La mise en évidence de la mutation P533R et étude du polymorphisme de l’intron 2 du gène de l’Iduronidase.

Texte intégral

(1)UNIVERSITE MOHAMMED V - SOUISSI FACULTE DE MEDECINE ET DE PHARMACIE –RABAT-. ANNEE: 2013. THESE N°: 73. LA MISE EN ÉVIDENCE DE LA MUTATION P533R ET ÉTUDE DU POLYMORPHISME DE L’INTRON 2 DU GÈNE DE L’IDURONIDASE. THESE. Présentée et soutenue publiquement le:………… PAR. Mme. AGNAOU Rajae Né le 15 Février 1989 à Rabat Pour l''Obtention du Doctorat en Pharmacie MOTS CLES : MPS I, Hurler, polymorphisme de taille, P533R, RFLP, ARMS.. MEMBRES DE JURY Mr. M. KHATTAB Professeur de Pédiatrie.. PRESIDENT. Mr. L. CHABRAOUI Professeur de Biochimie.. RAPPORTEUR. Mme. Y. KRIOUILE Professeur de Pédiatrie. Mme. S. BOUHSAIN Professeur de Biochimie. Mme. N. ALAMI OUAHABI Professeur de Biochimie.. JUGES.

(2) UNIVERSITE MOHAMMED V- SOUISSI FACULTE DE MEDECINE ET DE PHARMACIE - RABAT DOYENS HONORAIRES : 1962 – 1969 : Professeur Abdelmalek FARAJ 1969 – 1974 : Professeur Abdellatif BERBICH 1974 – 1981 : Professeur Bachir LAZRAK 1981 – 1989 : Professeur Taieb CHKILI 1989 – 1997 : Professeur Mohamed Tahar ALAOUI 1997 – 2003 : Professeur Abdelmajid BELMAHI 2003 – 2013 : Professeur Najia HAJJAJ – HASSOUNI ² ADMINISTRATION : Doyen : Professeur Mohamed ADNAOUI Vice Doyen chargé des Affaires Académiques et estudiantines Professeur Mohammed AHALLAT Vice Doyen chargé de la Recherche et de la Coopération Professeur Jamal TAOUFIK Vice Doyen chargé des Affaires Spécifiques à la Pharmacie Professeur Jamal TAOUFIK Secrétaire Général : Mr. El Hassane AHALLAT. PROFESSEURS : Mai et Octobre 1981 Pr. MAAZOUZI Ahmed Wajih Pr. TAOBANE Hamid*. Chirurgie Cardio-Vasculaire ChirurgieThoracique. Mai et Novembre 1982 Pr. ABROUQ Ali* Pr. BENSOUDA Mohamed Pr. BENOSMAN Abdellatif Pr. LAHBABI Naïma. Oto-Rhino-Laryngologie Anatomie Chirurgie Thoracique Physiologie. Novembre 1983 Pr. BELLAKHDAR Fouad Pr. HAJJAJ Najia ép. HASSOUNI. Neurochirurgie Rhumatologie. Décembre 1984 Pr. EL GUEDDARI Brahim El Khalil Pr. MAAOUNI Abdelaziz. Radiothérapie Médecine Interne.

(3) Pr. MAAZOUZI Ahmed Wajdi Pr. SETTAF Abdellatif. Anesthésie -Réanimation Chirurgie. Novembre et Décembre 1985 Pr. BENJELLOUN Halima Pr. BENSAID Younes Pr. EL ALAOUI Faris Moulay El Mostafa Pr. IRAQI Ghali. Cardiologie Pathologie Chirurgicale Neurologie Pneumo-phtisiologie. Janvier, Février et Décembre 1987 Pr. AJANA Ali Pr. CHAHED OUAZZANI Houria Pr. EL YAACOUBI Moradh Pr. ESSAID EL FEYDI Abdellah Pr. LACHKAR Hassan Pr. YAHYAOUI Mohamed. Radiologie Gastro-Entérologie Traumatologie Orthopédie Gastro-Entérologie Médecine Interne Neurologie. Décembre 1988 Pr. BENHAMAMOUCH Mohamed Najib Pr. DAFIRI Rachida Pr. HERMAS Mohamed Pr. TOLOUNE Farida*. Chirurgie Pédiatrique Radiologie Traumatologie Orthopédie Médecine Interne. Décembre 1989 Janvier et Novembre 1990 Pr. ADNAOUI Mohamed Pr. BOUKILI MAKHOUKHI Abdelali* Pr. CHAD Bouziane Pr. CHKOFF Rachid Pr. HACHIM Mohammed* Pr. KHARBACH Aîcha Pr. MANSOURI Fatima Pr. OUAZZANI Taïbi Mohamed Réda Pr. TAZI Saoud Anas. Médecine Interne Cardiologie Pathologie Chirurgicale Pathologie Chirurgicale Médecine-Interne Gynécologie -Obstétrique Anatomie-Pathologique Neurologie Anesthésie Réanimation. Février Avril Juillet et Décembre 1991 Pr. AL HAMANY Zaîtounia Pr. AZZOUZI Abderrahim Pr. BAYAHIA Rabéa Pr. BELKOUCHI Abdelkader Pr. BENABDELLAH Chahrazad Pr. BENCHEKROUN Belabbes Abdellatif Pr. BENSOUDA Yahia Pr. BERRAHO Amina Pr. BEZZAD Rachid Pr. CHABRAOUI Layachi. Anatomie-Pathologique Anesthésie Réanimation Néphrologie Chirurgie Générale Hématologie Chirurgie Générale Pharmacie galénique Ophtalmologie Gynécologie Obstétrique Biochimie et Chimie.

(4) Pr. CHERRAH Yahia Pr. CHOKAIRI Omar Pr. JANATI Idrissi Mohamed* Pr. KHATTAB Mohamed Pr. SOULAYMANI Rachida Pr. TAOUFIK Jamal. Pharmacologie Histologie Embryologie Chirurgie Générale Pédiatrie Pharmacologie Chimie thérapeutique. Décembre 1992 Pr. AHALLAT Mohamed Pr. BENSOUDA Adil Pr. BOUJIDA Mohamed Najib Pr. CHAHED OUAZZANI Laaziza Pr. CHRAIBI Chafiq Pr. DAOUDI Rajae Pr. DEHAYNI Mohamed* Pr. EL OUAHABI Abdessamad Pr. FELLAT Rokaya Pr. GHAFIR Driss* Pr. JIDDANE Mohamed Pr. OUAZZANI TAIBI Med Charaf Eddine Pr. TAGHY Ahmed Pr. ZOUHDI Mimoun. Chirurgie Générale Anesthésie Réanimation Radiologie Gastro-Entérologie Gynécologie Obstétrique Ophtalmologie Gynécologie Obstétrique Neurochirurgie Cardiologie Médecine Interne Anatomie Gynécologie Obstétrique Chirurgie Générale Microbiologie. Mars 1994 Pr. AGNAOU Lahcen Pr. BENCHERIFA Fatiha Pr. BENJAAFAR Noureddine Pr. BEN RAIS Nozha Pr. CAOUI Malika Pr. CHRAIBI Abdelmjid Pr. EL AMRANI Sabah Pr. EL AOUAD Rajae Pr. EL BARDOUNI Ahmed Pr. EL HASSANI My Rachid Pr. EL IDRISSI Lamghari Abdennaceur Pr. ERROUGANI Abdelkader Pr. ESSAKALI Malika Pr. ETTAYEBI Fouad Pr. HADRI Larbi* Pr. HASSAM Badredine Pr. IFRINE Lahssan Pr. JELTHI Ahmed Pr. MAHFOUD Mustapha Pr. MOUDENE Ahmed* Pr. RHRAB Brahim. Ophtalmologie Ophtalmologie Radiothérapie Biophysique Biophysique Endocrinologie et Maladies Métaboliques Gynécologie Obstétrique Immunologie Traumato-Orthopédie Radiologie Médecine Interne Chirurgie Générale Immunologie Chirurgie Pédiatrique Médecine Interne Dermatologie Chirurgie Générale Anatomie Pathologique Traumatologie – Orthopédie Traumatologie- Orthopédie Gynécologie –Obstétrique.

