Chapitre Chapitre Chapitre Chapitre IIIIV V V V
Influence d’une prise de testostérone ou Influence d’une prise de testostérone ou Influence d’une prise de testostérone ou
Influence d’une prise de testostérone ou de nandrolone sur leur de nandrolone sur leur de nandrolone sur leur de nandrolone sur leur métabolisme
métabolisme métabolisme
métabolisme
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1.
1. 1.
1. Introduction Introduction Introduction Introduction
La nandrolone est principalement métabolisée en norandrostérone et en norétiocholanolone avant glucuro- ou sulfo-conjugaison. Peu d’études ont été effectuées pour déterminer l’apport de l’analyse des métabolites sulfoconjuguées de la nandrolone sur la détection d’un dopage à ce stéroïde ou à l’un de ses précurseurs. Ces différents métabolites peuvent être utilisés pour identifier le norstéroïde administré (Schänzer, 2001 ; Tseng, 2006) ou l’origine endogène ou exogène de la nandrolone (Le Bizec, 2002).
Par contre, aucune étude n’a été menée sur une comparaison directe des résultats de quantification des métabolites de la nandrolone d’origine endogène et exogène. Les échantillons issus d’une étude clinique impliquant des prises de norandrostènedione ont été analysés conjointement à des échantillons d’urine contenant des métabolites de la nandrolone issus de la déméthylation in situ de l’androstérone et de l’étiocholanolone.
En ce qui concerne la testostérone, plusieurs méthodes de quantification des métabolites sulfo-conjugués ont été développées (Zhang, 1999 ; Buiarelli, 2004 ; Saudan, 2006b).
Mais peu d’études ont été menées sur l’apport de l’analyse des stéroïdes sulfoconjugués sur la mise en évidence d’un dopage aux stéroïdes endogènes. Il semble que lors d’une prise exogène de DHT, l’excrétion d’épiandrostérone sulfate soit augmentée (Van Eenoo, 2006). Il a également été démontré que la détermination des métabolites sulfo-conjugués peut être utile pour différencier un T/E élevé naturellement d’un T/E élevé par l’influence d’un facteur exogène (Dehennin, 1994). Ceci en particulier grâce au rapport de la testostérone glucuronide sur l’épitestostérone totale, sulfate et glucuronide (Dehennin, 1996). Une étude clinique impliquant des prises orales de testostérone undécanoate a été menée conjointement à l’étude sur la nandrolone. Les échantillons analysés ici sont issus d’une étude clinique menée par le Dr. Norbert Baume dans le cadre de son travail de thèse au Laboratoire suisse d’Analyse du Dopage de Lausanne en 2004. Le protocole de cette étude a été approuvé par la Commission d’éthique de la recherche clinique de la Faculté de Médecine de l’Université de Lausanne (Suisse) (protocole 53/04).
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2.
2. 2.
2. Objectif Objectif Objectif Objectif
L’objectif de cette étude est de déterminer dans quelle mesure la détermination des métabolites sulfoconjugués de la nandrolone et de la testostérone peuvent représenter des marqueurs discriminants d’une prise exogène de SAA.
3.
3. 3.
3. Design de l’étude clinique Design de l’étude clinique Design de l’étude clinique Design de l’étude clinique et méthode et méthode et méthodessss u et méthode u u utilisée tilisée tilisée tiliséessss
30 volontaires sains masculins, âgés de 20 à 30 ans et d’origine caucasienne, on été séparés aléatoirement en trois groupes de 10. L’étude consistait en la prise de 12 pilules d’un placébo pour le premier groupe (groupe placébo), de 19-norandrostènedione, un précurseur métabolique de la nandrolone, pour le second (groupe nandrolone) et finalement d’undécanoate de testostérone pour le troisième (groupe testostérone), les lundi, mercredi et vendredi matins durant quatre semaines consécutives. Les gélules étaient composées de 300mg de mannitol pour le groupe placébo, de 100mg de 19-norandrostènedione et de 127mg de mannitol pour le groupe nandrolone et de 80mg d’undécanoate de testostérone et de 115 mg de mannitol pour le groupe testostérone. Les gélules à base de 19-norandrostènedione (Sigma, St-Louis, MO, USA) et d’undécanoate de testostérone (Dynapharm, Meyrin, Suisse) ont été préparées par la pharmacie du Centre Hospitalier Universitaire du Canton de Vaud (CHUV, Lausanne, Suisse).
