Isolement des mycètes producteurs de substances antibactériennes à partir des sols sahariens

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République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de l’Enseignement Supérieur

et de la Recherche Scientifique

Université Mentouri de Constantine Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie Département des Sciences de la nature et de la Vie

Memoire

Présenté pour l’obtention du diplôme de Magister En Microbiologie et Biochimie Appliquées

Par

:

ABDELAZIZ Wided

Thème

Isolement des mycètes producteurs de substances antibactériennes à partir des sols sahariens

Devant le jury :

Présidente : Mme MERAIHI Z. Prof. Univ. Mentouri, Constantine Rapporteur : Mr. KACEM CHAOUCHE N. MC. Univ. Mentouri, Constantine Examinateurs : Mr. LAROUS L. Prof. Univ. Ferhat Abbas, Sétif Mr. DEHIMAT L. MC. Univ. Mentouri, Constantine

Année Universitaire : 2005-2006

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Introduction

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1- Introduction

Les moisissures, ou les mycètes ou les champignons filamenteux, sont des acteurs importants du monde microbien. Ils sont impliqués dans une multitude de processus biologiques de l’environnement. Ils présentent, on outre, un intérêt économiques, en raison à la fois de leur utilité et de leurs activités néfastes multiples : altérations des produits alimentaires et détériorations dans nombreux autres domaines, production de mycotoxines, vie parasitaire aux dépends de l’homme, des animaux et des plants.

Par ailleurs, elles synthétisent un grand nombre de substances complexes économiquement très importantes : acides organiques, alcaloïdes, antibiotiques, terpènes et enzymes.

Aujourd’hui, la connaissance de la biologie des moisissures est encor partielle ; cependant, la compréhension des métabolismes primaires et secondaires et de la génétique de ces microorganismes permet de maîtriser de mieux en mieux leurs capacités de biosynthèse et leur mise à profit pour l’homme.

A l’heur actuel, il n’existe pas en Algérie de données scientifiques significatives sur les variétés de mycètes, leur écologie et leur potentiel de production de métabolites secondaires.

D’autant plus, une grande partie de la superficie algérienne se situe entre 39°C et 10°C de latitude nord, caractérisée par un sol pauvre et une salinité avoisinante, par fois 18 g/L et une température basse par la nuit et une grande chaleur par le jour. Ces données laissant croire que, des souche fongiques productrices des métabolites secondaires stables à utilités biologiques peuvent être isolées et identifies à partir de zones arides situées dans le sud Algérien.

Aussi, l’objectif de notre travail est la recherche de mycètes développant d’activité antibactérienne, isolés du sol des régions aride. En effet, le travail s’articule sur :

• L’isolement des souches fongiques à partir du sol prélevé au sud est de Biskra ;

• La purification et l’identification des isolats obtenus ;

• La sélection des isolats produisant de substances à effet antibactérien par la mise en évidence de cette activité sur un milieu solide ;

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Introduction

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• La production de substance sur un milieu de fermentation optimisé et étudier l’effet du pH, température et source de carbone et azote sur la production de substances antibactériens.

• L’extraction et purification de la substance (utilisation de solvants organiques, chromatographie sur colonne, chromatographie sur couche mince).

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Revue bibliographique

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2- Revue bibliographique

2.1-Généralités sur les mycètes

Les champignons (fungi ou mycètes) constituent un groupe d’organismes hétérotrophes ubiquistes, riche de quelques 120000 espèces, présentant des structures et des caractéristiques biologiques extrêmement diversifiées, adaptés au mode de vie saprophyte, parasitaire ou symbiotique (Senal et al., 1993 ; Anonyme a, 2000 ; Anonyme b, 2000 ; Kirk et al., 2001).

Les mycètes sont des microorganismes eucaryotes filamenteux, aérobies strictes et rarement anaérobies (Mathew, 1995 ; Tortora et al., 2003), ayant un métabolisme hétérotrophe car ils tirent leur énergie de la respiration et de la fermentation des matières organiques solubles disponibles dans leur environnement (Leveau and Bouix, 1993 ; Nicklin et al., 1999) .

Sur le plan morphologique, le mycète est constitué d’un thalle qui forme son appareil végétatif (Hawksworth et al., 1994). L’appareil végétatif se compose d’élément de base appelé hyphe qui forme un réseau de filaments ramifiés ; le mycélium (Mathew, 1995). Chez la plupart des mycètes, les hyphes sont divisés par des cloisons, ou septa (septum au singulier) formant des unités qui ressemblent à des cellules distinctes avec un seul noyau, on les appelles alors hyphes segmentés ou septés. Dans quelques classes de mycètes, les hyphes ne contiennent pas des cloisons et ont l’aspect de longues cellules continues à noyau multiples ; ils sont appelées cénocytes (Tortora et al., 2003).

Les hyphes, segmentés ou non, sont en fait de petits tubules transparent s’entourent d’une paroi cellulaire rigide formée de polymère de chitine et des polymères de la cellulose, éléments chimiques qui lui confèrent une grande rigidité, une longévité et une grande capacité de résistance à la chaleur et à des pressions osmotiques élevées. De ces faits, les mycètes sont donc capables de vivre dans un environnement rude (Tortora et al., 2003). En effet, les mycètes se développent à pH légèrement acide (3 et 7) et à une température optimale comprise entre 20°C et 30°C, cependant certaines espèces sont psychrophiles, se développant à des températures très basses (<15°C ou même parfois à <0°C (Botton et al., 1990 ; Guiraud, 1998 ;Tortora et al., 2003).

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Comme chez les bactéries, la digestion des grosses molécules chez les mycètes doit commencer dans le milieu extérieur car seules les molécules de taille relativement petites peuvent franchir la paroi et gagner le cytoplasme (Davet, 1996). Les molécules complexes ou polymères doivent auparavant être dégradés en monomères par des enzymes excrétées ou liées à la paroi. Ces enzymes extracellulaires sont largement exploitées par la bio-industrie (Botton et al., 1990).

La plupart des champignons possèdent deux modalités de reproduction ; la reproduction asexuée (imparfaite ou végétative) et la reproduction sexuée (parfaite) (Senal et al ., 1993). La plupart des espèces sont, en effet, capables de former des spores, soit à l’intérieur de sporocystes (chez les champignons inférieur et à thalle non cloisonné), soit sur des ramifications différenciées du mycélium (conidiophores) (Davet, 1996).

Les mycètes sont divisés en deux grandes divisions ; Division Myxomycetes, qui à son tour subdivisée en trois classes à savoir : Dictyosteliomycets, Myxomycetes et Plasmodiophoromycetes, et la Division des Eumycota qui regroupe les sous divisions ; Mastigomycotina (Oomycetes, Chytridiomycetes), Zygomycotina, Ascomycotina, Basidiomycotina et Deuteromycotina (Hawksworth et al., 1994).

2.2- Conditions de culture des mycètes

• Macroéléments

Le carbone constitue l’élément le plus abondant dans la cellule fongique. Il représente environ 50 % de la cellule (Riviére, 1975), alors que, la teneur en azote varie entre 10 et 15%

(Scriban, 1993). Ainsi, le rapport carbone/azote influe considérablement la croissance et il est pour les mycètes de l’ordre de 20/1 (Barker et Worgan, 1981 ; Botton et al., 1990).

Grâce à la glycolyse et au métabolisme aérobie, les mycètes assimilent les sucres facilement métabolisables comme le glucose, le maltose, le saccharose et les polymères tels que l’amidon (Nicklin et al., 1999), comme ils peuvent dégrader les substrats organiques bon marché comme les déchets issus de l’industrie agro-alimentaire : la peau de mandarines (Nishio and Nagai, 1981), les mélasses et les pulpes de betteraves (Beldwins et al., 1986), les déchets d’abricot et de pèches (Aksoz, 1990), la pulpe et la peau d’orange (Hart et al., 1991). En outre, les mycètes utilisent facilement le lactosérum comme source de carbone (Rivière, 1975).