(5) Pr. SENOUCI Karima. Dermatologie. Mars 1994 Pr. ABBAR Mohamed* Pr. ABDELHAK M’barek Pr. BELAIDI Halima Pr. BRAHMI Rida Slimane Pr. BENTAHILA Abdelali Pr. BENYAHIA Mohammed Ali Pr. BERRADA Mohamed Saleh Pr. CHAMI Ilham Pr. CHERKAOUI Lalla Ouafae Pr. EL ABBADI Najia Pr. HANINE Ahmed* Pr. JALIL Abdelouahed Pr. LAKHDAR Amina Pr. MOUANE Nezha. Urologie Chirurgie – Pédiatrique Neurologie Gynécologie Obstétrique Pédiatrie Gynécologie – Obstétrique Traumatologie – Orthopédie Radiologie Ophtalmologie Neurochirurgie Radiologie Chirurgie Générale Gynécologie Obstétrique Pédiatrie. Mars 1995 Pr. ABOUQUAL Redouane Pr. AMRAOUI Mohamed Pr. BAIDADA Abdelaziz Pr. BARGACH Samir Pr. BEDDOUCHE Amoqrane* Pr. CHAARI Jilali* Pr. DIMOU M’barek* Pr. DRISSI KAMILI Med Nordine* Pr. EL MESNAOUI Abbes Pr. ESSAKALI HOUSSYNI Leila Pr. FERHATI Driss Pr. HASSOUNI Fadil Pr. HDA Abdelhamid* Pr. IBEN ATTYA ANDALOUSSI Ahmed Pr. IBRAHIMY Wafaa Pr. MANSOURI Aziz Pr. OUAZZANI CHAHDI Bahia Pr. SEFIANI Abdelaziz Pr. ZEGGWAGH Amine Ali. Réanimation Médicale Chirurgie Générale Gynécologie Obstétrique Gynécologie Obstétrique Urologie Médecine Interne Anesthésie Réanimation Anesthésie Réanimation Chirurgie Générale Oto-Rhino-Laryngologie Gynécologie Obstétrique Médecine Préventive, Santé Publique et Hygiène Cardiologie Urologie Ophtalmologie Radiothérapie Ophtalmologie Génétique Réanimation Médicale. Décembre 1996 Pr. AMIL Touriya* Pr. BELKACEM Rachid Pr. BOULANOUAR Abdelkrim Pr. EL ALAMI EL FARICHA EL Hassan Pr. GAOUZI Ahmed. Radiologie Chirurgie Pédiatrie Ophtalmologie Chirurgie Générale Pédiatrie.

(6) Pr. MAHFOUDI M’barek* Pr. MOHAMMADINE EL Hamid Pr. MOHAMMADI Mohamed Pr. MOULINE Soumaya Pr. OUADGHIRI Mohamed Pr. OUZEDDOUN Naima Pr. ZBIR EL Mehdi*. Radiologie Chirurgie Générale Médecine Interne Pneumo-phtisiologie Traumatologie-Orthopédie Néphrologie Cardiologie. Novembre 1997 Pr. ALAMI Mohamed Hassan Pr. BEN AMAR Abdesselem Pr. BEN SLIMANE Lounis Pr. BIROUK Nazha Pr. CHAOUIR Souad* Pr. DERRAZ Said Pr. ERREIMI Naima Pr. FELLAT Nadia Pr. GUEDDARI Fatima Zohra Pr. HAIMEUR Charki* Pr. KADDOURI Noureddine Pr. KOUTANI Abdellatif Pr. LAHLOU Mohamed Khalid Pr. MAHRAOUI CHAFIQ Pr. NAZI M’barek* Pr. OUAHABI Hamid* Pr. TAOUFIQ Jallal Pr. YOUSFI MALKI Mounia. Gynécologie-Obstétrique Chirurgie Générale Urologie Neurologie Radiologie Neurochirurgie Pédiatrie Cardiologie Radiologie Anesthésie Réanimation Chirurgie Pédiatrique Urologie Chirurgie Générale Pédiatrie Cardiologie Neurologie Psychiatrie Gynécologie Obstétrique. Novembre 1998 Pr. AFIFI RAJAA Pr. BENOMAR ALI Pr. BOUGTAB Abdesslam Pr. ER RIHANI Hassan Pr. EZZAITOUNI Fatima Pr. LAZRAK Khalid * Pr. BENKIRANE Majid* Pr. KHATOURI ALI* Pr. LABRAIMI Ahmed*. Gastro-Entérologie Neurologie Chirurgie Générale Oncologie Médicale Néphrologie Traumatologie Orthopédie Hématologie Cardiologie Anatomie Pathologique. Janvier 2000 Pr. ABID Ahmed* Pr. AIT OUMAR Hassan Pr. BENCHERIF My Zahid Pr. BENJELLOUN Dakhama Badr.Sououd Pr. BOURKADI Jamal-Eddine. Pneumophtisiologie Pédiatrie Ophtalmologie Pédiatrie Pneumo-phtisiologie.

(7) Pr. CHAOUI Zineb Pr. CHARIF CHEFCHAOUNI Al Montacer Pr. ECHARRAB El Mahjoub Pr. EL FTOUH Mustapha Pr. EL MOSTARCHID Brahim* Pr. EL OTMANY Azzedine Pr. HAMMANI Lahcen Pr. ISMAILI Mohamed Hatim Pr. ISMAILI Hassane* Pr. KRAMI Hayat Ennoufouss Pr. MAHMOUDI Abdelkrim* Pr. TACHINANTE Rajae Pr. TAZI MEZALEK Zoubida. Ophtalmologie Chirurgie Générale Chirurgie Générale Pneumo-phtisiologie Neurochirurgie Chirurgie Générale Radiologie Anesthésie-Réanimation Traumatologie Orthopédie Gastro-Entérologie Anesthésie-Réanimation Anesthésie-Réanimation Médecine Interne. Novembre 2000 Pr. AIDI Saadia Pr. AIT OURHROUI Mohamed Pr. AJANA Fatima Zohra Pr. BENAMR Said Pr. BENCHEKROUN Nabiha Pr. CHERTI Mohammed Pr. ECH-CHERIF EL KETTANI Selma Pr. EL HASSANI Amine Pr. EL IDGHIRI Hassan Pr. EL KHADER Khalid Pr. EL MAGHRAOUI Abdellah* Pr. GHARBI Mohamed El Hassan Pr. HSSAIDA Rachid* Pr. LAHLOU Abdou Pr. MAFTAH Mohamed* Pr. MAHASSINI Najat Pr. MDAGHRI ALAOUI Asmae Pr. NASSIH Mohamed* Pr. ROUIMI Abdelhadi. Neurologie Dermatologie Gastro-Entérologie Chirurgie Générale Ophtalmologie Cardiologie Anesthésie-Réanimation Pédiatrie Oto-Rhino-Laryngologie Urologie Rhumatologie Endocrinologie et Maladies Métaboliques Anesthésie-Réanimation Traumatologie Orthopédie Neurochirurgie Anatomie Pathologique Pédiatrie Stomatologie Et Chirurgie Maxillo-Faciale Neurologie. Décembre 2001 Pr. ABABOU Adil Pr. BALKHI Hicham* Pr. BELMEKKI Mohammed Pr. BENABDELJLIL Maria Pr. BENAMAR Loubna Pr. BENAMOR Jouda Pr. BENELBARHDADI Imane Pr. BENNANI Rajae Pr. BENOUACHANE Thami. Anesthésie-Réanimation Anesthésie-Réanimation Ophtalmologie Neurologie Néphrologie Pneumo-phtisiologie Gastro-Entérologie Cardiologie Pédiatrie.

(8) Pr. BENYOUSSEF Khalil Pr. BERRADA Rachid Pr. BEZZA Ahmed* Pr. BOUCHIKHI IDRISSI Med Larbi Pr. BOUHOUCH Rachida Pr. BOUMDIN El Hassane* Pr. CHAT Latifa Pr. CHELLAOUI Mounia Pr. DAALI Mustapha* Pr. DRISSI Sidi Mourad* Pr. EL HIJRI Ahmed Pr. EL MAAQILI Moulay Rachid Pr. EL MADHI Tarik Pr. EL MOUSSAIF Hamid Pr. EL OUNANI Mohamed Pr. ETTAIR Said Pr. GAZZAZ Miloudi* Pr. GOURINDA Hassan Pr. HRORA Abdelmalek Pr. KABBAJ Saad Pr. KABIRI EL Hassane* Pr. LAMRANI Moulay Omar Pr. LEKEHAL Brahim Pr. MAHASSIN Fattouma* Pr. MEDARHRI Jalil Pr. MIKDAME Mohammed* Pr. MOHSINE Raouf Pr. NOUINI Yassine Pr. SABBAH Farid Pr. SEFIANI Yasser Pr. TAOUFIQ BENCHEKROUN Soumia. Dermatologie Gynécologie Obstétrique Rhumatologie Anatomie Cardiologie Radiologie Radiologie Radiologie Chirurgie Générale Radiologie Anesthésie-Réanimation Neuro-Chirurgie Chirurgie-Pédiatrique Ophtalmologie Chirurgie Générale Pédiatrie Neuro-Chirurgie Chirurgie-Pédiatrique Chirurgie Générale Anesthésie-Réanimation Chirurgie Thoracique Traumatologie Orthopédie Chirurgie Vasculaire Périphérique Médecine Interne Chirurgie Générale Hématologie Clinique Chirurgie Générale Urologie Chirurgie Générale Chirurgie Vasculaire Périphérique Pédiatrie. Décembre 2002 Pr. AL BOUZIDI Abderrahmane* Pr. AMEUR Ahmed * Pr. AMRI Rachida Pr. AOURARH Aziz* Pr. BAMOU Youssef * Pr. BELMEJDOUB Ghizlene* Pr. BENZEKRI Laila Pr. BENZZOUBEIR Nadia* Pr. BERNOUSSI Zakiya Pr. BICHRA Mohamed Zakariya Pr. CHOHO Abdelkrim * Pr. CHKIRATE Bouchra. Anatomie Pathologique Urologie Cardiologie Gastro-Entérologie Biochimie-Chimie Endocrinologie et Maladies Métaboliques Dermatologie Gastro-Entérologie Anatomie Pathologique Psychiatrie Chirurgie Générale Pédiatrie.

