier et intellectuel de la Fédération Internationale de Football Amateur (FIFA) et plus particulièrement le Professeur Jiri Dvorak, président de la commission médicale (F-MARC) de la FIFA.

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Je souhaite également remercier mes parents qui ont toujours été présents et qui ont su me donner l’ouverture d’esprit indispensable à une telle entreprise. Même si parfois mon travail a pu leur paraître abstrait, leur soutien a été constant et d’une importance capitale pour moi. Je ne saurais trouver de mots assez forts pour leur signifier ma gratitude.

Mes remerciements vont également à Eva, pour son soutien au jour le jour, dans les moments difficiles comme dans les meilleurs. Je la remercie pour sa patience, sa compréhension et pour la place prépondérante qu’elle tient dans ma vie.

A mes amis, collègues devenus amis, amis devenus collègues pour leur soutien et pour les moments de détentes et de rires, indispensables à mon équilibre. C’est petit à petit que l’on se rend compte de la vraie valeur des gens.

Finalement, je ne saurais conclure sans remercier celui qui m’a appris à mener un projet à bien, à le finaliser. Celui par qui je pense avoir évolué et appris un certain sens des responsabilités. Merci donc au Docteur Christophe Saudan pour son dévouement, sa rigueur et son sens de la science. Plus que de simplement collaborer, il m’a inculqué des valeurs et montré un état d’esprit dont je reste admiratif. Je me fais un point d’honneur à perpétuer cet état d’esprit dans ma carrière scientifique future.

La thèse n’est pas tant signe d’intelligence, mais certainement de persévérance…

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Table des matières I

Table des matières Table des matières Table des matières Table des matières

Communications scientifiques………..V Liste des abréviations……….VII Avant-propos et objectifs de la thèse………...IX

Chapitre I Chapitre IChapitre I Chapitre I

Les stéroïdes androgène Les stéroïdes androgèneLes stéroïdes androgène

Les stéroïdes androgènes anabolisants et leur métabolismes anabolisants et leur métabolismes anabolisants et leur métabolismes anabolisants et leur métabolisme ... 1...111 1.

1.1.

1. GénéralitésGénéralitésGénéralitésGénéralités sur les stéroïdes androgènessur les stéroïdes androgènessur les stéroïdes androgènessur les stéroïdes androgènes anabolisantsanabolisantsanabolisants ...anabolisants... 3333

1.1. Historique ... 4

1.2. La testostérone ... 6

1.3. La nandrolone ... 11

2. 2.2. 2. L’analyse des stéroïdes endogènesL’analyse des stéroïdes endogènesL’analyse des stéroïdes endogènes ...L’analyse des stéroïdes endogènes... 13...131313 2.1. Détection et quantification ... 13

2.2. L’analyse des rapports isotopiques du carbone ... 16

2.3. Stratégie de détection d’un dopage aux SAA endogènes ... 20

3.3.3. 3. Facteurs influençant le métabolisme des stéroïdesFacteurs influençant le métabolisme des stéroïdesFacteurs influençant le métabolisme des stéroïdes endogènesFacteurs influençant le métabolisme des stéroïdesendogènesendogènesendogènes ... 23232323 3.1. Facteurs influençant le profil stéroïdien ... 23

3.1.1. Facteurs endogènes ... 23

3.1.2. Facteurs exogènes ... 26

3.2. Facteurs influençant le rapport isotopique du carbone ... 29

ChaChaCha

Chapitre pitre pitre IIpitre IIIIII Méthodes MéthodesMéthodes

Méthodes ... 31...313131 1.

1.1.

1. Validation de méthodes bioanalytiquesValidation de méthodes bioanalytiquesValidation de méthodes bioanalytiquesValidation de méthodes bioanalytiques ... 33...333333 2.

2.2.

2. Article I: Profiling of 19Article I: Profiling of 19Article I: Profiling of 19Article I: Profiling of 19----norsteroid sulfoconjugates in human urine by liquid norsteroid sulfoconjugates in human urine by liquid norsteroid sulfoconjugates in human urine by liquid norsteroid sulfoconjugates in human urine by liquid chromatography mass spectrometry

chromatography mass spectrometrychromatography mass spectrometry

chromatography mass spectrometry ... 34343434 3.3.3.

3. ArtArtArtArticle II: Isolation and quantification by highicle II: Isolation and quantification by highicle II: Isolation and quantification by highicle II: Isolation and quantification by high----performance liquid chromatographyperformance liquid chromatographyperformance liquid chromatography----performance liquid chromatography ion

ionion

ion----trap mass spectrometry of androgen sulfoconjugates in human urinetrap mass spectrometry of androgen sulfoconjugates in human urinetrap mass spectrometry of androgen sulfoconjugates in human urine ...trap mass spectrometry of androgen sulfoconjugates in human urine... 38383838

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Table des matières II

4.4.4.

4. Méthode d’analyse du profil stéroïdienMéthode d’analyse du profil stéroïdienMéthode d’analyse du profil stéroïdienMéthode d’analyse du profil stéroïdien ... 45454545 5.5.5.

5. Méthode IRMSMéthode IRMSMéthode IRMSMéthode IRMS ... 51...515151

Chapitre I Chapitre IChapitre I Chapitre IIIIIIIII

Profils stéroïdien et Profils stéroïdien et Profils stéroïdien et

Profils stéroïdien et rapports isotopiqrapports isotopiqrapports isotopiquesrapports isotopiquesues ...ues... 55555555 1.1.1.

1. IntroductionIntroductionIntroductionIntroduction ... 57575757 2.

2.2.

2. ObjectifsObjectifsObjectifsObjectifs ... 57575757 3.

3.3.

3. Design de l’étude clinique et méthodes utiliséesDesign de l’étude clinique et méthodes utiliséesDesign de l’étude clinique et méthodes utiliséesDesign de l’étude clinique et méthodes utilisées ... 57575757 4.

4.4.

4. Résultats et discussionRésultats et discussionRésultats et discussionRésultats et discussion ... 58585858 4.1. Article III: Steroid profiles of professional soccer players : an international comparative study... 58

4.2. Article IV: Detection of testosterone administration based on the carbon isotope ratio profiling of endogenous steroids: International reference populations of professional soccer players ... 60 5.

5.5.

5. ConclusionsConclusionsConclusions ...Conclusions... 63636363

Chapitre Chapitre Chapitre Chapitre IIIIVVVV

Influence d’une prise de testostérone ou de nandrolone sur leur métabolisme Influence d’une prise de testostérone ou de nandrolone sur leur métabolismeInfluence d’une prise de testostérone ou de nandrolone sur leur métabolisme

Influence d’une prise de testostérone ou de nandrolone sur leur métabolisme ... 65...656565 1.

1.1.

2.2.

