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Production d’acide itaconique par des souches d’Aspergilli par fermentation en milieu solide
Clémence Restino
To cite this version:
Clémence Restino. Production d’acide itaconique par des souches d’Aspergilli par fermentation en milieu solide. Biotechnologies. Université de Reims Champagne Ardenne, 2012. Français. �tel- 02803534�
Thèse de doctorat présentée par Clémence RESTINO
En vue de l’obtention du grade de :
Docteur de l’Université de Reims Champagne-Ardenne Spécialité : Microbiologie Industrielle
Soutenue publiquement le 5 décembre 2012 devant le jury :
Présidente : S. BOUQUILLON, Professeur – URCA, Reims
Rapporteurs : J. BOUDRANT, Directeur de Recherche – CNRS, Nancy R. CACHON, Professeur – AgroSup, Dijon
Examinateur : A. BRESIN, Recherche et développement – ARD, Pomacle-Bazancourt
Directeur de thèse : F. DUCHIRON, Professeur – INRA/URCA, Reims
Production d’acide itaconique par des souches d’Aspergilli par fermentation en milieu solide
Thèse de doctorat présentée par Clémence RESTINO
En vue de l’obtention du grade de :
Docteur de l’Université de Reims Champagne-Ardenne Spécialité : Microbiologie Industrielle
Soutenue publiquement le 5 décembre 2012 devant le jury :
Présidente : S. BOUQUILLON, Professeur – URCA, Reims
Rapporteurs : J. BOUDRANT, Directeur de Recherche – CNRS, Nancy R. CACHON, Professeur – AgroSup, Dijon
Examinateur : A. BRESIN, Recherche et développement – ARD, Pomacle-Bazancourt
Directeur de thèse : F. DUCHIRON, Professeur – INRA/URCA, Reims
Production d’acide itaconique par des souches d’Aspergilli par fermentation en milieu solide
Face à la roche, le ruisseau l’emporte toujours, non pas par la force mais par la persévérance.
H. Jackson Brown
REMERCIEMENTS
Une telle expérience n’est réalisable que par le soutien physique et moral de personnes que je tenais à remercier.
Je tiens à adresser tous mes remerciements à mon directeur de laboratoire et directeur de thèse, Monsieur le Professeur Francis Duchiron, pour m’avoir accueillie au sein de son laboratoire, pour m’avoir proposé un sujet si intéressant et pour la confiance qu’il m’a accordée tout au long de ses trois années. Merci de m’avoir fait découvrir la fermentation solide même si la production s’est avérée plus difficile que prévue. Finalement, on apprend beaucoup avec peu de bibliographie et en se heurtant aux difficultés. Je vous suis également très reconnaissante de m’avoir autorisée à mener, en parallèle et en complément de mon sujet de thèse, une étude de biologie moléculaire.
Je remercie sincèrement Madame le Professeur Sandrine Bouquillon, coordinatrice du programme Pentoraf, pour avoir accepté de présider le jury. Je tiens à vous remercier pour nos nombreuses discussions, vos conseils et vos encouragements lors du grand sprint final (qui n’ont pas cessé, même après la soutenance). Un grand merci pour le temps que vous m’avez consacré.
J’exprime toute ma gratitude à Monsieur le Directeur de Recherche Joseph Boudrant (CNRS, Nancy), ainsi qu’à Monsieur le Professeur Rémy Cachon (AgroSup, Dijon) pour avoir accepté de juger ce travail. Je vous remercie pour les corrections apportées à ce manuscrit, pour la discussion que vous avez animée lors de ma soutenance et pour le temps que vous m’avez gentiment accordé.
Je remercie également le Docteur Anthony Bresin (Société ARD, Pomacle- Bazancourt) pour avoir accepté de participer à mon jury de thèse en tant qu’examinateur.
J’adresse tous mes remerciements au Conseil Général de la Marne pour avoir financé ces travaux.
Je tiens à remercier Monsieur le Directeur de Recherche Bernard Kurek, Directeur de l’UMR FARE 614, pour m’avoir acceptée au sein de son unité.
Je remercie chaleureusement Mesdames les Docteurs Parissa Alimardani- Theuil et Angélique Gainvors-Claisse pour m’avoir aidée dans mes travaux de biologie moléculaire sans rien attendre en retour. Vous avez renforcé, sans le vouloir, ma passion pour la biologie moléculaire. Merci pour vos conseils, votre soutien inconditionnel, votre bonne humeur, c’était « super ! » (Parissa, tu mettras l’intonation qu’il faut, seule toi c’est le faire). Ce fut un plaisir d’apprendre à vos côtés et de partager cette aventure (et d’autres entre 12h-14h !). Vous me manquez déjà. Angélique, vous savez tout le bien que je pense de vous (professionnellement et humainement) et je sais tout ce que je vous dois…
Je tiens à remercier les stagiaires qui m’ont aidée au cours de mes travaux et que j’ai encadrés : Mélissa, Hanane, Ambre, Loïc, Marie (à 4 mains c’est plus facile qu’à 2 surtout quand ça ne marche pas !) ou partagés : Timothée, Julien et Dexu et celle que je n’ai pas encadrée directement mais qui a contribué à l’avancement du projet de biomol : Florence (Garde ta bonne humeur, tout paraît plus simple !).