(9) Pr. EL ALAMI EL FELLOUS Sidi Zouhair Pr. EL BARNOUSSI Leila Pr. EL HAOURI Mohamed * Pr. EL MANSARI Omar* Pr. ES-SADEL Abdelhamid Pr. FILALI ADIB Abdelhai Pr. HADDOUR Leila Pr. HAJJI Zakia Pr. IKEN Ali Pr. ISMAEL Farid Pr. JAAFAR Abdeloihab* Pr. KRIOUILE Yamina Pr. LAGHMARI Mina Pr. MABROUK Hfid* Pr. MOUSSAOUI RAHALI Driss* Pr. MOUSTAGHFIR Abdelhamid* Pr. NAITLHO Abdelhamid* Pr. OUJILAL Abdelilah Pr. RACHID Khalid * Pr. RAISS Mohamed Pr. RGUIBI IDRISSI Sidi Mustapha* Pr. RHOU Hakima Pr. SIAH Samir * Pr. THIMOU Amal Pr. ZENTAR Aziz*. Chirurgie Pédiatrique Gynécologie Obstétrique Dermatologie Chirurgie Générale Chirurgie Générale Gynécologie Obstétrique Cardiologie Ophtalmologie Urologie Traumatologie Orthopédie Traumatologie Orthopédie Pédiatrie Ophtalmologie Traumatologie Orthopédie Gynécologie Obstétrique Cardiologie Médecine Interne Oto-Rhino-Laryngologie Traumatologie Orthopédie Chirurgie Générale Pneumophtisiologie Néphrologie Anesthésie Réanimation Pédiatrie Chirurgie Générale. Janvier 2004 Pr. ABDELLAH El Hassan Pr. AMRANI Mariam Pr. BENBOUZID Mohammed Anas Pr. BENKIRANE Ahmed* Pr. BOUGHALEM Mohamed* Pr. BOULAADAS Malik Pr. BOURAZZA Ahmed* Pr. CHAGAR Belkacem* Pr. CHERRADI Nadia Pr. EL FENNI Jamal* Pr. EL HANCHI ZAKI Pr. EL KHORASSANI Mohamed Pr. EL YOUNASSI Badreddine* Pr. HACHI Hafid Pr. JABOUIRIK Fatima Pr. KARMANE Abdelouahed Pr. KHABOUZE Samira Pr. KHARMAZ Mohamed. Ophtalmologie Anatomie Pathologique Oto-Rhino-Laryngologie Gastro-Entérologie Anesthésie Réanimation Stomatologie et Chirurgie Maxillo-faciale Neurologie Traumatologie Orthopédie Anatomie Pathologique Radiologie Gynécologie Obstétrique Pédiatrie Cardiologie Chirurgie Générale Pédiatrie Ophtalmologie Gynécologie Obstétrique Traumatologie Orthopédie.

(10) Pr. LEZREK Mohammed* Pr. MOUGHIL Said Pr. SASSENOU ISMAIL* Pr. TARIB Abdelilah* Pr. TIJAMI Fouad Pr. ZARZUR Jamila. Urologie Chirurgie Cardio-Vasculaire Gastro-Entérologie Pharmacie Clinique Chirurgie Générale Cardiologie. Janvier 2005 Pr. ABBASSI Abdellah Pr. AL KANDRY Sif Eddine* Pr. ALAOUI Ahmed Essaid Pr. ALLALI Fadoua Pr. AMAZOUZI Abdellah Pr. AZIZ Noureddine* Pr. BAHIRI Rachid Pr. BARKAT Amina Pr. BENHALIMA Hanane Pr. BENHARBIT Mohamed Pr. BENYASS Aatif Pr. BERNOUSSI Abdelghani Pr. CHARIF CHEFCHAOUNI Mohamed Pr. DOUDOUH Abderrahim* Pr. EL HAMZAOUI Sakina Pr. HAJJI Leila Pr. HESSISSEN Leila Pr. JIDAL Mohamed* Pr. KARIM Abdelouahed Pr. KENDOUSSI Mohamed* Pr. LAAROUSSI Mohamed Pr. LYAGOUBI Mohammed Pr. NIAMANE Radouane* Pr. RAGALA Abdelhak Pr. SBIHI Souad Pr. TNACHERI OUAZZANI Btissam Pr. ZERAIDI Najia. Chirurgie Réparatrice et Plastique Chirurgie Générale Microbiologie Rhumatologie Ophtalmologie Radiologie Rhumatologie Pédiatrie Stomatologie et Chirurgie Maxillo Faciale Ophtalmologie Cardiologie Ophtalmologie Ophtalmologie Biophysique Microbiologie Cardiologie Pédiatrie Radiologie Ophtalmologie Cardiologie Chirurgie Cardio-vasculaire Parasitologie Rhumatologie Gynécologie Obstétrique Histo-Embryologie Cytogénétique Ophtalmologie Gynécologie Obstétrique. Décembre 2005 Pr. CHANI Mohamed. Anesthésie Réanimation. Avril 2006 Pr. ACHEMLAL Lahsen* Pr. AKJOUJ Said* Pr. BELMEKKI Abdelkader* Pr. BENCHEIKH Razika Pr. BIYI Abdelhamid*. Rhumatologie Radiologie Hématologie O.R.L Biophysique.

(11) Pr. BOUHAFS Mohamed El Amine Pr. BOULAHYA Abdellatif* Pr. CHENGUETI ANSARI Anas Pr. DOGHMI Nawal Pr. ESSAMRI Wafaa Pr. FELLAT Ibtissam Pr. FAROUDY Mamoun Pr. GHADOUANE Mohammed* Pr. HARMOUCHE Hicham Pr. HANAFI Sidi Mohamed* Pr. IDRISS LAHLOU Amine Pr. JROUNDI Laila Pr. KARMOUNI Tariq Pr. KILI Amina Pr. KISRA Hassan Pr. KISRA Mounir Pr. LAATIRIS Abdelkader* Pr. LMIMOUNI Badreddine* Pr. MANSOURI Hamid* Pr. OUANASS Abderrazzak Pr. SAFI Soumaya* Pr. SEKKAT Fatima Zahra Pr. SOUALHI Mouna Pr. TELLAL Saida* Pr. ZAHRAOUI Rachida. Chirurgie - Pédiatrique Chirurgie Cardio – Vasculaire Gynécologie Obstétrique Cardiologie Gastro-entérologie Cardiologie Anesthésie Réanimation Urologie Médecine Interne Anesthésie Réanimation Microbiologie Radiologie Urologie Pédiatrie Psychiatrie Chirurgie – Pédiatrique Pharmacie Galénique Parasitologie Radiothérapie Psychiatrie Endocrinologie Psychiatrie Pneumo – Phtisiologie Biochimie Pneumo – Phtisiologie. Octobre 2007 Pr. ABIDI Khalid Pr. ACHACHI Leila Pr. ACHOUR Abdessamad* Pr. AIT HOUSSA Mahdi* Pr. AMHAJJI Larbi* Pr. AMMAR Haddou Pr. AOUFI Sarra Pr. BAITE Abdelouahed* Pr. BALOUCH Lhousaine* Pr. BENZIANE Hamid* Pr. BOUTIMZIANE Nourdine Pr. CHARKAOUI Naoual* Pr. EHIRCHIOU Abdelkader* Pr. ELABSI Mohamed Pr. EL BEKKALI Youssef* Pr. EL MOUSSAOUI Rachid Pr. EL OMARI Fatima Pr. GANA Rachid. Réanimation médicale Pneumo phtisiologie Chirurgie générale Chirurgie cardio vasculaire Traumatologie orthopédie ORL Parasitologie Anesthésie réanimation Biochimie-chimie Pharmacie clinique Ophtalmologie Pharmacie galénique Chirurgie générale Chirurgie générale Chirurgie cardio vasculaire Anesthésie réanimation Psychiatrie Neuro chirurgie.

(12) Pr. GHARIB Noureddine Pr. HADADI Khalid* Pr. ICHOU Mohamed* Pr. ISMAILI Nadia Pr. KEBDANI Tayeb Pr. LALAOUI SALIM Jaafar* Pr. LOUZI Lhoussain* Pr. MADANI Naoufel Pr. MAHI Mohamed* Pr. MARC Karima Pr. MASRAR Azlarab Pr. MOUSSAOUI Abdelmajid Pr. MOUTAJ Redouane * Pr. MRABET Mustapha* Pr. MRANI Saad* Pr. OUZZIF Ez zohra* Pr. RABHI Monsef* Pr. RADOUANE Bouchaib* Pr. SEFFAR Myriame Pr. SEKHSOKH Yessine* Pr. SIFAT Hassan* Pr. TABERKANET Mustafa* Pr. TACHFOUTI Samira Pr. TAJDINE Mohammed Tariq* Pr. TANANE Mansour* Pr. TLIGUI Houssain Pr. TOUATI Zakia. Chirurgie plastique et réparatrice Radiothérapie Oncologie médicale Dermatologie Radiothérapie Anesthésie réanimation Microbiologie Réanimation médicale Radiologie Pneumo phtisiologie Hématologique Anesthésier réanimation Parasitologie Médecine préventive santé publique et hygiène Virologie Biochimie-chimie Médecine interne Radiologie Microbiologie Microbiologie Radiothérapie Chirurgie vasculaire périphérique Ophtalmologie Chirurgie générale Traumatologie orthopédie Parasitologie Cardiologie. Décembre 2008 Pr ZOUBIR Mohamed* Pr TAHIRI My El Hassan*. Anesthésie Réanimation Chirurgie Générale. PROFESSEURS AGREGES : Mars 2009 Pr. ABOUZAHIR Ali* Pr. AGDR Aomar* Pr. AIT ALI Abdelmounaim* Pr. AIT BENHADDOU El hachmia Pr. AKHADDAR Ali* Pr. ALLALI Nazik Pr. AMAHZOUNE Brahim* Pr. AMINE Bouchra Pr. AZENDOUR Hicham* Pr. BELYAMANI Lahcen*. Médecine interne Pédiatre Chirurgie Générale Neurologie Neuro-chirurgie Radiologie Chirurgie Cardio-vasculaire Rhumatologie Anesthésie Réanimation Anesthésie Réanimation.