2. ObjectifObjectifObjectifObjectif ... 68686868 3.

3.3.

3. Design de l’étude clinique et méthodeDesign de l’étude clinique et méthodeDesign de l’étude clinique et méthodeDesign de l’étude clinique et méthodessss utiliséeutiliséeutiliséeutiliséessss ... 68686868 4.4.4.

4. Résultats et discussionRésultats et discussionRésultats et discussionRésultats et discussion ... 69696969 4.1. Article V: Profiling of 19-norandrosterone sulfate and glucuronide in human urine:

Implications in athlete’s drug testing ... 69

4.1. Application de la méthode de l’article II sur l’étude clinique impliquant des prises de testostérone undécanoate, résultats préliminaires ... 72 5.5.5.

5. ConclusionsConclusionsConclusions ...Conclusions... 77777777

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Table des matières III

Chapitre V Chapitre VChapitre V Chapitre V

Influence d’une prise de HCG sur le métabolisme des stéroïdes endogènes Influence d’une prise de HCG sur le métabolisme des stéroïdes endogènesInfluence d’une prise de HCG sur le métabolisme des stéroïdes endogènes

Influence d’une prise de HCG sur le métabolisme des stéroïdes endogènes ... 79797979 1.

1.1.

2.2.

2. ObjectifObjectifObjectifObjectif ... 81818181 3.3.3.

3. Design de l’étude clinique et méthodes utiliséesDesign de l’étude clinique et méthodes utiliséesDesign de l’étude clinique et méthodes utiliséesDesign de l’étude clinique et méthodes utilisées ... 81818181 4.4.4.

4. Résultats préliminairesRésultats préliminairesRésultats préliminairesRésultats préliminaires ... 83838383

Chapitre VI Chapitre VIChapitre VI Chapitre VI

Conclusions et perspectives Conclusions et perspectivesConclusions et perspectives

Conclusions et perspectives ... 89898989

Chapitre VII Chapitre VIIChapitre VII Chapitre VII Bibliographie BibliographieBibliographie

Bibliographie ... 95...959595

Chapitre Chapitre Chapitre Chapitre VIIVIIVIIVIIIIII Publications PublicationsPublications

Publications ... 119119119 119

Chapitre Chapitre Chapitre Chapitre IIIIXXXX Annexe AnnexeAnnexe

Annexe ... 165165165 165

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Communications scientifiques V

COMMUNICATIONS SCIENTIFIQUES

Ce travail de thèse a fait l’objet de diverses publications scientifiques, communications orales et posters. A l’impression de ce travail, cinq articles ont été publiés (articles I à V).

Publications PublicationsPublications Publications

I. Strahm E, Rudaz S, Veuthey J-L, Saugy M, Saudan C. Profiling of 19-norsteroid sulfoconjugates in human urine by liquid chromatography mass spectrometry.

Analitica Chimica Acta 613 (2008) 228-237

II. Strahm E, Kohler I, Rudaz S, Martel S, Carrupt P-A, Veuthey J-L, Saugy M, Saudan C. Isolation and quantification by high-performance liquid chromatography -ion-trap mass spectrometry of androgen sulfoconjugates in human urine. Journal of Chromatography A 1196-1197 (2008) 153-160

III. Strahm E, Sottas P-E, Schweizer C, Saugy M, Dvorak J, Saudan C. Steroid profiles of professional soccer players: an international comparative study. British Journal of Sports Medicine 43 (2009) 1126-1130

IV. Strahm E, Emery C, Saugy M, Dvorak J, Saudan C. Detection of testosterone administration based on the carbon isotope ratio profiling of endogenous steroids:

International reference populations of professional soccer players. British Journal of Sports Medicine 43 (2009) 1041-1044

V. Strahm E, Baume N, Mangin P, Saugy M, Ayotte C, Saudan C. Profiling of 19- norandrosterone sulfate and glucuronide in human urine: implications in athlete’s drug testing. Steroids 74 (2009)359-364

Annexes AnnexesAnnexes Annexes

I. Saudan C, Emery C, Marclay F, Strahm E, Mangin P, Saugy M. Validation and performance comparison of two carbon isotope ratio methods to control the misuse of androgens in human. Journal of Chromatography B 877 (2008) 2321-2329

Communications orales Communications oralesCommunications orales Communications orales

• Strahm E, Sottas P-E, Dvorak J, Saugy M, Saudan C. Determination of testosterone misuse in sport, an international comparative study. . . The . International Association of Forensic Scientists (TIAFT) 47th international meeting, Geneva, Switzerland, August 2009

• Strahm E, Sottas P-E, Dvorak J, Saugy M, Saudan C. δ¹³C-values of endogenous urinary steroids from different world populations of soccer players. 27nd Cologne Workshop on Dope Analysis, March 2009

• Strahm E, Kohler I, Rudaz S, Veuthey J-L, Saugy M, Saudan C. Quantification of testosterone conjugated metabolites in human urine samples by use of LC/MS/MS, Tenth International Symposium on Hyphenated Techniques in

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Communications scientifiques VI

Chromatography and Hyphenated Chromatographic Analyzers, Bruges, Belgium, January 2008

Posters PostersPosters Posters

• Strahm E, Johner M, Sottas P-E, Saudan C, Pralong F, Dvorak J, Saugy M.

Endogenous steroid profiling in urine and blood for the detection of HCG abuse in sport. Inauguration of the Swiss Center for Applied Human Toxicology (SCAHT), University of Geneva, Geneva, November 2009

• Strahm E, Sottas P-E, Schweizer C, Saugy M, Saudan C. Steroid profiles of professional athletes: an international comparative study. CHUV scientific day, Lausanne, January 2009 & 27nd Cologne Workshop on Dope Analysis, March 2009

• Strahm E, Perrenoud A, Saugy M, Saudan C. Analytical strategy to increase sensitivity for the quantification of endogenous steroids glucuronide in human urine using LC-MS/MS. 25th Montreux Symposium LC-MS, Montreux, Switzerland, November 2008

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Liste des abréviations VII

LISTE DES ABRÉVIATIONS

Vous trouverez ci-dessous la liste des abréviations courantes de la communauté scientifique utilisées dans le cadre de ce travail. Certaines abréviations sont en anglais car il s’agit de la langue utilisée pour l’écriture des publications.

