Epidémiologie moléculaire des rotaviroses bovines en région Charolaise

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Epidémiologie moléculaire des rotaviroses bovines en région Charolaise

Patrice Vende, R. Karoum, G. Manet, C. Rizet, F. Schelcher, J. Cohen, H.

Navetat

To cite this version:

Patrice Vende, R. Karoum, G. Manet, C. Rizet, F. Schelcher, et al.. Epidémiologie moléculaire des rotaviroses bovines en région Charolaise. Veterinary Research, BioMed Central, 1999, 30, pp.451-456.

�hal-02693533�

Article original

Épidémiologie moléculaire des rotaviroses bovines

en région ^charolaise

Patrice Vende Reda Karoum a Guislain Manet b Claude Rizet c

François ^{Schelcher Jean Cohen} Hervé Navetat d

a

Laboratoire de virologie ^et immunologie moléculaires, Inra. CRJ, domaine de Vilvert, ⁷⁸³⁵² Jouy-en-Josas ^{cedex, France}

! Laboratoire vétérinaire départemental d’analyses ^{de l’Allier, Z.I. de} l’Étoile BP 1707, 03000 Moulins, France

c

6, ^rue du Général-de-Gaulle 03130 Le Donjon, ^France

d École vétérinaire de Toulouse, 23, chemin des Capelles, 31076 Toulouse, France

(Reçu ^{le 22 mars} 1999 ; accepté ^le 5 juillet 1999)

Abstract - Molecular epidemiology of bovine rotavirus from the Charolais area (France). ^Fae-

cal samples from 164 diarrhoeic calves under 60 days of age ^were collected from the Charolais area

of France during winter of 1998. The samples ^{were tested} by ^an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ^to detect the presence of rotavirus antigen. ^{Of 164} dairy ^{calves tested, 45.1 % were} pos- itive for rotavirus antigen. The presence of rotavirus ^was confirmed by electrophoresis ^of genomic

segments. ^Genomic segment ⁹ coding for the surface glycoprotein ^{VP7 was} amplified by ^RT-PCR using amplimeres corresponding ^{to a} conserved sequence located ^at the 5’ and 3’ ends. Nucleotides of the region ^{29 to 32()-560} (average ^{427) was} determined by ^the Taq dye deoxynucleotide cycle sequencing ^method. By comparison ^to the 175 sequences of gene ⁹ previously published, sequence

analysis demonstrated that all of the isolates from the present study belong ^{to the} genotype ^{G6. This} result confirms previously published ^data indicating ^the prevalence of rotavirus G6 in bovine, and sug- gests ^{that a} monovalent vaccine based on G6 antigen would be sufficient to elicit a good protection.

© Inra/Elsevier, ^Paris.

rotavirus / serotype ^{/ bovine} gastro-enteritis ^{/ RT-PCR}

*

Correspondance ^{et tires a} part

Tél.: (33) ¹ 3465 2604 ; ^fiax: (33) 1 3465 2621 ; ^{e-mail :} cohenC!biotec.jouy.inra.fir

Résumé - Une enquête épidémiologique ^{chez des veaux} atteints de gastro-entérite ^a été réalisée dans la région charolaise au cours de l’hiver 1998. Cette enquête ^a porté ^sur 1 fi4 animaux âgés ^{de moins}

de 60 j. Les ^{rotavirus ont été} diagnostiqués, ^{dans des} échantillons de fèces, par ^{un test} Elisa dans 45, c¡,.

des cas. La présence du rotavirus a été vérifié par électrophorèse ^des segments ^d’ARN génomique.