(13) Pr. BJIJOU Younes Pr. BOUHSAIN Sanae* Pr. BOUI Mohammed* Pr. BOUNAIM Ahmed* Pr. BOUSSOUGA Mostapha* Pr. CHAKOUR Mohammed * Pr. CHTATA Hassan Toufik* Pr. DOGHMI Kamal* Pr. EL MALKI Hadj Omar Pr. EL OUENNASS Mostapha* Pr. ENNIBI Khalid* Pr. FATHI Khalid Pr. HASSIKOU Hasna * Pr. KABBAJ Nawal Pr. KABIRI Meryem Pr. KADI Said * Pr. KARBOUBI Lamya Pr. L’KASSIMI Hachemi* Pr. LAMSAOURI Jamal* Pr. MARMADE Lahcen Pr. MESKINI Toufik Pr. MESSAOUDI Nezha * Pr. MSSROURI Rahal Pr. NASSAR Ittimade Pr. OUKERRAJ Latifa Pr. RHORFI Ismail Abderrahmani * Pr. ZOUHAIR Said*. Anatomie Biochimie-chimie Dermatologie Chirurgie Générale Traumatologie orthopédique Hématologie biologique Chirurgie vasculaire périphérique Hématologie clinique Chirurgie Générale Microbiologie Médecine interne Gynécologie obstétrique Rhumatologie Gastro-entérologie Pédiatrie Traumatologie orthopédique Pédiatrie Microbiologie Chimie Thérapeutique Chirurgie Cardio-vasculaire Pédiatrie Hématologie biologique Chirurgie Générale Radiologie Cardiologie Pneumo-phtisiologie Microbiologie. Octobre 2010 Pr. ALILOU Mustapha Pr. AMEZIANE Taoufiq* Pr. BELAGUID Abdelaziz Pr. BOUAITY Brahim* Pr. CHADLI Mariama* Pr. CHEMSI Mohamed* Pr. CHERRADI Ghizlan Pr. DAMI Abdellah* Pr. DARBI Abdellatif* Pr. DENDANE Mohammed Anouar Pr. EL HAFIDI Naima Pr. EL KHARRAS Abdennasser* Pr. EL MAZOUZ Samir Pr. EL SAYEGH Hachem Pr. ERRABIH Ikram Pr. LAMALMI Najat. Anesthésie réanimation Médecine interne Physiologie ORL Microbiologie Médecine aéronautique Cardiologie Biochimie chimie Radiologie Chirurgie pédiatrique Pédiatrie Radiologie Chirurgie plastique et réparatrice Urologie Gastro entérologie Anatomie pathologique.

(14) Pr. LEZREK Mounir Pr. MALIH Mohamed* Pr. MOSADIK Ahlam Pr. MOUJAHID Mountassir* Pr. NAZIH Mouna* Pr. RAISSOUNI Zakaria* Pr. ZOUAIDIA Fouad. Ophtalmologie Pédiatrie Anesthésie Réanimation Chirurgie générale Hématologie Traumatologie Orthopédie Anatomie pathologique. Mai 2012 Pr. Abdelouahed AMRANI Pr. ABOUELALAA Khalil* Pr. Ahmed JAHID Pr. BELAIZI Mohamed* Pr. BENCHEBBA Drissi* Pr. DRISSI Mohamed* Pr. EL KHATTABI Abdessadek* Pr. EL OUAZZANI Hanane* Pr. MEHSSANI Jamal* Pr. Mouna EL ALAOUI MHAMDI Pr. Mounir ER-RAJI Pr. RAISSOUNI Maha*. Chirurgie Pédiatrique Anesthésie Réanimation Anatomie Pathologique Psychiatrie Traumatologie Orthopédique Anesthésie Réanimation Médecine Interne Pneumophtisiologie Psychiatrie Chirurgie Générale Chirurgie Pédiatrique Cardiologie. ENSEIGNANTS SCIENTIFIQUES PROFESSEURS Pr. ABOUDRAR Saadia Pr. ALAMI OUHABI Naima Pr. ALAOUI KATIM Pr. ALAOUI SLIMANI Lalla Naïma Pr. ANSAR M’hammed Pr. BOUHOUCHE Ahmed Pr. BOUKLOUZE Abdelaziz Pr. BOURJOUANE Mohamed Pr. CHAHED OUAZZANI Lalla Chadia Pr. DAKKA Taoufiq Pr. DRAOUI Mustapha Pr. EL GUESSABI Lahcen Pr. ETTAIB Abdelkader Pr. FAOUZI Moulay El Abbes Pr. HAMZAOUI Laila Pr. HMAMOUCHI Mohame Pr. IBRAHIMI Azeddine Pr. KHANFRI Jamal Eddine Pr. OULAD BOUYAHYA IDRISSI Med Pr. REDHA Ahlam Pr. TOUATI Driss. Physiologie Biochimie Pharmacologie Histologie-Embryologie Chimie Organique et Pharmacie Chimique Génétique Humaine Applications Pharmaceutiques Microbiologie Biochimie Physiologie Chimie Analytique Pharmacognosie Zootechnie Pharmacologie Biophysique Chimie Organique Biotechnologie Biologie Chimie Organique Biochimie Pharmacognosie.

(15) Pr. ZAHIDI Ahmed Pr. ZELLOU Amina *Enseignants Militaires. Pharmacologie Chimie Organique.

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(17) Dédicaces.

(18) A Mes très chers parents : Tous les mots du monde ne sauraient exprimer l’immense amour que je vous porte, la profonde gratitude que je vous témoigne pour tous vos. efforts et sacrifices. Vous avez. toujours été présents et généreux et c’est à travers vos prières et vos encouragements que j’ai opté pour cette noble profession. J’espère avoir répondu aux espoirs que vous avez placés en moi. Ce modeste travail est aussi le votre. Puisse dieu tout puissant vous restituer un minimum de ce que je vous dois. A mon cher frère Yassine et ma chère sœur Amal : J’espère avoir été à la hauteur de votre estime, que ce travail soit le témoignage mes sentiments les plus chers. Je vous exprime mon grand amour et mes vœux de bonheur et de réussite. A mon cher mari Noureddine : Pour ton soutien moral et tes encouragements qui m’ont poussé vers l’avant, j’espère espérances.. avoir été à la hauteur de tes.

(19) A Tous les membres de la famille AGNAOU : Je vous dédie ce travail avec tous mes vœux de bonheur et de longue vie. A Tous les membres de la famille El JASTMI: Je vous dédie ce travail avec l’expression de mon profond dévouement et tout mon attachement. A Tous les membres de la famille ZEDDOU : Je vous dédie ce travail en vous souhaite une vie pleine de santé et de bonheur. A mes très chères amies : Chaimae, Rahima, Nisserine, Hayat, Zakiya, Rabab, Ghyzlane… J’aurais toujours à l’esprit le souvenir des agréables années d’études, des inoubliables moments vécus ensemble. Puisse Dieu vous protéger..

(20) A Tous Mes maîtres et Professeurs. A tous ceux qui ont contribué à l'élaboration de ce travail, en particulier au personnel du laboratoire de Chimie Biochimie Biologie Biologie moléculaire et ceux du plateau technique de recherche. A tous ceux connus ou inconnus qui vont feuilleter un jour ce travail..

(21) Remerciements.

(22) A notre maître et président de thèse Monsieur KHATTAB Mohammed Professeur de Pédiatrie. En présidant ce jury, vous nous faites un grand honneur.. Votre compétence, votre rigueur et vos qualités humaines sont exemplaires.. Veuillez trouver, cher maître, dans ce modeste travail, l’expression de notre très haute considération et notre profonde gratitude..

(23) A notre maître et rapporteur de thèse Monsieur CHABRAOUI Layachi Professeur de Biochimie. Cher maitre, préparer ce travail sous votre direction a été pour nous un grand honneur et un véritable privilège. Les qualités tant humaines que professionnelles qui sont les vôtres ne sont plus à présenter, elles font depuis des années votre réputation.. Nous espérons a travers notre travail être à la hauteur de votre confiance et de vos attentes, veuillez y trouver l’expression de notre plus sincère reconnaissance..

(24) A notre maître et juge de thèse Madame KRIOUILE Yamna Professeur de pédiatrie. C’est un réel plaisir et un honneur pour nous de vous compter parmi les membres de ce jury de thèse.. En dépit de vos nombreuses occupations vous avez accepté de venir juger ce travail.. Veuillez trouver, chère maître, l’expression de notre très haute considération et notre profonde gratitude..

(25) A notre maître et juge de thèse Madame BOUHSAIN Sanae Professeur de Biochimie. Nous vous remercions sincèrement de l’honneur que vous nous faites en siégeant dans notre jury.. Votre sérieux, vos compétences et vos qualités humaines et intellectuelles n'ont cessé de susciter ma grande admiration.. Que ce travail soit pour nous l’occasion de vous exprimer notre gratitude et notre profond respect..