Je remercie toutes les personnes qui, à leur manière, ont contribué à ce travail. Merci à Mademoiselle Véronique Gaillet, Assistante Ingénieur, pour l’aide apportée au cours de ces années. Merci aux différents laboratoires (Microbiologie Générale et Moléculaire, Signalisation et Récepteurs Matriciels et Institut de Chimie Moléculaire de Reims) qui m’ont permis de me servir de certains appareils ou encore qui m’ont fourni gracieusement certains produits. Merci à Monsieur le Docteur Dominique Harakat pour les analyses de spectrométrie de masse.
Bien qu’incapables de comprendre, merci à « mes » champignons, Aspergillus itaconicus et Aspergillus terreus, qui m’ont appris la patience et la ténacité.
Mes remerciements ne seraient pas complets si je ne citais pas celle par qui mon « aventure scientifique » a commencé lors d’un stage de Master 1 : Mademoiselle le Docteur Elise Lambert. Vous avez su me faire partager votre passion pour la Recherche. Je vous remercie pour vos conseils et le soutien sans faille que vous avez pu m’apporter depuis toutes ces années. Merci d’avoir cru en moi !
Merci à mes « vieilles » amies du lycée Elodie et Manu, celles qui ont toujours été présentes dans les bons et les mauvais moments, malgré la distance.
A Anthony, tu as su être, dans cette épreuve, ma certitude dans mes doutes, mon rire dans mes larmes, ma force dans mes faiblesses, mon calme dans mes tempêtes… merci d’être à mes côtés et de m’accepter telle que je suis.
Je n’oublie pas mes parents et ma famille qui ont soutenu chacun de mes choix et notamment ma mère qui a partagé le bon et supporté le moins bon, depuis ma première heure. Maman, que tu trouves ici la preuve de tout mon amour.
« L’amour maternel n’est point chose éphémère ; il ne trompe jamais, et jamais ne finit. » Evariste Boulay-Paty
Une pensée pour mon oncle Michel…
Je clos cette aventure en dédiant cette thèse à mes grands-parents, et plus particulièrement à ma grand–mère qui aurait voulu voir l’aboutissement de toutes ces années. Je sais que vous étiez fiers de mes études mais la « richesse » des personnes ne passent pas uniquement par un diplôme… moi aussi je suis fière de vous.
RESUME
Depuis quelques années, un des défis de la Recherche est de valoriser les co-produits agro-industriels. Une des voies permettant la valorisation de ces co- produits est la fermentation en milieu solide.
Le but de ce travail est de produire de l’acide itaconique par des souches d’Aspergilli (Aspergillus itaconicus et Aspergillus terreus) à partir de ressources renouvelables. Le substrat choisi dans cette étude est le son de blé, coproduit largement disponible en Champagne-Ardenne.
L’acide itaconique a été classé dans le TOP 12 des molécules plateformes par le Department Of Energy Américain. Ces molécules plateformes peuvent être produites à partir de biomasse ligno-cellulosique et peuvent être utilisées à la place de molécules d’origine pétrochimique.
Dans notre étude, nous n’avons pas mis en évidence de production d’acide itaconique par la souche Aspergillus terreus NRRL 1960 mais nous avons observé, pour la première fois, la production d’acide fumarique par fermentation en milieu solide. L’acide fumarique est tout aussi intéressant que l’acide itaconique puisqu’il fait également partie du TOP 12 des molécules plateformes.
La production maximale obtenue est de 0,44 mg/g de matière sèche par fermentation en milieu solide sur son de blé humidifié à 70% et à pH 3, après 5 jours d’incubation à 30°C.
De plus, nous avons montré qu’Aspergillus itaconicus NRRL 161 est capable de produire 6,77 mg d’acide itaconique/g de matière sèche par fermentation en milieu solide sur son de blé humidifié à 60% par une solution de saccharose à 400 g/L et à pH 3, après 4 jours d’incubation à 30°C.
Dans une dernière partie, nous avons mis en évidence, chez Aspergillus itaconicus NRRL 161, la présence potentielle du gène codant pour la Cis-Aconitic acid Decarboxylase, enzyme clé dans la production d’acide itaconique.
Mots clés : Acide itaconique, Acide fumarique, Aspergillus itaconicus, Aspergillus terreus, Fermentation en milieu solide, Gène CAD1
ABSTRACT
Since a few years, one of research’s challenges is to valorise agro-industrial by- products. One of the ways permitting the valorisation of these “wastes” is solid-state fermentation.