Les échantillons urinaires étudiés ici ont été prélevés avant le début de l’étude puis 4, 8 et 24 heures après la prise de gélule et enfin, un cinquième échantillon à été collecté 200 heures après la dernière prise de gélule. Les urines ont été conservées à 4°C avant distribution en flacons de 20mL et congélation à -20°C.
L’analyse des métabolites sulfo- et glucuro-conjugués a été effectuée à l’aide des méthodes décrites pour la nandrolone (chapitre II.2) et pour la testostérone (chapitre II.3).
Les échantillons contenant des métabolites de la nandrolone d’origine endogène ont été sélectionnés parmi les échantillons issus du travail de routine au LAD ainsi qu’au Laboratoire de contrôle du dopage INRS - Institut Armand-Frappier (Montréal, Canada).
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4.
4. 4.
4. Résultats Résultats Résultats Résultats et discussion et discussion et discussion et discussion
4.1.4.1.4.1.
4.1. ArticleArticleArticleArticle VVV: Profiling of 19V: Profiling of 19: Profiling of 19----norandrosterone sulfate and glucuronide in human : Profiling of 19norandrosterone sulfate and glucuronide in human norandrosterone sulfate and glucuronide in human norandrosterone sulfate and glucuronide in human urine:
urine:
urine:
urine: Implications in athlete’s drug testingImplications in athlete’s drug testingImplications in athlete’s drug testingImplications in athlete’s drug testing
Parmi les 10 volontaires initialement inclus dans l’étude, 8 individus du groupe nandrolone ont participé à l’étude jusqu’à son terme. La 19-norandrostènedione est un précurseur métabolique de la nandrolone, elle est convertie dans le foie par l’action de la 17β-hydroxystéroïde déshydrogénase. La figure 16 montre les cinétiques d’excrétion des métabolites sulfo- et glucuro-conjugués de la 19-NA et de la 19-NE chez les 8 volontaires du groupe nandrolone (S1 à S8).
Figure 16 Figure 16Figure 16
Figure 16.... Cinétiques d’excrétion urinaire de la 19-NAS (), 19-NES (), 19-NAG () et 19-NEG () dans des échantillons de 8 volontaires (S1 à S8) après une prise orale de 19-norandrostenedione (100 mg) à t = 0.
Les valeurs en-dessous de 1ng/mL ne sont pas indiquées
Les concentrations maximales en métabolites conjugués de la nandrolone sont observées 4 heures après une prise orale de 19-norandrostènedione. La 19-NAG est le métabolite
0.1
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urinaire le plus concentré après 4 heures, mais la 19-NAS devient le métabolite majeur après 24 heures chez 7 sujets sur 8, comme lors d’une prise de 19-norandrostènediol (Torrado, 2008). De même en fin d’excrétion, la 19-NAS reste le métabolite majeur chez 7 sujets sur 8. Etant donné que ce métabolite est souvent le seul présent 200 heures après la prise de la prohormone, il semble qu’il constitue un marqueur à long terme d’une prise de 19-norandrostènedione. Par contre, pour le sujet S1, le seul métabolite observé en fin d’excrétion est la 19-NAG. La figure 17 montre l’évolution des rapports de concentration des métabolites conjugués de la nandrolone.
.
