Détection de Xanthomonas campestris pv. citri, agent du chancre bactérien des agrumes, par NESTED-PCR : Optimisation de la technique et mise au point d'un protocole quantitatif, application dans le cadre d'une étude d'écologie microbienne

Université de Sciences et Technologies de Lille

CIRAD-FLHOR Agence de la Réunion Laboratoire de Phytopathologie

M ém o ire de Tin d'études pour l'obtention du DESS G énie C ellulaire et M oléculaire

D É T E C T IO N DE X A N T H O M O N A S C A M P E S T R I S PV. C I T R I ,

A G E N T DU C H A N C R E BACTERIEN DES A GR UM ES,

PAR NESTED-PCR :

- Optimisation de la technique et mise au point d'un protocole

quantitatif,

- Application dans le cadre d'une étude d'écologie microbienne.

Présenté par Isabelle V IL L E M O T

Université de Sciences et Technologies de Lille

CIRAD-FLHOR Agence de la Réunion Laboratoire de Phytopathologie

M ém oire de fin d'études pour l'obtention du DESS G énie C ellulaire et M oléculaire

D É T E C T I O N DE X A N T H O M O N A S C A M P E S T R I S PV. C I T R I ,

A G E N T DU C H A N C R E BAC TER IEN DES A G R U M E S ,

PAR NESTED-PCR :

- Optimisation de la technique et mise au point d'un protocole

q uantitatif,

- A pplication dans le cadre d'une étude d'écologie microbienne.

Présenté par Isabelle V IL L E M O T

Responsable de stage : Olivier PR U VO ST Soutenu le 20 Septembre 1994 à l'USTL

AVANT-PROPOS

Ce stage s'est déroulé au laboratoire de phytopathologie du C IR A D -FL H O R de Saint Pierre du 7 mars au 15 septembre 1994.

Je tiens à rem ercier ici toutes les personnes qui ont contribuées à faire de ce stage une form idable expérience :

- O livier qui par sa motivation et son dynam ism e a rendu ce travail passionnant. Sa présence et son aide jusqu'au dernier moment font de lui un excellent m aître de stage (normal, c'est un ancien universitaire lillois !!).

- John H artung, chercheur de l'U SD A de B eltsville aux Etats U nis avec la collaboration duquel ce travail a été réalisé. Ses conseils en début de stage m 'ont été très utiles par la suite.

- N inie ma petite com plice avec qui j'ai passé des m om ents form idables et qui a toujours été là pour m'aider.

- Liolio mon voisin de laboratoire un peu râleur mais trognon quand m êm e qui a toujours été de bons conseils pour mon travail et mon mémoire.

- Jean-Jacques et Francis sans lesquels l'ambiance au laboratoire n'aurait pas été aussi joyeuse.

- Elisabeth et M arie-Rose pour leur aide et leur bonne humeur.

Je n'oublierai pas la bande de stagiaires et de V AT pour tous les bons m om ents passés ensem ble ainsi que mes colocatrices de la "case de passage", Cri-Cri, V aloch et Cacou pour ces 6 m ois de cohabitation sans oublier Pierrot qui nous a supporté les prem iers mois. A Serge enfin, qui m'a fait découvrir sa belle île et ses spécialités et sans lequel je n'aurais pas eu tant de peine à partir.

SOMMAIRE

IN T R O D U C T IO N ...1

O B JEC TIFS D E L 'É T U D E ... 2

É T U D E B I B L I O G R A P H I Q U E ... 3

1. L 'h ô te : les a g r u m e s ... 3

1.1 D éfinition et répartition géographique...3

1.2 Production m o n d ia le ... 3

2. L a m a la d ie : le c h a n c r e b a c té rie n des a g r u m e s ... 3

2.1 Répartition géographique et o rig in e ... 3

2.2 Im portance écon om ique... 4

2.3 S ym pto m atologie...4

2.4 É pidém iologie...4

2.4.1 l'in fe c tio n ... 4

2.4.2 les facteurs externes favorisant le développement de la m aladie... 4

2.4.3 la su rv ie...5

2.4.4 la d is s é m in a tio n ...5

2.5 Les m oyens de l u t t e ... 6

3. L 'a g e n t p a th o g è n e : Xanthom onas campestris pv. citri (X.c.c) ...7

3.1 N o m en clatu re... 7

3.2 C aractères g én é ra u x ... 7

3.3 Techniques d'isolem ent et d'identification... 7

4 L a d é tec tio n de l'a g e n t p a th o g è n e ...8

4.1 O b je c tifs... 8

4.2 Les techniques de d é te c tio n ... 8

4.2.1 test de pouvoir p ath o g èn e ... ^ ...8

4.2.2 techniques séro lo g iq u es...9

4.2.3 dénom brem ent sur milieux gélosés sem isélectifs... 9

4.2.4 techniques m oléculaires...9

4.3 La P C R (Polym erase Chain R e a c tio n )...9

4.3.1 g én éra lités... 9

4.3.2 m ise au point de la PCR sur X .c.c... 10

M A T É R IE L E T M É T H O D E S ...12

1. L es souch es b a c t é r i e n n e s ...12

1.1 D e sc rip tio n ... 12

1.2 Culture et n u m ératio n ...12

3. La N -P C R ... 12

3.1 Sélection des amorces... 12

3.2 Les conditions de la N -P C R ... 13

4 D étection et analyse des produits d'am plification...13

4.1 Détection électrophorétique... 13

4.2 Détection colori métrique...13

5. T ests d'inhibition de la N -P C R ...14

5.1 Effet des extraits d'agrumes... ... 14

5.2 Effet du cu iv re... 14

6. N -PCR q u a n tita tiv e... 14

7. Application de la N-PCR qualitative et quantitative à l'étude de la dissém ination de X.c.c par la plu ie... 15

7.1 D ispositif... 15

7.2 Suivi de la propagation de la bactérie... 15

8. Analyses statistiq ues... 16

R E S U L T A T S ...17

1. N -PCR sur ADN plasmidique p u rifié... 17

2. Sensibilité de la N -P C R ... 17

2.1 Sensibilité de la N-PCR sur p F L l ...17

2.2 Sensibilité de la N-PCR avec la souche de X.c.c JA1 5 9 -1 ... 18

2.3 Analyse des résultats...18

3. Effet des extraits d'agrumes et du cuivre sur l'am p lifica tio n ...19

3.1 Effet des extraits d'agrume... 19

3.2 Effet du cuivre... 19

4. PCR q u a n tita tiv e...19

4.1 N-PCR sur A 3 1 ...~... 20

4.2 Quantification de pFLl par N -PCR... 20

4.3 Quantification de la souche JA159-1... 20

4.4 Analyse des résultats...21

5. A pplication de la N-PCR qualitative et quantitative à l'étude de la dissém ination de X.c.c par la p lu ie ... 21

5.1 suivi de la dissémination sous l'effet d'une pluie fin e... 21

5.2 suivi de la dissémination sous l'effet d'une pluie de forte intensité... 22

5.3 quantification de X.c.c sur les plants malades après traitement par la plu ie...22

D IS C U S S IO N ...24

Le chancre bactérien ou chancre citrique, causé par Xanthomonas campestris pv. citri (X.c.c), est l'une des maladies les plus sérieuses affectant les agrumes. Originaire du Sud Est asiatique ou de l'Inde, la maladie est endémique en Orient (KOIZUMI, 1985). Elle constitue une véritable menace pour 1' agrumiculture dans les pays où le chancre ne sévit pas encore ou a été éradiqué (CIVEROLO, 1981). Des procédures de quarantaine ont été mises au point pour les pays où la maladie existe afin de mieux la contrôler et d'empêcher sa propagation à travers le monde (Anonyme, 1990).

Il existe au moins trois formes bien reconnues de la maladie causées par différents variants de X .c.c : la forme asiatique ou chancre A présente dans les zones agrumicoles du monde entier à l'exception du bassin Méditerranéen, des Caraïbes, de l'Afrique et des USA. La forme B, présente dans quelques pays d'Amérique du sud (Argentine, Paraguay et Uruguay). Le chancre C ou chancre de la lime Mexicaine présent au Brésil.