A Androstérone

AFR Africain

AINS Anti-inflammatoire non-stéroïdien α-diol 5α-androstane-3α,17β-diol

AMA Agence Mondiale Antidopage

AR Récepteur aux androgènes

ARG Argentin

AS Androstérone sulfate

β-diol 5β-androstane-3α,17β-diol CIO Comité international olympique

CYP Cytochrome P450

CYP 450scc Cytochrome P450 side chain cleavage

Del Délétion

DHEA Déhydroépiandrostérone

DHT Dihydrotestostérone

EC Energie de collision

E Epitestostérone

E. coli Escherichia coli 16-EN 16(5α)-androsténol

ERC Composé endogène de référence

ESI Electrospray ionisation

Etio Etiocholanolone

FDA Food and Drug Administration

G Glucuronide

GC Chromatographie en phase gazeuse

GS Gravité spécifique

HCG Hormone gonadotrophine chorionique humaine HSD Hydroxystéroïde déhydrogénase

ICH International Conference on Harmonization IMC Index de masse corporel

Ins Inséré

IRMS Isotope ratio mass spectrometry

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Liste des abréviations VIII

ITA Italien

ITMS Iodotriméthylsilane

JAP Japonais

LAD Laboratoire suisse d’Analyse du Dopage de Lausanne

LC Chromatographie en phase liquide

LH Hormone lutéinisante

LLE Extraction liquide-liquide LLOQ Lower limit of quantification LTQ Linear trap quadripôle

MRPL Minimum required performance limit

MS Spectrométrie de masse

MSTFA N-méthyl-N-triméthylsilyltrifluoroacetamide

NA 19-norandrostérone

NE 19-norétiocholanolone

OUG Ougandais

PD Prégnanediol

RIA Test radio-immunologique

S Sulfate

SAA Stéroïde androgène anabolisant

SE Standard d’étalonnage

SCAN Full scan mode

SFSTP Société Française des Sciences et Techniques Pharmaceutiques SHBG Sexual hormone binding globulin

SIM Single ion monitoring

SPE Support d’extraction sur phase solide

SUI Suisse

SULT Sulfotransférase

SV Standard de validation

T Testostérone

TBME Tert-butyl-méthyl-ether

TMS Tri-méthyl-silyl

TSQ Triple-stage quadripôle

UDP Uridine diphosphate

UGT Uridine diphospohate glucuronide transférase

UI Unité internationale

ULOQ Upper limit of quantification VPDB Vienna Pee Dee Belemnite

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Avant-propos et objectifs de la thèse IX

AVANT-PROPOS ET OBJECTIFS DE LA THÈSE

Le présent travail de thèse a été réalisé au Laboratoire suisse d’Analyse du Dopage (LAD) du Centre Universitaire Romand de Médecine Légale à Lausanne en collaboration avec le Laboratoire de Chimie Analytique et Pharmaceutique (LCAP) de la section des Sciences Pharmaceutiques de l’Université de Genève et de l’Université de Lausanne. Il a été accompli sous la direction du Professeur Jean-Luc Veuthey, directeur du LCAP et la codirection du Docteur Martial Saugy, directeur du LAD.

Cette thèse décrit les évolutions actuelles dans le monde de l’antidopage concernant la lutte contre l’abus de substances endogènes, plus particulièrement les stéroïdes anabolisants. Depuis le début de la lutte contre l’abus de stéroïdes endogènes, la stratégie de détection d’un dopage n’a que peu évoluée. Elle est basée sur la quantification de certains métabolites spécifiques dans l’urine ainsi que sur l’analyse isotopique du carbone des stéroïdes endogènes. Bien que cette stratégie soit applicable dans la plupart des cas, il subsiste quelques problèmes ou risques inhérents aux méthodes utilisées. La quantification de métabolites spécifiques dans l’urine ne permet pas de mesurer des variations minimes des taux de stéroïdes endogènes qui pourraient être la résultante d’une administration par voir transdermique ou par micro-injections de stéroïdes. De même, certaines substances, comme l’hormone gonadotrophine chorionique humaine induit une production naturelle de testostérone. Ainsi, l’analyse isotopique ne permet pas de différencier la testostérone induite par ce biais d’une induction naturelle. C’est donc dans l’amélioration de cette stratégie que s’inscrit ce travail de thèse.

Le premier objectif de ce travail de thèse est d’investiguer le métabolisme de la testostérone afin de mettre en évidence la possibilité d’utiliser le profil stéroïdien comme outil diagnostique d’un dopage.

Pour ce faire, une méthode de quantification des métabolites de phase II des stéroïdes androgènes anabolisants a été développée et appliquée à des échantillons provenant d’individus dopés et non-dopés. Les cas particuliers du dopage à la testostérone, à la nandrolone et à la HCG ont été investigués.

Le second objectif de ce travail de thèse est de définir si les critères actuels de détection d’un dopage à la testostérone sont applicables à toutes les populations sans tenir compte

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Avant-propos et objectifs de la thèse X

des variations inter-individuelles. Ceci dans l’optique d’une égalité de traitement des athlètes dans la lutte antidopage.

Les objectifs spécifiques à chacun des travaux présentés dans cette thèse sont les suivants :

Article I Article IArticle I

Article I :::: Développer et valider une méthode de quantification par LC-MS/MS des métabolites de phase II des nor-stéroïdes dans l’urine humaine.

Article II Article IIArticle II

Article II :::: Développer et valider une méthode de quantification par LC-MS/MS des métabolites de phase II des molécules du profil stéroïdien dans l’urine humaine.

Article I Article IArticle I

Article IIIIIII :::: Déterminer si les critères actuels de mise en évidence d’un dopage aux SAA II par le profil stéroïdien sont applicables à des individus de différentes origines.

Article Article Article

Article IIIIVVV :::: Déterminer si les critères actuels de mise en évidence d’un dopage aux SAA V par l’analyse isotopique du carbone sont applicables à des individus de différentes origines possédant des régimes alimentaires différents.

Article V Article VArticle V

Article V :::: Déterminer l’apport de la quantification des métabolites urinaires sulfo- conjugués des nor-stéroïdes sur l’analyse antidopage.

Etude sur l’influence d’une prise de testostérone undécanoate Etude sur l’influence d’une prise de testostérone undécanoateEtude sur l’influence d’une prise de testostérone undécanoate

Etude sur l’influence d’une prise de testostérone undécanoate :::: Déterminer l’apport de la quantification des métabolites urinaires sulfo-conjugués des stéroïdes endogènes sur l’analyse antidopage.

Etude sur l’influence d’une prise de HCG Etude sur l’influence d’une prise de HCGEtude sur l’influence d’une prise de HCG

Etude sur l’influence d’une prise de HCG :::: Mettre en évidence un marqueur d’une prise de HCG exogène en se basant sur le profil stéroïdien et l’analyse de certaines hormones dans le sérum.

Ce travail est composé de neuf chapitres. Le chapitre I introduit les différentes notions théoriques et connaissances préalables requises pour une bonne compréhension de cette thèse. Le chapitre II réunit les méthodes développées et utilisées dans ce travail de thèse. Deux développements de méthode de quantification de stéroïdes conjugués dans l’urine ont donnés lieu à la publication des articles I et II, résumés dans ce chapitre.