The aim of this work is to produce itaconic acid with Aspergilli (Aspergillus itaconicus and Aspergillus terreus) strains from renewable resources. The chosen substrate in this study is wheat bran, by-product widely available in Champagne- Ardenne.
Itaconic acid is classified among the TOP 12 of building blocks by the American Department Of Energy. Building blocks can be produced from ligno-cellulosic biomass and can be used instead of petrochemical-based molecules.
In our study, we have not highlighted itaconic acid production by Aspergillus terreus NRRL 1960, but we have observed, for the first time, fumaric acid production by solid state fermentation. Fumaric acid is as interesting as itaconic acid since it also belongs to the TOP 12 of building blocks. Maximal production of fumaric acid is 0.44 mg/g dry matter by solid-state fermentation on wheat bran moistened at 70% and at pH 3, after 5 days of incubation at 30°C.
Furthermore, we have shown that Aspergillus itaconicus NRRL 161 is able to produce 6.77 mg of itaconic acid/g dry matter by solid state fermentation on wheat bran moistened at 60% with sucrose solution at 400 g/L and at pH 3, after 4 days of incubation at 30°C.
In a last part, we have highlighted, in Aspergillus itaconicus NRRL 161, the potential presence of the Cis-Aconitic acid Decarboxylase encoding gene, key enzyme in itaconic acid production.
Key words: Itaconic acid, Fumaric acid, Aspergillus itaconicus, Aspergillus terreus, Solid-state fermentation, CAD1 gene.
SOMMAIRE
Liste des abréviations 1
Liste des figures 4
Liste des tableaux 7
INTRODUCTION GENERALE 8
SYNTHESE DES CONNAISSANCES 12
I. Les acides organiques 13
A.Généralités 13
B.Production non fermentaire 13
C.Production par fermentation 13
1.Production par fermentation en milieu liquide 13
2.Production par fermentation en milieu solide 14
a. L’acide citrique 14
b. L’acide lactique 15
c. L’acide gluconique 16
D.L’acide itaconique 17
1.Généralités 17
2.Historique 18
3.Méthodes de production 19
a. Synthèse chimique 19
b. Production biotechnologique 19
i. Micro-organismes utilisés 19
ii. Voie de biosynthèse et conditions de production 22
iii. L’enzyme Cis-Aconitic acid Decarboxylase 24
4.Applications 28
E.L’acide fumarique 28
1.Généralités 28
2.Historique 29
3.Méthodes de production 30
a. Synthèse chimique et conversion enzymatique 30
b. Production biotechnologique 30
i. Micro-organismes utilisés 30
ii. Voie de biosynthèse et conditions de production 31
4.Applications 32
II. La Fermentation en Milieu Solide 33
A.Définition 33
B.Origine et applications ancestrales 34
C.Historique européen 35
D.Organismes utilisés 36
E.Facteurs influençant la fermentation en milieu solide 37
1.Le type d’inoculum 37
2.L’humidité 37
3.La température 38
4.Le pH 39
5.L’aération et le brassage 40
6.L’oxygène et le dioxyde de carbone 40
7.Les facteurs nutritionnels 41
8.Les substrats 41
a. Généralités 41
b. Le son de blé 43
i. Généralités 43
ii. Rôle et propriétés 43
9.La taille des particules 44
F.Les équipements 45
1.Les équipements de laboratoire 45
2.Les équipements aux échelles pilote et industrielle 46
a. Le réacteur en couche profonde 46
b. Le réacteur à plateau 47
G.Applications 49
1.La production d’enzymes 49
2.La production de métabolites secondaires 51
3.La biorémédiation 51
H.Inconvénients et avantages de la fermentation en milieu solide 52
III. Les Aspergilli 52
A.Généralités 52
B.Reproduction 53
C. Caractéristiques 53
D. Applications 54
E. Aspergillus itaconicus 55
F. Aspergillus terreus 56
MATERIEL ET METHODES 59
I. Etude de la production d’acide organique par fermentation en milieu solide
par des souches d’Aspergilli 60
A. Micro-organismes utilisés 60
B. Culture des souches 60
1. Milieux de culture 60
2. Ensemencement en conditions stériles et culture des souches 60
a. Milieux gélosés 60
b. Milieux liquides 61
C. Matières premières utilisées 61
D. Préparation des fermentations en milieu solide 61
E. Milieux de pré-humidification utilisés 62
F. Inoculation des fermentations en milieu solide 63
1. Inoculation par une suspension de conidies 63
2. Inoculation avec du mycélium 63
G. Extraction et analyse des fermentations en milieu solide 64
1. Mesure du taux d’humidité 64
2. Mesure de la matière totale et de la matière sèche 64
3. Extraction, mesure du pH et préparation des échantillons avant analyse 64 H. Détection et dosage de l’acide itaconique et de l’acide fumarique 65
1.Dosage de l’acide itaconique et de l’acide fumarique par Chromatographie Liquide
Haute Performance 65
2. Spectrométrie de masse 66
II. Recherche du gène codant pour la Cis-Aconitic acid Decarboxylase chez