Un chancre D a été décrit au Mexique au début des années 80 sur lime mexicaine. Il semble que dans ce cas, les Xanthomonas isolées soient des pathogènes secondaires voire des saprophytes, l'agent causal étant un champignon du genre Alternaria.

La forme la plus répandue, la plus sévère et possédant le spectre d'hôtes le plus large est la forme asiatique: c'est celle qui sévit à la Réunion ainsi que dans tous les pays riverains de l'Océan Indien.

Les différents variants ou pathotypes de X.c.c ont tout d'abord été distingués par leur spectre d'hôtes et leur origine géographique puis, leur existence a été rapidement confirmée par l'utilisation d'un grand nombre de techniques d'identification (tests physiologiques et biochimiques, empreintes métaboliques, sérologie, sensibilité vis à vis de bactériophages, RFLP...). Toutes confirment une grande variabilité inter et intrapathotype.

La détection fiable du pathogène est une nécessité pour tous les pays concernés par le chancre bactérien. C'est pourquoi le développement de méthodes de diagnostic performantes constitue une priorité.

L'île de la Réunion est le seul territoire de la Communauté Européenne où sévit le chancre bactérien. Celui-ci représente avec la Tristeza (maladie d'origine virale) un fléau pour l'agrumiculture réunionnaise. La Réunion offre des conditions climatiques favorables au maintien et à l'extension de la maladie. Elle y a été décrite pour la première fois en 1967 (BRUN, 1971), mais ce n'est vraiment qu'après le passage de la dépression tropicale Hyacinthe en 1980 que l'on a assisté à sa recrudescence (AUBERT et al., 1982).

Afin d'envisager une stratégie de lutte efficace contre le chancre bactérien, une étude épidémiologique a été engagée par le CIRAD FLHOR de la Réunion. Les études déjà réalisées ont permis de préciser le cycle biologique de X .c .c , de définir les stades de sensibilité de l'hôte, de préciser l'influence des conditions climatiques sur la multiplication du pathogène ainsi que sur la vitesse d'apparition des symptômes.

L'objectif actuel est de mieux connaître les modes de dissémination du pathogène en vergers et en pépinières. Une telle étude nécessite de posséder en parallèle des techniques de détection de la bactérie spécifiques et sensibles.

Différentes techniques sont étudiées pour détecter le pathogène à l'île de la Réunion. La PCR (Polymerase Chain Reaction) récemment mise au point pour X .c.c (HARTUNG et al., 1993) est évaluée pour ses critères de sensibilité, de spécificité et de facilité en vue d'un usage en routine.

Le but de cette étude est d'optimiser cette technique de détection par la m ise au point d'un protocole de "nested" PCR (N-PCR) et par l'utilisation d'une méthode de détection des produits d'amplification par colorimétrie (ELISA).

Les performances de cette technique seront testées sur ADN purifié, sur cultures bactériennes pures et sur matériel végétal contaminé avant et après traitement chimique par des sels de cuivre.

Le second volet de cette étude sera consacré à la mise au point d'un protocole de N-PCR quantitative que l'on comparera à une autre technique de quantification : le dénombrement sur milieu sélectif. Son application dans le cadre de l'étude de la dissémination de X .c.c par la pluie permettra d'appliquer la N-PCR à des études d'écologie microbienne.

T ab leau 1: P roduction fruitière m ondiale en m illions de tonnes (données FAO - in V E R N IE R E , 1992). 1 9 7 9 - 8 1 1 9 8 4 1 9 8 6 1 9 9 0 R a is in s 6 6 , 2 65,1 6 6 , 9 6 3 , 0 P o m m e s 3 4 ,5 3 9 ,9 4 0 , 9 4 2 , 0 P ê c h e s et 5 ,5 6 , 2 6 , 2 -N e ctarin e s A g r u m e s 5 3 , 0 - - 6 4 , 5 B a n a n e s 3 7 , 4 4 0 , 6 4 1 , 3 4 2 , 0 Plantains 2 5 , 2 23,7 2 7 , 2

-T a b lea u 2: É v a lu a tio n de la p ro d u ctio n m o n d ia le d 'a g ru m es en m illio n s de ton n es (d o n n ées FAO - in V E R N IE R E , 1992).

19 71 -7 2 1975 -76 1976-77 1980-81 1987-88 19 88 -89 1 9 8 9 -9 0 O ra n g e s 3 0 , 6 9 3 6 , 5 6 4 2 , 3 4 4 3 , 6 7 4 6 ,2 1 T a n g e r i n e s 6,71 7 , 4 3 8 ,4 7 8 , 1 8 8 ,3 7 L im e s et 4 , 0 9 4 , 7 2 6 , 2 4 6 , 2 9 6 , 2 5 citro n s P o m e l o s 3 ,7 2 4 , 3 0 4 , 7 7 4,91 4 , 0 3 T otal 5 1 , 0 7 5 3 , 0 1 6 1 , 8 4 6 3 , 0 6 6 4 , 4 9

T a b l e a u 3: Les i mp o r t a t i o ns d' a g r u me s à l'île de la Ré uni o n (en t onnes) ( A n o n y m e , 1993). A G R U M E S 1989 1990 1991 1992 C itron s et lim es 4 3 0 510 457 6 3 0 C lém en tin es 27 34 43 31 M a n d a rin e s et 17 21 18 36 h y b rid e s O ra n g e s et 3807 3027 2 7 9 3 2 7 4 9 tan g o rs P o m e l o s 104 140 114 2 4 9 T OT AL 4 3 8 5 3 7 3 1 3 4 2 5 3 6 9 5

1.1 Définition et répartition géographique

L'ensemble des arbres et des fruits, économiquement utiles à l'homme, appartenant aux trois genres Poncirus, Fortunella et Citrus, de la famille des Rutacées et sous famille des Aurantioïdées, est désigné par le terme agrumes.

D e façon plus générale, le terme agrumes désigne le citron et les fruits voisins : orange, mandarine, clémentine, pamplemousse, combava etc.

Originaire du sud est asiatique, l'agrumiculture s'est rapidement répandue vers le bassin méditerranéen et l'Afrique pour gagner, via l'Europe, les Amériques.

Actuellement, elle est répandue dans toutes les zones subtropicales, tropicales et tempérées du globe, comprises entre les latitudes 23°5 nord et sud (CASSIN,1984).

1.2 Production mondiale

En 1989-90, l'agrumiculture est devenue la première production fruitière avec 65 millions de tonnes juste devant les raisins (Tableau 1).

Les oranges occupaient la place la plus importante en 1990 avec plus de 70% de la production totale devant les tangerines (appellation regroupant les clémentines et les mandarines), les limes et citrons et les pomelos (Tableau 2). Les Etats-Unis et le Brésil sont les principaux producteurs.

A la Réunion, le verger agrumicole occupe la deuxième place derrière celui du litchi. Cependant, la production réunionnaise d'agrumes ne permet pas de couvrir la consommation locale ce qui oblige la Réunion à avoir recours aux importations (Tableau 3).

1. L'hôte: les agrum es

2. La maladie: le chancre bactérien des agrumes

Le chancre bactérien des agrumes (CBA), ou chancre citrique appelé "Citrus Bacterial Canker Disease" par les anglo saxons, est une maladie bactérienne causée par Xanthomonas campestris pv. citri (HASSE, 1915), DOWSON, 1939 (DYE et al., 1980).

2.1 Répartition géographique et origine

Cette maladie représente l'une des affections principales des agrumes à l'île de la Réunion mais aussi dans de nombreuses zones agrumicoles du monde. En effet, le chancre citrique est présent dans 20 états d'Asie et 6 états d'Océanie (KOIZUMI, 1985). Seul le pourtour méditerranéen, les Caraïbes, l'Afrique et les USA semblent aujourd'hui épargnés (VERNIERE et al., 1992).