Le chapitre III traite du profil stéroïdien et de l’analyse isotopique du carbone, deux méthodes utilisées actuellement dans le domaine de l’antidopage. Lors d’une étude clinique, les données obtenues à partir d’échantillons urinaires provenant d’athlètes d’origine ethniques diverses ont été confrontées aux critères actuellement en vigueur pour la mise en évidence d’un dopage aux stéroïdes endogènes. L’article III traite du profile stéroïdien, alors que l’article IV traite de l’analyse isotopique du carbone.

Le chapitre IV se concentre sur l’étude du métabolisme des stéroïdes endogènes lors d’une prise exogène de nandrolone ou de testostérone. Pour ce faire, des échantillons

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Avant-propos et objectifs de la thèse XI

issus d’une étude clinique effectuée antérieurement à ce travail ont été utilisés. Dans ce cadre, l’apport spécifique des métabolites urinaires sulfo-conjugués dans la lutte contre le dopage a été étudié. L’article V décrit l’apport des métabolites sulfo-conjugués sur la détection d’un dopage à la nandrolone.

Finalement, le chapitre V se penche sur la détection du dopage à l’hormone gonadotrophine chorionique humaine (HCG) en utilisant le profil stéroïdien comme outil diagnostique. Une étude clinique impliquant des injections de HCG et des collectes de sang et d’urine a été entreprise pour étudier ce sujet.

Pour conclure cette thèse, le chapitre VI contient les conclusions et perspectives générales de ce travail. Et les chapitres VII, VIII et IX contiennent respectivement la bibliographie, les publications faisant partie de la présente thèse et un article donné en annexe concernant les méthodes d’analyse isotopiques utilisées au LAD.

(19)

(20)

Chapitre I Chapitre I Chapitre I Chapitre I

Les stéroïdes androgèn Les stéroïdes androgèn Les stéroïdes androgèn

Les stéroïdes androgènes anabolisants et leur métabolisme es anabolisants et leur métabolisme es anabolisants et leur métabolisme es anabolisants et leur métabolisme

(21)

(22)

Chapitre I – Les stéroïdes androgènes anabolisants et leur métabolisme 3

1. 1. 1.

1. Généralités sur l Généralités sur l Généralités sur l Généralités sur les stéroïdes androgèn es stéroïdes androgèn es stéroïdes androgènes anabolisants es stéroïdes androgèn es anabolisants es anabolisants es anabolisants

Les stéroïdes androgènes anabolisants ou SAA, sont une classe d'hormones naturelles ou synthétiques proche de l’une des hormones endogènes masculines les plus importantes, la testostérone. Ils possèdent nombre d’effets physiologiques qui peuvent être séparés en deux groupes, les propriétés androgéniques et anaboliques. L’effet androgénique est dépendant de la liaison des SAA avec les récepteurs aux androgènes, il est responsable des modifications physiologiques et morphologiques qui interviennent chez l’homme à la puberté. Les SAA endogènes régulent la croissance générale des tissus, la maturation des organes génitaux et participent au développement et à l’entretien des caractéristiques masculines secondaires (croissance des cordes vocales, augmentation de la pilosité, calvitie, etc.). Parallèlement à l’activité androgénique, les SAA favorisent l’anabolisme au dépend du catabolisme. L’effet anabolique correspond à l’assimilation des matières ingérées. Il permet la synthèse moléculaire qui se traduit par l’augmentation de la masse musculaire ou par l’augmentation de l’agressivité. C’est cet effet qui est principalement recherché à des fins de dopage. Au contraire, le catabolisme correspond à la dégradation des matières assimilées en déchet.

Chaque SAA est caractérisé par un rapport des effets androgéniques/anaboliques propre (Tableau 1). Il n’existe qu’un seul type de AR, ce qui explique pourquoi aucun SAA ne possède qu’une des deux caractéristiques (Catlin, 2001).

Tableau 1.

Tableau 1.Tableau 1.

Tableau 1. (Kuhn, 2002) Rapport des effets anaboliques/androgéniques de certains SAA

SAA Rapport effet

anabolique/androgénique Testostérone

Méthyltestostérone

1 1

Methandrostenol 2-5

Oxymétholone 9

Oxandrolone 10

Nandrolone 10

Stanozolol 30

(23)

1.1.1.1.1.1.

1.1. Historique Historique Historique Historique

Il est connu depuis des siècles que la castration n’entraîne pas seulement une perte de la fertilité, mais également d’importantes modifications du développement des caractéristiques masculines secondaires. La première démonstration scientifique de l’activité endocrinienne des testicules remonte au milieu du 19^ème siècle (Berthold, 1849).

Des testicules de jeunes coqs avaient alors été greffés dans la cavité abdominale d’autres jeunes coqs castrés. Les coqs ainsi transplantés s’étaient développés de façon normale.

Pendant plus de 60 ans, les travaux de Berthold ne furent pas compris et les tentatives de répétition de l’expérience échouèrent. La fonction endocrinienne des testicules ne fut donc pas reconnue avant que de nouvelles recherches sur le développement de l’appareil reproducteur masculin ne furent entreprises entre 1920 et 1940. Des procédures d’extraction de ce qui était alors appelé “hormones mâles ” à partir de testicules d’animaux ou d’urine humaine furent mises au point. C’est en 1939 que le premier extrait de testicule fut préparé dans le but de contrer les effets d’une castration (Moore, 1939).

L’androstérone, un métabolite de la testostérone, fut le premier androgène à être isolé à partir de l’urine humaine (Butenandt, 1931). Cependant son activité androgénique était plus faible que l’activité de l’extrait de testicules. Deux groupes de chercheurs publièrent l’hémisynthèse de l’androstérone à partir du cholestérol en 1935 et, la même année, après modification chimique de l’androstérone, ces deux mêmes groupes publièrent l’hémisynthèse d’un nouvel androgène aux propriétés similaires à l’extrait de testicules de taureaux (Butenandt, 1935 ; Ruzicka, 1935). Ce travail a valu le Prix Nobel de Chimie à Butenandt et Ruzicka en 1939. Cette même année, un autre groupe isola une hormone à partir de testicules de taureaux dont la structure chimique était identique à l’hormone synthétisée par Butenandt et Ruzicka. Ils lui donnèrent le nom de testostérone (David, 1935). Durant les années suivantes, nombre de stéroïdes endogènes furent découverts et le nom générique d’androgène fut donné à cette famille de composés. Parallèlement, la recherche s’est appliquée à produire des stéroïdes possédant une activité anabolique supérieure à l’activité androgénique. En effet, les propriétés anaboliques, comme l’utilisation accrue d’azote pour la production de protéines, seraient très utiles sans la composante androgénique qui induit une masculinisation.