A. itaconicus NRRL 161 68
A. Micro-organismes et plasmide utilisés 68
1. Escherichia coli JM109® 68
2.Escherichia coli E. cloni 10G® 68
3.Le plasmide pGEM-4Z® 68
B. Milieux de culture, milieux de sélection et conditions de croissance des bactéries 69
1. Milieux de culture 69
2.Milieux de sélection 70
C. Extraction d’ADN génomique et plasmidique 70
1. Préparation du matériel biologique 70
2.Extraction d’ADNg d’A. itaconicus et A. terreus 71
3.Extraction d’ADN plasmidique (ADNpl) d’E. coli 72
D. Amplification d’ADN par réaction de polymérisation en chaîne et purification 72 1. Détermination des amorces à partir du gène CAD1 d’A. terreus 72
2.Conditions de « PCR » 74
3.Purification des produits de « PCR » 74
E. Analyse de l’ADN par électrophorèse sur gel d’agarose 75
F. Analyse des ADN et construction de molécules recombinées 76 1. Coupure enzymatique de l’ADNg et de l’ADNpl par des endonucléases de restriction 76
2.Extraction d’un fragment d’ADN d’un gel d’agarose 76
3.Ligation des molécules d’ADN 77
a. Déphosphorylation des extrémités 5’phosphate de l’ADNpl 77
b. Précipitation alcoolique 77
c. Ligation 77
G. Hybridation ADN-ADN 78
1. Hybridation par la technique des tâches 78
a. Marquage et vérification du marquage des sondes 78
b. Préparation d’un ADN « Dot-Blotting » 78
2.Hybridation par la technique de « Southern-Blot » 79
H. Techniques de transformation 80
1. Transformation au CaCl2 80
a. Obtention de bactéries compétentes 80
b. Transformation par un plasmide 81
2.Transformation par électroporation 81
I. Séquençage de fragment d’ADN 81
RESULTATS et DISCUSSION 82 Première partie : Criblage de souches d’Aspergilli productrices d’acide
itaconique et Production d’acide organique par fermentation en milieu solide
par des souches d’Aspergilli 83
I. Criblage de souches d’Aspergilli productrices d’acide itaconique 84 II. Etude de la production d’acide fumarique par A. terreus NRRL 1960 par
fermentation en milieu solide 89
A.Effet du pH initial et de la durée d’incubation sur la production d’acide fumarique par
A. terreus par fermentation en milieu solide 89
B. Effet de l’ajout de milieux de production d’acide organique au son de blé sur la
production d’acide fumarique par A. terreus par fermentation en milieu solide 92 C. Evolution de la quantité d’acide itaconique dans un milieu de fermentation en présence
ou en absence de la souche A. terreus 95
III. Etude de la production d’acide itaconique par A. itaconicus NRRL 161 101 A.Evolution de la quantité d’acide itaconique dans un milieu de fermentation
en présence ou en absence de la souche A. itaconicus 101
B.Effet du pH initial sur la production d’acide itaconique par A. itaconicus par
fermentation en milieu solide 105
C.Effet de l’humidité initiale sur la production d’acide itaconique par A. itaconicus par
fermentation en milieu solide 108
D. Effet de la température d’incubation sur la production d’acide itaconique par
A. itaconicus par fermentation en milieu solide 109
E. Effet de la quantité de son de blé sur la production d’acide itaconique par A. itaconicus
par fermentation en milieu solide 111
F.Effet du maintien du milieu à pH acide au cours d’une fermentation en milieu solide
avec A. itaconicus 113
G.Effet de tampons et de solutions d’acide sur la production d’acide itaconique par
A. itaconicus par fermentation en milieu solide 115
H.Effet de la concentration de saccharose sur la production d’acide itaconique par
A. itaconicus par fermentation en milieu solide 118
I. Effet des sources de carbone sur la production d’acide itaconique par A. itaconicus par
fermentation en milieu solide 120
J. Effet des substrats sur la production d’acide itaconique par A. itaconicus par
fermentation en milieu solide 121
K. Effet de l’apport d’azote sur la production d’acide itaconique par A. itaconicus par
fermentation en milieu solide 121
L.Effet d’un inoculum végétatif sur la production d’acide itaconique par A. itaconicus par
fermentation en milieu solide 124
Deuxième partie : Recherche du gène codant pour la Cis-Aconitic acid
Decarboxylase chez A. itaconicus NRRL 161 129
I. Amplification partielle du gène CAD1 chez A. terreus NRRL 1960 par « PCR » 130 II. Essais d’amplification de fragment du gène codant pour la CAD chez A. itaconicus
NRRL 161 par « PCR » 134
III. Mise en évidence du gène « CAD1 » chez A. itaconicus par utilisation de sondes
d’A. terreus 135
A. Essais d’hybridation par « Dot-Blot » 135
B. Essais d’hybridation par « Southern-Blot » 136
IV. Construction d’une mini banque d’ADNg d’A. itaconicus 139
CONCLUSION GENERALE et PERSPECTIVES 143
BIBLIOGRAPHIE 143
ANNEXES 143