Figure 17 Figure 17Figure 17
Figure 17.... Evolution des rapports de concentrations 19-NAS/19-NES (ligne pleine), 19-NAG/19-NEG (discontinus) and NAG/NAS (pointillés) dans l’urine de 8 sujets après administration orale de 19-norandrostenedione (100 mg) à t = 0. Les rapports comportant des concentrations inférieures à 1 ng/mL ne sont pas indiqués
En général, le rapport 19-NAG/19-NEG diminue entre 4 et 24 heures après administration de 19-norandrostènedione. Au contraire, le rapport 19-NAS/19-NES augmente entre 4 et 24 heures. Mais dans tous les cas, de grandes variations inter-individuelles sont observables. La comparaison de l’excrétion de la 19-NAG et de 19-NAS
Rapport des concentrations
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montre une inversion du rapport de concentrations durant l’excrétion. Il semble qu’un délai existe entre l’excrétion des différents conjugués de la nandrolone. Cette étude montre qu’à basse concentration, les substrats sont plus sulfo-conjugués alors qu’à haute concentration, la réaction de sulfatation semble saturée et le substrat devient principalement glucuro-conjugué. En effet, si l’on considère qu’une quantité limitée d’enzyme est disponible pour catalyser la réaction de sulfatation, l’arrivée d’une importante quantité de substrat pourra saturer cette réaction. Le substrat en excès sera donc métabolisé par glucuro-conjugaison.
Des échantillons contenant des métabolites de la nandrolone issus de la déméthylation de l’androstérone et de l’étiocholanolone ont été analysés et comparés aux échantillons contenant les mêmes SAA, mais d’origine exogène (E1 à E6). Les résultats sont donnés dans le tableau 13.
Tableau 1 Tableau 1Tableau 1
Tableau 13333.... Echantillons d’urine humaine contenant des norstéroïdes d’origine endogène ou exogènes à basse concentration
Echantillon Concentration (nmol/L) Rapport de concentrations
19-NAS 19-NES 19-NAG 19-NEG NAS/NES NAG/NEG NAG/NAS Echantillons contenant des 19-norstéroïdes d'origine exogène
X1 778 21 41 5.5 37 7.4 0.05
Echantillons contenant des 19-norstéroïdes endogènes formés par déméthylation in situ
E1 20 < 2.8 15 11.1 - 1.4 0.8
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La 19-NAS est présente dans tous les échantillons ayant subi une déméthylation in situ. Des variations sont observées entre les différents rapports de concentrations, mais ces différences ne sont pas significatives. Ces paramètres ne semblent pas suffisamment discriminants pour permettre de mettre en évidence l’origine de la 19-NA dans l’urine.
Des résultats similaires ont été obtenus simultanément à nos recherches dans un laboratoire canadien (Guay, 2009). Ceux-ci ont analysé des échantillons contenant des norstéroïdes provenant de femmes enceintes et de personnes ayant ingérer des abats de porc non-castrés. Aucune distinction n’a pu être relevée entre des échantillons contenant des métabolites endogènes et ceux contenant des métabolites exogènes. Par contre, ils ont montré l’utilité de la GC-C-IRMS pour mettre en évidence un dopage à la nandrolone ou à un précurseur. Mais comme relevé précédemment, cette méthode souffre encore
prises de testostérone undécanoate, résultats préliminaires, résultats préliminaires, résultats préliminaires, résultats préliminaires
La partie de l’étude clinique impliquant une prise exogène de testostérone undécanoate a été menée à bien par 7 sujets (S1 à S7). Le but de cette étude est de déterminer l’apport de l’analyse des métabolites sulfo-conjugués sur la détection d’un dopage à la testostérone. C’est pourquoi l’intérêt est porté ici sur les métabolites sulfo-conjugués de cinq stéroïdes retrouvés dans l’urine et faisant partie du métabolisme de la testostérone.
Si la testostérone, l’épitestostérone, l’androstérone et l’étiocholanolone sont généralement excrétées majoritairement sous forme glucuro-conjuguée dans l’urine, la DHEA est majoritairement sulfo-conjuguée.