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Par ailleurs, les mycètes utilisent l’azote sous sa forme minérale ou organique. La plupart des mycètes peuvent en général, assimiler aussi bien l’azote ammoniacal que l’azote nitrique (Davet and Rouxel, 1997) et lorsque il s’agit de l’azote organique, il est plus souvent apporté sous forme de peptone. Parfois, la source d’azote organique peut servir simultanément de source de carbone (Davet and Rouxel, 1997).

• Oligo-éléments

En plus de la source carbonée, de la source azotée et des facteurs de croissance, plusieurs sels minéraux comme KH2PO4, MgSO4.7H2O et CaCl2 et des concentrations moindres comme Mn, Fe, Zn, Cu, etc. sont nécessaires à la croissance des mycètes (Larpent-Gourgaud and Sanglier, 1992).

2.3- Ascomycètes et Chrysonilia

Les Ascomycotina (Ascomycètes) est le groupe de champignons le plus important (environ 35 000 espèces en majorité microscopiques). Les mycètes de ce grand groupe sont caractérisés par la formation, au cours de leur reproduction sexuée, de sporocystes spécialisés ou asque à l’intérieur duquel s’individualisent, à la suite d’une méiose, les ascospores. Chez les plus évolués, les asques sont, à maturité, contenus dans un organe appelé ascocarpe (Le poivre et al., 2003).

La paroi est constituée d’une seule couche de micro fibrilles de chitine noyée dans une matrice de glycane plus ou moins ramifiés. Les cloisons ou septa ne sont pas liées à la division des noyaux : elles sont mises en place indépendamment. Chez le genre Neurospora, les cloisons apparaissent 24 heurs après la formation de l’hyphe. Elles s’édifient de la périphérie vers le centre à la lumière d’un diaphragme qui se ferme, laissant un pore central large de 300 à 500 nm, qui permet le passage du cytosol, de mitochondries et de noyaux. La présence de ces cloisons incomplètes renforce la rigidité des hyphes et permet des pressions intra vacuolaires plus élevées et elle évite la perte de substances en cas de blessure (Bouchet, 1999).

Au fur et à mesure de la croissance, les pores sont obturés par des bouchons de glycane, ce qui isole progressivement les parties les plus âgées du mycélium destinées à disparaître. Chez

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Neurospora, les premières obturations commencent au vingtième jour de la formation des hyphes (Bouchet, 19999).

2.3.1- Chrysonilia

Le genre Chrysonilia qu’est la forme parfaite de Neurospora est un groupe de mycètes appartenant aux ascomycètes ; caractérisé par un thalle à paroi épaisse, septé, claire à croissance rapide. Les arthrospores sont hyalines portées sur des conidiophores non différenciés. Les spores se séparant facilement et présentant entres elles un filament protoplasmique émis par le pore central de la double cloison intermédiaire (figure 1). Ces mycètes sont thermorésistants par ses ascospores qui sont capables de survivre à la panification (Botton et al., 1990).

Le genre Chrysonilia regroupe des espèces très hétérogènes isolées du sol des régions chaudes. Possédant une vitesse de croissance très rapide et provoque d’énormes problèmes de contamination au laboratoire (Talo et al., 1996 ; Anonyme c, 2006).

Figure 1 : Morphologie et organisation mycélienne de Chrysonilia sp. ( Dr. James Scott photographs).

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Selon Erikson et Hawksworth (1998), la taxonomie du Chrysonilia repose sur sa forme parfaite qui est le Neurospora, et suit l’organisation suivante:

Branche : Ascomycotina Sou branche : Pezizomycotina Classe : Sordariomyctes Order : Sordariales Genre : Chrysonilia

Les meilleurs milieux de culture pour l’isolement et identification de Chrysonilia sp sont : Neurospora Culture Agar et Potato Dextrose Agar et milieux contenant de la lignine ou la lignocellulose comme source de carbone (Duran et al., 1994 ; Ferraz and Duran, 1995 ; Rodriguez et al., 1997).

2.4- Sol

2.4.1- Généralités sur le sol

Le sol est le milieu meuble où s’ancrent les racines et dans lequel puisent l’eau et les élément minéraux nécessaires à la croissances et au développement des végétaux. Ce n’est qu’une infime pellicule à la surface de la croûte terrestre, former au cours des temps géologiques par une lente transformation des roches mères initiales sous l’effet de phénomènes physiques, chimiques et biologiques dont l’action se poursuit de nos jours (LeClech, 2000).

Le sol est un complexe dynamique, caractérisé par une atmosphère interne, une économie de l’eau particulière, une flore et une faune déterminées, des éléments minéraux. Mais le sol est aussi un milieu dynamique car ses propriétés s’acquièrent progressivement sous l’action combinée des facteurs du milieu (Dechaufour, 1979).

Le sol est un milieu minéral poreux, gaz et liquide peuvent y circuler. On y distinguera donc, trois compartiments physiques : un compartiment solide, un compartiment liquide et un compartiment gazeux. Mais le sol n’est pas seulement un substrat physico-chimique, c’est aussi un support de vie, créatrice de matière organique. Aux tris fractions précédentes il nous faudra donc ajouter pour décrire le sol un compartiment organique vivant, métabolique actif, de la matière organique morte (Davet, 1996).

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8 2.4.2- Caractéristiques du sol aride

Les milieux arides sont des milieux fragiles, où les populations animales et végétales sont susceptibles de subir des variations brutales, en extension et en nombre. Le rythme de développement des populations animales et végétales en milieu désertique est aléatoire, étroitement dépendant des précipitations et une communauté importante de microorganismes sont liés à ces populations (Muzzolini, 2000 ; LeBerre and Ramousse, 2001).

Le milieu aride se caractérise par des précipitations annuelles faibles, à distribution très irrégulière dans le temps comme dans l'espace, et notablement inférieures à l'évaporation potentielle annuelle. En zone aride, il pourrait s'évaporer 10 à 20 fois plus d'eau qu'il n'en tombe chaque année (Margat, 1985). Des indices ont été définis (Lloyd, 1986 ; Midleton and Thomas, 1997) pour classer les zones climatiques en fonction de leur degré d’aridité (Tableau 1). L'indice d'aridité (Ia) est le rapport entre la moyenne des précipitations annuelles (P) et l'évapotranspiration potentielle (ETP). Selon Smith et Koala, (1999) l’indice de l’aridité est calculé suivant l’équation :

Ia = P

/

^ETP

Tableau 1 : Classification de l’aridité (d’après, Lloyd, 1986 )

Zones Indice d’aridité Ia Pluviométrie (mm/an)

Sub-humide 0.5 – 0.65 ?

Semi-aride 0.2 – 0.5 200 - 500

Aride 0.05 – 0.2 50 -200

Hyper- aride ‹ 0.02 0 - 50

La faiblesse de la pluviosité est le caractère fondamental du climat saharien. On note ainsi des précipitations annuelles très faibles dans certaines localités : 33 mm à Béni Abbés ; 13 mm à Adrar ; 10 mm à In Salah, en Algérie (Mohamed and Hind, 1998). Toutefois, des pluies diluviennes peuvent aussi s’y produire. En septembre 1950, Tamanrasset a reçu 44 mm en trois heures (Anonyme d, 2003), alors que sa moyenne annuelle est de 25 mm (Mohamed and Hind, 1998).

Le climat thermique est assez uniforme ; les étés du Sahara septentrional ne sont donc guère moins torrides que ceux de la zone centrale ou même de la région soudanaise. Juin, juillet et août sont les mois les plus chauds des zones septentrionals et centrale. Mais vers le Sud, cette période estivale se trouve décalée, recouvrant avril, mai et juin à Gao. Juillet est, dans le

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premier cas, le mois le plus chaud avec, en année normale, une moyenne des maxima quotidiens compris entre 40° C et 46° C, selon les localités. Les plus hautes températures ont été observées à In Salah avec 56°C et à Tindouf avec 59° C. En hiver, il gèle presque partout, les températures les plus basses enregistrées atteignaient -10° C dans le Tibesti, -7°C à Tamanrasset, -6°C à Colomb-Béchar et à Béni Abbés. Janvier est le mois le plus froid et m (moyenne des températures minimales) varie de -1,8°C à El Bayadh à 6,7°C à Biskra (Djellouli and Nedjraoui, 1995), correspondant aux variantes à hiver froid, frais et tempéré.