Même si des composés possédant un pouvoir anabolique important ont été produits, aucun ne possédant que l’effet anabolique n’a été découvert. C’est pourquoi l’on parle plus couramment de SAA (Kochakian, 1976).

(24)

Ce n’est qu’en 1939 que les effets physiologiques des hormones sexuelles mâles sont mis en relation avec un potentiel effet sur l’augmentation des performances sportives (Bøje, 1939). Dès le début des années 1950, les culturistes américains et les haltérophiles russes deviennent les premiers sportifs consommateurs de testostérone (Wright, 1978 ; Fair, 1988). Durant les années 1960, la consommation de SAA se généralise dans l’athlétisme, d’abord pour les lanceurs puis pour les athlètes d’autres disciplines comme le sprint. A cette époque, les stéroïdes sont davantage considérés comme un complément alimentaire que comme un produit dopant. En effet, leur utilisation reste discrète, mais plus pour éviter de divulguer les meilleures dosages à son adversaire que par peur de la critique quant à un manque d’esprit sportif (Gilbert, 1969).

Par le passé, les SAA étaient utilisés pour traiter l’anémie associée à des problèmes rénaux, mais ceux-ci ont été supplantés par l’érythropoïétine recombinante (Bagatell, 1996). Par contre, les SAA sont actuellement utilisés en médecine pour traiter les cas d’hypogonadisme ou de retard de puberté afin d’induire ou de maintenir les caractéristiques masculines secondaires (Bagatell, 1996). Les SAA sont également utilisés pour maintenir la force physique, la masse musculaire ainsi qu’un sentiment de bien-être général chez les hommes âgés ou les patients atteints par le virus de l’immunodéficience humaine (HIV).

En dépit de leur effet positif sur les performances, la consommation de SAA peut entraîner divers effets secondaires physiques et psychologiques, parfois irréversibles (Goldberg, 1996). Dès l’avènement de l’utilisation des SAA et parallèlement à la découverte de leurs effets secondaires, des organisations sportives comme le Comité International Olympique (CIO) ou médicales comme l’American Medical Association dénoncent l’utilisation des SAA car ils peuvent apporter un avantage certain lors de compétitions. Ainsi, les premiers tests de dépistage d’un dopage aux stéroïdes ont naturellement été mis en place dès 1976 au moment où le CIO les a ajoutés à la liste des substances interdites pour la pratique sportive. Le problème du dopage s’est accru dans les années 1980 en raison du dopage d’État que certains pays pratiquaient, comme la République Démocratique Allemande. Durant les années 1990, le nombre de records enregistrés dans certaines disciplines sportives diminue, ce qui coïncide avec l’amélioration des méthodes de dépistage (Franke, 1997).

Actuellement, l’usage de SAA n’est plus confiné au dopage chez les athlètes professionnels, mais devient un réel problème de santé publique (Sjöqvist, 2008). En

(25)

Europe et aux États-Unis, il a été montré que 1 à 5% des jeunes de 18 à 25 ans ont déjà consommé des SAA. Cette consommation peut induire des problèmes physiologiques mais également des troubles d’ordre psychique se traduisant par des comportements violents. Pour toutes ces raisons, la politique actuelle est à la prévention voire à l’interdiction des SAA pour un usage autre que médical.

1.2.

1.2.1.2.

1.2. La tLa tLa tLa testostérone estostérone estostérone estostérone Mécanisme d’action

La testostérone est impliquée dans plusieurs mécanismes de régulation du corps humain comme le métabolisme des protéines et des os, les fonctions sexuelles et cognitives ou encore l’érythropoïèse et la régulation des taux plasmatiques de lipide (Bagatell, 1996).

La majeure partie de la testostérone circulante est liée à l’albumine ou à la globuline liant les hormones sexuelles (SHBG) dans la circulation sanguine. La testostérone libre, présente en faible quantité (5%) (Dunn, 1981), constitue la fraction active capable de diffuser dans les cellules et de se lier aux AR. Les différents effets biologiques dépendent du tissu cible. Dans les muscles, la testostérone se lie aux AR dans le cytosol de la cellule et le complexe stéroïde-AR migre dans le noyau pour se lier à des sites spécifiques sur l’ADN, ce qui a pour conséquence d’induire ou de réprimer la transcription de certains gènes (Mooradian, 1987). La résultante de ces réactions peut donc être visible quelques heures ou jours après l’administration.

Les SAA possèdent également des propriétés non-génomiques (Lösel, 2003). Ces réactions impliquent la participation de messagers secondaires intracellulaires. Elles se différencient de l’action génomique, entre autre, par leur rapide mise en action, de l’ordre de la seconde ou de la minute, par rapport à des heures ou des jours pour les effets sur la transcription. Elles agissent également sur les cellules ne possédant pas de noyau (spermatozoïdes, érythrocytes, plaquettes), contrairement aux effets génomiques qui passent par la mise en action de récepteurs nucléaires. Ces diverses réactions aboutissent généralement à des activations ou inactivations de molécules, dont certaines peuvent être des facteurs de transcription interagissant avec le complexe stéroïde-AR.

Mais ces effets ne sont pas perturbés par les antagonistes des SAA vis-à-vis des AR.

Malgré cela, il semble que ces réactions puissent avoir lieu, pour certains stéroïdes, par l’intermédiaire des AR eux-mêmes ou de récepteurs spécifiques (Wehling, 2006).

(26)

Effets secondaires

Le nombre important d’effets secondaires reportés lors de l’usage de SAA est dû à la complexité d’action des SAA dans le corps. La plupart des effets secondaires sont réversibles à l’arrêt du traitement (Goldberg, 1996).

Le système cardio-vasculaire est touché par une augmentation de la pression sanguine (Riebe, 1992) ainsi qu’une modification des taux de cholestérol sanguin (Hartgens, 2004).

La structure du cœur peut être modifiée par une augmentation de la largeur des parois du ventricule gauche (McKillop, 1986). Ceci a pour conséquence une baisse de l’efficacité des battements cardiaques avec risques d’hypertension, d’arythmie cardiaque et de crise cardiaque (Sullivan, 1998).

Le nombre et le volume des glandes sébacées sont augmentés, ce qui induit des problèmes d’acné (Melnik, 2007). Les hommes peuvent développer une gynécomastie associée à une augmentation de la transformation des SAA en estrogènes (Neild, 1995).

De plus, une stérilité par aspermie est provoquée par l’inhibition de la production de testostérone endogène (Torres-Calleja, 2001).

Chez la femme, l’action androgénique de la testostérone va induire une masculinisation (Hartgens, 2004).

Finalement, les SAA peuvent induire des accès de violence (Sjöqvist, 2008) ainsi que des problèmes psychiques comme l’euphorie, la confusion, l’anxiété, la paranoïa, des hallucinations et de graves dépressions (Hartgens, 2004).

