• Aucun résultat trouvé

Milieu de culture sélectif pour la détection de Pseudomonas protegens

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2021

Partager "Milieu de culture sélectif pour la détection de Pseudomonas protegens"

Copied!
2
0
0

Texte intégral

(1)

HAL Id: hal-02476714

https://hal.archives-ouvertes.fr/hal-02476714

Submitted on 5 Jun 2020

HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers.

L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d’enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés.

Milieu de culture sélectif pour la détection de Pseudomonas protegens

Sylvie Pages, Jean-Claude Ogier, Sophie Gaudriault

To cite this version:

Sylvie Pages, Jean-Claude Ogier, Sophie Gaudriault. Milieu de culture sélectif pour la détection de Pseudomonas protegens. 9. Colloque de l’Association Francophone d’Ecologie Microbienne (AFEM), Nov 2019, Bussang, France. �hal-02476714�

(2)

Milieu de culture sélectif pour la détection de Pseudomonas protegens

Sylvie Pagès, Jean-Claude Ogier, Sophie Gaudriault

UMR 1333 INRA-Université de Montpellier

DGIMI : Diversité, Génomes et Interactions Microorganismes-Insectes Université de Montpellier

Bât. 24, 3ème Etage, CC101 Place Eugène Bataillon

34095 MONTPELLIER CEDEX 5

Espèces CMI Irgasan®

µg/mL

P. aeruginosa 1000

P. protegens 1000

P. putida 250

Stenotrophomonas maltophilia 250 Achromobacter xylosoxidans 1000 Agrobacterium tumefaciens < 100 Ochrobactrum anthropi < 1 Ochrobactrum intermedium < 1 Photorhabdus luminescens < 1 Variovorax paradoxus < 10 Xenorhabdus nematophila < 1

E. coli < 1

GLU AR MN MA NA MA GN CAP ADI MLT CIT PAC

Espèces (Nombre de souches)

D-glucose L-arabinose D-mannose D-mannitol N-acetyl- D-maltose Potassium Capric acid Adipic acid Malic acid Trisodium Phenylacetic

Pseudomonas aeruginosa (2) + - - + + - + + + + + - Pseudomonas chlororaphis (5) + v + + + v + + - + + v Pseudomonas protegens (12) + - + + + v + + + + + +

Pseudomonas putida (3) + - + v - v + + - + + v

Stenotrophomonas maltophilia (6) + - + - + + v v - + + - Achromobacter xylosoxidans (4) v - v - - - + + + + + + Agrobacterium tumefaciens (3) + + + + + + + - - + v - Ochrobactrum anthropi (4) + + v - + v v v - + v - Ochrobactrum intermedium (1) + + + + + + + + - + + - Photorhabdus luminescens (1) + - + - + + + - - - v - Variovorax paradoxus (5) + + + + v - + v + + v + Xenorhabdus nematophila (1) + + + + + - - - - + - -

Concentration Minimal Inhibitrice Irgasan ®

+: assimilation, -: absence d’assimilation, v: variable

Screening rapide par PCR-fitF (2)

(gène spécifique de P. protegens)

Identification des taxons par PCR-ARNr16S

Culture 3 jours à 28°C

500 pb

1500 pb

1 2

5

3

8

6

9 7

INTRODUCTION

1/ TESTS PRELIMINAIRES à l’élaboration du milieu

Assimilation des sucres : API 20NE System

Diverses substances sont utilisées pour rendre un milieu sélectif, antibiotiques, produits chimiques, colorants ou combinaison de produits. Le choix est orienté par rapport aux besoins nutritionnels des bactéries à isoler. Il est donc nécessaire de déterminer quelles substances sont adéquates afin d’isoler sélectivement le

candidat. Aujourd’hui, l’intérêt d’isoler des microorganismes à partir de différentes matrices complexes est devenu nécessaire. La métagénomique et la culturomique sont des approches complémentaires afin d’étudier la biologie fonctionnelle des micro-organismes dans les écosystèmes (1).