Dans un deuxième temps ^le segment génomique ^{9 codant} pour la glycoprotéine de surface VP7 a été

amplifié par transcription ^inverse et polymérisation ^{en chaîne} (RT-PCR) à l’aide d’amorces corres-

pondant ^aux extrémités conservées 5’ et 3’ des segments génomiques. ^Le produit ^{de cette} amplification

a été purifié, puis partiellement séquence par ^une méthode fondée sur l’utilisation de la Taq polymérase

et des didéoxynucléotides fluorescents. Les séquences ^obtenues, qui correspondent ^{à la} région ^com- prise ^entre les nucléotides 29 à 320-560 (avec ^une moyenne de 427), ^{ont été} analysées ^et comparées

à l’ensemble des 175 séquences ^{du même} gène présentes dans les bases de données. Il en est ressorti que les isolats étudiés appartenaient tous ^au génotype G6. Ce résultat confirme à l’échelon d’une région

la prévalence chez les bovins de G6 et avec l’ensemble des données publiées justifie l’utilisation de vaccin monovalent G6. © Inra/Elsevier, ^Paris.

rotavirus / sérotype ^/ gastro-entérite ^{bovine / RT-PCR}

1. INTRODUCTION

Les rotavirus sont les agents étiologiques majeurs ^des gastro-entérites ^{du veau et en} général de l’enfant et des jeunes ^animaux.

Les rotavirus comme tous les virus à ARN

présentent ^une grande variabilité. Les rota-

virus du _{groupe A} sont classés en sérotypes

en se fondant sur la glycoprotéine ^externe

VP7 (G-types) ^{et sur la} protéine ^de spicule

VP4 (P-types). ^{Dans la mesure où VP7 en} général ^{suscite une} réponse neutralisante

plus ^forte que VP4 ^on attache souvent plus d’importance ^au G-type. ^On compte ^actuel- lement 14 sérotypes ^G chez les rotavirus du groupe A. Chez l’enfant des enquêtes épi- démiologiques ^ont clairement _{montré que} les sérotypes G1, G2, G3, ^{G4 sont en} géné-

ral les plus rencontrés [4], mais que dans certains contextes géographiques ^d’autres sérotypes pouvaient ^être prévalents [10].

Les données concernant les sérotypes ^des

rotavirus isolés chez le veau sont beaucoup plus ^{rares. En} particulier ^{aucune étude séro-} typique n’a été réalisée jusque ^{là en France.}

En général ^{les virus les} plus ^{souvent isolés}

chez le veau appartiennent ^au sérotype ^G6 [14, 15], ^{mais avec des} fréquences ^notable-

ment plus ^{faibles on trouve des} sérotypes G10, ^{G8 et G1} [1, 11]. ^La détermination du

sérotype d’un isolat implique ^{sa mise en}

culture in vitro, ^ce qui ^est extrêmement lourd pour les rotavirus. La biologie moléculaire permet ^de caractériser de différentes façons

[2, 9] ^le gène qui code pour l’antigène qui

induit des anticorps neutralisants et ainsi donne accès beaucoup plus facilement au

sérotype ^{dans la mesure où} pour les rotavi-

rus on a montré qu’il y ^{a une} bonne corré- lation entre le génotype ^{et le} sérotype [1, 12].

Dans cette étude limitée à l’hiver 1998

et à la région charolaise nous nous sommes

proposés ^de déterminer _par séquençage par- tiel (environ ⁴⁰ %) ^du gène ^codant pour VP7 les sérotypes ^les plus fréquemment ^ren-

contrés chez les veaux atteints de gastro- entérites.

2. MATÉRIEL ET MÉTHODES

2.1. Prélèvement des échantillons

La période ^des prélèvements s’est étendue de la mi-décembre 1997 au début avril 1998.

L’étude a porté ^{sur 29} exploitations ^{toutes situées}

en Charolais et où sévissaient des diarrhées. Les diarrhées avaient été prévalentes pendant ^les

années précédentes dans 22 de ces exploitations

et pour 24 d’entre elles les vaches gestantes avaient été vaccinées avec des vaccins commer-

ciaux inactivés. Au cours de cette période ¹⁶⁴ prélèvements ^ont été effectués chez des veaux

âgés de moins de 60 j ^et présentant ^{une diarrhée}

mucoïde évocatrice d’une atteinte par le rotavi-

rus. Aucun prélèvement n’a été réalisé chez des

veaux qui présentaient ^une pathologie ^{associée ou}

qui ^avaient reçu ^un traitement préalable. ^La répar-

tition des cas d’animaux malades en fonction de

l’âge, ^{et de la} gravité ^{de la} déshydratation, ^illus-

trée dans la fïgure ^1, porte uniquement ^{sur les}

60 animaux pour lesquels ^le génotype ^{du rota-}

virus présent dans les fèces a pu être déterminé.