Il faut noter que la maladie a totalement été éradiquée de certains pays comme la Nouvelle Zélande, l'Afrique du Sud et le Mozambique (STALL et al., 1981 ; VERNIERE et al., 1992) ainsi que récemment en Floride (CIVEROLO, communication personnelle).

D e la même façon, elle est réapparue en Australie depuis 1991 après plusieurs décennies d'absence (BROADBENT et al., 1992) ; son éradication est en cours.

Le chancre bactérien continue de se répandre dans de nouveaux pays tels que l'Iran (ALIZADEH & RAHIMIAN, 1990), les Émirats Arabes Unis (EL GOORANI, 1989), la République du Yémen (BARNES, 1988), l'Irak (IBRAHIM & BAYAA, 1989) l'Archipel des Maldives (ROISTACHER & CIVEROLO, 1989).

La maladie, observée pour la première fois au Japon en 1889 (CIVEROLO, 1984), aurait pour origine l'Inde ou l'île de Java, pays à partir desquels elle se serait répandue vers les autres régions d'Asie et du globe.

A l'île de la Réunion, le CBA a été décrit pour la première fois en 1967 (BRUN, 1971) qui signalait la maladie sur combava, pomelo et limettier mexicain ainsi que sur oranger et citronnier. Il est cependant fort probable qu'il était préexistant depuis plusieurs années, voire plusieurs décennies.

Tableau 4

: Degrés de sensibilité des principales espèces d'agrumes et

des cultivars hybrides à Xanthom onas campestris pv. citri.

Classes de sensibilité

Très sensible Sensible Peu sensible Tolérant

C. paradisi C. latifolia C. medica C. bergamia

(P o m elo ) (L im e de Tahiti et de Perse)—“H ^

1 ... I (B e r g a m o tier)

Ç. aurantifoliat C. limettitioides

1 I I C. limon C. unshiu

( L u n e m ex ica in e) 1 _{(L im e douce)} 1 1 _(Citron) 1 _{(Mandarinier Satsuma)}r ' ■ ... " ■ ■ i

u C. hystrix C. reticulata 1 1 C. reshniyuzu (C om b ava) i (Mandarinier) 1 4. 1 ... 1 ' 5 £ C. grandis C. calamondin OJ u 3 1 (Pam plem oussier)

1--- j 3 U I C. sinensis C. junos (Oranger doux) i j--- ---- -- { T á n g e l o * C. madurensis T a n g o r * 1 1 1 1 Fortunella spp. 1---j (Kumquat)

, Poncirus trifoliata C. limettitioides C. macrophylla

-1 —... 1 (Oranger trifolié) 1 1 (A le m o w ) 1 C i t r a n g e * C. limonia cSi 0» u C i t r u m e l o * 1 1 C. jambhiri OJD 0) u o c-1 1 v is-à -v is du pathotyp e E 1 1 (Limon rugueux) C. aurantium 1--- 1 (Oranger acide) C. reshni 1--- 1

(M andan nier Cléopatre)

* C u l ti v a rs h y b r i d e s :

- C i t r a n g e : C. sinensis x Poncirus trifoliata

- C i t r u m e l o : Poncirus trifolata x C. paradisi cv. 'sw ingle' - T á n g e l o : C. reticulata b la n c o x C. paradisi

2.2 Importance économique

La maladie, en entraînant une chute prématurée des fruits, une défoliation des arbres et le développement de lésions sur les fruits occasionne des baisses de rendement de production et rend les agrumes affectés inacceptables sur le marché. C'est l'apparence externe des fruits qui est altérée et non pas leur valeur gustative : ils restent consommables localement, surtout dans les pays où la demande est insatisfaite.

De plus, les pays atteints par le CBA sont soumis à des règles strictes de quarantaine leur interdisant toute exportation de fruits frais vers des pays où l'agrumiculture est indemne de chancre (USA et Europe par exemple).

2.3 Svmptomatologie

Le diagnostic par simple observation visuelle reste délicat car les symptômes causés par X.c.c peuvent être confondus avec ceux d'autres affections non bactériennes (ROSSETI, 1981 ; AUBERT et al. , 1982). Les lésions caractéristiques du CBA se développent sur toutes les parties aériennes, essentiellement sur des organes jeunes.

Sur feuilles, les lésions apparaissent sur les faces supérieures et inférieures . D es petites taches aqueuses apparaissent d'abord (VERNIERE et al., 1992). Elles brunissent ensuite pour se bomber et se transformer en lésions cratériformes. Un halo chlorotique les entoure le plus souvent (Planche 1).

Les lésions sur rameaux (Planche 2) et fruits (Planche 3) ressemblent à celles observées sur feuilles. Elles restent localisées au niveau de l'épicarpe pour les fruits.

Aucun symptôme n'a été observé sur fleurs et ils sont très rares sur racines aériennes. 2.4 Épidémiologie

2.4.1 l'infection

Les cellules de Xanthomonas présentes à la surface des plantes ont besoin d'envahir les tissus afin de se multiplier et d'induire la maladie. Ne possédant pas de mécanismes actifs pour traverser les barrières protectrices de la plante, les bactéries peuvent pénétrer dans les tissus par les ouvertures naturelles que sont les stomates et lenticelles. Elles peuvent aussi pénétrer par les blessures crées par le vent, les insectes ou l'homme (GOTO, 1962 ; KOIZUMI, 1983 ; GRAHAM et al., 1992 ; BRUN, 1971). Les bactéries infectent principalement les jeunes tissus ; ainsi leur sensibilité est maximale quand les feuilles et tiges mesurent 50 à 80 % de leur taille adulte (KOIZUMI, 1983).

La sensibilité des feuilles varie avec l ' âge des tissus : les feuilles matures deviennent résistantes à l'infection stomatalç alors qu'elles restent sensibles à l'infection par blessure (OTA, 1967 ; KOIZUMI, 1972 ; CIVEROLO, 1984). Il en est de même pour les fruits qui sont sensibles pendant leur période de croissance et deviennent résistants avant leur maturité (STALL e t al.,

1981).

Une étude récente a montré qu'il n'existe aucune différence de structure entre les stomates jeunes et âgés ou entre structure et densité de stomates de plantes sensibles et tolérantes. La résistance d'un tissu serait plutôt due à la réduction de la multiplication des bactéries dans les espaces intercellulaires chez les espèces tolérantes (GRAHAM et al., 1992).

Le Tableau 4 résume les différents degrés de sensibilité au chancre bactérien au sein de la famille des Rutacées.

2.4.2 les facteurs externes favorisant le développement de la maladie

La maladie s'établit en climat chaud et humide. La présence d'eau libre (pluie, rosée, irrigation) ainsi que de températures comprises entre 14 et 38°C (avec un optimum de 26°5 à 30°C) est indispensable à l'infection (B R U N , 1971, KOIZUM I, 1976 ; K O IZ U M I, 1985 ; CIVEROLO, 1984).

Les attaques du chancre sont sévères dans les régions où température et pluie augmentent en même temps durant l'année. L'île de la Réunion par exemple, offre un climat tropical humide idéal qui comporte deux saisons ayant des effets différents sur l'évolution de la maladie :

Planche 1. Lésions caractéristiques du chancre bactérien des agrum es sur feuilles

Planche 2. Sym ptôm es sur ram eaux du à Xantliomonas campestris pv. citri.

Planche 3. Lésions caractéristiques du chancre bactérien des agrum es sur fruit

l'une favorable à l'extension parce que chaude et pluvieuse (températures moyennes de 25 à 26°C au niveau de la mer d'octobre à mars) ; l'autre au contraire, beaucoup plus fraîche et sèche (20 à 22°C au niveau de la mer d'avril à septembre) où X.c.c se trouve généralement en phase de survie.

La période de latence (entre l'infection' et l'apparition des symptômes) est de 5 à 6 jours à 30°C et de plusieurs mois à 15°C (CIVEROLO & STAPLETON, 1984).