Juillet reste le mois le plus chaud avec des valeurs de M (moyenne des températures maximales du mois le plus chaud) variant de 33°C à Aflou à 41,7°C à Ouled Djellal à l’ouest de Biskra. La température moyenne annuelle pour l’ensemble de la steppe varie de 19 à 24°C.

Il existe donc de grands écarts de température entre l'hiver et l'été. L'amplitude des variations thermiques annuelles, qui est l'une des particularités du climat des déserts chauds, peut dépasser 55°C au Sahara. En outre, la variation diurne, c'est-à-dire la différence entre le maximum diurne et le minimum nocturne, dépasse souvent 35°C (Anonyme d, 2003).

Le Sahara détient le record mondial de l'ensoleillement avec 3000 à 3500 heures par an contre 1600 à Paris. En saison sèche, le ciel est clair et lumineux tant que le vent ne le trouble pas, ce qui est rare. Au cours de la saison des pluies, il prend un aspect plombé et les nuages peuvent former une nappe continue d'autant plus impressionnante que les horizons sont vastes (Anonyme d, 2003).

Avec la chaleur, l'été, le vent est l'autre caractéristique permanente du Sahara. Par sa situation dans l'hémisphère boréal, le Sahara est soumis, au sol, à des vents dominants orientés du Nord-Est au Sud-Ouest. Mais, localement, le vent peut provenir de directions sensiblement différentes : du Sud ou du Sud-Ouest au Sahara central, de l'Est au Sahara méridional. II est dirigé d'Est en Ouest sur la bande côtière atlantique où les courants marins froids s'opposent à la formation de vents marins en Mauritanie (Anonyme d, 2003).

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10 2.4.2.1- Zones aride en Algérie

Les zones arides, situées entre l’Atlas Tellien au Nord et l’atlas Saharien au Sud, couvrent une superficie globale de 20 millions d’hectares formant de grands ensembles :

• 15 millions d’hectares sont occupés par une végétation steppique graminéenne et chamaephytique constituant les vrais zones de parcours ;

• 5 millions sont occupés par les cultures, les forêts et le sol nu.

Les sols se présentent sous forme de mosaïque allant des sols anciens aux sols récents peu évolués (Djebaili et al, 1983). Les régions arides se distinguent par :

· Les sols minéraux bruts (lithosols et régosols) localisés sur les sommets des djebels ;

· Les sols peu évolués regroupant les sols d’origines colluviale des glacis, alluviale des lits d’oueds et des dayas et éolienne des formations sableuses fixées ;

· Les sols calcimagnésiques caractérisés par des rendzines sur les versants des djebels, les sols bruns calcaires à accumulations calcaires, très répandus, et les sols à encroûtement gypseux, plus rares ;

· Les sols iso humiques représentés par les glacis d’érosion et les sols halomorphes qui occupent les chotts et les sebkhas.

Les sols sont caractérisés par la présence d’accumulation calcaire réduisant la profondeur de sol utile, la faible teneur en matière organique et en éléments biogènes et une forte sensibilité à l’érosion et à la dégradation.

2.4.3- Le Sol et les mycètes

Le sol est l’habitat naturel pour des myriades de microorganismes et d’autres formes vivantes, formant des populations de différents genres (Bugmann, 1996). Le nombre et l’activité de ces populations changent d’une région à une autre, influencé par le contenu de matières organiques du sol, la texture du sol, le pH, l’humidité, la température, l’aération et d’autres facteurs (Ruark and Zarnoch, 1992 ; Madigan et al., 1997 ; Subler and Kirsch, 1998 ; Peuk, 2000 ; Smith et al., 2000 ; Katterer and Andren , 2001).

L’évaluation de la biomasse des microorganismes a montré que dans la plupart des sols, les mycètes sont le composant principale (Bååth and Söderström, 1980 ; Schnürer et al., 1985) (tableau 2).

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Certaines espèces fongiques se retrouvent sur la plupart des terrains, comme les Aspergillus, Penicillium, Epicoccum, Fusarium, Trichoderma, Mucor, Absidia, Rhyzopus, Mortierella, Zygorhynchus, Chaetomium, Gymnoascus, etc. On y retrouve aussi communément des Oomycetes et des Chytridiomycetes (Boiron, 1996).

Tableau 2 : Nombre de microorganismes par gramme de terre du jardin, en fonction de la profondeur selon Alexender, (1991).

Les mycètes du sol comportent les saprophytes, les symbiotique (mycorhizes) et les parasites selon la façon dont ils obtiennent leur carbone et énergie (Christensen, 1989 ; Senal et al., 1993 ; Prescott et al., 1995 ).

Décomposeurs, les mycètes saprophytes, convertissent le matériel organique mort en biomasse fongique, dioxydes de carbone (CO₂), et petites molécules telles que les acides organiques. Ces mycètes emploient généralement les substrats complexes, tels que la cellulose et la lignine, du bois, et sont essentiels en décomposant les structures d'anneau de carbone dans quelques polluants. Quelques mycètes s'appellent les " mycètes de sucre " parce qu'ils emploient les mêmes substrats simples que beaucoup de bactéries.

Comme les bactéries, les mycètes sont importants pour immobiliser, ou maintenir, des aliments dans le sol. En outre, plusieurs des métabolites secondaires des mycètes sont les acides organiques, ainsi elles aident à augmenter l'accumulation de la matière organique riche d'acide humique qui est résistante à la dégradation et peut rester dans le sol pour des centaines d'années.

Mutualistes - les mycètes mycorhize - colonisez les racines des plantes. En échange du carbone de la plante, à l'aide de mycètes mycorhize solubiliser le phosphore et apportent des aliments de sol (phosphore, azote, micro-éléments nutritive, et peut-être eau) à la plante (Ingham, 2000).

Profondeur (cm) Bactéries Actinomycètes Mycètes Algues

3 à 8 9 750 000 2 080 000 119 000 25 000

20 à 25 2 179 000 545 000 50 000 5 000

35 à 40 570 000 49 000 400000 500

65 à 75 11 000 5 000 6 000 100

135 à 145 1 400 - 3 000 -

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12 2.5- Milieux extrêmes et le monde vivant

Les environnements modérés sont importants pour soutenir la vie. Caractérisés par des valeurs moyennes de facteurs environnementaux ; pH près du neutre, température entre 20 et 40°C, pression atmosphérique inférieur à 1, des niveaux proportionnés de l'eau et présence suffisantes d’aliments et de sels.

N'importe quel état environnemental qui peut être perçu comme au delà de la gamme acceptable normale est un état extrême. Beaucoup d'environnements extrêmes, tels que les ressorts acides ou chauds, lacs salins et/ou alcalins, déserts et les lits d'océan sont également trouvés en nature, qui est trop durs pour que la vie normale puisse exister.

Une variété de microbes, cependant, survive et se développe dans de tels environnements. Ces organismes, connues sous le nom d'extrémophiles, tolèrent non seulement la condition (extrême spécifique), mais exigent habituellement ces derniers pour la survie et la croissance.

La plupart des extrémophiles sont trouvés en monde microbien. La gamme des extrémités environnementales tolérées par des microbes est beaucoup plus large que d'autres formes de la vie. Les limites de la croissance et de la reproduction des microbes sont, -12° à plus que +100°c, pH 0 à 13, pressions hydrostatiques jusqu' à 1400 atmosphères et concentrations en sel des saumures saturées. En plus des environnements extrêmes normaux, il y a des conditions extrêmes synthétiques telles que les maisons fraîches, les bâtiments de chauffage par vapeur et la mine acide (Satyanarayana et al., 2005).