(26) A notre maître et juge de thèse Madame ALAMI OUAHABI Naima Professeur de Biochimie.. Nous sommes infiniment sensible à l’honneur que vous faites en acceptant de juger nôtre thèse.. Votre. rigueur. et. dévouement. sont. pour. nous. source. d’admiration et de profond respect.. Veuillez. trouver,. chère. maître,. l’expression. reconnaissance et notre profonde estime.. de. notre.

(27) LISTE DES ABREVIATIONS :. IDUA. :. Gène de l’iduronidase.. RFLP. :. Restriction Fragment Lenght Polymorphism. MPS I. :. Mucopolysaccharidose de type I MPS I. DS. :. Dermane-sulfate. HS. :. Héparane-sulfate. ARMS. :. Amplification-refractory mutation system.. PCR. :. Polymerase chain reaction. ADN. :. Acide désoxyribonucléique. VNTR. :. Variable number of tandem repeats. BET. :. Bromure d’éthidium. TBE. :. Tampon Tris, Borate, EDTA. UV. :. Ultraviolet. DMSO. :. Diméthylsulfoxyde.

(28) LISTE DES FIGURES :. Figure 1 : Répartition des étudiants selon le sexe. Figure 2 : Répartition des étudiants selon l’origine géographique. Figure 3 : Principe schématique de la PCR . Figure 4 : Photo d’une migration électrophorétique des produits d’amplification du VNTR de l’intron 2 sur gel d’agarose à 2%. Figure 5: Principe de la Technique RFLP Figure 6 : Profils élecrophorétiques de quelques échantillons étudiés. Figure 7 : Répartition des différents haplotypes de l’intron 2 du gène IDUA « chez la population marocaine ». Figure 8 : Répartition des différents allèles de l’intron 2 du gène IDUA « chez la population marocaine » Figure 9 : Profil élecrophorétique d’un échantillon normal et d’un échantillon muté après digestion enzymatique. Figure 10 : Profil élecrophorétique d’un échantillon normal et d’un échantillon muté après amplification par amorces spècifiques. Figure 11 : Résultat du séquençage d’un patient Hurler homozygote pour la mutation P533R Figure 12 : Résultat du séquençage du patient Hurler hétérozygote pour la mutation P533R Figure 13 : Localisation du gène IDUA.

(29) Figure 14 : Morphotype d’une enfant atteinte de la maladie de Hurler Figure 15 : Anomalies lymphocytaires observé sur un frottis sanguin. Figure 16 : profil électrophorétique de mucopolysaccharides sur plaque d’acétate de cellulose. Figure 17 : shémas résumant les étapes nécessaires à l’isolement des GaG’s à partir des urines. Figure 18 : Localisation de la mutation P533R LISTE DES TABLEAUX: Tableau I : Résultats de l’étude des génotypes du polymorphisme de taille Tableau II : Résultats de l’étude de la fréquence des allèles du polymorphisme de taille Tableau III : Maladies de surcharge lysosomale et anomalies cytologiques Tableau IV : valeur usuelles du dosage des GAG's urinaires par la méthode du DMB en fonction de l’âge. Tableau V : valeur usuelles de l’activité enzymatique des enzymes lysosomales.

(30) TABLE DES MATIERES :. I.. INTRODUCTION …………………………………………………..……2. II.. MATERIELS ET METHODES……………………………………..……3. 1. La population d’étude …………………………..………………...…..…4 2. Méthodes ………………………………………………………….......…6 2.1.. Etude du polymorphisme de taille.….……………..…………....…7. 2.1.1. Amplification de l’ADN cible………………………………….7 2.1.2. Electrophorèse sur Gel d’Agarose………………………….…11 2.2.. Technique de recherche de la mutation P533R par RFLP………..13. 2.2.1. Amplification de l’ADN cible………………………….……..13 2.2.2. Digestion enzymatique……………………………………......14 2.2.3. Electrophorèse sur Gel d’Agarose ...……………….…………17 2.3.. Technique de recherche de la mutation P533R par ARMS……....18. 2.3.1. Principe de la technique ARMS ………………………………18 2.3.2. Amplification de l’ADN cible……………………………...…18 2.3.3. Electrophorèse sur Gel d’Agarose……………………….……19 III.. RESULTATS. 1. Etude du polymorphisme de taille de l’intron 2…………………..……..21 2. Recherche de la mutation P533R par RFLP ……………...…………….25 3. Recherche de la mutation P533R par ARMS …………….…………….26 4. Résultats du séquençage de l’exon 11 des 4 patients Hurler……………27 IV.. DISCUSSION. A. Aspect analytique………………………………………….…………......30.

(31) B. Apport du travail au niveau marocain………………….………………...32 1. Intérêt de l’étude du polymorphisme de taille de l’intron..……………..32 1.1.. Les répétitions en tandem. ………………………………..……...32. 1.2.. Interprétation des résultats obtenus…………………..….……….34. 2. Intérêt de la recherche de la mutation P533R …………….…………...35 2.1.. Sur le plan clinique ………………………………………...…….36. 2.2.. Sur le plan biologique…………………………………………….40 2.2.1. Examens biologiques d’orientation ……………………..……40 2.2.2. Examens biologiques de confirmation ……………….…......42. 2.3.. Sur le plan moléculaire…………………………………….….….48 2.3.1. Apport de l’étude moléculaire (génétique) à la MPS I……....48 2.3.2. Interprétation des résultats obtenus pour la mise au point de la technique de recherche de la mutation P533R ……………….49. 2.4.. Sur le plan thérapeutique……………………………………….....51 2.4.1. Traitement symptomatique …………………………………..51 2.4.2. Le traitement spécifique ……………………………………...53. 3. Limite du travail ……………………………………...………………...56. V.. CONCLUSION…………………………………………..…………… ..58. RESUMES………………………………………………….…………………..61 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES………………………………..……..65.

(32) Mise en évidence de la mutation P533R et étude du polymorphisme de l’intron 2 du gène de l’iduronidase.. 1.

(33) Mise en évidence de la mutation P533R et étude du polymorphisme de l’intron 2 du gène de l’iduronidase.. L’alpha-L-iduronidase est une enzyme lysosomale qui intervient dans le catabolisme des glycosaminoglycanes. Son déficit est responsable de la mucopolysaccharidose de type I (MPS I), une maladie héréditaire du métabolisme qui se transmet selon le mode autosomique récessif. Il y a trois types d’expression clinique. La maladie d’Hurler est le phénotype sévère, la maladie de Scheie est la forme modérée et une forme intermédiaire appelée syndrome de Hurler-Scheie. Le déficit en α-L-Iduronidase est responsable de l’accumulation lysosomique progressive du dermane-sulfate (DS) et de l’héparane-sulfate (HS) [1]. Ces glycosaminoglycanes sont éliminés dans les urines où leur étude permet d’orienter le diagnostic de la maladie. Celui-ci est confirmé par la mise en évidence de la diminution de l’activité enzymatique dans les leucocytes. L’α-L-Iduronidase est codée par le gène de l’iduronidase (IDUA) situé sur le bras court du chromosome 4 (4p16.3) [2]. Plus de 100 mutations du gène IDUA ont été identifiées, mais l’étude de ce gène chez les patients Marocains atteints de mucopolysaccharidose de type I (MPS I) a montré que la mutation P533R est présente chez la majorité d’entre eux [3]. Il s’agit d’une mutation ponctuelle (CCG =>CGG) qui conduit à la substitution d’un acide aminé neutre (la proline) par un acide aminé basique (l’arginine) en position 533 de la protéine IDUA. Le but de notre travail est de contribuer à l’étude du gène IDUA en mettant au point une méthode simple de recherche de la mutation P533R et en étudiant le polymorphisme de taille (VNTR) décrit par Scott au niveau de l’intron 2 du gène IDUA [4].. 2.

(34) Mise en évidence de la mutation P533R et étude du polymorphisme de l’intron 2 du gène de l’iduronidase.. Notre étude a été réalisée au sein du laboratoire de biochimie et du plateau technique de recherche de la faculté de médecine et de pharmacie de Rabat, durant une période de 9 mois.. 3.


(36) Mise en évidence de la mutation P533R et étude du polymorphisme de l’intron 2 du gène de l’iduronidase.. 1. La population d’étude : Elle comporte 75 étudiants de la section pharmacie de la faculté de médecine et de pharmacie Rabat ainsi que 4 patients atteint de la maladie d’Hurler. Le consentement a été obtenu de la famille de chaque patient et une fiche de consentement éclairée a été remplie par chaque étudiant (Annexe). Elle renferme des renseignements tels que : le nom, le lieu de naissance, la région d’origine… Critères d’inclusion à l’étude : • L’étudiant doit être inscrit à la faculté de médecine et de pharmacie de Rabat au sein de la section pharmacie. • Le patient doit être confirmé portant la mutation P533R. Caractéristiques de la population d’étude : • Répartition de la population en fonction du sexe : Sur un effectif de 75 étudiants, les sujets féminins représentent plus que la moitié, soit (44/75), alors que les sujets masculins ne représentent que 41,33% (31/75). Le sexe ratio M/F est de 0,70 (Figure 1).. 5.