2.4.3 la survie

X.c.c peut survivre pour un certain temps sous forme parasitaire dans les tissus malades, sous forme épiphyte sur plantes hôte ou sous forme saprophyte sur plantes non hôte et dans le sol. Ces trois formes de survie sont très différentes si on considère leur potentialité vis à vis de la propagation de la maladie.

- Survie sous forme parasitaire :

Les lésions chancreuses, principales sources d'inoculum, sont connues pour être la principale source d'inoculum (GOTTWALD et al., 1992). Les lésions peuvent contenir 106 à 108 bactéries et exsuder 105 à 106 bactéries/ml (STALL et al., 1980).

Les bactéries peuvent observer une période de latence prolongée : c'est le cas au Japon en automne où X .c.c reste en phase de latence au sein de tissus infectés mais ne présentant pas de symptômes. Les lésions n'apparaissent alors qu'au printemps suivant (KOIZUMI, 1977).

- Survie sous forme épiphyte :

L'agent pathogène peut survivre en épiphyte à la surface des organes des plantes hôte sans qu'aucun symptôme ne soit observé (TIMMER,-1989 ; VERNIERE, 1992). Les bactéries épiphytes peuvent jouer un rôle important dans le cycle biologique des maladies com m e source potentielle d'inoculum. Mais dans le cas de X.c.c, l'importance épidémiologique de cette phase est en fait très discutée (TIMMER, 1989). D es expériences d'infestations artificielles indiquent que X.c.c peut survivre quelques mois en épiphyte uniquement sous forte hygrométrie (VERNIERE,

1992).

- Survie sous forme saprophyte :

L'agent pathogène peut survivre en petites quantités et pendant des durées limitées sur plantes non hôte (GOTO et a l. , 1975)

Les populations de X.c.c diminuent rapidement dans les lésions des organes tombés au sol. La bactérie disparaît lorsque le mésophylle est totalement dégradé (SERIZAWA, 1981).

X.c.c peut survivre dans la rhizosphère des plantes hôtes et non hôtes. Cependant, il semble que la bactérie ne se maintienne que pendant de courtes périodes allant de 2 à 8 semaines. Cette durée dépend des conditions d'humidité, de température, de la présence ou non de débris végétaux et du pH (CIVEROLO, 1984).

2.4.4 la dissémination

Les mécanismes impliqués dans la dispersion de la bactérie à courtes ou à longues distances sont nombreux :

- Le facteur humain :

La dispersion de la maladie à longue distance est principalement liée au transfert de matériel végétal infecté (CIVEROLO, 1984). A courte distance, le développement de la maladie est souvent conditionné par la présence de plantes malades dans les vergers lors de la plantation.

L'homme est le principal responsable par le transport de matériel végétal infecté d'un pays à un autre mais aussi par sa propagation à l'intérieur d'un territoire : déplacements dans les vergers, irrigation, taille... (BRUN, 1971 ; CIVEROLO & STAPLETON, 1984).

- La pluie et le vent :

Les facteurs clim atiques sont plutôt à l'origine d'une dissém ination de X.c.c sur des courtes distances : à l'échelle de la plante ou de la parcelle.

L'eau nécessaire à la pénétration des bactéries dans les tissus est un facteur im portant pour la propagation de la maladie. En effet, la bactérie en se développant à la périphérie des lésions se disperse dans l'eau de pluie qui tom be sur de nouvelles pousses.

C et effet est p articulièrem ent im portant dans les p épinières où la p roxim ité des plantes rend les contacts plus faciles. Les bactéries se propagent du plant m alade aux plants sains u n iq u em en t p ar d es g o u ttes qui to m b en t sur les feu illes (S T A L L et al., 1980 ; T IM M E R

et al., 1991).

Il fau t n o ter que de fortes p lu ies sont su sc ep tib les d e lessiv e r les b actéries (SERIZAW A, 1981).

Le v ent p erm et la progression de la m aladie en v erg er par le transport de micro gouttes d'inoculum (K U H A R A , 1978) et par la création de blessures sur les feuilles augm entant ainsi le no m b re d e sites propices à l'infection (S E R IZ A W A & IN O U E , 1976). Son action est im portante lorsque la vitesse du vent est supérieure à 6,5 m/sec.

- Les insectes :

La m ineuse des feuilles (Phyllocnistis citrella), en creu san t des galeries dans le parenchym e foliaire, crée des blessures (GOTO, 1962).

2.5 Les m ovens de lutte

X.c.c est un organism e de quarantaine dans de nom breux pays (A nonym e, 1990). Des m oyens de lutte do iv en t à la fois éviter la dissém ination vers des zones indem nes de chancre citrique mais aussi contrôler la maladie là où elle existe déjà.

La lutte par éradication n'est envisageable que si la m aladie est présente sur un territoire depuis peu de tem ps. D ans tous les cas, elle dem ande de grosses disponibilités financières. Cette m éthode est non envisageable à la R éunion (endém ie, p résence de rutacées sauvages pouvant potentiellem ent héberger l'agent pathogène). Elle a, cependant été réussie dans de nom breux pays tels que l'A frique du Sud ou la N ouvelle Z élande (BRU N, 1971) ou plus récem m ent en Floride (CIV ERO LO, com m unication personnelle).

Les autres m oyens de lutte, applicables dans les pays où la m aladie est endém ique, sont les suivants :

- Lutte chim ique :

L'utilisation de produits à base de cuivre (sels de cuivre) donne d'assez bons résultats sur des variétés peu sensibles. Leurs effets sont plus bactériostatiques que bactéricides (STA LL

et al., 1980) et sont limités à la surface des organes. Ils n'ont pas d'action sur les bactéries présentes à l'intérieur des lésions.

Des antibiotiques ont aussi été testés, notam m ent le sulfate de streptomycine. Ils sont cependant m oins efficaces que le cuivre et interdits par la législation française.

- Lutte par des méthodes culturales :

Elles consistent principalem ent à sélectionner dans la m esure du possible des espèces ou variétés tolérantes ou faiblem ent sensibles, à détruire les organes atteints, à m ettre en place des haies brise-vent, à adapter l'irrigation, à travailler avec des outils désinfectés et à produire des plants de pépinière indem nes de maladie (KOIZUM I, 1985 ; CIV ER O LO , 1984).

3. L'agent pathogène 3.1 Nom enclature

La bactérie responsable de la maladie appartient au genre Xanthomonas qui ne contient que des espèces phytopathogènes. Six espèces font partie de ce genre : Xanthomonas campestris en est l’espèce type (B R A D B U R Y , 1986).

Les X. campestris pathogènes vis à vis de plantes botaniquem ent proches ont été regroupées sous le term e d e pathovar (désigné pv.). A insi toutes les souches de X. campestris in fectan t des espèces d e C itrus et causant le CBA sont désignées com m e Xanthom onas cam pestris pv. citri (X.c.c).

P lusieurs variants de cet agent pathogène ont été décrits. Ils in d u isen t d es form es de la m aladie d'incidences économ iques très variables : ces variants sont reg ro u p és sous le term e de pathotype (D YE et al., 1980). On distingue 3 principaux pathotypes :

-Le pathotype A : il occasionne le chancre asiatique et possède le spectre d'hôte le plus large. Il affecte tous les agrum es et en particulier les pomelos, les lim ettiers, les citronniers et les orangers. Il se retrouve dans la quasi totalité des pays concernés par le chancre. C 'est le pathotype qui sévit à la R éunion (A U B ER T et al., 1982 ; LA VILLE, 1985).

-Le pathotype B : il provoque le chancre sud am éricain. Il est p résen t en A rgentine, en Uruguay et au Paraguay. Il affecte surtout les citronniers e t les limettiers.

-Le pathotype C : il induit le chancre de la lim e M exicaine. Sa p résence est lim itée au Brésil.

-Le pathotype D : il a été observé en 1981 sur lime M exicaine au M exique. Il n'induit pas de sym ptôm es sur fruits. La maladie serait en fait dûe à un cham pignon du genre Alternaría, isolé constam m ent des symptômes. X.c.c ne serait dans ce cas qu'un opportuniste.