Métabolisme

Le métabolisme des stéroïdes endogènes est divisé en trois parties, la phase I, II et III.

Le métabolisme de phase I consiste en une fonctionnalisation de la molécule par l’action d’enzymes. Les stéroïdes sont essentiellement métabolisés par les enzymes issues du cytochrome P450c17α (CYP17) dans le foie, les reins, les glandes surrénales et les testicules. Tous les stéroïdes sont issus du métabolisme du cholestérol par l’action enzymatique du cytochrome P450 side chain cleavage (CYP450scc). Les enzymes du CYP17 catalysent ensuite de manière similaire la 17-hydroxylation de la pregnénolone et de la progestérone mais une enzyme particulière du CYP17, la 17,20-lyase, possède une activité 100 fois supérieure sur la 17-hydroxypregnenolone que sur la 17-hydroxyprogestérone (Auchus, 1998). De ce fait, la majeure partie des stéroïdes endogènes sont produits à partir de la déhydroépiandrostérone (DHEA) (Figure 1).

Comme décrit dans la figure 1, l’enzyme 3β-hydroxystéroïde dehydrogénase

∆⁵- ∆⁴-isomérase (3β-HSD) agit sur tous les androgènes. Cette enzyme catalyse la déhydrogénation des 3β-hydroxystéroïdes et réduit les précurseurs des stéroïdes

(27)

∆⁵-stéroïdes en ∆⁴-kétostéroïdes (la pregnénolone en progestérone, la 17-hydroxypregnénolone en 17-hydroxyprogestérone, la DHEA en androstènedione et la 5-androstène-3β,17β-diol en testostérone) (Simard, 2005).

Il existe une dizaine de 17β-hydroxystéroïde déhydrogénase (17β-HSD). De structures différentes, ces enzymes sont actives sur des molécules aux propriétés physico-chimiques très proches et agissent sur la formation ou l’inactivation des stéroïdes.

La 5α-réductase est responsable de la catalyse irréversible de la testostérone en dihydrotestostérone (DHT), le stéroïde endogène le plus puissant car se liant avec une grande affinité au AR. Il existe deux isoformes de la 5α-réductase, le type I et le type II, produites par deux gènes distincts, la SRD5A1 et la SRD5A2. Ces deux gènes sont exprimés dans un nombre important de tissus, mais la 5α-réductase de type II est prédominante dans la prostate alors que le type I est davantage exprimé dans le foie, les muscles, la peau et le cerveau. Cela semble indiquer que ces deux isoformes jouent un rôle biologique différent.

La DHT est finalement métabolisée en 5α- et 5β-androstane-3α,17β-diols (α-diol et β-diol) à la suite d’une réduction. Ces deux molécules sont recherchées lors de tests antidopages dans l’urine et leur rapport de concentration α-diol/β-diol est généralement proche de 15:1 (Schänzer, 1996). Par contre, par son action sur l’androstènedione, la 5α-réductase conduit à la formation d’androstanedione qui est finalement transformée en androstérone (A) et étiocholanolone (Etio), les deux métabolites urinaires principaux des SAA endogènes. Leur rapport de concentration dans l’urine est généralement proche de 1:1 (Schänzer, 1996).

Finalement, d’autres cytochromes ont une action sur les stéroïdes. Le CYP7B1, largement exprimé dans le corps, catalyse la 5α-hydroxylation de la DHEA. Cette voie majeure de la métabolisation de la DHEA ne conduit pas aux autres stéroïdes sexuels (Martin, 2004). Le CYP7B1 joue donc un rôle important dans le contrôle des taux de DHEA et dans le maintien des taux d’androgènes (Tang, 2006). Les androgènes peuvent être convertis en estrogène par l’intervention du CYP19 dont l’aromatase fait partie.

Cette enzyme est la seule capable de cette transformation (Simpson, 1994) qui est à l’origine de l’apparition de gynécomastie chez l’homme et chez la femme (Neild, 1995).

(28)

2

CholestérolPrégnénolone

5,16-Androstadiénol16(5α)-Androsténol 17α-Hydroxyprégnénolone Progestérone17α-Hydroxyprogestérone Epitestostérone

DéhydroépiandrostéroneAndrostènediol TestostéroneAndrostènedione 5α/5β-Androstanedione5α/5β-Dihydrotestostérone 5α-AndrostanediolAndrostérone5β-AndrostanediolEtiocholanolone

5β-Prégnanediol

1 222

3 3

4 4

5 5 5

77 8888

6

2,7,8 9 55

2,7,8 1.Cytochrome P450 sidechaine cleavage(CYP450scc) 2.3β-Hydroxystéroïdedéshydrogénase (3β-HSD) 3.17α-Hydroxylase 4.17,20-Lyase 5.17β-HSD 6.17α-HSD 7.5α/5β-réductase 8.3α-HSD 9.16-En syntase

Figure 1.

Figure 1.Figure 1.

Figure 1. Métabolisme principal des SAA endogènes

(29)

Le métabolisme de phase II correspond à l’ajout d’un groupe polaire sur la molécule par l’action d’une enzyme. Cet ajout a pour but de désactiver la molécule, de la rendre plus hydrophile et donc de faciliter son élimination dans l’urine. L’ajout d’un groupe sulfate est très important pour la régulation intracellulaire de l’activité des stéroïdes (Reed, 2005). Les sulfotransférases (SULT) présentent dans le cytosol des cellules humaines sont les enzymes responsables de la sulfatation de beaucoup de stéroïdes endogènes et exogènes (Falany, 1997). La SULT2B1 est active sur la DHEA, le précurseur principal des androgènes (Falany, 1997). C’est pourquoi elle joue un rôle important dans la régulation des androgènes. De plus, la DHEA et son métabolite conjugué, la DHEA sulfate, sont les stéroïdes les plus abondants dans la circulation sanguine (Berr, 1996).

La testostérone est conjuguée à un sulfate par la SULT2A1 (Falany, 1997), mais ceci ne constitue qu’une voie mineure de la métabolisation de phase II de la testostérone (Borts, 2000).

La principale voie de conjugaison de la testostérone est effectuée par l’ajout d’un groupe glucuronide à l’aide d’uridine diphosphate (UDP). Il semble que la glucuro-conjugaison des stéroïdes joue un rôle dans la régulation des taux intracellulaires de stéroïdes libres et donc dans leur activité biologique (Belanger, 2003). Les UDP-glucuronosyl transférase (UGT) sont les enzymes qui catalysent la conjugaison avec l’acide glucuronique. Ils sont séparés en deux familles, les UGT1 et les UGT2. La sous-famille des UGT2B est synthétisée dans un nombre important de tissus différents du corps humain (Turgeon, 2001). Trois UGT2B différentes sont à l’origine de la majeure partie de la glucuronidation des androgènes. Il a été démontré que l’UGT2B7 joue un rôle important sur la glucuronidation de l’épitestostérone et de l’androstérone (Coffman, 1998).