2.5.1- Tolérance des mycètes aux milieux extrêmes

Dans leur milieu naturel, la plupart des moisissures sont saprophytes, tirant leur nourriture de matières organiques mortes ou plus ou moins décomposées. Même, si toute matière organique peut constituer un substrat de croissance pour les moisissures, les conditions optimales de croissance peuvent varier d’une espèce à l’autre, chacune d’entre elles ayant un degré différent d’adaptation à son environnement (Halewyn et al., 2002).

Certaines moisissures requièrent un taux d’humidité très élevé pour croître tandis que d’autres préfèrent des taux beaucoup moins élevés. Certaines peuvent croître sur des feuilles en décomposition, substance humide et facilement pénétrable, tandis que d’autres s’attaquent à des matières plus ligneuses, telles le bois ou même à des matières animales chitineuses tels les cheveux et les ongles. De plus, la compétition inter espèces procurera un avantage aux moisissures les mieux adaptées, référant à la notion de niches écologiques particulières pour

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la croissance optimale de chaque type de moisissure (Grant et al., 1988 ; Malloch, 1997 ; Robbins et al., 2000).

Les spores permettent aux moisissures de résister à des conditions extrêmes comme le gel, le processus de digestion et les grandes sécheresses (Tableau 3). Cette résistance aux conditions environnementales peut varier considérablement d’une espèce à l’autre mais on retrouve des espèces adaptées presque à tous les climats et conditions extrêmes (Halewyn et al., 2002).

Tableau 3 : Aperçus de degré de résistance des spores fongiques selon (Regnault, 1990 ; Block, 1991 ; Kendrick,1999 ; Carlile et al.,2001).

Conditions

environnementales

Seuil de résistance Durée de la viabilité

Exemples d’espèces concernées Chaleurs très élevées 90C° (feux de forêts) Quelques mois Ascospores de

Byssochlamyces

Froid intense Congélation un hiver Plusieurs d’espèces

du Nord Sécheresse de l’air ambiant ±0% d’humidité

relative

Semaine à année La majorité des genres de l’environnement intérieur : Eurotium, Aspergillus,

Penicillium Présence de l’humidité

dans le milieu sur lequel se déposent les spores

De 0 à50%de l’humidité

+de 50%d’humidité

Jusqu’à des années Ả ces taux, les spores devraient germer dans le cas contraire, pourrissent

Eurotium sp

Toutes les espèces

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14 2.5.1.1- Tolérance des mycètes à la salinité

Dans la nature, la plupart des cas de salinité sont dus aux sels de sodium et surtout au NaCl (Senal et al., 1993). La haute salinité compromet des fonctions biologiques dans les écosystème et cause la dégradation des ressources de sol et de l’eau (Tanji, 1990 ; 1996 ; Sumner and Naidu, 1998 ; Sumner, 2000 ; DasSarma and Arora, 2001 ; Anonyme e, 2004).

Bien que, les océans soient de loin, la plus grande eau superficielle saline des environnements hyper salins (3.5% sels totaux). Ce processus mène les diverses espèces microbiennes à s’adapter aux différentes gammes de salinités (figure 1), pendant que la saumure est concentrée de 1 mol/L à 3.5 mol/L (DasSarma et Arora, 2001).

Les microorganismes halophiles et halotolérants sont trouvés dans chacun des trois types de vie : Archea, Bacteria et Eucarya (Oren, 1999 ; Benlloch et al., 2000 ; Gunde-Cimerman et al., 2000 ; Litchfield and Gillevet, 2002 ). Ils peuvent être classifiés selon leur concentration en sel de NaCl :

- Les halophiles, se développent de façons optimales à 0.2-0.85 mol/L (2-5%) de NaCl.

- Les halophiles modérés se développent de façons optimales à 0.85-3.4 mol/L (5-20%) de NaCl.

- Les halophiles extrêmes se développent de façons optimales à 3.4-5.1 mol/L (20-30%) de NaCl.

En revanche, les non halophiles se développent de façons optimales à moins de 0.2 mol/L.

Les halotolérants peuvent se développer dans la salinité élevée et en l’absence d’une concentration élevée des sels (Galinski, 1993).

Les mycètes ont été découvertes dans les environnement dont la salinité s’étend entre 15- 32% de NaCl, où jusqu’ici supposé que seules les bactéries pouvaient se développer (Gunde- Cimerman et al., 2002).

En outre, un certain nombre des mycètes tolérants de sel ont été isolées à partir des poissons salés (Polypeaucilum pisce et Basipetspora halophila) (Satyanarayana et al.,2005), eau de mer et des sols des désert (Andews and Pih, 1987 ; Blomberg and Adler, 1993 ; Adler, 1996 ). Une variété des mycètes filamenteux ont été récemment isolées à partir de la mer morte (340 g/L en montent de sels dissous) (Kispapo et al., 2003).

Buchalo et al., (2000) ont isolé 26 espèces fongiques de la mer morte représentent 13 genres : Zygoymycotina( Absidia glauca), Ascomycotina (Chaetomium aureum, C. flaveginum, Emericella nidulans, Eurotium amstelodami, Gymnoascella marismortui, Thelvia terricola)

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mycètes mitosporiques (Acremonium persicinum, Stachybotrys chartarum, Ucladium chlamydosporum).

Figure 2 : La tolérance des microorganismes aux concentrations de sels (NaCl) : PR-6 Agmenellum quadraplicatum, Fs Fabrea saline, Ds Dunaliella salina, Ah Aphanothece halophytica,

H Halobacterium d’après DasSarma et Arora (2001).

L’osmose élevée (hypersalinité) peut être nocive à la cellule fongique car, l’eau perdue dans le milieu environnemental peut empêcher la perte de l’eau cellulaire. Dans ces conditions, les mycètes halophiles accumulent généralement des concentrations élevées des corps dissous dans le cytoplasme (Galinski, 1993). Ces corps dissous (osmolytes) qui s’accumulent dans la cellule des halophiles sont habituellement, des acides aminés et des polyols comme, Betaïne de glycine, acetoïne, tréhalose et glycérol qui ne perturbent pas les processus métaboliques.

Les osmolytes peuvent se produire par la biosynthèse du matériel de stockage ou par de nouveaux matériel se trouvant dans le milieu (DasSarma and Arora, 2001).

(17)

16

2.5.1.2- Tolérance des mycètes à la haute température

Parmi les organismes eucaryotes, seulement quelques espèces de mycètes peuvent se développer à des températures situées entre 45 °C et 55 °C (Cooney et Emerson, 1964). En effet, les mycètes thermophiles ont une température de croissance minimale inférieure à 20°C et maximale supérieure à 50 °C (Brock, 1995 ; Blochl et al., 1997 ; Maheshwari et al., 2000 ). Par ailleurs, Tansey et Brock (1978) ont répertorié 30 espèces fongiques croît à des températures élevées modérément (60°C à 62°C). En outre, la majorité de mycètes thermophiles appartiennent aux Zygomycètes ( Rhizomucor miehi, R.pussillus), Ascomycètes (Chaetomium thermophile, Thermoascus aurantiacus, Dactylomyces thermophilus , Melanocarpus albomyces, Talaromyces thermophilus, T. emersonii, Thielavia terresteris), Basidiomycètes ( Phanerochaet chrysosporium) et Hyphomycètes (Acremonium almbamensis, A. thermophilum, Myceliophtora thermophila, Thermomyces laginosus, Seytalidium thermophilum, Malbranchea cimnamonea) (Tensey and Brock, 1978 ; Mouchacca, 1997 ; 1999).

Sur le plan physiologique, la haute température chez la cellule fongique augmente la fluidité de la membrane et ce par l’augmentation de la proportion des acides gras saturés (Sinensky, 1974 ; Jaenicke, 1996). Par contre, dans des basses températures, la membrane cellulaire contient une proportion plus élevée d’acides gras insaturés (Sinensky, 1974). En effet, il a été trouvé que, le degré de non saturation des acides gras de la couche phospholipidique de la membrane est de 0.88 chez les mycètes développés à 50°C, et de 1.06 chez les mêmes mycètes développés à 30°C (Rajasekaram and Maheshwari, 1990). Par ailleurs, il a été démontré que chez les mycètes thermophiles, l’ADN contient plus de liaisons G-C que de liaisons A-T (Galtier et al., 1999).