Les souches de types B, C et D m oins agressives que celles du p athotype A ne constituent qu'une m enace très limitée pour 1' agrumiculture.

U ne nouvelle m aladie causée par Xanthomonas campestris est apparue en Floride en 1984 dans les pépinières. N om m ée "Citrus Bacterial Spot Disease" par les anglo-saxons, cette m aladie possède une sym ptom atologie atypique sur les hôtes sensibles que sont Poncirus trifoliata et ses hybrides. Identifié à l'origine com m e un nouveau variant de X.c.c (nom m é pathotype E), l'agent pathogène fut rebaptisé Xanthomonas campestris pv. citrumelo au vu de différences m arquées de sa structure génom ique (G ABRIEL et al., 1989).

3.2 Caractères généraux

X.c.c est une bactérie G ram négatif en forme de bâtonnet (1,5 à 2 |im de long e t 0,5 à 0,8 |im de large). Elle est m obile grâce à un unique flagelle polaire.

Les X a n th o m o n a s se cara cté risen t par la synthèse d e p ig m e n ts ja u n e s sp éc ifiq u es appartenant au groupe des xanthomonadines.

Sur m ilieux gélosés contenant de la peptone et une source de carb o n e (ex : L P G A ), les colonies sont bom bées, circulaires, de 3 à 4 mn de diam ètre, en to u rées d'un m u cu s dû à la production de polysaccharides extracellulaires (EPS) après 3 à 4 jours d'incubation à 28-30°C.

Les bactéries se multiplient de 7 à 32°C. Leur température optim ale de croissance est 28°C. Elles ont un m étabolism e respiratoire aérobie strict, possèdent une catalase et n' ont pas d'oxidase.

3.3 Techniques d'isolem ent et d'identification

D ifférentes études réalisées sur les souches de X.c.c ont m ontré une grande variabilité inter et intrapathotype ; d'où la nécessité d'utiliser des techniques d 'id en tific atio n précises afin de m ieux connaître l'agent pathogène et d'envisager une lutte efficace contre lui.

L 'isolem ent de X.c.c p eut se faire sur milieux gélosés sélectifs ou non. A près 3 à 4 jo u rs d'incubation à 28 °C une prem ière sélection peut être faite sur la couleur des colonies, leur form e bom bée et leur aspect muqueux.

Les techniques d'identification les plus couram m ent utilisées pour caractériser les différents pathotypes sont :

-les techniques biochimiques basées principalement sur l'utilisation de différentes sources de nutrim ents. Ces tests ont l'avantage d'être simples et peu coûteux mais ils ont un tem ps de réponse im portant et sont lourds à mettre en oeuvre.

-le s te c h n iq u e s s é r o lo g iq u e s te lle s q u e l'i m m u n o d i f f u s i o n , l'a g g l u t i n a t i o n , l'im m unofluorescence et les techniques ELISA basées sur l'utilisation d 'anticorps m onoclonaux (A L V A R E Z et al., 1991) ou polyclonaux spécifiques (C IV ER O LO & FAN, 1982). Ces techniques rapides et peu coûteuses perm ettent une différentiation des souches du pathotype A. C ependant l'existence de réactions croisées nécessite une validation par d'autres méthodes.

-les techniques lvsotvpiques basées sur la sensibilité des souches vis à vis des citriphages C P I, C P2 et CP3. Peu coûteux, ces tests permettent uniquem ent une différenciation spécifique des souches du pathotype B (VERNIERE et a i, 1992).

-les techniques basées sur les propriétés des acides nucléiques. Les techniques suivantes : em p rein tes g én om iques (H A R T U N G & C IV ER O LO , 1987), R F L P (G A B R IE L et al., 1988 ; H A R T U N G & C IV E R O L O , 1989 ) et profils de restriction de l'A D N p lasm id iq u e (P R U V O S T

et al., 1992) perm ettent une bonne identification des différents pathotypes.

4. La détection de l'agent pathogène 4.1 Objectifs

La lutte contre le CBA à la Réunion étant im possible par éradication, son contrôle réside sur la m ise en p la ce d 'u n e stratégie de lutte intégrée. Elle co nsiste n o ta m m e n t à d iffu s e r aux a g ricu lteu rs d es p la n ts de p ép in ières indem nes de X.c.c. Il a en e ffe t été m o n tré q u e le dév elo p p em en t de la m aladie en vergers est souvent liée à la plantation de p lantes m alad es ou porteuses saines d'inoculum . Pour cela, il est nécessaire de disposer de techniques de détection spécifiques et sensibles.

Par ailleurs, la propagation de la maladie à longue distance peut être lim itée si le contrôle du m atériel v ég é tal aux fro n tières est efficace. D es m o y e n s de d étectio n sûrs so n t là en co re indispensables.

Enfin, le diagnostic de la maladie à partir de plants atteints sans mise en culture de l'agent pathogène repose égalem ent sur des techniques de détection performantes.

4.2 Les techniques de détection

Les techniques de détection de X.c.c sont diverses. Dans tous les cas, elles doivent répondre à 5 critères :

- la spécificité : il faut détecter l'agent pathogène et lui seul.

- la sensibilité : il faut pouvoir mettre en évidence l'agent pathogène m êm e lorsqu'il est présent en faible quantité. Dans le cas de la détection de X.c.c , il faudra p o u v o ir d étecter la bactérie avant m êm e l'apparition des symptômes sur agrumes.

- la rapidité : pour une utilisation en routine, les tests ne doivent pas être trop lourds. - le tem ps de réponse : les résultats doivent être connus le plus rapidem ent possible. - le coût : les tests ne doivent pas être trop onéreux.

Il faut noter qu'actuellem ent aucune m éthode parfaite alliant spécificité, rapidité et faible coût n'existe. Le choix des tests se fait principalement en fonction de l'équipem ent du laboratoire et du coût des réactifs nécessaires (VERNIERE et al., 1992).

4.2.1 test de pouvoir pathogène :

La m éthode la plus sûre pour détecter X.c.c est d'inoculer des feuilles saines avec un broyât d 'o rg an es d o n t on v eu t tester l'état sanitaire, e t d 'o b se rv er l'ap p aritio n d e sy m p tô m es caractéristiques (K O IZU M I, 1971). Un protocole d'inoculation de feuilles m aintenues en survie en boites de Pétri a été m is au point (CIVEROLO, 1984). Cependant, cette technique est peu aisée car :

- c'est un test assez lourd à mettre en oeuvre.

- les sym ptôm es n'apparaissent q u'après au m oins 7 jo u rs d 'in cu b atio n à 28°C, parfois beaucoup plus si la quantité de X.c.c présente au départ est faible. Ceci nécessite d'incuber les feuilles en survie p en d an t environ 3 sem aines, ce q ui au g m en te fo rtem en t le risq u e de contaminations fongiques, surtout en zone tropicale.

- il est nécessaire d'obtenir une culture pure d e X .c.c et de l'identifier à l'aide des techniques disponibles à l'issue du test de pouvoir pathogène.

4.2.2 techniques sérologiques

E lles so n t b asées sur l'u tilisa tio n d 'an tico rp s m o n o c lo n a u x ou p o ly c lo n a u x spécifiques. L 'im m u n o flu o resc en ce indirecte ainsi que la tech n iq u e E L IS A (C IV E R O L O et al., 1982) sont les techniques utilisées pour détecter X.c.c.

Ces tech n iq u es sont rapides à réaliser (48 heures m ax im u m ) e t p erm etten t une différenciation rapide des souches du pathotype A. Cependant, elles sont peu sensibles (103 à 104 cellules/ml pour l'im m unofluorescence et 105 à 106 cellules/m l pour E LISA ) et pèchent par m anque de spécificité m algré l'utilisation d'anticorps m onoclonaux. En effet, l'anticorps m onoclonal A l spécifique des souches du pathotype A ne réagit pas avec les souches rencontrées au M oyen O rient (V ER N IER E et al., 1993). L'im m unofluorescence, plus sensible que l'EL ISA , est trop fastidieuse pour être utilisable en routine.