Chaque prélèvement ^est réparti ^en quatre ^frac- tions aliquotes ^et congelé à -20 °C dans les meilleurs délais. Des prélèvements ^{ont été aussi}

réalisés chez cinq ^{veaux ne} présentant pas de

signes cliniques de diarrhée.

2.2. Elisa

La présence d’antigène de rotavirus dans les fèces de veau a été recherchée _par le test Elisa

(Pathosure ^Bovine Enteritis, Vetoquinol, Lure, France) qui permet ^la capture ^de Rotavirus, ^de Coronavirus bovin et d’E. cnli à facteur d’atta- chement K99.

2.3. Génotypage

Sans décongeler l’échantillon on a prélevé 0,2 g de fèces qui ^{ont été dilués dans 0,5 mL de}

tampon Tris-CI 20 mM, ^{NaCI 50} mM, ^EDTA 1 mM, pH 7,5 (tampon TNE), homogénéisés ^et

clarifiés par 5 min de centrifugation ^{à 13 000}

tr./min. et à 4 °C. La suite de l’extraction a été réalisée avec le kit Q!A am p Viral RNA (Qiagen, Orsay, ^{France). Une} partie ^du surnageant

(140 N L) ^{a été} mélangée ^{avec 560} N L ^{du tam-}

pon d’extraction (AVL) ^et traitée selon les indi- cations du fabricant. L’ARN a été récupéré ^dans

un volume de 50 pL d’eau, puis analysé par élec-

trophorèse ^en gel d’agarose ^{à 1 % en} tampon TAE (Tris-Acétate 40 mM, EDTA 2 mM, pH ^{7). ).}

Le segment génomique bicaténaire 9 a été

spécifiquement amplifié par transcription ^inverse (RT) ^et amplification par polymérisation ^en

chaîne (PCR) ^{dans un tube} unique ^{en utilisant}

le kit Ready ^{To Go} (Pharmacia, St-Quentin-en- Yvelines, France). Le substrat de la RT étant un

ARN bicaténaire le mélange ^{constitué de 5} pL

d’échantillon d’ARN viral et des deux ampli-

mères (beg9 ^{et end9 [6!, 100} pmole chaque) ^dans

un volume total de 50 N L ^{a été} porté ^{à 100 °C} pendant ^{3 min} puis ^refroidi brusquement pour

assurer une dénaturation complète de la matrice.

Une partie ^{de ce} mélange (34 N L) ^{a été} déposée

dans le tube qui contient la transcriptase ^inverse

et la Taq polymérase. ^{Dans le} thermocycleur ^la température ^est d’abord fixée à 42 °C pendant

30 min, puis ^{à 95 °C} pendant ⁵ min pour ^res-

pectivement ^la transcription ^{inverse et l’inacti-}

vation de l’enzyme. L’amplification proprement dite par la Taq polymérase ^{a consisté en 32} cycles (95 °C ³⁰ s ; 50 °C 30 s ; 72 °C 1 min). ^L’effi-

cacité de la RT-PCR a été contrôlée en faisant

migrer par électrophorèse ⁵ pL ^du produit ^{de la}

réaction dans un gel ^{à 1 °!o} d’agarose. ^Le produit

de la RT-PCR a été purifié, débarrassé des ampli-

mères _par fixation sur une micro-colonne de silice

(NucleoSpin ^Extract, Macherey-Nagel GmbH)

et élué dans un volume de 50 pL de Tris-Cl l0 0 mM, pH ^8,5.

Le séquençage ^a été réalisé à partir ^{de 5} pL ^du produit purifié de la RT-PCR par la méthode des

didéoxynucléotides tluorescents Tag d y e ^termi-

rwtor dans un séquenceur automatique ^PE- Applied Biosystem ^{ABI 373.}

2.4. Électrophorétypes

Sur les échantillons positifs par Elisa, l’ARN viral extrait comme indiqué ^{ci-dessus a été ana-} lysé par électrophorèse ^en gel ^de polyacrylamide

selon le protocole ^décrit précédemment [13].