2.5.1.3- Tolérance des mycètes à la sécheresse

Les mycètes sont généralement plus adaptés à la sécheresse que des bactéries ou la faune du sol (Swift et al., 1979 ; Elimi and West, 1995 ; Malinowski et al. , 2000). En effet, certains mycètes du sol peuvent survivre pendant les périodes de sécheresse par la formation des spores, en particulier en contact avec l’oxygène et des sels minéraux. Les sports sont des cellules de résistance et leur formation nécessite une concentration, plus au moins, importante de matière carbonée.

(18)

17 2.6- Métabolites secondaires des mycètes

Beaucoup de mycètes et de bactéries peuvent produire des composés appelés métabolites secondaires (Demain, 1999). Les métabolites secondaires se caractérisent par le fait que, leur production n’est pas indispensable à la croissance du microorganisme lui-même et ils sont de structure et d’activité biologique très diverses. Habituellement, ils sont sécrétés sous forme de mélange qui ne représente une structure chimique unique (Howksworth et al., 1995 ; Boiron, 1996).

Les microorganismes ne produisent pas leurs métabolites secondaires avant d’avoir terminé leur phase de croissance et d’avoir entamé la phase stationnaire, appelé idiophase. En effet, le métabolite secondaire peut être un produit d’un métabolite primaire du même microbe (Calvot et al., 2002 ; Tortora et al., 2003 ) qui se forme (le métabolite primaire) au moment où les cellules se divisent durant la phase de croissance logarithmique appelée trophophase (Tortora et al., 2003).

Les métabolites secondaires englobent tout produit à activités antibiotiques, pharmaceutiques, immunosuppressive et toxiques (mycotoxine et phytotoxine) (Jae-Hyuk and Keller, 2005 ; Keller and Woobok, 2005).

Chez les mycètes, la production de métabolites secondaires est un processus couplé au développement morphologique en particulier à la phase de sporulation (Hapwood, 1988 ; Mapleston et al., 1992 ; Stone and Williams, 1992 ; Demain and fang, 2000 ; Calvo et al., 2002). De ce fait, les métabolites secondaires peuvent avoir certaines activités :

1- Métabolites qui activent la sporulation (acide linoléique et ses dérivés produit par Aspergillus nidulans) (Champ et al., 1987 ; Champ and El-Zayat, 1989 ; Mazur et al., 1991 ; Calvo et al., 2001 ) ;

2- Pigments nécessaires (mélanine) pour la formation des spores sexuelles et asexuelle (Kawamura et al., 1999) ;

3- Métabolites toxiques secrétés par des colonies à la période approximative de la sporulation (la biosynthèse des mycotoxines) (Trail et al., 1994 ; Hapwood, 1988 ; Alspaugh et al., 1997).

(19)

18 Ultérieurement, les métabolites secondaires peuvent :

1. Retarder la germination des spores jusqu’à ce que les conditions environnementales soient favorables ;

2. Protégent les spores en dormance contre des amibes ;

3. Eliminer dans l’environnement immédiat des microorganismes concurrents pendant la germination (Demain and Fang, 2000).

Génétiquement, les gènes responsables de la biosynthèse des métabolites secondaires sont habituellement arrangés dans des faisceaux contenant également les gènes responsables de la résistance à l’action toxique et parfois, des gènes précurseurs de la biosynthèse d’antibiotiques (Martin and Liras, 1989 ; Cundliff, 1989 ; Chater and Bibb, 1997 ; Martin, 1998).

Ce processus constitue chez les mycètes un régulateur global de métabolites secondaires appelé Lae A. En effet, ce facteur a été identifié chez A. nidulans et plus récemment chez A.

fumigatus. Cette découverte a permis d’augmenter ou diminuer la production des métabolites secondaires chez un mycète en modulant l’expression de Lae A. Par exemple, l’overexpression du gène Lae A augmente considérablement la production de pénicilline chez A. nidulans et la production de lovastatine chez l’A. terreus et la suppression de Lae A chez A.

fumigatus élimine la production du gliotoxine et d’autre métabolites secondaires et diminue la virulence de ce mycète pathogène (Woobok and Keller,2004 ; Keller and Woobok, 2005).

2.6.1 - Mycotoxines

Les mycotoxines sont des métabolites secondaires peu volatiles, élaborés par diverses moisissures sous certaines conditions environnementales. A l’heure actuelle seuls certaines espèces de moisissures sont connue comme ayant la capacité de produire des toxines. Leur biosynthèse est dépendante de plusieurs facteurs, dont la température, l’intensité lumineuse, le dioxyde de carbone dans l’air, les éléments nutritifs disponibles et la présence et la présence d’autres espèces en compétition (Hendey et al., 1993).

Les mycotoxines se retrouvent dans le mycélium et les spores et peuvent diffuser dans le substratum. Plusieurs de ces toxines sont relativement stables et leur toxicité peut persister longtemps et ce même lorsque les cellules fongiques ne sont pas viables. Il faut toutefois noter qu’il n’existe actuellement pas de données sur la durée précise de cette toxicité. Il y aurait, selon les auteurs, jusqu’à 400 mycotoxines répertoriés (Etzel, 2002).

(20)

19

Le nombre exact de mycotoxines peuvent se retrouver sur des matériaux contaminés n’a pas été établi, néanmoins, plusieurs études en cours d’identification, dans des conditions expérimentales ou naturelle (Nielson et al., 1999).

Chaque mycotoxines n’est pas nécessairement spécifique à une moisissure donnée. La gliotoxine, par exemple : peut aussi bien être produite par Aspergillus fumigatus que par Trichoderma viridae. De même, une moisissure donnée peut produire plusieurs toxines ;Aspergillus fumigatus, agent étiologique de certaines atteintes pulmonaires, fabrique plus de huit toxines différent (Maheux, 1998).

Six groupes de mycotoxines sont produits par trois principaux types de champignons : Aspergillus, Penicillium et Fusarium. De structure chimiques différentes ; cancérogènes, mutagènes, oestrogénique, neurotoxique, ou immuno-supessif (Jouany, 2002). Le Tableau (4) récapitule la majorité des mycotoxines répertories.

Tableau 4 : Exemples de mycotoxines produites par certaines moisissures (Halewyn et al.,2002).

(21)

20 2.6.2- Antibiotiques

Les antibiotiques sont des substances chimiques et /ou organiques produites par un petit nombre de microorganismes et exerçant une action toxiques envers d’autres microorganismes dont principalement les bactéries. Cette action peut être seulement inhibitrice de la croissance, elle est alors bactériostatique et réversible, mais elle peut aussi être létale et dans ce cas elle est bactéricide et irréversible. Souvent un même antibiotique peut exercer l’un ou l’autre de ces effets, en fonction de sa concentration (Prescot, 1995).

Parmi un totale de quelque 10700 antibiotiques décrits pour l’ensemble du monde vivant, environ 1600 proviennent de champignon. La répartition des organismes producteurs dans les différentes classes ou ordres fongiques est fonction non seulement des capacités de synthèse mais aussi de la fréquence des diverses espèces dans la nature et de leur aptitude à se développer facilement en culture. Les genres Aspergillus et Penicillium ainsi que les espèces de l’ordre des Monilliales constituent les réservoirs les plus importants (Botton et al., 1990).

Tableau 5 : Mycètes producteurs d’antibiotiques (Larpent and Larpent -Gouraud, 1990).

Organismes producteurs Antibiotiques

Aspergillus flavus Aspergillus fumigatus

Cephalosporium acremoniumù Cephalosporium caerulens Fusidium coccineum Helminthsporium siccans Paecilomyces variotti Penicillium chrysogenum Penicillium griseofulvum

Acide aspergillique Fumagilline Céphalosporine Cérulinine Acide fusidique Siccanine Variotine Pénicilline Griséofluvine

Bien que les antibiotiques ne soient pas obligatoires pour la sporulation chez les mycètes, cependant, certains d’eux stimulent la formation de spores et empêchent la germination (Demain and Fang, 2000).