La quantification des métabolites glucuro-conjugués a servi à confirmer l’augmentation du rapport T/E après une prise de testostérone exogène (données non montrées). En se basant sur le profil stéroïdien, il a pu être démontré que le sujet S1 ne possède pas le gène UGT2B17. En effet, après une prise de 80mg de testostérone undécanoate, le sujet S1 ne montre pas d’augmentation significative de son rapport T/E et celui-ci ne dépasse pas 0.5. Ce cas particulier avait déjà été discuté par Baume et al. en 2006 (Baume, 2006a). Ces derniers avaient montré que malgré l’incapacité à mettre en évidence une prise exogène de testostérone à l’aide du profil stéroïdien, l’analyse par GC-C-IRMS permettait cette détection. A ce moment là, la cause de cette stabilité du T/E n’était pas connue, mais en se basant sur les découvertes effectuées en génétique sur le métabolisme de la testostérone (Jakobsson, 2006), l’étude complémentaire effectuée dans
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le cadre de ce travail à permis d’identifier que cet individu présente une délétion du gène UGT2B17.
La quantification des métabolites sulfo-conjugués a été effectuée par LC-MS/MS. Avec la multiplication des analyses, la stabilité du système analytique utilisé s’est avéré limitée pour la quantification des métabolites à basses concentrations. Etant donné que la testostérone est souvent excrétée à des concentrations inférieures à 1 ng/mL d’urine sous forme sulfo-conjuguée, la fiabilité des résultats de quantification pour cette molécule est discutable. C’est pourquoi les résultats de quantification de ce stéroïde ne seront pas discutés ici. Le développement d’une méthode de quantification se basant sur un volume d’urine initial supérieur devrait être envisagé. Mais comme les autres métabolites sont excrétés en grande quantité comparativement à la testostérone, une méthode spécifique à ce stéroïde devrait être développée.
La figure 18 montre les cinétiques d’excrétion urinaire chez 7 volontaires (S1 à S7) des stéroïdes sulfo-conjugués après une prise de 80mg de testostérone undécanoate. La concentration en stéroïde a été systématiquement corrigée par la gravité spécifique selon l’équation 1 lorsque celle-ci différait de 1.020.
L’excrétion urinaire d’épitestostérone est significativement augmentée chez deux volontaires (p < 0.01), S1 et S6, à t4h, puis elle reste significativement élevée chez le sujet S1 jusqu’à t24h. Par contre, chez tous les autres individus, la concentration en épitestostérone sulfate ne varie pas significativement après une prise de testostérone.
Une augmentation de la concentration urinaire de DHEA sulfate est observable chez le sujet S1, mais celle-ci n’est pas significative (p > 0.15). Par contre, chez les sujets S2 jusqu’à t24h, et S7 jusqu’à t8h, une augmentation significative de DHEA sulfate est constatée (p < 0.04). La concentration en androstérone sulfate est augmentée significativement chez les sujets S1, S2 et S3 jusqu’à t24h (p < 0.05) alors que pour l’étiocholanolone sulfate, une augmentation significative n’est observée que pour le sujet S1 jusqu’à t24h (p = 0.03).
L’augmentation de la concentration urinaire de stéroïdes sulfo-conjugués à t4h a également été observée chez plusieurs individus du groupe placébo (données non montrées). Cette augmentation est suivie d’un retour au niveau basal à t8h. Ceci peut être expliqué par le fait que la testostérone est produite suivant un rythme circadien.
Une étude avait montré que l’excrétion de testostérone, d’épitestostérone, d’androstérone et d’étiocholanolone sous forme glucuro-conjuguée est plus importante entre 10 et 12h qu’entre 6 et 8h le matin (Mareck-Engelke, 1995b). Si cette excrétion est liée a la production des stéroïdes, il se peut que l’effet soit le même sur les stéroïdes sulfo-conjugués.
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Figure 1 Figure 1Figure 1
Figure 18888.... Cinétiques d’excrétion urinaire des métabolites sulfo-conjugués de l’épitestostérone (), de la DHEA (), de l’androstérone () et de l’étiocholanolone () après une prise orale de 80mg de testostérone undécanoate à t = 0
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Le profil d’excrétion urinaire des stéroïdes sulfo-conjugués est bien influencé par une prise exogène de testostérone undécanoate, mais aucune de ces molécules ne peut servir de marqueur systématique d’un dopage à la testostérone. Il est intéressant de noter que pour le sujet S1, qui ne possède pas le gène UGT2B17, il n’y a pas de surproduction de stéroïdes sulfo-conjugués en comparaison avec les autres volontaires possédant ce gène.