4.2.3 dénom brem ents sur milieux gélosés semisélectifs

Un m ilieu sem isélectif (KCB) a été mis au point et utilisé dans le cadre de travaux d'écologie m icrobienne aux USA et en Argentine (G R A H A M et al., 1989). D ans les conditions de la Réunion, sa sélectivité s'est avérée insuffisante (PR U V O ST, com m unication personnelle). Un autre milieu plus sélectif (SPATKCA), exploitant la m ultirésistance aux B-lactamines des souches de X.c.c. dans l'a rc h ip e l des M ascareig n es (P R U V O S T e t al., 1994), a é té m is au p o in t (M ONIER, 1992). L'isolem ent sur milieu sem isélectif est une technique lourde à m ettre en oeuvre, mais très sensible (1 0 1 bactéries/m l). Lidentification à posteriori d es colonies obtenues par au moins une des techniques disponibles est nécessaire.

4.2.4 techniques moléculaires

Il a été m ontré que les souches du pathotype A partagent toutes un fragm ent d'A D N plasm idique de 4,2 kb après digestion par l'enzym e de restriction Bam HI. C e fragm ent est absent des autres pathotypes de X.c.c et du pv. citrumelo.

Deux sondes nucléiques : pFL62.42 et p F L l (sous clone de pFL62.42) ont été mises au point à partir de ce fragm ent. La technique d'hybridation A D N /A D N p a r D ot B lot perm et de détecter rapidem ent sa présence dans une souche donnée. Cette technique m angue cependant de sensibilité (limite de détection : 2 ng d'ADN génom ique soit environ 106 copies) et de spécificité vis à vis du pathotype A présent à la Réunion (signal obtenu avec certaines souches des pathotypes B et C et des pvs. vignicola et bilvae mais pas avec les souches du pv. citrumelo).

4.3 LA PCR (Polvmerase Chain Reaction') 4.3.1 généralités

Cette technique a été mise au point p ar SAIK I et al. en 1985. Elle perm et d'am plifier de façon exponentielle des séquences d'A D N spécifiques p ar synthèse in vitro à l'aide d'une A D N polym érase résistante à le chaleur (Taq ADN polymérase).

Les 3 étapes principales d'un cycle de réaction sont:

- dénaturation par la chaleur de l'ADN double brin possédant la séquence à amplifier. - hybridation de 2 am orces aux séquences spécifiques p résen te s sur ch aq u e brin dénaturé.

- synthèse des brins com plém entaires par extension à partir des am orces grâce à la

Taq A D N polym erase.

Les nouveaux brins d'A D N synthétisés sont soumis à leur tour aux 3 étapes décrites ci-dessus et ce p en d an t de nom breux cycles. Ils constituent d onc de nouvelles c ib les p o u r les amplifications ultérieures.

La spécificité de la PCR repose sur le choix d es am orces d o n t la séq u en ce est com plém entaires d'une séquence présente sur les brins à amplifier.

Ses perform ances o nt tout d'abord été prouvées en m icrobiologie a lim en taire et m édicale pour la détection d'agents pathogènes bactériens ou viraux.

La détection des bactéries phytopathogènes par PCR a été décrite p o u r la prem ière fois par R A S M U S S E N & W U L F F en 1990 qui d év elo p p èren t un pro to co le de d étectio n de

Pseudomonas syringae pv. pisi dans des graines.

La sensibilité et la spécificité de la PCR peuvent être augm entées en utilisant des sondes nucléiques hybridant avec les produits d'amplification (H EN SO N & FR EN C H , 1993). C'est ainsi qu'une sensibilité de 102 copies d'A D N /m l a été obtenue p o u r la détection d e Pseudomonas syringae par hybridation A D N /A D N avec une sonde m arquée à la dig o x y g én in e. C es sondes perm ettent d'une part de détecter les produits d'amplification présents en faible quantité et donc non v isu alisab le s a p rès m igration éléctro p h o ré tiq u e e t d 'au tre p a rt de s'a ffra n c h ir d es risq u es d'amplification non spécifique.

C ependant, ces techniques d'hybridation restent laborieuses et longues ren d an t la détection p ar PC R inutilisable en routine. C 'est p ourquoi a été m is au p o in t un p ro to c o le de "nested PCR" (N -PC R ) qui perm et d'élim iner l'étape d'hybridation tout en g ard an t une grande spécificité.

C ette nouvelle technique basée sur l'application de 2 séries d e P C R avec 2 paires d'am orces différentes (les amorces de la deuxièm e PCR sont spécifiques de séquences internes aux fragm ents am plifiés lors de la prem ière PCR) permet une augm entation de sensibilité par rapport à une seule série d'amplification. La détection de Mycobacterium tuberculosis par N -P C R a perm is d 'augm enter la sensibilité d'un facteur 1000 par rapport à une sim ple PC R (M IY A Z A K I e t al.,

1993). La sensibilité obtenue après N -PCR est comparable à celle obtenue par une seule PC R suivie d'un Southem -B lot (K APPERU D et al., 1993).

L a détection des produits d'amplification se fait généralem ent p ar électrophorèse en gel d 'agarose. L a m igration p erm et de séparer les frag m en ts am plifiés p ar leu r taille. C ette technique assez longue n ’est pas automatisable et rend difficile l'utilisation de la PC R en routine.

P lu sie u rs m é th o d es ne n éce ssitan t pas la s ép aratio n p a r e le c tro p h o rè s e o nt récem m ent été décrites pour la détection des produits d'amplification. Elles s'avèrent aussi sensibles que l'électrophorèse (LA N D G R A F et al., 1991). Ce sont des techniques colorim étriques basées sur l'utilisation p o u r la PC R d'am orces m odifiées par fixation de m olécules ou d e n u cléo tid es qui perm ettent d'une p art la capture des fragments am plifiés e t d'autre part la détection (S T E F F E N & A TLA S, 1991). L a biotine, les com posés fluorescents, la p ero x id ase ainsi que d es séquences reconnues par des protéines sont les outils les plus utilisés.

Ces techniques apparentées aux techniques im m unologiques peuvent être facilem ent automatisables.

La PC R , longtem ps considérée com me une technique qualitative, p eut être utilisée dans le but de quantifier le nombre initial de molécules cibles dans un échantillon. Les techniques colorim étriques précédem m ent décrites peuvent servir à m esurer la quantité de produits am plifiés (L A N D G R A F et al., 1991). Cependant, elles exigent de se p lacer durant la phase exponentielle de l'amplification où il y a proportionnalité entre la quantité de produits form és et celle de l'A D N cible. L a d ifficu lté à estim e r cette phase rend ces techniques inu tilisab les c a r non stan d a rd isab les (SIEB ER T & LA R R IC K , 1993).

Il semble que les meilleurs résultats de PCR quantitative obtenus sont ceux basés sur la co-am plification dans le m êm e tube et avec les m êm es am orces de l'A D N cib le e t d'un A D N

com pétiteur servant de standard de concentration que l'on p eut différencier du p rem ier p a r la taille du fragm ent am plifié. D ans ce cas, les m esures peuvent être faites q u elq u e soit le stade de l'amplification (PA N N ETIER et al., 1992).

4.3.2 mise au point de la PCR sur X.c.c

La séquence de l'insert de p F L l a été déterm inée et a perm is la synthèse d 'a m o rc e s spécifiques du pathotype A de X.c.c (H ARTUN G et al., 1993). Seules les souches du pv.vignicola

et une souche du pv. bilvae donnent une réponse positive avec ces amorces.

La sensibilité a pu être augm entée à 25 pg soit environ 102 copies et à 101 copies après hybridation des produits d'amplification avec la sonde p F L l.

L'intérêt de cette technique très sensible est qu'elle perm et de détecter des bactéries présentes sur de vieilles lésions alors qu'elles sont non détectables sur milieux gélosés (H A R TU N G et al., 1993).

La technique PCR constitue donc un outil de détection performant. Son optimisation en vue de la rendre utilisable en routine ainsi que la m ise au p o in t d'un p ro to c o le de PCR quantitative sont les objectifs que nous nous proposons d'atteindre.