1
LISTE DES ABREVIATIONS
ADN : Acide DésoxyriboNucléique ADNg : ADN génomique
ADNpl : ADN plasmidique AF : Acide fumarique AI : Acide itaconique
ARD : Agro-industrie Recherche et Développement ARN : Acide RiboNucléique
BEt : Bromure d’Ethidium
CAD : Cis-Aconitic Acid Decarboxylase CIAP : Calf Intestinal Alkaline Phosphatase CECT : Colleción Española De Cultivos Tipo CSL : Corn Steep Liquor
°C : Degré Celsius DIG : Digoxygénine
dNTP : désoxyNucléoside TriPhosphate
DSM : Deutsche Sammlung von Mikroorganismen dUTP : désoxyuracile triphosphate
EDTA : Ethylene Diamine Tetraacetic Acid
FARE : Fractionnement des Agro-Ressources et Environnement FML : Fermentation en milieu liquide
FMS : Fermentation en milieu solide g : gramme
HPLC : High Performance Liquid Chromatography IFO : Institue for Fermentation, Osaka
2 IPTG : IsoPropyl β-D-ThioGalactopyranoside
INRA : Institut National de la Recherche Agronomique kb : kilobase
kV : kiloVolt L : Litre
M : Marqueur de taille M : Molaire
MH : Milieu de Harrold M40Y : Malt 40 Yeast µF : microFarraday µg : microgramme µL : microLitre µM : microMolaire mM : milliMolaire mol : mole
Mb : Mégabase MS : Matière Sèche MT : Matière Totale
NBT/BCIP : NitroBlue Tetrazolium chloride / 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-Phosphate ng : Nanogramme
NRRL : Northern Regional Research Laboratory NTG : N-Méthyl-N’-Nitro-N-Nitrosoguanidine Ω : Ohm
pb : paire de base
PCR : Polymerase Chain Reaction PDA : Potato Dextrose Agar
3 p/p : poids/poids
p/v : poids/volume RNase : Ribonucléase rpm : rotation par minute TAE : Tris Acetate EDTA TBE : Tris Borate EDTA U : Unité
UV : Ultra Violet
X-gal : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside
4 LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Structure chimique de l’acide itaconique ... 17
Figure 2 : Structure chimique de l’acide acrylique et méthacrylique ... 17
Figure 3 : Voie de biosynthèse de l’acide itaconique ... 23
Figure 4 : Schéma représentant la localisation de l’aconitase, de la Cis-Aconitic acid Decarboxylase (CAD) et de l’acide itaconique ... 25
Figure 5 : Electrophorèse SDS-PAGE des préparations enzymatiques au cours des étapes de purification de la CAD ... 26
Figure 6 : Séquence nucléotidique du gène CAD1 codant pour la CAD et séquence protéique déduite ... 27
Figure 7 : Structure chimique de l’acide fumarique ... 29
Figure 8 : Réacteur colonne de laboratoire ... 46
Figure 9 : Réacteur pilote en cuve profonde, INRA Dijon ... 47
Figure 10 : Fermenteur semi-pilote de type koji, Laboratoire de Microbiologie Industrielle de l’UFR Sciences de Reims ... 48
Figure 11 : Fermenteur industriel automatisé de type Koji, Société Fujiwara Japon... 48
Figure 12 : Schéma représentant la structure microscopique des Aspergilli ... 54
Figure 13 : Observations macroscopiques d’A. itaconicus, mycélium non sporulé (A), totalement sporulé (B) vu du dessus et mycélium vu du dessous (C) ... 56
Figure 14 : Observation microscopique d’une tête conidienne d’A. itaconicus ... 56
Figure 15 : Observations macroscopiques d’A. terreus, mycélium non sporulé (A), en partie sporulé (B) vu du dessus et mycélium vu du dessous (C) ... 57
Figure 16 : Observation microscopique d’une tête conidienne d’A. terreus ... 57
Figure 17 : Représentation schématique de l’inoculation et de l’analyse d’une fermentation en milieu solide ... 67
Figure 18 : Carte de restriction du plasmide pGEM-4Z ... 69
Figure 19 : Position des amorces cad1, 2a, b et c sur le gène CAD1, décrit par Kanamasa et al. 2008 ... 73
5 Figure 20 : Marqueurs de taille 1 kb et 100 bp utilisés ... 75 Figure 21 : Schéma du montage permettant le transfert d’ADN à partir d’un gel d’agarose
sur membrane de nylon chargée positivement ... 80 Figure 22 : Spectres de masse du standard d’acide fumarique (A) et de l’échantillon obtenu
par fermentation en milieu solide sur son de blé humidifié à 70% et à pH 3 après 3 jours d’incubation à 30°C (B) ... 88 Figure 23 : A. terreus sur son de blé acidifié ou non ... 89 Figure 24 : Effet du pH initial sur l’humidité et le pH du milieu de fermentation ... 90 Figure 25 : Effet du pH initial sur la production d’acide fumarique par A. terreus par
fermentation en milieu solide ... 91 Figure 26 : Effet de l’ajout de différents milieux de production d’acide organique au son de
blé sur l’humidité et le pH du milieu de fermentation... 92 Figure 27 : Effet de l’ajout de différents milieux de production d’acide organique au son de
blé sur la production d’acide fumarique par A. terreus par fermentation en milieu solide ... 93 Figure 28 : Milieux de culture en présence ou en absence d’acide itaconique et inoculés ou