(37) Mise en évidence de la mutation P533R et étude du polymorphisme de l’intron 2 du gène de l’iduronidase.. Répartition des étudiants selon le sexe. 41% masculin 59%. féminin. Figure 1 : Répartition des étudiants selon le sexe. • Répartition de la population d’étude selon la tranche d’âge : - La tranche d’âge âge des étudiants varie entre 20 et 25 ans. - Les 4 patients Hurler sont âgés de 4 à 13 ans. • Répartition de la population selon l’origine géographique - Les es origines géographiques des es étudiants de la section pharmacie de Rabat sont représentées dans la figure ci-dessous: ci. 6.

(38) Mise en évidence de la mutation P533R et étude du polymorphisme de l’intron 2 du gène de l’iduronidase.. Figure 2 : Répartition des étudiants selon l’origine géographique.. 2. Méthodes : Nous avons réalisé cette étude en deux parties : - La première partie consistait à étudier le polymorphisme de taille présent au niveau de l’intron 2 du gène IDUA chez la population phénotypiquement saine. - La deuxième partie consistait à mettre en place une technique de diagnostic moléculaire de la maladie de Hurler en recherchant la mutation P533R, puis à vérifier l’efficacité de la technique mise en place grâce aux patients confirmés atteints de la maladie d’Hurler et portant la mutation P533R. 7.

(39) Mise en évidence de la mutation P533R et étude du polymorphisme de l’intron 2 du gène de l’iduronidase.. 2.1. Etude du polymorphisme de taille : Pour étudier le polymorphisme de taille présent au niveau de l’intron 2 du gène IDUA, nous avons réalisé des PCR à partir des ADN déjà préparés selon le protocole décrit par M. Max Bwanga (thèse de Pharmacie n°60, 2012). Les produits d’amplification obtenus sont ensuite séparés et identifiés par électrophorèse. 2.1.1. Amplification d’ADN cible (PCR) : • Principe : La PCR (Polymerase Chain Reaction) fut inventée par K. Mullis en 1983 et brevetée en 1985. Son principe repose sur l’utilisation de l’ADN polymérase pour répliquer in vitro des séquences précises d’ADN. Cette méthode permet d’obtenir, à partir d’un échantillon complexe et peu abondant, d’importantes quantités d’un fragment d’ADN spécifique et de longueur définie. Chaque cycle de PCR est constitué de trois étapes : - Une dénaturation : c’est une étape qui permet de séparer les deux brins d’ADN par élévation de la température. - Une hybridation : c’est une étape où les amorces vont reconnaitre leur site complémentaire et vont s’y fixer par des liaisons hydrogène. - Une élongation : c’est une étape qui permet à la Taq polymérase de synthétiser le brin complémentaire à l’ADN matrice, grâce aux dNTPs libres présents dans le milieu réactionnel. 8.

(40) Mise en évidence de la mutation P533R et étude du polymorphisme de l’intron 2 du gène de l’iduronidase.. Ce cycle est répété un grand nombre de fois pour obtenir une multiplication exponentielle de la séquence d’ADN cible (Figure 3).. Figure 3 : Principe schématique de la PCR [5].. 9.

(41) Mise en évidence de la mutation P533R et étude du polymorphisme de l’intron 2 du gène de l’iduronidase.. • Protocole : La composition pour un volume de PCR de 50µl est la suivante : Tampon taq (5X) : 10 µl Mgcl2 25mM. : 5 µl. Le primer (F-I2). : 1 µl. Le primer (R-I2). : 1 µl. d-NTP. : 1 µl. Eau (ultra pure). : 30,5 µl. Taq polymérase. : 0,5 µl. Echantillon d’ADN : 1 µl. Les échantillons ainsi préparés sont placés dans un thermocycleur (HVD Life sciences Qantaus®). Le paramétrage de l’appareil est réglé comme suit : - Préchauffage de la plaque du couvercle du thermocycleur à 112°C. - La dénaturation à 95°C. - L’hybridation à 57°C. - L’élongation à 72°C.. Le fragment de gène que nous allons amplifier est de 714pb. Il se caractérise par la présence d’un VNTR « variable number of tandem repeats »,. 10.

(42) Mise en évidence de la mutation P533R et étude du polymorphisme de l’intron 2 du gène de l’iduronidase.. C’est un emplacement dans le gène où une courte séquence nucléotidique est organisée comme une répétition en tandem. La séquence nucléotidique qui se répète est constituée d’un fragment de 86pb. On distingue 3 allèles pour l’intron 2 en fonction de l’absence du fragment de 86pb (marqué en rouge) ou de sa présence en un ou en deux exemplaires. Allèle G : 714pb. (Séquence nucléotidique de 86pb répétée). 11.

(43) Mise en évidence de la mutation P533R et étude du polymorphisme de l’intron 2 du gène de l’iduronidase.. Allèle M : 628 pb (séquence nucléotidique en un seul exemplaire). Allèle P : 542pb. (Séquence nucléotidique est absente). 12.

(44) Mise en évidence de la mutation P533R et étude du polymorphisme de l’intron 2 du gène de l’iduronidase.. 2.1.2. Electrophorèse sur Gel d’Agarose : L’électrophorèse est une technique physicochimique qui sépare des constituants ionisés dans un champ électrique. Elle est utilisée le plus souvent dans un but analytique mais également pour purifier des molécules solubles. Depuis une vingtaine d’année, le développement de nouveaux supports (gels de polyacrylamide, d’agarose et capillaires de silice) comme champ migratoire a donné à l’électrophorèse un nouvel essor. Il convient toutefois de distinguer les techniques utilisées par un laboratoire d’analyses de routine, qui reposent sur l’utilisation de kits (techniques semi- ou totalement automatisées), de celles pratiquées dans un laboratoire de recherche nécessitant une phase de mise au point [6]. • Principe de l’électrophorèse de l’ADN: L’électrophorèse de l’ADN est effectuée dans un gel d’agarose creusé de puits où seront déposées les échantillons d’ADN (produits PCR) à analyser. Le gel plonge dans un tampon alcalin (pH 8.6). Dans ces conditions l’ADN qui s’ionise sur ses groupements phosphates est chargé négativement et migre vers l’anode. Le déplacement de l’ADN dans le gel poreux sous le champ électrique est proportionnel à la taille des fragments d’ADN qui sont donc séparés en fonction de leur taille, exprimée en paires de bases (pb). Les petits fragments migrent plus rapidement que les plus grands. Afin de repérer les fragments par leur taille, on dépose dans l’un des puits du gel, un marqueur de poids qui est formé par un mélange de fragments de tailles connues. Les marqueurs commercialisés sont souvent obtenus par digestion d’ADN identifié par une enzyme de restriction [6]. 13.

(45) Mise en évidence de la mutation P533R et étude du polymorphisme de l’intron 2 du gène de l’iduronidase.. • Protocole utilisé : Nous avons utilisé l’électrophorèse sur gel d’agarose pour identifier et contrôler les produits d’amplification par PCR. Cette séparation s'effectue dans un tampon TBE à travers la matrice du gel d'agarose additionné de Bromure d’éthidium (BET), agent intercalant d’une grande sensibilité, la détection de la fluorescence s’effectuant sous UV [6]. L'action d'intercalation de cette substance est à l'origine d'effets mutagènes importants, pouvant être également cancérigènes et tératogènes. L'exposition est relativement faible lors de la manipulation des gels, ce qui ne dispense pas de porter impérativement des gants. Le gel d’agarose à 2% est préparé dans le tampon TBE 1X. Les conditions d’électrophorèse que nous avons utilisées sont : - Tension : le voltage 60 volts. - Temps de migration : une heure. Dans ces conditions le courant généré est de 35 mA. A la fin de la migration le gel est retiré de la cuve et placé dans la chambre de visualisation sous lumière UV. L’image est capturée à l’aide d’une caméra et traitée par ordinateur (Figure 4).. 14.

(46) Mise en évidence de la mutation P533R et étude du polymorphisme de l’intron 2 du gène de l’iduronidase.. Figure 4: Photo d’une migration électrophorétique des produits d’amplification du VNTR de l’intron 2 sur gel d’agarose à 2%.. 2.2. Technique de recherche de la mutation P533R par RFLP : Pour mettre en place une technique de recherche de la mutation P533R, qui permettrait de diagnostiquer la maladie de Hurler sans faire de séquençage, nous avons procédé comme suit. 2.2.1. Amplification de l’ADN cible (PCR) : • Protocole : La composition pour un volume de PCR de 50µl est la suivante : Tampon taq (5X) : 10 µl MgCl2 25mM DMSO Le primer (F-11). : 5 µl : 5 µl : 1 µl 15.

(47) Mise en évidence de la mutation P533R et étude du polymorphisme de l’intron 2 du gène de l’iduronidase.. Le primer (R-12). : 1 µl. d-NTP. : 1 µl. Eau (ultra pure). : 25,5 µl. Taq polymérase. : 0,5 µl. Echantillon d’ADN : 1 µl Les échantillons sont placés dans le thermocycleur. Le paramétrage de l’appareil est réglé comme suit : - Préchauffage de la plaque du couvercle du thermocycleur à 112°C. - La dénaturation à 95°C. - L’hybridation à 57°C. - L’élongation à 72°C. Le fragment de gène que nous allons amplifier est de 449 pb. 2.2.2. Digestion enzymatique (RFLP) : • Principe : La RFLP est la l’abréviation de l’expression anglaise Restriction Fragment Lengh Polymorphism (le terme français équivalent est Polymorphisme de longueur des fragments de restriction). Elle repose sur la digestion d’un ADN cible par une ou plusieurs enzymes de restriction spécifiques des sites de restriction portés par l’ADN. Certaines mutations modifient la séquence du site de restriction et empêchent l'action de l'enzyme. Les modifications par mutation peuvent également faire apparaitre un nouveau site de restriction permettant ainsi l’action d’une enzyme de restriction. Les non-coupures de l'ADN ou au contraire les nouvelles coupures sont détectées par une variation du nombre et 16.