L’UGT2B15 est active dans la glucuronidation de l’α-diol, de la β-diol et de la DHT. Elle est également modérément active sur la testostérone (Turgeon, 2001). L’UGT la plus active sur la testostérone est l’UGT2B17. Cette activité est si importante qu’il a été démontré qu’une délétion du gène codant pour cette enzyme conduit à une importante diminution de l’excrétion urinaire de testostérone glucuro-conjuguée (Jakobsson, 2006).

Une récente étude (Sten, 2009a) a montré l’activité de glucuronidation de divers UGT envers la testostérone et l’épitestostérone (Tableau 2).

La phase III du métabolisme correspond à l’élimination des stéroïdes dans l’urine ou les fèces. Cette phase est essentiellement exercée par des glycoprotéines membranaires permettant le transport actif des métabolites conjugués hors de la cellule (Silverman, 1999). Ces glycoprotéines sont à l’origine de multiples résistances aux SAA car elles diminuent leur taux intracellulaires (Silverman, 1997).

(30)

Table TableTable

Tableauauau 2au222.... (Sten, 2009a) Criblage de l’activité de glucuronidation des sous-familles d’UGT recombinantes 1A, 2A et 2B sur la testostérone et l’épitestostérone

UGT Formation de glucuronide

Testostérone Epitestostérone pmol/mg de protéine/min

1A1 n.d n.d.

1A3 4.6 ± 0.3 n.d.

1A4 5.5 ± 0.3 4.9 ± 0.8

1A5 n.d n.d.

1A6 n.d n.d.

1A7 n.d n.d.

1A8 2.7 ± 0.1 n.d.

1A9 10.4 ± 0.5 n.d.

1A10 7.9 ± 0.8 n.d.

2A1 253 ± 5.4 172 ± 0.9

2A2 13.5 ± 0.5 69.7 ± 5.4

2A3 n.d n.d.

2B4 n.d 8.1 ± 0.6

2B7 4.6 ± 0.1 312.5 ± 20.0

2B10 n.d n.d.

2B11 n.d n.d.

2B15 7.9 ± 0.1 n.d.

2B15c 63 ± 2.9 n.d.

2B17 508.9 ± 19.6 n.d.

2B28 n.d n.d.

n.d. = non détecté

1.3.

1.3.1.3.

1.3. La nLa nLa nLa nandroloneandroloneandroloneandrolone

La nandrolone fait partie des 19-norstéroïdes. Sa structure est similaire à la testostérone mais avec une déméthylation en position 19. La nandrolone est un stéroïde exogène aux propriétés anaboliques et androgéniques connues depuis les années 1930. Comme les autres SAA, la nandrolone fut d’abord utilisée dans un cadre médical puis pour l’amélioration des performances chez les sportifs dès les années 1960 (Kuipers, 1991 ; Bowers, 2002) et ce, malgré leur interdiction par le CIO en 1976 lors des Jeux Olympiques de Montréal.

Les effets secondaires des norstéroïdes sont comparables à ceux décrits pour la testostérone (Kuipers, 1991 ; Parr, 2009). Il a été prouvé que la nandrolone induit des effets secondaires par son influence sur l’expression de certains gènes (Alsiö, 2009).

(31)

La nandrolone est métabolisée de manière similaire à la testostérone pour donner majoritairement la 19-norandrostérone (NA) et la 19-norétiocholanolone (NE) (Engel, 1958) puis leurs métabolites de phase II respectifs (Figure 2). La norépiandrostérone a été observée suite à l’injection intramusculaire de nandrolone décanoate (Massé, 1985).

Ce stéroïde est principalement excrété sous forme sulfatée (Schänzer, 1996). La norépiétiocholanolone, également excrétée sous forme sulfatée n’a été observée que plus récemment (Torrado, 2008). Si la NA est généralement retrouvée en concentration plus élevée que la NE, ce rapport peut varier en fonction du produit administré, du mode d’administration et du temps d’excrétion. Par exemple, cette tendance peut s’inverser en fin d’excrétion, lorsque les concentrations en NA et NE sont basses (Torrado, 2008).

L’excrétion des sulfates peut également apporter une information importante, comme le montre l’article V produit durant ce travail de thèse.

Figure 2.

Figure 2.Figure 2.

Figure 2. Métabolisme principal de la nandrolone

Les 19-norstéroïdes ne sont pas uniquement d’origine exogène, ils sont également des intermédiaires dans la biosynthèse des estrogènes à partir des androgènes (Farnsworth,

H O

O H

O

O H

O O

O

O H

H

O O

H

O

O H

H

O O

H

H O

O

H

H O

O

H

H O

O

H

H O

O

H

Norandrostènediol

Nandrolone Norandrostènedione

5α-dihydronortestostérone 5α-norandrostanedione 5β-dihydronortestostérone 5β-norandrostanedione

Norandrostérone Norépiandrostérone Norétiocholanolone Norépiétiocholanolone 3

1 2 1 2

3 3

4 5 4 5

1. 5α-réductase 2. 5β-réductase 3. 17β-HSD 4. 3α-HSD 5. 3β-HSD

(32)

1966 ; Skinner, 1969 ; Desgrez, 1970 ; Le Bizec, 1999). Bien que le complexe enzymatique P450arom, responsable de cette conversion, soit présent dans presque toutes les cellules du corps humain, l’activité ne dépasse pas les 0.1% de biotransformation quantitative des androgènes (Payne, 1976 ; Frost, 1980). Même si plusieurs états pathologiques peuvent expliquer la présence de 19-norstéroïdes dans l’urine, il est universellement reconnu qu’ils sont des intermédiaires de cette voie métabolique. En enzymologie, il est connu qu’un intermédiaire lié à un complexe enzymatique peut être libéré en faibles quantités (Dumasia, 1989). Ce phénomène fut démontré au début des années 1960 pour expliquer la présence de métabolites de la nandrolone dans les urines humaines (Short, 1961 ; 1964).

2. 2. 2.

2. L’analyse des stéroïdes endogènes L’analyse des stéroïdes endogènes L’analyse des stéroïdes endogènes L’analyse des stéroïdes endogènes

2.1.

2.1.2.1.

2.1. Détection et quantificationDétection et quantificationDétection et quantificationDétection et quantification Test radio-immunologique

Les SAA furent d’abord analysés par test radio-immunologique (RIA pour radioimmunoassay), utilisant des anticorps spécifiques des stéroïdes en présence d’un traceur (Brooks, 1975). Des tests pour l’analyse de la testostérone et de l’épitestostérone sont apparus plus tard (Bilek, 1987). Malgré une grande sensibilité, l’inconvénient de ces tests était le manque de sélectivité dû aux molécules de structures similaires pouvant interagir avec les anticorps. Le risque de faux-positif était donc relativement élevé. C’est pourquoi les résultats antidopages n’étaient recevables que lorsque l’analyse pouvait être confirmée sur des kits RIA différents.