non par A. terreus ... 96 Figure 29 : Evolution de la quantité d’acide itaconique en présence ou en absence
d’A. terreus ... 97 Figure 30 : Milieux de culture en présence ou en absence d’acide itaconique et inoculé ou
non par A. itaconicus ... 102 Figure 31 : Evolution de la quantité d’acide itaconique en présence ou en absence
d’A. itaconicus ... 103 Figure 32 : Effet du pH initial sur la production d’acide itaconique par A. itaconicus par
fermentation en milieu solide ... 106 Figure 33 : Effet de l’humidité initiale sur la production d’acide itaconique par A. itaconicus
par fermentation en milieu solide ... 108 Figure 34 : Effet de la température d’incubation sur la production d’acide itaconique par
A. itaconicus par fermentation en milieu solide ... 110 Figure 35 : A. itaconicus cultivé sur différentes quantités de son de blé ... 111 Figure 36 : Effet de la quantité de son de blé sur la production d’acide itaconique par
A. itaconicus par fermentation en milieu solide ... 112
6 Figure 37 : A. itaconicus sur son de blé maintenu à pH acide ... 113 Figure 38 : Effet du maintien du pH acide sur la production d’acide itaconique par
A. itaconicus par fermentation en milieu solide ... 114 Figure 39 : A. itaconicus sur son de blé en présence de différents tampons et/ou de solutions
d’acide ... 116 Figure 40 : Effet de l’ajout de tampons et/ou d’acides sur la production d’acide itaconique par A. itaconicus par fermentation en milieu solide ... 117 Figure 41 : Effet de la concentration en saccharose sur la production d’acide itaconique par A.
itaconicus par fermentation en milieu solide ... 119 Figure 42 : Effet de l’apport d’azote sur la production d’acide itaconique par A. itaconicus
par fermentation en milieu solide ... 122 Figure 43 : Effet de l’âge de l’inoculum végétatif sur la production d’acide itaconique par
A. itaconicus par fermentation en milieu solide ... 125 Figure 44 : Extraction d’ADNg d’A. terreus ... 131 Figure 45 : Schéma représentant le gène codant pour la CAD ainsi que la localisation des
fragments attendus après amplification par « PCR »
chez A. terreus NRRL1960 ... 131 Figure 46 : Amplification des fragments cad1, cad2a, cad2b et cad2c chez A. terreus NRRL
1960 ... 132 Figure 47 : Hybridation par « Dot-Blot » de la sonde cad1 (A) et cad2a (B) avec l’ADN
génomique d’A. itaconicus ... 135 Figure 48 : Hybridation par « Southern-Blot » de la sonde cad1 (B) et cad2b (D) avec l’ADN
génomique d’A. itaconicus ... 137 Figure 49 : Localisation schématique des sondes cad1 et cad2b et du gène codant pour la
CAD chez A. itaconicus après digestion par BamHI ou par EcoRI ... 139 Figure 50 : ADNg d’A. itaconicus coupé par BamHI et localisation de la zone 6000-8000pb
découpée ... 140 Figure 51 : Profil de restriction des vecteurs recombinants contenant le fragment d’ADNg
d’A. itaconicus codant potentiellement pour la CAD ... 141 Figure 52 : Hybridation de la sonde cad2b marquée à la DIG avec l’ADNpl extrait des clones
contenant potentiellement le gène codant pour la CAD chez A. itaconicus ... 143
7
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1 : Principaux acides organiques produits par fermentation liquide ... 14 Tableau 2 : Caractéristiques physico-chimiques de l’acide itaconique ... 18 Tableau 3 : Micro-organismes utilisés pour la production d’acide itaconique et les
concentrations obtenues ... 20 Tableau 4 : Souches d’Aspergillus terreus utilisées pour la production d’acide itaconique .. 21 Tableau 5 : Caractéristiques physico-chimiques de l’acide fumarique ... 29 Tableau 6 : Souches de Rhizopus utilisées pour la production d’acide fumarique et les
concentrations obtenues ... 31 Tableau 7 : Exemples d’aliments produits par fermentation en milieu solide ... 34 Tableau 8 : Exemple de micro-organismes utilisés en fermentation en milieu solide et leurs
applications ... 36 Tableau 9 : Exemples d’enzymes produites par fermentation en milieu solide ... 50 Tableau 10 : Exemples de molécules produites par différentes espèces d’Aspergilli ... 55 Tableau 11 : Amorces utilisées pour les réactions d’amplification par « PCR » ... 73 Tableau 12 : Production d’acide itaconique par différentes souches d’Aspergilli par
fermentation en milieu solide en fonction du pH initial ... 86 Tableau 13 : Taille approximative des inserts (pb) obtenus pour chaque clone ... 142
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INTRODUCTION GENERALE
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D’hier à aujourd’hui
Dès l’Antiquité, l’idée d’un monde vivant invisible à l’œil nu a été émise par Aristote.