(48) Mise en évidence de la mutation P533R et étude du polymorphisme de l’intron 2 du gène de l’iduronidase.. de la longueur des fragments d'ADN (fragments de restriction) obtenus après digestion enzymatique.. Figure 5: Principe de la Technique RFLP [7]. • Protocole : Pour rechercher la mutation P533R nous utilisons l’enzyme Hpy99I. Elle possède deux sites de restriction sur le fragment amplifié au niveau de l’exon 11 du gène IDUA sur le chromosome 4. Le site de restriction reconnu par l’enzyme est CGWCG est indiqué en jaune sur la figure ci dessous. L’action de l’enzyme à lieu juste après le site de reconnaissance comme indiqué sur la figure ci dessous par les flèches rouges.. 17.

(49) Mise en évidence de la mutation P533R et étude du polymorphisme de l’intron 2 du gène de l’iduronidase.. La composition pour un volume de digestion de 20µl que nous allons incuber à 37°C est la suivante : ADN (produit PCR) BSA. : 10 µl. : 0,5 µl. Tampon : 2 µl Enzyme : 1U par µg d’ADN Eau. : 7 µl. En absence de la mutation, l’enzyme reconnait les deux sites et engendre 3 fragments : 200pb + 148pb + 101pb. Length. 5' Enzyme 5' Base. 3' Enzyme 3' Base. Sequence. 200. Hpy99I. 250. none. 449. CCATCACAGC CCTTCCCTCC CCCAGGTCAC GCGGCTCCGC GCCCTGCCCC TGACCCAAGG GCAGCTGGTT CTGGTCTGGT CGGATGAACA CGTGGGCTCC AAGTGCGTGA GTGGGGCCGC CCCTCCCTCT GCCTGGTCCT AGGCAGGTCC CTGGGTCCCG ACCCCTTCAC CCATGCGGTC ACTCGGGCCA CTTGCCGTGG. 148. none. 1. Hpy99I. 148. TTCGCCCTGA GGTCGGGCCG AGCGTCCCCA GCTCCCCTGG AGAACCCTGA GGACCGGCCA CTGCGCCCAG GACCCGGTGG CCGCGGCGCC CCGCCCCTTA CCCGCCGGCG GCCGCCTGAC CCTGCGCCCC GCGCTGCGGC TGCCGTCG. 101. Hpy99I. 149. Hpy99I. 249. CTTTTGCTGG TGCACGTGTG TGCGCGCCCC GAGAAGCCGC CCGGGCAGGC AAGTGGCAGT CCCCTAACCC GCGCCGCGGC CCGGACTCCC CTTCCCCGAC G. 18.

(50) Mise en évidence de la mutation P533R et étude du polymorphisme de l’intron 2 du gène de l’iduronidase.. En présence de la mutation P533R, la cytosine est substituée par une guanine.. L’enzyme ne reconnaitra qu’un seul site ce qui va engendrer 2 fragments seulement : 200pb + 249pb.. Length. 5' Enzyme 5' Base. 3' Enzyme. 3' Base. Sequence. 249. none. 1. Hpy99I. 249. TTCGCCCTGA GGTCGGGCCG AGCGTCCCCA GCTCCCCTGG AGAACCCTGA GGACCGGCCA CTGCGCCCAG GACCCGGTGG CCGCGGCGCC CCGCCCCTTA CCCGCCGGCG GCCGCCTGAC CCTGCGCCCC GCGCTGCGGC TGCGGTCGCT TTTGCTGGTG CACGTGTGTG CGCGCCCCGA GAAGCCGCCC GGGCAGGCAA GTGGCAGTCC CCTAACCCGC GCCGCGGCCC GGACTCCCCT TCCCCGACG. 200. Hpy99I. 250. none. 449. CCATCACAGC CCTTCCCTCC CCCAGGTCAC GCGGCTCCGC GCCCTGCCCC TGACCCAAGG GCAGCTGGTT CTGGTCTGGT CGGATGAACA CGTGGGCTCC AAGTGCGTGA GTGGGGCCGC CCCTCCCTCT GCCTGGTCCT AGGCAGGTCC CTGGGTCCCG ACCCCTTCAC CCATGCGGTC ACTCGGGCCA CTTGCCGTGG. 2.2.3. Electrophorèse sur Gel d’Agarose : Les conditions d’électrophorèse avec lesquelles nous avons travaillé sont : - Tension : le voltage 60 volts. - Temps de migration : une heure et demie.. 19.

(51) Mise en évidence de la mutation P533R et étude du polymorphisme de l’intron 2 du gène de l’iduronidase.. 2.3. Technique de recherche de la mutation P533R par ARMS : Nous avons procédé comme suit. 2.3.1. Principe de la technique ARMS: Le système d'amplification par amorce spécifique (ARMS : amplificationrefractory mutation system) est une méthode simple pour détecter toute mutation impliquant de petites délétions ou des mutations ponctuelles. Cette technique est basée sur l'utilisation d'amorces spécifiques qui permettent d’amplifier l'ADN si l'allèle cible est contenue dans l'échantillon, la présence ou l'absence du produit de PCR permet donc de conclure que l'allèle cible est présent ou absent. 2.3.1. Amplification de l’ADN cible (PCR) : • Protocole : La compositon pour un volume de PCR de 50µl est la suivante : Tampon taq (5X). : 10 µl. Mgcl2 25mM. : 5 µl. DMSO. : 5 µl. Le primer (F-11N ou F-11M) : 1 µl Le primer (R-10). : 1 µl. d-NTP. : 1 µl. Eau (ultra pure). : 25,5 µl. Taq polymérase. : 0,5 µl. Echantillon d’ADN. : 1 µl 20.

(52) Mise en évidence de la mutation P533R et étude du polymorphisme de l’intron 2 du gène de l’iduronidase.. Pour chaque échantillon à étudier nous avons réalisé deux amplifications, une avec le primer forward normal et l’autre avec le forward muté. Les échantillons seront ensuite placés dans le thermocycleur Qantaus® selon les mêmes conditions que celles utilisées pour l’étude de la mutation P533R par RFLP. 2.3.3. Electrophorèse sur Gel d’Agarose : Les conditions d’électrophorèse avec lesquelles nous avons travaillé sont : - Tension : le voltage 60 volts. - Temps de migration : une heure et demie.. 21.


(54) Mise en évidence de la mutation P533R et étude du polymorphisme de l’intron 2 du gène de l’iduronidase.. 1. Etude du polymorphisme de taille de l’intron 2 : Après avoir réalisé la PCR et l’électrophorèse des 75 ADN recueillis chez les étudiants de la section pharmacie, les résultats de l’étude du polymorphisme de taille au niveau de l’intron 2 montrent la présence des 3 allèles dans la population étudiée. La figure 6 ci-dessous rapporte les exemples de 2 gels obtenus montrant les génotypes de certains étudiants de notre série.. Figure 6 : Profils élecrophorétiques de quelques échantillons étudiés.. 23.

(55) Mise en évidence de la mutation P533R et étude du polymorphisme de l’intron 2 du gène de l’iduronidase.. Les résultats de l’étude de la répartition des 3 allèles et des différents génotypes, sont représentés dans les tableaux I et II et illustrés par les figures 7 et 8 ci-dessous.. Tableau I : Résultats de l’étude des génotypes du polymorphisme de taille Génotype. Nombre de patients. Fréquence. M/P. 20. 27%. P/P. 12. 16%. G/P. 11. 15%. M/M. 13. 17%. G/M. 13. 17%. G/G. 6. 8%. Tableau II :. Résultats de l’étude de la fréquence des allèles du polymorphisme de taille. Allèle. Nombre. Fréquence. P (542 pb). 55. 37%. M (628 pb). 59. 39%. G (714 pb). 36. 24%. 24.

(56) Mise en évidence de la mutation P533R et étude du polymorphisme de l’intron 2 du gène de l’iduronidase.. Distribution des haplotypes de l'intron 2 du gène IDUA chez la population Marocaine M/M 17%. G/G 8%. P/P 16%. M/P 27%. G/P G/M 15% 17%. épartition des différents haplotypes de l’intron 2 du gène Figure 7 : Répartition IDUA « chez la population marocaine ». G : 714pb ; M : 628pb ; P : 542pb.. Distribution des differents allèles de l'intron 2 du gène IDUA chez la population Marocaine G P 24% 37% M 39%. Figure 8 : Répartition des différents allèles de l’intron 2 du gène IDUA « chez la population marocaine ». G : 714pb ; M : 628pb ; P : 542pb.. 25.

(57) Mise en évidence de la mutation P533R et étude du polymorphisme de l’intron 2 du gène de l’iduronidase.. 2. Recherche de la mutation P533R par RFLP :. Figure 9 : Profil élecrophorétique d’un échantillon normal et d’un échantillon muté après digestion enzymatique. • Interprétations du profil électrophorétique : - « M » correspond au marqueur de poids moléculaire. - « A » correspond au fragment amplifié dans l’exon 11 avant digestion enzymatique. Il présente une bande de 449 pb. 26.