T ab leau 5 : A m o rces de la N-PCR.

Designation Sequence (5'.3') Commentaire

4 7 TG T C G T CGC TTG TAT GGC GGG TG C G AC CGT TCA GGA Produit d'amplification : 469 pb 494-3 494-4 CTC G A T CAC G AT G TC CTT CTC C G TG G A T G GC ATG AGC ATG AAG

Produit d'amplification : 295 pb

494-3 Bio Biotine-CTC GAT CAC G AT GTC CTT CTC C

Amorce permettant la capture

494-4 lac AAT TGT TAT CCG CTC ACA ATT GTG GAT

G GC ATG AGC ATG AAG

Amorce permettant la détection

La séquence de l'opérateur lac d'E.coli est soulignée.

T a b leau 6 : P r o gra m m es des 2 séries d'am plification de la N -P C R .

P rem ière série : C IT R I 1

1 cycle 3 min Dénaturation Association Elongation 1 min 1 min 1 min 95 °C 55 °C 70 °C Dénaturation 30 s 96 °C

34 cycles 2 min 40 Association 1 min 58 °C

Elongation 1 min 10 72 °C

D eu xièm e série : C ITR I 2

Dénaturation 30 s 96 °C

20 cycles Association 30 s 58 °C

1.1 D escription

L a souche JA159.1 isolée à la R éunion en 1981 sur c lé m en tin ier (C itru s r e tic u la ta

cv.Clém entine ) est utilisée pour la N-PCR.

La souche C40S est un m utant spontané de la souche C 40 isolée de lésions foliaires sur un oranger de la variété "W ashington navel" à la Réunion en 1988. Résistant à la streptom ycine, il est utilisé p o u r l'étude de la dissém ination du chancre bactérien par la pluie. C es d eux souches appartiennent au pathotype A et sont pathogènes sur agrumes.

Elles sont conservées à -80°C sous forme de microbanques (Pro Lab Diagnostic). 1.2. Culture et numération

Les bactéries sont cultivées à 28°C sur milieu L P G A T ou sur milieu S P A T en présence de 50 mg/ml de streptomycine pour la souche C40S.

Les suspensions bactériennes sont réalisées dans des tubes de tam pon HC1 stérile. La densité optique (DO) est m esurée à 600 nm pour évaluer la concentration des bactéries dans les tubes. Des dilutions au dixièm e sont effectuées dans le même tampon de sorte à obtenir des suspensions de titre inférieur. Elles seront soumises à la N-PCR.

Le nom bre de bactéries est estim é parallèlem ent sur milieu S PA T après d ép ô t de 49 (il de suspension bactérienne à l'aide de l'ensem enceur spiral (Interscience, FR A N C E). A près incubation pendant 2 jours à 28°C, les colonies sont comptées.

La composition des milieux et tampons utilisés est donnée en A nnexe 1 1. L es so u c h e s b a ctérien n es

2. l'A D N p la sm id iq u e : p F L l

Le plasm ide pFL62.42 a été construit en clonant un fragm ent Bam H1 de 4,2 kb d e l'A D N plasm id iq u e de la souche X C 62 de X.c.c dans le vecteur pU C 9 (P R U V O S T et al., 1992) Le plasm ide p F L l contient un fragm ent Eco R I de 572 pb (cloné dans pU C 9) p ro v en an t de l'insert de pFL62.42 (H A R TU N G , 1993).

C e plasm ide, conservé dans la souche JM 107 d'E.coli. est extrait par la m éthode alcaline décrite p ar B IR N B O IM & D O L Y (1979) et purifié à l'aide du k it "Prep-A -G ene D N A M iniprep" (Biorad, France).

L a co n cen tratio n en A D N est estim ée par fluorim étrie (flu o rim ètre T K O 100, H o efer Scientific). Le principe de cette technique figure en Annexe 2.

D es dilutions au dixièm e sont réalisées dans du TE à partir de la solution m ère de sorte à obtenir une gam m e de concentrations s'échelonnant de 107 à 1 copie de p F L l/|il qui sera soumise à la N -PC R .

3. La N - P C R

3.1 Sélection des amorces

La séquence des am orces a été déterm inée à partir de l'analyse de la séquence d e l'insert

Eco RI de 700 pb de p F L l. Le choix des amorces a été fait après étude de la séquence par le logiciel M ac V ector (IBI Kodak, N ew haven, CT USA) (H A R TU N G , com m unication personnelle). Leur localisation et description sont données dans le Tableau 5 et la Figure 1.

Les am orces 4 et 7 sont utilisées pour la prem ière série d'am plification de la N -PC R . Les amorces internes 494-3 et 494-4 sont utilisées pour la seconde série.

P o u r la d étection co lo rim étriq u e des p roduits d 'am p lificatio n , on u tilise les am o rces m a rq u ées. L 'am o rc e 4 9 4 -3 bio p o ssèd e à son ex trém ité 5' un ré s id u b io tin e q u i p e rm e t l'im m obilisation des produits d'am plification. L'am orce 494-4 lac possède à son extrém ité 5' la séquence de 21 pb de l'opérateur lac d'E.coli. qui perm et de détecter les fragm ents biotinylés.

10 20 30 40 . 50

--- 5--- ^

C G T T G C A C C T C C C G C T G C A T G G C G T T G G T G T C G T C G C T T G T A T G G C C T A T

60 70 80 90 100 A G T C G A T A C T G G A A A T C A TT ATATATATAC ATAG ATAAGT ATATATATAC

110 120 130 140 494-3 B io 150 C T A T C A A C C C T TG A G G A A G G G C T T C C A G T G C C TC G A TC A C G A T G T C C T T C 160 170 180 190 200 T C C G T G A C C C T G C C G C C T T C T C T T C C G A G G C C T G A G G C C T G C G C G C G C A G 210 220 230 240 250 G T G A T C A G C C A G T T C C T C G G G G A A G TTG A A G A T TT T TT G C A C C C G T G C G C 260 270 280 290 300 G G C C G T A G C G C T G C G T T T C C T C A G C A G C G G G C G G C G T G G C T G C C G G T G T C 3 1 0 320 330 340 350 G T G G T C A C G G C A G C A G G T G C C A C C A G C G G C T T C T C G G C C T T G T C C G C C T C 3 6 0 370 380 390 4 0 o C G C C T T C G A G G A A G C G T C G G T C T T G G C G G C T TG A A C T G C G C C G T G T T G G G

X

PCR avec amorces non marquées 4 9 4 - 3 BiO

V / / A

777771

< ï

3.2 Les conditions de la N-PCR

Les réactions sont effectuées à l'aide de l'am plificateur PC R P T C -100 (M J R esearch, W atertow n, M A,USA).

25 |il de m élange réactionnel contenant 2,5 |il de tampon de Barry 10 x (50 m M de Tris, 200 mM de NaCl, 10 % de triton X100, 1 % de gélatine, 30 mM deM gC l2) (B A R R Y et al., 1991),

0,5 (iM de chaque am orce, 125 |iM de chaque nucléotide et 0,5 U de T a q A D N p o ly m erase (B oehringer M annheim ou G ibco BRL) sont soumis après addition de l'A D N cible à l'amplification. Deux gouttes d'huile minérale stérile sont ajoutées pour éviter l'évaporation du mélange.

Le m êm e m élange réactionnel est utilisé pour les deux séries de PC R , seules les am orces changent (Tableau 5). Un fil de la première série d'amplification sert de cible pour la seconde.

Les program m es d'amplification de la première (CITRI 1) et de la deuxièm e PC R (CITRI 2) sont présentés dans le Tableau 6.

Les d ifférentes étapes précédant l'am plification sont différentes selon que l'on soit en présence d'ADN purifié ou de cellules vivantes : elles sont présentées en Annexe 3.