GC-MS

Dès le début des années 1980, la méthode de confirmation rapidement adoptée par le CIO fut la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS) pour ses avantages sur la RIA en termes de sélectivité et de facilité d’utilisation.

La GC-MS nécessite une préparation d’échantillon incluant souvent une extraction sur support solide (SPE) ou liquide-liquide (LLE). Cette étape est suivie d’une hydrolyse de la fonction conjuguée (glucuronide, sulfate) pour obtenir un composé moins polaire et de plus petite taille. Finalement, une dérivation est effectuée pour rendre le stéroïde compatible avec la GC-MS (Massé, 1989 ; Chung, 1990). Habituellement, l’hydrolyse

(33)

enzymatique est préférée à l’hydrolyse chimique pour sa simplicité d’utilisation et sa spécificité. Les glucuronides sont généralement hydrolysés à l’aide de β-glucuronidase d’Escherichia coli. Mais l’extrait d’Helix pomatia, riche en glucuronidase et aryle sulfatase peut également être utilisé pour cliver tous les conjugués. Cependant, ce second extrait n’est pas couramment utilisé dans le domaine de l’antidopage car il peut conduire à la formation d’artefacts comme la formation de testostérone dans l’urine ce qui augmente artificiellement les taux endogènes (Vanluchene, 1982). La dérivation est usuellement effectuée par ajout d’un groupe trimethylsilyl qui rend le stéroïde plus volatil et thermiquement stable. La réaction est effectuée à l’aide de N-methyl-N- trimethylsilyltrifluoroacetamide (MSTFA) avec un catalyseur. D’abord utilisé à cette fin, l’iodotrimethylsilane (ITMS) (Donike, 1980) a été remplacé par l’ammonium iodide (NH4I), plus stable. Le NH4I réagit in situ avec le MSTFA pour donner l’ITMS, mais de l’ethanethiol est ajouté comme antioxydant pour éviter la formation de iodine (Opfermann, 1997). L’extrait contenant les stéroïdes est ensuite injecté dans le GC-MS.

Une séparation optimale est requise pour les composants de même masse comme les isomères testostérone et épitestostérone ou androstérone et étiocholanolone. La détection s’effectue en mode single ion monitoring (SIM) sur un ion de quantification et plusieurs autres ions de confirmation (Massé, 1989). L’identification des composés est effectuée en mode full scan (SCAN). Généralement, les systèmes GC-MS utilisent une source d’ionisation à impact électronique et un quadripôle. Au début des années 1990, le CIO impose des limites de détection sous la forme de limites minimales de performance requises (minimum required performance limit = MRPL) nécessitant l’utilisation de MS haute résolution (généralement des secteurs magnétiques) ou de GC-MS/MS (Bowers, 1997a). La haute résolution s’est avérée très utile, bien qu’onéreuse, quand des comparaisons de détection d’échantillons positifs ont été effectuées (Horning, 1997). Mais pour des raisons financières, certains laboratoires ont préféré s’équiper d’analyseurs de masses MS/MS tandem plutôt que de MS haute résolution. L’analyse MS/MS peut s’effectuer soit dans l’espace, en utilisant un triple quadripôle, soit dans le temps à l’aide d’un piège àions. Mais malgré la possibilité d’accumuler un ion spécifique dans la trappe d’ions, il semble que cet appareil n’apporte pas de gain significatif en mode SIM par rapport à un quadripôle seul (Bowers, 1997b).

Malgré un usage très largement répandu, la séparation par GC possède quelques limitations. Ces méthodes ne sont pas adaptées à l’analyse de grosses molécules ou de molécules polaires. De plus, les informations sur le métabolisme de phase II sont perdues lors de l’étape d’hydrolyse.

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LC-MS

A la fin des années 1990, l’utilisation de la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) s’est développée en toxicologie et dans la lutte contre le dopage (Maurer, 1998). Cette méthode de séparation permet l’analyse des composés sous leur forme initiale, les molécules polaires et ionisables ne nécessitant pas de modification. Ceci permet potentiellement d’analyser les stéroïdes sous forme sulfo- et glucuro-conjuguées. La compatibilité entre les échantillons et le système analytique permet l’analyse en ligne des composés d’intérêt. La LC-MS rend possible l’analyse du profil métabolique complet d’un composé, par exemple de la testostérone conjointement à ses métabolites de phase I et II, beaucoup plus polaires (Borts, 2000). De plus, les composés polaires peuvent être quantifiés à basse concentration dans les échantillons biologiques (Hopfgartner, 2003).

Plusieurs méthodes ont été développées pour permettre l’analyse directe des métabolites urinaires conjugués de la testostérone (Bowers, 1996 ; Bean, 1997 ; Borts, 2000). Mais Bowers et Borts observèrent une importante suppression du signal variant considérablement d’un échantillon à l’autre. Ils attribuèrent cette suppression de signal à la nature polaire des stéroïdes conjugués, ce qui les rend difficiles à purifier malgré l’ajout de différentes étapes d’extraction. Afin de corriger cet effet, ils introduisirent l’utilisation des standards internes deutérés. Ces standards sont les mêmes stéroïdes que ceux recherchés, mais plusieurs hydrogènes ont été substitués par des atomes de deutérium. Ceci permet d’avoir une molécule qui se comportera de façon similaire à l’analyte durant la préparation d’échantillon et qui subira les mêmes effets matrice tout en étant séparable par la spectrométrie de masse. Même si les limites des standards deutérés sont connues (Wang, 2007), ils restent couramment utilisés dans l’analyse par LC-MS/MS. Malgré cela, il est toujours nécessaire d’étudier l’effet matrice lors du développement d’une méthode analytique en LC-MS. La suppression de signal est due à la présence de composés moins volatiles, comme des sels, des composés endogènes ou exogènes, qui peuvent modifier la formation et l’évaporation des gouttelettes dans le spray de la source (Annesley, 2003). Ceci influence en particulier les molécules de faible masse moléculaire et les composés polaires. En l’occurrence, les stéroïdes conjugués sont des molécules polaires qui subiront un important effet de matrice. L’étude de l’effet de matrice se distingue en trois parties. La première se base sur les travaux de Matuszewski qui suggéraient de comparer les signaux obtenus pour un standard directement injecté dans le système LC-MS à des échantillons enrichis en composés d’intérêts avant et après extraction (Matuszewski, 1998). Plus récemment, cette méthodologie a été complétée avec l’extraction d’eau enrichie avec les composés d’intérêts