Brièvement l’échantillon d’ARN a été remis en

suspension ^{dans du} glycérol ^{5 %! et la} migration

a eu lieu sous une tension de 100 volts pendant

2 h à travers un gel ^{à 10 % de} polyacrylamide.

Après migration ^le gel ^a été coloré au bromure

d’éthidium.

2.5. Comparaison ^des séquences

Les séquences ^{ont été} analysées à l’aide de l’ensemble de programmes GCG [3], ^les aligne-

ments multiples ^{et les} dendrogrammes ^{ont été}

réalisés en utilisant l’algorithme ^de Higgins [8]. ].

Grâce à cet algorithme ^{on a} pu classer les virus selon huit principaux génotypes qui par ailleurs ont été classés par neutralisation dans ^autant de

sérotypes [72].

3. RÉSULTATS ET DISCUSSION

L’analyse ^{des 164} prélèvements ^{a mon-}

tré que 45,1 ^{°7o des veaux atteints de diar-} rhée présentaient ^{au moment des} signes ^cli- niques ^{du rotavirus} dans leurs fèces. Les

cinq prélèvements ^{réalisés chez les veaux}

sains sont restés négatifs après ^{Elisa et RT-}

PCR. Sur les 74 échantillons positifs ^par Elisa, ^{12 n’ont} pas conduit, après ^RT-PCR

à la synthèse ^{de l’ADNc} correspondant ^au gène 9 du rotavirus et pour ^deux échantillons

supplémentaires l’extrémité 5’de ce gène

n’a pas pu être séquencée. ^{Six de ces 12 2}

échantillons contenaient pourtant des quan- tités détectables de rotavirus comme on a

pu le vérifier en analysant par électrophorèse

les segments génomiques (fïgure 2, ^échan- tillon 104). ^{Il est} possible que ^ces échan- tillons contenaient aussi des inhibiteurs qui

ont empêché ^le fonctionnement de la RT ou

de la Taq. ^De tels inhibiteurs ont souvent été mis en évidence lors de RT-PCR à _par- tir de fluides biologiques ^et plusieurs

méthodes ont été proposées pour les élimi-

ner et purifier davantage ^le matériel à ana-

lyser. ^D’autre part ^{il est} possible que le test

Elisa ait identifié de

faux positifs ^».

L’analyse par électrophorèse ^en gel ^de polyacrylamide ^des segments génomiques

a indiqué qu’il y avait très _peu d’électro-

phorétypes identiques. ^Les exemples ^{de la} figure ² illustrent le fait que ^{souvent les} dif- férences d’électrophorétypes portent ^{sur un}

ou des segments n’appartenant pas ^au tri-

plet ^7-8-9 qui ^{contient le} gène que ^nous

avons séquencé.

De façon ^{à limiter} l’étendue du séquen-

çage nous avons dans un premier temps ^ana- lysé l’ensemble des 175 séquences ^du gène ⁹

codant pour la protéine ^VP7 présentes ^dans

les bases de données. La comparaison ^des séquences et l’analyse ^{des mutants} d’échap- pement permet de définir trois domaines

antigéniques majeurs A, ^{B et C et neuf} régions ^variables (VR) [7]. Le domaine A coïncide avec la région ^{variable VR 5 et}

s’étend des acides aminés 86 à 101 soit aux

nucléotides 304-352. Aussi nous nous sommes limités au séquençage ^à partir ^de

l’extrémité 5’du gène. Avec l’amorce choi- sie beg9, la ^{même que} celle utilisée _{pour la} RT-PCR, nous avons pu lire les nucléotides

entre les positions ^{29 à} gauche ^{et les} posi-

tions 320-560, (avec ^une moyenne de 427) à droite. La région séquencée représente

environ 40 % du gène. Elle contient le domaine antigénique ^{A et 5 des 9 VR iden-}

tifiées dans la structure primaire ^{de VP7.}

L’extrémité 3’de la région effectivement

séquencée était située entre les nucléotides

320 et 560, c’est-à-dire _{que pour} quelques

échantillons le domaine antigénique ^{A n’a a}

pas été entièrement séquencé.