(58) Mise en évidence de la mutation P533R et étude du polymorphisme de l’intron 2 du gène de l’iduronidase.. - « B » correspond aux sujets suj Hurler qui porte la mutation P533R après digestion enzymatique. enzymatique. Il présente 2 bandes seulement 200pb + 249pb. - « C » correspond à l’un des étudiants de la série que nous avons étudiée.. Il présente 3 bandes après digestion 200pb + 148pb 14 + 101pb. 3. Recherche de la mutation P533R par ARMS : La figure 10 montre les résultats obtenus pour un patient Hurler homozygote pour laa mutation P533R et pour l’un des étudiants étudiés.. Figure 10 : Profil élecrophorétique d’un échantillon normal et d’un échantillon muté après amplification par amorces spècifiques.. 27.

(59) Mise en évidence de la mutation P533R et étude du polymorphisme de l’intron 2 du gène de l’iduronidase.. • Interprétations du profil électrophorétique : - « M* » correspond au marqueur de poids moléculaire. - « 1 » correspond à l’ADN du patient Hurler amplifié par le primer normal (amplification négative). - « 2 » correspond à l’ADN du patient Hurler amplifié par le primer muté. (amplification positive). - « 3 » correspond à l’ADN de l’étudiant 1 de la série que nous étudiant amplifié par le primer normal (amplification positive). - « 4 » correspond à l’ADN de l’étudiant 1 de la série que nous étudiant amplifié par le primer muté (amplification négative).. La recherche de la mutation P533R sur 22 ADN parmi ceux obtenus à partir des étudiants s’est avérée négative. L’application des techniques mises au point aux ADN des 4 patients Hurler a montré que trois parmi eux étaient homozygotes et le quatrième hétérozygote pour la mutation P533R.. 4. Résultats du séquençage de l’exon 11 des 4 patients Hurler : La mutation P533R a été recherchée par séquençage de l’exon 11 chez les 4 patients Hurler. Cette étude a été réalisée au Laboratoire de Biochimie Génétique de l’Institut Cochin à Paris dans le cadre d’un programme de collaboration, elle a permis de confirmer que 3 des patients que nous avons étudiés étaient homozygotes pour la mutation recherchée (Figure 11). Le quatrième patient était hétérozygote (Figure 12) pour la mutation P533R, il s’agit d’un patient ayant un statut d’hétérozygote composite pour qui la 28.

(60) Mise en évidence de la mutation P533R et étude du polymorphisme de l’intron 2 du gène de l’iduronidase.. recherche de la deuxième mutation qui est en cours nécessite le séquençage de l’ensemble du gène IDUA.. Figure 11 : Résultat du séquençage d’un patient Hurler homozygote pour la mutation P533R : séquence en bas (CGG) comparée à une séquence normale (CCG) en haut.. 29.

(61) Mise en évidence de la mutation P533R et étude du polymorphisme de l’intron 2 du gène de l’iduronidase.. Figure 12 : Résultat du séquençage du patient Hurler hétérozygote pour la mutation P533R : séquence en bas (CGG/CCG) comparée à une séquence normale (CCG) en haut.. 30.


(63) Mise en évidence de la mutation P533R et étude du polymorphisme de l’intron 2 du gène de l’iduronidase.. A. Aspects analytique : • Matériels génétique : L’objectif de notre étude est d’estimer la prévalence des trois allèles constituant le VNTR (Variable Number Tandem Repeat) présent au niveau de l’intron 2 du gène IDUA et de rechercher la mutation P533R au niveau de l’exon 11 du gène IDUA dans l’échantillon d’individus normaux recrutés, considérés comme représentatif de la population Marocaine. Nous avons donc utilisé pour notre étude des ADN que nous avons récupérés à partir d’une population estimée représentative : les étudiants de la section Pharmacie. Ces ADN ont été prélevés dans le cadre d’une étude similaire portant sur la phénylcétonurie puis conservés à -20°C. La population d’étude choisie peut être considérée représentative puisque les étudiants de la section pharmacie proviennent des différentes régions du Maroc. La quasi-totalité des régions du royaume furent donc représentées avec une prédominance des étudiants provenant des villes de Fès, Casablanca et Rabat qui sont des villes où le nombre d’habitants est également élevé par rapport à d’autres villes du pays. On pourrait donc considérer que le groupe d’étudiants est assez représentatif de la population Marocaine sans toutefois prétendre être à l’abri de biais de recrutement. Nous avions prévu d’augmenter l’effectif de notre groupe d’étudiants en prélevant une deuxième promotion d’étudiants en pharmacie, mais nous n’avons pas pu réaliser cet objectif pour des raisons logistiques. Nous considérons que les résultats que nous rapportons dans ce travail sont préliminaires. 32.

(64) Mise en évidence de la mutation P533R et étude du polymorphisme de l’intron 2 du gène de l’iduronidase.. • La nature des Primers et leur concentration optimale : La mise au point de la technique a nécessité plusieurs ajustements en vue d’une optimisation des conditions de PCR permettant d’améliorer le rendement et d’augmenter la spécificité. Les ajustements avaient porté entre autres sur la nature des primers que nous avons utilisés et qui sont formés de 20 bases chacun. Nous avons préparé une dilution permettant de travailler avec une concentration de 100 ng/µl. Il faut noter qu’une concentration élevée en primers peut faire apparaitre des produits d’amplifications non spécifiques. • La concentration optimale du Tampon Taq : Le tampon Tq 5X fourni par le fabriquant doit être dilué au 1/5ème. Nous avons utilisé 10 µl de tampon pour un volume total de PCR de 50µl. • Le volume de chlorure de magnésium à utiliser : La concentration de Chlorure de Magnésium (MgCl2) est une donnée capitale qui doit être optimisée. Nous avons réalisé des PCR avec une gamme de concentrations de MgCl2 en utilisant des prises d’essai de 3µl, 4 µl et 5 µl de MgCl2 à 25 mM. Les résultats étaient meilleurs avec une prise de 5 µl de MgCl2. • La température optimale d’amplification: Nous avons réalisé plusieurs séries de PCR avec des températures d’hybridation allant de 56 à 60°C. Pour l’étude du polymorphisme de taille (amplification de l’intron 2), 58°C était la température la plus concluante. Alors que pour l’étude de la mutation 33.

(65) Mise en évidence de la mutation P533R et étude du polymorphisme de l’intron 2 du gène de l’iduronidase.. P533R, nous avons opté pour 60°C, température optimale pour amplifier ce gène. • Optimisation de la PCR : Pour l’amplification des exons 10 et 11 riche en guanine et cytosine nous avons utilisé le DMSO connue pour son pouvoir à déstabiliser la structure en double hélice d’un ADN à haute teneur en GC. En effet La présence de guanine et cytosine augmente la force de liaison hydrogène rendant la dénaturation de la matrice plus difficile, ce qui conduit à la formation de structures secondaires intermoléculaires qui peuvent rivaliser avec l'hybridation des amorces [8]. • Conditions physicochimiques de la digestion enzymatique : Nous avons choisi 37°C pour réaliser nos incubations comme le préconise la fiche descriptive de l’enzyme [9]. Nous avons ensuite testé des durées d’incubation de 4, 6, 8… heures afin de choisir la durée qui nous permet d’obtenir le meilleur rendement de digestion du fragment d’ADN étudié. Nous avons ensuite retenu 6h. B. Apport du travail au niveau marocain : 1. Intérêt de l’étude du polymorphisme de taille de l’intron 2 : 1.1. Les répétitions en tandem [10] : • Définition: Une répétition en tandem est une succession de motifs d’ADN répétés les uns derrière les autres. Les répétitions en tandem représentent environ 3% du 34.

(66) Mise en évidence de la mutation P533R et étude du polymorphisme de l’intron 2 du gène de l’iduronidase.. génome humain, la majorité (en nombre de locus) étant des répétitions de dinucléotides. Il y a environ 1 répétition en tandem tous les 2 kilobases. Elles ont été étudiées en premier lieu chez les mammifères, où trois catégories ont été distinguées : les satellites, les minisatellites, et les microsatellites. Cette distinction correspond à différentes plages de taille (pour la longueur totale) et a été faite de façon plus ou moins arbitraire : l’ADN « satellite » a tout d’abord été observé et isolé par centrifugation sur gradient de densité, où il constituait une fraction particulière dite « satellite ». Ensuite, des répétitions en tandem de taille inférieure, pouvant être analysées grâce à la technique de Southern Blot, ont été caractérisées puis appelées « minisatellites ». Enfin, les répétitions en tandem de taille encore inférieure pouvant être étudié par PCR ont été nommées « microsatellites ». Les répétitions en tandem sont souvent polymorphes et leurs allèles, de tailles différentes, sont facilement identifiables par PCR à partir d’amorces spécifiques, suivie d’une simple migration sur gel. C’est la méthode que nous avons adopté pour l’étude de l’intron 2 du gène IDUA. La répétition en tandem que nous étudions au niveau de l’intron 2 est de 86pb. Elle est donc classée parmi les minisatellites qui sont définis comme étant constitués d’unités d’une quinzaine à plusieurs centaines de paires de bases. Le premier minisatellite humain a été mis en évidence en 1980 par Wyman [11] et le nom de « minisatellites » leur a été donné par Jeffreys en 1985 [12] , qui a découvert la grande utilité de ces structures extrêmement polymorphes pour réaliser les premières « empreintes génétiques ».. 35.