Afin d'éviter au m axim um d'éventuelles contaminations liées à la présence d'aérosols, toutes les manipulations sont réalisées sous hotte à flux laminaire. Des em bouts à filtre sont utilisés pour les m icropipettes. T o u tes les solutions (eau, huile, tam pon) sont aliq u o té es en p etit v o lu m e et autoclavées. Le port de gants est indispensable. Les m anipulations sont réalisées dans des pièces différentes et avec des micropipettes différentes avant et après l'amplification (KW OK, 1990).

4. D étection et a n a ly se des produits d'am plification 4.1 Détection électrophorétique

2 à 3 [il de produits d'amplification obtenus après la deuxièm e PC R sont déposés dans les puits d'un gel d'agarose à 2 ou 3 % (Nusieve 3:1, FM C B ioproducts, R ockland U SA ) et soum is à une électrophorèse d'1 h 15 à 1 h 30 à 3,3 volts/cm dans du TA E (Annexe 1).

Les bandes d'A D N sont visualisées grâce au transillum inateur U V après coloration dans une solution de bromure d'éthidium à 0,5 |Xg/ml.

Le m arqueur VI (pBR328 digéré par Bgl I et H in f I, Boehringer M annheim .; A nnexe 4) est utilisé comme marqueur de taille.

Les p h o to g rap h ies et l'analyse des bandes est effectuée à l'aide d e l'an a ly seu r de gel G DS 5000 UVP.

4.2 Détection colorimétrique (Figure 2)

Le kit D IA N A (Detection of Immobilized A m plified Nucleic Acids, D ynal, N orvège) est un système qui perm et la détection colorimétrique des séquences d'A D N amplifiées. Les réactifs fournis sont utilisables pour des protocoles qualitatifs et quantitatifs.

40 |il de produits d'amplification sont mélangés à 40 |il (100 |ig) de billes rñagnétiques lavées sur lesquelles sont fixées des molécules de streptavidine (D ynabeads M 280 Streptavidine ; Dynal, N orvège).

D urant l'incubation de 15 minutes à température ambiante, les fragm ents biotinylés grâce à l'am orce 494-3 Bio (Tableau 5) sont capturés et im m obilisés sur les particules m agnétiques elles m êm e attirées par un support -aimant.

Les billes porteuses de l'A D N im m obilisé sont ensuite lavées avec 100 (il d'une solution contenant 25 mM de Tris HC1 (pH 8), 0,2 M de NaCl, 1 mM d'EDTA, 10 m M de M gC l2 , 10 m M de dithiothréitol et 0,05 % de Tw een 20 (Tampon DIANA).

Les billes sont resuspendues dans 50 (il du même tampon et 50 |il d'une solution à 0,5 mg/ml de protéines de fusion constituées par le répresseur du gène lac et la B galactosidase.

L'incubation pendant 20 minutes à température ambiante perm et la fixation du répresseur à la séquence de l'opérateur lac fixée sur l'amorce 494-4 lac.

Les billes séparées magnétiquement sont ensuite lavées 4 fois avec 150 |il de tam pon DIANA et resuspendues dans 50 |il du même tampon.

50 (il d 'u n e so lu tio n à 1,25 m g/m l du su b strat ch ro m o g én iq u e d e l'en z y m e , l'ortho nitrophenyl B-D- galactoside (ONPG) sont ajoutés. Après incubation de 20 m inutes, le transfert de

75 (il du m élange est réalisé dans des plaques de titration et la réaction est stoppée avec 75 |il d'une solution de Na2CC>3 1M.

Les échantillons positifs présentent une coloration ja u n e do n t I'absorbance est m esurée à 405 nm par un lecteur ELISA (Bio Tek Instrument).

5 .T ests d 'in h ib itio n de la N -P C R 5.1 Effet des extraits d'agrumes

7 clones de C itrus cultivés sous serre ont été utilisés p o u r cette ex périence : le lim ettier M exicain (iCitrus aurantifolia) SRA 619, le limettier de Tahiti (Citrus latifolia) SRA 58, le com bava

(Citrus hystrix), le clém entinier (Citrus reticulata cv. C lém entine) SR A 63, T ángelo orlando (C.

reticulata cv.Dancy x C. paradisi cv. Duncan), l'oranger cv. Valencia (Citrus sinensis)SRA 360 et le pomelo cv. Henderson (Citrus paradisi ) SRA 336.

5 g de feuilles de chaque espèce sont prélevés et broyés dans du tam pon Tris-H Cl (pH 7- 7,2) à l'aide du broyeur stom acher 400 (Seward Médical UK).

Les effets de 1 (il ainsi que 10 (il d'extraits d'agrum es sur la N -PC R sont testés pour les concentrations de 101 et 103 bactéries (JA159.1)/réaction.

Les échantillons sans broyats d'agrumes constituent les témoins positifs. Des tém oins négatifs sans bactéries sont réalisés afin de s'assurer de l'absence naturelle de X.c.c sur les feuilles. Les témoins sans bactérie et sans extrait d'agrume permettent de montrer l'absence de contaminations.

Les program m es d'am plification C ITR I 1 et C ITR I 2. sont appliqués. 1 |il d e la prem ière série d'amplification sert d'A D N cible pour la deuxième série.

5.2 Effet du cuivre

C ette expérience est réalisée en p résence de différentes co n cen tratio n s d 'u n e solution d'hydroxyde de cuivre (Cham pion Flo., C alliope France). La solution m ère à 34 m g/100 ml est diluée dans du tam pon Tris-H Cl de sorte à obtenir les quantités suivantes : 340 |ig , 34 [ig, 340 ng, 34 ng, 3,4 ng.

L'effet de 1 |il des d ifférentes quantités de cu iv re sur la N -P C R est étu d ié p o u r des concentrations en JA 159.1 (source d'AD N cible) de 101 et 103 cellules/réaction.

Le cu iv re e s t in tro d u it u niquem ent dans le m élan g e réac tio n n e l de la p rem ière série d'am plification et soum is au program m e C ITR I 1. 1 (il des produits d 'am plification obtenus sert d'A D N cible pour la seconde série.

6. N -P C R q u a n tita tiv e (Figure 3) „

La PCR quantitative est basée sur le principe de coamplification de l'A DN cible avec un ADN com pétiteur de concentration connue en présence des m êm es am orces et des m êm es conditions opératoires.

L'A DN com pétiteur diffère de l'ADN cible uniquem ent p ar sa taille puisqu'il possède en plus 4 copies de la séquence de l'opérateur lac. Cette différence de taille p erm et de d ifféren cier les amplifiais de l'ADN cible et de l'ADN compétiteur par électrophorèse.

Dans notre expérience, A31 constitue l'A D N com pétiteur. Sa séquence, horm is le fragm ent

lac, est identique à ceÛe de p F L l. Sa concentration est déterminée par fluorimétrie et des solutions de concentrations allant de 1 à 107 copies/p.1 de TE sont préparées.

C haque suspension d'A D N com pétiteur est soum is à la N -PC R en p résence d'u n e quantité fixe d'A D N cible. A insi, ljil de chaque tube de la gam m e d'A31 est ajouté à l |i l de p F L l ou de JA159.1 dans le m élange réac tio n n e l. Quatre concentrations de p F L l et de JA159.1 ont été testées :

101, 1 0 3, 1 0 5 et 107 copies de séquence cible/jj.1.

Les amorces 4 et 7 sont utilisées pour la prem ière série d'am plification. Pour la seconde série, on utilise l'amorce 494-3 biotinylée et l'amorce 494-4 qui ne possède pas la séquence de l'opérateur lac.

Première étape: N-PCR A D N cible > A D N compétiteur 4 bio

VA

— • s

Y

■ XA

y

à

1ZO T 3 1

1

X, ■

VA

Deuxièm e étape : Détection colorimétrique des produits d'amplification

t t-t t Signal colorimétrique + Signal colorimétrique •' + + + 4 bio — e -r / l ■ I l 1 1 1 ■ t / J 494.4 7 4 bio • — M ■ ■ M

de la séquence de l'opérateur lac

A D N cible

494.4 7

O — c Bille magnétique + Streptavidine

• Biotine

A im ant

§ ONPG

0 B galactosidase

S