Les concentrations basales en sulfate ne sont pas significativement différentes chez cet individu par rapport aux autres volontaires, y compris pour la testostérone sulfate (données non montrées). Par contre, lors d’une prise exogène de testostérone, toutes les molécules d’intérêt voient leur excrétion urinaire augmenter. Cette observation devrait être confirmée sur d’autres individus ne possédant pas le gène UGT2B17.
L’observation des rapports de concentration des stéroïdes urinaires peut parfois apporter des informations intéressantes sur leur métabolisme. La figure 19 montre l’évolution des rapports de concentrations AS/ES, EtioS/ES, AS/DHEAS, EtioS/DHEAS et AS/ES dans l’urine des 7 sujets ayant pris par voie orale 80mg de testostérone undécanoate. Le rapport AS/ES semble être le facteur le plus discriminant pour mettre en évidence un dopage à la testostérone. En effet, ce rapport est significativement augmenté jusqu’à t24h
chez les sujets S2, S3, S5, S7 et jusqu’à t8h chez le sujet S4. Par contre, chez les sujets S1 et S6, ce rapport reste inchangé. Les autres rapports exprimés dans la figure 19 montrent une certaine stabilité, sauf à t4h où une variation significative est parfois observée. Mais comme pour les concentrations, ces rapports ne permettent pas de mettre en évidence de manière univoque un dopage à la testostérone chez tous les sujets de l’étude. Ceux-ci peuvent également être dus à l’influence du rythme circadien plus importante sur certains stéroïdes que d’autres.
Finalement, le rapport des concentrations de la testostérone glucuronide sur l’épitestostérone totale a été comparé au rapport TG/EG. Dans le cas de cette étude, aucune différence n’a été constatée entre ces deux valeurs. Mais ce rapport avait été introduit pour différencier les cas de TG/EG élevés de façon naturellement des TG/EG élevés à cause d’un apport de xénobiotique (Dehennin, 1996). Or, dans le cas présent, aucun individu ne possédait de TG/EG naturellement supérieur à 4.0. Il n’a donc pas été possible de confirmer ces résultats.
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Figure 19 Figure 19Figure 19
Figure 19.... Evolution des rapports de concentrations AS/ES (rouge), EtioS/ES (bleu), AS/DHEAS (vert), EtioS/DHEAS (violet) et AS/EtioS (noir) dans l’urine de 7 sujets après administration orale de testostérone undécanoate (80 mg) à t = 0
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5.
5. 5.
5. Conclusions Conclusions Conclusions Conclusions
Cette étude a permis de montrer que la discrimination entre des métabolites conjugués de la nandrolone d’origine endogène ou exogène en se basant sur les concentrations ou les rapports de concentrations de SAA dans l’urine est difficile. Par contre, la 19-NAS est excrétée plus lentement dans l’urine. En isolant ce métabolite avec la méthode décrite ici, puis en l’analysant par GC-C-IRMS après solvolyse, il serait possible d’élargir la fenêtre de détection d’un dopage aux norstéroïdes. De plus, une analyse par LC-IRMS pourrait être envisagée car elle permettrait une analyse directe de la 19-NAS. Elle donnerait directement le rapport isotopique du stéroïde car la fonction sulfate ne contient pas de carbone.
Cette étude a également permis de montrer que la mesure des taux urinaires des métabolites sulfo-conjugués de l’épitestostérone, de l’androstérone, de l’étiocholanolone et de la DHEA n’apporte pas d’amélioration significative dans la mise en évidence d’un dopage à la testostérone par administration orale de testostérone undécanoate. Par contre, le rapport de concentrations AS/ES a permis de discriminer des urines contenant des stéroïdes exogènes chez 5 sujets sur 7. Ceci ne constitue donc pas un biomarqueur univoque, mais pourrait être considéré comme un indice dans une stratégie globale incluant tous les métabolites conjugués.