Les gènes structuraux codant pour les antibiotiques synthétases sont habituellement chromosomiques. Les mécanismes spécifiques réglant le début de la synthèse des antibiotiques incluent la répression de catabolite de carbone et l’arrêt de leur biosynthèse se produit par l’inhibition de l’antibiotique synthétase (Demain et al., 1983).

(22)

21

2.6.3- Mécanismes d’action des substances antibactériennes

Les facteurs les plus importants de l’activité biologique dans composé donné sont ses propriétés physico-chimiques, sa structure chimique, arrangement stérique de ses atomes et la présence des parties bioactifs dans sa structure (Betina ,1989).

Biochimiquement, les modes d’action des substances antimicrobiennes peuvent être divisé en quatre catégories (Riley and Norred, 1994) :

• L’interaction avec l’ADN.

• L’inhibition des différentes étapes de la synthèse de protéines ;

• Les effets sur les membranes cytoplasmiques ;

• L’effet sur le métabolisme énergétique.

Par ailleurs, ces différents modes d’action peuvent être étudies par les méthodes suivantes (Betina, 1989) :

• Interaction avec des biomolécules (ADN ; au niveau moléculaire) ;

• Interaction avec des enzymes dans des réactions enzymatiques ;

• Interaction avec les cellules libérant les systèmes de défenses (effet sur ARN, synthèse d’ARN ou de protéine) ;

• Interaction avec des composants de la cellules (mitochondries ou membranes) ;

• Interaction au niveau cellulaire (culture cellulaire) ;

• Interaction au niveau des tissus et des organes après l’administration a un organisme vivant.

2.7- Méthodes de séparations et identifications des métabolites secondaires

Parmi les méthodes les plus utilisées dans ce genre de recherche est la chromatographie. Les techniques de chromatographie sont développées avec une rapidité, au cours de ces 40 dernières années, que leur utilisation en chimie analytique est devenues incontournables tant au laboratoire de recherche qu'au laboratoire de contrôle. A l'origine, ces techniques sont utilisées pour la séparation des substances colorées (d'où son nom), la chromatographie est aujourd'hui une méthode puissante d'analyse qualitative et quantitative.

La Chromatographie sur Couche Mince (CCM) est une méthode simple et rapide qui permet de suivre l'évolution d'une réaction ou de tester la pureté des composés organiques.

(23)

22

La phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants (état liquide) et la phase stationnaire est généralement un adsorbant maintenu sur une plaque soit en verre soit en plastique rigide. L’échantillon, liquide ou solubilisé, dans un solvant volatil est déposé ponctuellement sur la phase stationnaire (sur la plaque). Les constituants de l'échantillon sont élués par la phase mobile qui grimpe par capillarité vers le haut de la plaque. Ils peuvent être identifiés par comparaison à l'élution simultanée de témoins.

Bien que le principe de la CCM ait connu depuis plus d'un siècle (Beyerinck, 1989), son application en tant que méthode analytique ne date que de la fin des années 50, lorsqu'on abandonne progressivement la chromatographie sur papier pour celle réalisée sur des adsorbants déposés sur une plaque de verre pour des questions de reproductibilité et de rapidité. Cette technique de séparation est performante et certainement pleine d'avenir (Kaldsz and Bolhori, 1997).

Ces dernières années la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) a remplacé la chromatographie sur couche mince (Anonyme e, 2004). HPLC est une nouvelle technique, qui a amélioré la séparation, l’identification, la purification et la quantification loin au delà d’autres techniques. Elle est très recommandée pour l’analyse des métabolites secondaires pour sa souplesse et son automatisation (Neilson, 2000).

D’autre méthodes peuvent être utilisées pour la séparation et l’identification des métabolites secondaires telles que : Chromatographie en phase gazeuse (CPG) couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS), ELISA (Enzyme –Linked Immunosorbant Assay) et électrophorèse capillaire (CE) (Neilson, 2000)

(24)

Matériel et méthodes

23

3-Matériel et Méthodes

3.1- Echantillonnage

Le travail porte sur la production des substances antibactériennes secrétées par des mycètes isolés à partir du sol. En effet, les échantillons du sol utilisés pour cet objectif sont prélevés des différentes sites de la région de Biskra située dans le sud est Algérien (figure 8).

Deux sites sont choisis pour le prélèvement du sol en l’occurrence El M’GHIERE et CHEGGA. Le choix des ces endroits repose sur deux critères principaux à savoir ; la température élevée et degré de salinité du sol. En effet, la localité d’El M’GHIERE se trouve à 140 Km au sud de chef lieu de la willaya de Biskra, connue pour ses chotts (fournisseur du sel pour SONATRACH) et la localité de CHEGGA qui se trouve, quant à elle, à 80 Km au sud de BISKRA sur l’axe BISKRA - El M’GHIERE (figure 3). Les échantillons du sol englobent le sol humide de palmeraie et le sol sec de steppe (figure 4). Par ailleurs, le tableau 7 détaille les caractéristiques des échantillons prélevés.

Figure 3 : Carte d’Algérie montrant la région d’échantillonnage (Biskra).

(25)

24

Le prélèvement du sol est réalisé à l’aide d’une tarière et pour chaque prélèvement, la couche des trois premiers centimètres (couche supérieure) est écartée (Buhot, 1973 ; Mihail et Alcoren, 1987 ; Saadoune and Momani, 1997) (tableau 6). Le sol ensuite, recueilli dans des sacs en papier soigneusement fermés et l’analyse mycologique est effectuée dès l’arrivée au laboratoire (Rodriguez-Zaragoza et al., 2005).

Figure 4 : Sites d’échantillonnage ; 1 : sol steppique, 2 : sol de palmeraie.

Tableau6: Aspects des sites d’échantillonnages

Sites d’échantillonnage Caractéristiques des lieux Profondeur

ELM’GHIERE Palmeraie (sol humide)

Palmeraie (sol humide) Palmeraie (sol humide)

10cm 20cm 50cm

CHEGGA Steppe

Steppe Steppe

10cm 20cm 50cm

3.2- Etude climatologique et pédologique du sol

3.2.1- Données climatologiques

La région de prélèvement des échantillons est située à une altitude de 213 mètre, une latitude de 34 ° 51' 0" nord et à une longitude de 5° 43' 59" Est (Anonyme h, 2005).

Le climat de Biskra est un climat sec (saharien). Caractérisé pour l’année 2004, par une précipitation moyenne annuelle de 295 mm, une humidité relative de 41,5 % et par une température moyenne minimale du mois le plus froid (Janvier) de 7,8 °C et une température moyenne maximale du mois le plus chaud (Août) de 40,9°C .

1 2

(26)

25

Le prélèvement des échantillons a été effectué durant le mois de Novembre (2004). Par ailleurs les données climatologiques de la région pour toute l’année 2004 sont collectées (ONM, station de Constantine).

3.2.2- Etude pedologique

L’analyse physico-chimique des échantillons du sol est élaborée par le Laboratoire de chimie des sols, Agence National des Ressources Hydrauliques, Antenne Régionale Est, Constantine (Zone Industrielle Palma Constantine).

Ces analyses sont : o Dosage d’azote ; o Dosage de carbone ;

o Dosage de la matière organique.

Par ailleurs, tous les échantillons ont subi des mesures du pH suivant la méthode de Davet et Rouxel (1997) qui consiste en la détermination des valeurs du pH d’une suspension du sol contenant 10 g du sol dans 90 ml d’eau distillée à l’aide d’un pH mètre.