Cette pensée fut reprise maintes fois mais aucune preuve ne fut apportée.
Dans les années 1670, Antony Van Leeuwenhoek, drapier néerlandais et chercheur amateur, développa le premier microscope. Ainsi fut découvert le monde des micro-organismes.
Méconnus jusqu’au XVIIème siècle, ces organismes sont pourtant la première forme de vie apparue sur Terre, il y a environ 4 milliards d’années.
Principalement reliés aux maladies infectieuses telles que la tuberculose, le choléra, la peste… Louis Pasteur montre, au milieu du XIXème siècle, le rôle de ces êtres vivants dans la fermentation alcoolique. Ce terme faisait alors référence à un procédé en milieu liquide. Suite à cette découverte, de nombreuses applications industrielles et la construction de fermenteurs permettant la culture de micro-organismes anaérobies ont vu le jour. Rapidement les industriels ont découvert que les micro-organismes aérobies étaient capables de produire des molécules d’intérêt. Les fermenteurs ont donc été adaptés à la culture de micro-organismes aérobies et le terme de fermentation s’est alors étendu aux processus faisant intervenir des micro-organismes aérobies ou anaérobies en milieu liquide ou en milieu solide.
La fermentation en milieu solide correspond à la culture de micro-organismes sur matrice solide servant de support et/ou de substrat en absence ou presque d’eau libre.
La fermentation en milieu solide est utilisée, en Extrême-Orient, depuis des millénaires notamment pour la production de saké et de tofu grâce à des souches fongiques.
10 Longtemps délaissée au profit de la fermentation liquide, la fermentation solide connait un regain d’intérêt depuis quelques années. Ce processus permet, en plus du développement de produits alimentaires (pain, fromage), la production d’enzymes, d’antibiotiques mais aussi d’acides organiques.
Depuis le XXème siècle, les recherches s’orientent vers le développement de la technique de fermentation solide afin de produire ces métabolites. Parallèlement à ceci, l’objectif des recherches est aussi de valoriser les co-produits agricoles qui peuvent servir de substrat dans les fermentations solides. La région Champagne- Ardenne est la deuxième région française productrice de céréales où le blé est la céréale la plus cultivée. Ceci entraîne une quantité importante de co-produits pour l’industrie qui peuvent, cependant, être valorisés par voie fermentaire. De plus, la raréfaction des ressources pétrolières et le réchauffement climatique appuient également la recherche et le développement d’alternatives à la pétrochimie.
En 2004, le Département de l’Energie Américain a établi un classement de douze molécules dites « plateformes » (1,4-diacides (succinique, fumarique, malique) ; acide 2,5-furane-dicarboxylique ; acide-3-hydroxy-propionique ; acide aspartique ; acide glucarique ; acide glutamique ; acide itaconique ; acide lévulinique ; 3-hydroxybutyrolactone ; glycérol ; sorbitol ; xylitol/arabinitol) pouvant être produites par voie fermentaire et ayant des applications dans l’industrie chimique.
Dans ce contexte scientifique et dans le cadre du Contrat de Projets Etat-Région 2007-2013, le programme de recherche PENTORAF a été mis en place. Il a pour objectif la valorisation non alimentaire de la biomasse afin de produire des biomolécules, bioénergies et biomatériaux et ainsi maintenir l’évolution de l’agriculture régionale.
L’objectif de ce travail de thèse est la production d’une molécule plateforme tel que l’acide itaconique par fermentation. D’un point de vue économique et environnemental, la technique de production utilisée est
11 la fermentation en milieu solide. Afin de valoriser la biomasse ligno- cellulosique régionale, nous avons choisi comme principal substrat de fermentation le son de blé, agro-ressource fortement disponible en Champagne-Ardenne.
Dans la première partie des résultats, nous recherchons les souches d’Aspergilli capables de produire de l’acide itaconique puis nous présentons les travaux de mise en évidence et d’essais d’amélioration de la production d’acide fumarique par Aspergillus terreus NRRL 1960.
Nous continuons par la présentation des essais de production d’acide itaconique par fermentation en milieu solide par Aspergillus itaconicus NRRL 161. Dans la seconde partie, nous présentons les travaux réalisés sur la recherche du gène codant pour l’enzyme Cis-Aconitic Acid Decarboxylase, enzyme clé dans la production d’acide itaconique, chez Aspergillus itaconicus NRRL 161.