Malgré ^ces différences de longueurs séquencées nous avons comparé ^l’ensemble

des données obtenues avec une sélection

représentative ^des gènes des différents G-

types grâce ^à l’option ^{PILEUP du} pro- gramme GCG. Comme ^on peut ^{le voir sur le} dendrogramme ^de la. fïgure ^{3 tous les échan-}

tillons analysés ^se regroupent ^{avec les autres} virus qui ^dans la base de données appar- tiennent au génotype ^{G6. La} majorité ^est

encadrée par des virus G6 (par exemple ^les

échantillons 025-096), ^{une minorité} (par exemple les échantillons 122-113) ^se

retrouve en dehors. On peut ^noter que le virus humain G6 (rotvp7h ; [5]) ^{et la} plu- part des isolats de cette étude ont une ori-

gine ^commune.

Cette étude limitée à une seule région ^et

à l’hiver 1997-1998 est la première ^menée

en France pour déterminer les sérotypes ^de

rotavirus bovins. Elle montre que les ^rota- virus de sérotype ^{G6 sont} prévalents ^chez

les bovins et associés à environ la moitié des troubles gastro-entéritiques. ^On peut remarquer qu’aucun ^des prélèvements n’appartenait à l’un des autres sérotypes qui

ont déjà été retrouvés chez les bovins avec en général ^des prévalences plus faibles que pour le sérotype ^{G6. Ce résultat est dans}

une certaine mesure surprenant ^{car les séro-} types ^{G10 et G8 ont} été retrouvés au Japon

et aux États-Unis avec des fréquences ^com- prises ^{entre 20 et 3 %.} L’absence de ces

sérotypes ^{dans notre étude} pourrait ^{être due}

à la limitation géographique ^et temporelle

des prélèvements ^{ou au fait} que les études antérieures étaient fondées sur des approches

indirectes mettant en oeuvre l’hybridation

moléculaire ou la RFLP (restriction frag-

ment length polymorphisrve). ^Le séquençage

d’environ 40 % du gène ^semble plus ^fiable

que ^ces méthodes, qui ^{comme l’électro-} phorèse ^des segments génomiques, ^{ont ten-}

dance à surestimer la disparité ^des prélève-

ments.

La stratégie ^{vaccinale mise en oeuvre}

chez les bovins est fondée sur la vaccina- tion des mères et vise à augmenter ^la concentration en anticorps neutralisants du colostrum et du lait 15, 16]. ^{Il est donc} essentiel que les vaccins contiennent le ou

les antigènes ^des sérotypes rencontrés en

majorité ^sur le terrain. Nos résultats confir-

ment ceux obtenus dans d’autres pays ^euro-

péens [ 14]. ^{Ils semblent} indiquer que des vaccins multivalents ne sont pas nécessaires

et que des antigènes provenant ^{de souches} G6 devraient suffire à protéger ^{les bovins}

des rotaviroses. On peut toutefois souhai-

ter que les vaccins actuellement diffusés en

France spécifient la valence de l’antigène utilisé, ^ce qui ^n’est pas ^encore le cas pour la

grande majorité des vaccins diffusés.

4. REMERCIEMENTS.

Les auteurs remercient M. J. J. Augier, président ^du Groupement de défense sani- taire de l’Allier (03), ^{M. R.} Vernisse, ^direc-

teur du Groupement de défense sanitaire de l’Allier (03), ^{M. P.} Mathévet, D’ vétérinaire à Marcigny (71), ^{M. P.} Duclos, ^{D r vétéri-} naire à Matour (71 ), ^{M. N. Roch D r vétéri-} naire à Montceau les Mines (71 ), ^{M. J.L.}

Laurent, ^{D r} vétérinaire à Épinac (71), M. J. Manière, ^{D r} vétérinaire à Decize (58),

M. O. Salat, ^{D r} vétérinaire à Saint-Flour (15), ^{M. J.M.} Debenest, ^D’ vétérinaire à Saint-Yrieix-La-Perche (87), ^{M. A.} Mey-

rus, D r vétérinaire à Montmarault (03). ).

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