OBJECTIF : création d’un milieu de culture afin d’isoler spécifiquement et sélectivement l’espèce Pseudomonas protegens

3/ VALIDATION du milieu M9-PP-Agar sur cultures isolées Assimilation de l’ acide

adipique (ADI) par

P. protegens : utilisation comme source de carbone

Ingrédients (concentrations finales utilisées)

M9-PP 2X

M9 Base… ………..2X

Stérilisation de la sol. mère 5X par autoclavage 20 min à 120°C

Irgasan® *……….. 20 µg/mL

Stérilisation par filtration 0.2µ

Conservation de la sol. mère à 20 mg/mL à -20°C

Acide adipique……… ….20 mM

Stérilisation de la sol.mère à 0.1M par filtration 0.2µ

MgSO4, 7H2O… ………..4 mM

Stérilisation de la sol.mère à 1M par autoclavage 20 min à 120 °C

CaCl2, 2H2O………. 0.2 mM

Stérilisation de la sol. mère à 0.1M par autoclavage 20 min à 120 °C

Agar 2X Agar ……….……… 30 g/L

Stérilisation par autoclavage 20 min à 120 °C Conservation en surfusion à 56°C

Mode opératoire 125 mL de M9-PP 2X et 125 mL de Agar 2X sont mélangés

extemporanément puis le mélange est distribué en boite de Petri Culture Aérobiose, températures 28°C - 37°C

2/ PROCEDURE DE PREPARATION du milieu

Pseudomonas protegens est résistant à l’Irgasan®

CMI à 1 mg/mL Figure 1 : exemples de croissance bactérienne observée sur milieu M9-PP-Agar

4/ PERFORMANCE du milieu M9-PP-Agar en matrice complexe

Figure 2 : croissance bactérienne à partir d’un échantillon de sol

Spots 1 et 9 : P. protegens

Spot 2 : Variovorax paradoxus Spot 3 : Serratia liquefaciens

Spot 5 : Achromobacter xylosoxidans Spot 6 : Stenotrophomonas maltophilia Spot 7 : P. putida

Spot 8 : P. aeruginosa

Figure 3 :exemple de validation par PCR-fitF (2) et PCR-ARNr16S des taxons sur M9-PP-Agar

Références :

(1) Carini P. mSystems. 2019; (2) Péchy-Tarr et al Environ Microbiol. 2008; (3) Keel et al. Environ Microbiol. 2016; (4) Ogier, Pagès et al submitted to Microbiome.

CONCLUSIONS et PERSPECTIVES

- 75 % de spécificité et 100 % de sensibilité pour isoler Pseudomonas protegens (68 souches testées et 23 espèces représentées) : croissance - 100 % de spécificité : croissance + couleur brune des colonies, caractère différentiel pour sélectionner P. protegens d’autres taxons

- M9-PP-Agar utilisable à partir de matrices complexes pour la recherche de l’espèce P. protegens, agent de bio-contrôle (3), bio stimulant, associée à des macro organismes comme les nématodes entomopathogènes (4)

- Publication en cours ( Journal of Microbiological Methods)

* Dissolution de l’Irgasan® dans l’ éthanol 100 %

20 % matrice de sol mélangé à 10

+5

CFU de P. protegens CHAO

T

Dilutions de 10 en 10 sur GNO et M9-PP-Agar

Culture 48 heures à 28°C

Gélose nutritive Ordinaire (GNO)

M9-PP-Agar

5/ CONTR Ô LES des CFU sur milieu M9-PP-Agar

Colonies brunes

- Pseudomonas aeruginosa et P. putida - Stenotrophomonas maltophilia

- Agrobacterium tumefaciens - Achromobacter xylosoxidans - Variovorax paradoxus

- Serratia liquefaciens et S. marcescens

pas de brunissement des colonies - Pseudomonas protegens : colonies brunes

Différence de 3 log entre les cultures GNO et M9-PP Réduction de la croissance des champignons

colonies brunes

Taxons identifiés cultivant sur M9-PP-Agar

Références

Documents relatifs

Entre 1959 et 1972, les missions Corona ont eu pour objectif d’espionner le bloc soviétique (prin-.. Le suivi des changements d’occupation et d’utilisation des sols en milieu urbain

Optimisation d’un microcapteur GaAs à ondes acoustiques et de sa biointerface pour la détection de pathogènes en milieu liquide.. Université de Franche-Comté; Université de

Cela confirme la présence du carbocation tertiaire E dans le milieu superacide qui subit une réaction de deutération ionique après activation d’une liaison C-D du

• Un usager ou un résident qui a été en contact étroit ou élargi (en provenance d’un milieu de soins) ou qui est un contact à risque modéré ou élevé (en provenance de

A partir d‟un prélèvement de l‟épithélium cornéen et limbique de lapins, les cellules épithéliales (limbiques et cornéennes) sont ensemencées dans des inserts

Le type de résidus utilisés comme source de carbone organique aura une influence sur la croissance des microalgues, mais également sur la production de lipides et le profil

Plusieurs études ont été entreprises simultanément avec pour but principal de dimensionner un projet pour le développement des cultures notamment coton, en