3.3- Etude mycologique

3.3.1- Isolement des mycètes

L’isolement des mycètes est réalisé selon la méthode de suspension- dilution (dilutions plates) (Davet, 1996 ; Davet and Rouxel, 1997). La préparation des dilutions consiste, tout d’abord, à préparer la solution mère du sol en ajoutant 10g du sol à 90 ml d’eau distillée stérile suivie d’une agitation pendant 30 min. Cette solution a servi à préparer des dilutions décimales par l’ajout successif de 1 ml de la solution à 9 ml d’eau distillée stérile jusqu’à l’obtention de la dilution de 10^-6. Ensuite, un volume de 1ml de chaque suspension est déposé dans une boite de Pétri et homogénéisé au milieu Czapeck-Dox composé de (g/L eau distillée) : 2 NaNO3, 1 KH₂PO₄, 0.5 MgSO₄.7H₂O, 0.5 KCl, 0.01 FeSO₄.7H₂O, 30 Saccharose et 20 agar. Le pH du milieu est amené à 6.5 à l’aide d’une solution de 0.1 M de NaOH. L’homogénéisation est réalisé par agitation manuelle des boites par un mouvement circulaire sur plan horizontal. Les boites sont incubées à 28-30°C pendant six jours (Botton et al., 1990). En outre, d’autres boites contenants le milieu précédent sont ensemencées par des grains des sols sans passer par la suspension et les dilutions.

(27)

26

N.B. La préparation des dilutions a pour objectif d’aider à obtenir, dans la mesure du possible, des isolats séparés.

3.3.2- Purification des isolats

Pour la purification des souches fongiques, nous avons appliqué la méthode des dilutions qui consiste à prélever, à l’aide d’un fil de platine, un frottement à partir de la boite de pétri qui contient plusieurs colonies et que l’on mis dans des tubes à essais remplis de 9 ml eau physiologique (9g de NaCl dans 1 litre de l’eau distillée). Après agitation, on procède à la préparation des dilutions décimales jusqu’à l’obtention d’un seuls spore /ml. Les spores séparées (monospores) sont ensemencés dans des boites de Pétri (100 mm) contenant de l’eau gélosé (Agar 2%). Après une incubation de 18 h à 28° C, la bouture mycélienne est recherchée à l’aide d’une binoculaire pour être repiquée dans une boite de Pétri contenant du Potato – Agar – 2% et du Dextrose- 2% (w/v) (PDA) (Botton et al., 1990). La culture est ensuite ensemencée sur le milieu Malt-Extract-Agar (MEA) idéal pour le développement de la colonie fongique (Samson et al., 1981) dont la composition est en g/L : 20 agar, 20 glucose, 20 extrait de malt. Les souches sont conservées sous forme de spores dans une solution de 30% de glycérol / eau physiologique à -20 °C (Botton et al., 1990).

3.3.3 - Identification des isolats

L’identification des isolats est basée sur les observations du mycélium fongique :

Ø Observation macroscopique : qui permet de déterminer la couleur de la colonie pendant le développement et à mesurer son diamètre.

Ø Observation microscopique : qui détecte la présence du thalle, la présence ou l’absence de septum, la nature de la production et les caractéristiques des fructifications et des spores (Samson et Haesks, 1988 ; Hawkswarth, 1995 ; Hoog and Guarro, 1995 ; Gams et al., 1998 ). Le mycélium est fixé en utilisant une solution contenant 13 ml de 40 % formaldéhyde et 5 ml d’acide acétique glaciale, ajouté à 200 ml d’éthanol 50 % ( w/v). La préparation est colorée avec de lactophénol bleu coton (Packer et Thomas, 1990). En outre, l’utilisation d’un microscope à fluorescence (Zeiss Axioscop 2 MOt, AxiocamhRc, hallbergmoos, Germany) a permis la prise en photo du mycélium.

(28)

27

3.3.4- Sélection des isolats producteurs de substances antibactériennes

Le test de l’activité des isolats identifiés consiste à rechercher son effet antibactérien sur le développement des bactéries test : Bacillus subtilis, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis et Staphylococcus aureus (voir annexe).

Un écouvillon stérile trempé dans la suspension bactérienne standardisé a servi à ensemencer uniformément toute la surface de la boite de gélose nutritive (10 g/L peptone, 5 g/L extrait de viande, 5 g/L NaCl et 15 g/L agar). Après séchage de la surface (environ 5 min), des disques de 5 mm de diamètre d’une colonie mycélienne de 6 à 9 jours (suivant le développement) réactivée sur PDA sont déposés sur la gélose précédente. Après deuxième séchage, les boites de Pétri sont incubées à 35°C pendant 18h. Les diamètres des zones d’inhibition sont mesurés au millimètre près (Prescot, 1995 ; Madigan et al., 1997).

3.4- Etude de l’isolat sélectionné

3.4.1- Choix du milieu de développement et étude macroscopique et microscopique

A l’aide de l’anse de platine, la bouture mycélienne de l’isolat (14), qui développait une activité antibactérienne importante sur les bactéries test, est ensemencée sur milieu Czapek- Dox, PDA, MEA et OGA (Oxytétracycline- Glucose- Agar contenant en g/L : 5 Extrait de levure, 20 glucose, 16 agar ). Les boites de pétri sont incubées à 30 °C. La croissance de la colonie et sa couleur sont surveillées du premier jour jusqu’au 6^e jour d’incubation.

3.4.2- Tolérance à la salinité

La tolérance à la salinité de l’isolat (14) est étudie dans des erlens de 250 ml contenant 100 ml de milieu Czapeck Dox liquide composé de concentrations progressives de NaCl (g/L) : 0, 15, 30, 45, 60, 75, 100, 200, 300 (Kogej et al., 2005). Chaque erlen est ensemencé par deux disques mycéliens de 5 mm de diamètre de l’isolat (10jours). Les erlens ont subi ensuite, une incubation statique de 10 jours à 30 °C. Le meilleur développement est déterminé par la mesure du poids sec du mycélium.

(29)

28 3.4.3- Test de termo-tholértance

Des cultures en milieu liquide sont préparées par la même méthode précédente. Cependant la tolérance de l’isolat à la température, est étudié selon un autre procédé qui consiste en la filtration de la culture après 10 jours d’incubation et le mycélium est mis dans des boites de Pétri stériles et incubé ensuite, à des températures : 60, 70, 80, 90 et 100 °C pendant 20 jours.

3.5- Facteurs influençant la production des substances antibactériennes

3.5.1- Choix de source de carbone

L’effet de source de carbone sur la production de substances antibactériennes par l’isolat (14) a été étudié. En effet, cinq sucres ont été utilisés pour cet objectif, il s’agit de l’amidon, du glucose, du fructose, du xylose et du saccharose. Le tableau 7 montre la composition et l’organisation des milieux et dans tous les cas le pH est ramené à 5.0. La suite de la méthode est identique à celle mentionnée précédemment (3.3.2).

Tableau 7: Sélection de source de carbone pour la production de substances antibactériennes par l’isolat (14).

Source de carbone

Milieu 1 Milieu 2 Milieu 3 Milieu 4 Milieu 5 Milieu 6 Composants

(g/L)

Ext. de levure KH2PO4

MgSO4.7H2O FeSO4.7H2O NaCl Succharose Glucose Fructose Xylose Amidon

5 1 0.5 0.01 15 0 0 0 0 0

5 1 0.5 0.01 15 30 0 0 0 0

5 1 0.5 0.01 15 0 30 0 0 0

5 1 0.5 0.01 15 0 0 30 0 0

5 1 0.5 0.01 15 0 0 0 30 0

5 1 0.5 0.01 15 0 0 0 0 30

(30)

29 3.5.2- Choix de source d’azote

L’effet de deux sources d’azote sur la production de substances antibactériennes est étudie. En effet, une source d’azote organique (extrait de levure) et une autre source minérale (NaNO3) sont utilisées pour cet objectif. Le tableau 8 montre la composition et l’organisation des milieux et dans tous les cas le pH des milieux est ramené à 5. La suite de la méthode est identique à celle mentionnée précédemment (3.3.2).

Tableau 8 : Sélection de source d’azote pour la production de substances antibactériennes par l’isolat.

Source d’azote

Milieu 1 Milieu 2 Milieu 3

Composants (g/L)

KH2PO4

MgSO4.7H2O NaCl FeSO4.7H2O

Saccharose NaNO3

Extrait de levure

1 0.5

15 0.01

30 0 0

1 0.5

15 0.01

30 5 0

1 0.5

15 0.01

30 0 5

1. La biomasse

Pour déterminer le poids sec du mycélium, l’échantillon est filtré sur papier Wattman 3. Le mycélium est lavé deux fois avec de l’eau distillée, séché à 105° C, jusqu’ à poids constant.

2. L’activité antibactérienne

L’activité antibactérienne est recherchée dans le filtrat de chaque prélèvement suivant la technique des puits. Des boites de pétri contenant une couche de gélose nutritive d’une épaisseur de 4mm, est préparée avec les bactéries tests : E.coli, Bacillus subtilis, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis et Staphylococcus aureus (L’hôpital de Daksi), après une séchage de 5 min à 0 °C, la gélose est perforée avec un cylindre en cuivre de 4mm de diamètre stérile. Les puits préparés sont prêts pour recevoir un volume de 10µl du filtrat. Les boites sont, ensuite, incubées à 37 °C. La mesure des zones d’inhibition autours des puits est effectuée après 18 h à 24 h d’incubation (Tortorano et al., 1979).

(31)

30 3. Le pH

Le pH du filtrat est mesuré à l’aide d’un pH mètre (pH M 210).

3.5.3- Choix du pH

Les cultures sont réalisées dans des erlens de 250 ml à raison de100 ml de milieu Czapek Dox liquide contenant 15 g/L de NaCl, 5 g/L d’extrait de levure et 30 g/L de saccharose. La gamme du pH testée est comprise entre 3 et 8 avec un intervalle de 0.5. La suite de la méthode est identique à celle mentionnée précédemment (3.3.2).

3.5.4- Choix de température de développement

Des cultures en milieu liquide sont préparées par la même méthode précédente. Cependant, les erlens sont incubés à des températures différentes : 10, 20, 30, 40, 50 °C. La suite de la méthode est identique à celle mentionnée précédemment (3.3.2).

3.5.5- Choix des concentrations des sources de carbone et d’azote

Après la sélection de saccharose et de l’extrait de levure comme étant les meilleures sources de carbone et d’azote, le meilleur effet des deux éléments réunies sur l’activité antibactérienne est recherché dans un milieu Czapek-Dox liquide composé en (g/L) de :

1 KH2PO4, 0.5 MgSO4.7H2O, 15 NaCl, 0.01 FeSO4.7H2O avec la combinaison des différentes concentrations des deux éléments suivant le tableau (9). Les cultures sont préparées dans des erlens de 250 ml contenant 100 ml du milieu dont le pH est ajusté à 5.0. L’incubation statique est effectuée à 30°C pendant 10 jours.

(32)

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Tableau 9 : Sélection de la concentration de saccharose et d’extrait de levure.

Concentration de Saccharose (g/L)

0 10 20 30 40 50

Concentration de l’extrait de levure (g/L)

0 1 2 3 4 5 6

1 7 8 9 10 11 12

3 13 14 15 16 17 18

5 19 20 21 22 23 24

7 25 26 27 28 29 30

10 31 32 33 34 35 36

3.6- Cinétique de production des substances antibactériennes par l’isolat

L’évolution de la production des substances antibactériennes par l’isolat durant différentes phases de croissance est réalisée dans des erlens de 250 ml contenant 100 ml du milieu de culture composé en (g/l) de : 5 extrait de levure, 1 KH2PO4, 0.5 MgSO4.7H2O, 15 NaCl, 0.01 FeSO4.7H2O, 20 saccharoses, puis ajuster le pH à 5.0. La suite de la méthode est identique à celle mentionnée précédemment (3.3.2).

Des prélèvements sont effectués périodiquement tous les 24 heurs puis filtrés sur papier wattman n°3 pour déterminer la biomasse, puis le pH et l’activité antibactérienne dans le filtrat.

N.B. Tous les milieux utilisés dans cette partie sont stérilisés à 121 °C pendant 20 minutes.

3.7- Extraction et séparation de substances antibactériennes

L’extraction et la séparation des substances antibactériennes produites par l’isolat est effectuée suivant la méthode de Lardinois, (1976) approuvée par la Communauté Economique Européenne est qui consiste en :

(33)

32 3.7.1- La préparation de l’échantillon

Les cultures en milieu liquide sont préparées par la même méthode précédente. Après l’incubation statique des erlens à 30 °C pendant 10 jours, le contenu des erlens est filtrée sur papier Whattman 3.

3.7.2- L’extraction

50 ml du filtrat sont introduits dans une fiole conique de 500 ml, auxquels sont ajoutés 25 ml d’eau distillée et 25 ml de chloroforme. Le mélange est agité 30 minutes durant à l’aide d’un agitateur magnétique puis transvasé dans une ampoule à décantation pour séparer la phase aqueuse de la phase chloroformiser. La phase chloroformique sert a pour la recherche des substances antibactériennes dans les étapes suivantes.

3.7.3- Fractionnement sur colonne

La colonne utilisée mesurait 22 X 300 mm préparée selon le procédé suivant : le tube est muni à l’extrémité inférieure d’une grille et de coton, ensuit rempli à deux tiers par le chloroforme puis par 5 g de sulfate de sodium (anhydre granulé). Après avoir vérifier que la surface supérieure de la couche de sulfate de sodium est inondée, des petites fractions de 10 g de gel de silice granulométrie (0.05 à 0.20mm) est rajoutées en remuant avec précaution après chaque addition pour éliminer les bulles d’air. La préparation est laissée déposer durant 15 min, ensuite 15 g sulfate de sodium sont rajoutés avec précaution formant ainsi la couche supérieure de la colonne. L’excès du chloroforme est éliminé par la voie de tube inférieur placé pour cet objectif.

50 ml d’extrait recueilli (phase chloroformique) sont additionnés à 100 ml de n- hexane, le mélange est ensuit, transvasé quantitativement dans la colonne en éliminant le liquide écoulé, suivi par l’ajoute de 100 ml d’éther diethylique et laisser à nouveau descendre le liquide jusqu'à la surface supérieure de la couche de sulfate de sodium. Au cours de cette opération, on veille à ce que le débit d'écoulement soit 8 à 18 ml/min et que la colonne ne soit pas mis à sec. Eliminer le liquide écoulé, éluer ensuite par 150 ml mélange (chloroforme – méthanol : 97/3 V/V). L’éluent contenant les substances antibactériennes est recueilli puis évaporé presque à sec à une température qui ne dépasse pas les 50°C en utilisant l’appareil rotatif

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évaporation sous vide (BǗCHI. Rotavapor R-200.). Enfin, on a recueilli de nouveau le résidu à l’aide du chloroforme.

N.B. pour s’assurer de la présence de substances antibactériennes dans les différentes phases, un disque de 5mm de diamètre de papier wattman N° 3 est saturé par la phase, puis séché et ensuite testé pour son effet antibactérien sur E. coli.

3.7.4- Séparation sur couche mince

Deux types de gel sont utilisés pour cet objectif : gel de silice G-60 et gel de polyamide. Les plaques de verre (200 X 200 mm) chargées de gel sont injectées par l’extrait chloroformique à 2 cm du bord inférieur et sur des points à 2 cm d’intervalle l’un de l’autre (figure 5). Les plaques sont ensuite, développées à l’abri de la lumière, par un éluent composé de chloroforme et de méthanol (96/4 V/V). La révélation est réalisée par la lumière UV (360 nm) en plaçant la plaque à 10 cm de la lampe et les taches donnent une fluorescence caractérisante. Par ailleurs, les plaques sont préparées selon le procédé suivant : introduire 30 g de gel dans une fiole conique, ajouter 50 ml d’éthanol, boucher et agiter pendant une minute. Etendre la suspension sur les plaques de manière à obtenir une couche uniforme de 0.25mm d’épaisseur (opération réalisée par l’étaleur). Laisser sécher à l’air libre et au moment de l’emploi, activer les plaques en les maintenant durant 1 heur dans l’étuve à 110

°C).

Figure 5 : Conception de la plaque de couche mince.