SYNTHESE DES CONNAISSANCES
13 I. Les acides organiques
A. Généralités
Les acides organiques ont été découverts par Scheele en 1784 (Tomic 2010). Ce sont des composés chimiques de faibles poids moléculaires se caractérisant par la présence d’au moins une fonction carboxylique (Plassard et Fransson 2009). Ces acides sont produits naturellement par tous les organismes tels que les micro-organismes, les plantes, les animaux et les êtres humains. Les acides organiques les plus courants sont les acides carboxyliques qui sont principalement employés dans l’industrie alimentaire comme additifs alimentaires et sont utilisés comme agent de conservation, acidulant ou antioxydant.
B. Production non fermentaire
La production industrielle des acides organiques a débuté avec la production d’acide citrique à partir de citrons ainsi que la production d’acide malique à partir de pommes (Tomic 2010).
A la fin du XIXème siècle, des études portant sur les champignons filamenteux, et plus particulièrement les Aspergilli, ont montré que ces micro-organismes étaient capables de produire ces molécules. Avec cette découverte, les chercheurs et industriels se sont alors tournés vers l’utilisation des micro-organismes tels que les champignons pour la production d’acides organiques. Ces molécules sont vite devenues un domaine important d’étude pour leurs diverses applications.
C. Production par fermentation
1. Production par fermentation en milieu liquide
La production, par fermentation, d’un acide organique dépend du micro-organisme utilisé mais aussi de la régulation de paramètres physico-chimiques tels que l’oxygénation (procédé aérobie ou non), la température, le pH et l’agitation/aération.
La production d’acides organiques est généralement réalisée par fermentation en milieu liquide. La liste des principaux acides organiques produits par fermentation liquide ainsi que les micro-organismes producteurs sont présentés dans le tableau 1.
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Acide organique Micro-organisme
Acide acétique Acetobacter (b)
Acide citrique Aspergillus (m)
Acide fumarique Aspergillus
Acide gluconique Aspergillus
Acide itaconique Aspergillus
Acide lactique Rhizopus (m), Lactobacillus (b)
Acide malique Rhizopus
Acide oxalique Aspergillus
Acide succinique Aspergillus, Escherichia coli (b)
Tableau 1 : Principaux acides organiques produits par fermentation liquide (Magnuson et Lasure 2004) b : bactérie ; m : moisissure
2. Production par fermentation en milieu solide
Les acides organiques sont généralement produits par fermentation en milieu liquide (FML) mais ils peuvent également être produits par fermentation en milieu solide (FMS).
Actuellement, les principaux acides organiques produits par FMS sont : l’acide citrique, l’acide lactique et l’acide gluconique (Soccol 2008).
a. L’acide citrique
L’acide citrique (C6H8O7) est le principal acide organique produit et utilisé.
L’acide citrique est un intermédiaire du cycle de Krebs. Il est largement utilisé dans l’alimentation, comme additif alimentaire, mais aussi dans la composition des détergents et des cosmétiques (Krishna 2005). La production d’acide citrique par fermentation liquide à l’échelle industrielle date de la fin du XIXème siècle. Depuis quelques années, les recherches
15 s’orientent vers une production d’acide citrique par FMS. Différents micro-organismes sont utilisés mais Aspergillus niger reste le meilleur champignon producteur d’acide citrique (Papagianni 2007).
L’acide citrique peut être produit à partir de canne à sucre, son de blé ou de riz ou encore de grains de café, etc. Différents paramètres influencent cette production par Aspergillus niger.
En effet, la production d’acide citrique est fortement influencée par le type et la concentration de la source de carbone. Cette source de carbone, principalement le saccharose, doit être comprise entre 140 et 220 g/L. La source d’azote ne doit pas excéder 0,4 g/L. L’utilisation de sels d’ammonium, comme le sulfate d’ammonium, est préférée pour la production d’acide citrique. En effet, l’utilisation des ces sels comme source d’azote permet une diminution du pH du milieu de fermentation qui est essentielle pour la production d’acide citrique. Celle-ci est améliorée lorsque le pH est aux environ de 2. La température de fermentation est généralement de 28 à 30°C et le meilleur taux d’humidité initiale est de 70%. Les métaux tels que le cuivre, le zinc, le manganèse et le fer doivent être présents en faible quantité (Dhillon et al. 2011). De plus, des chercheurs ont montré que l’ajout d’alcool (1 à 4% (v/p)), comme le méthanol par exemple, est favorable à la production d’acide citrique. Il est important de noter qu’une forte aération augmente la sporulation du champignon entrainant une diminution de production d’acide citrique. Ainsi, il est nécessaire de maintenir le champignon à l’état de mycélium (Soccol 2008).
Selon la souche sauvage d’Aspergillus niger utilisée et les conditions de fermentation, la production d’acide citrique peut varier de 88 à 264 mg/g de matière sèche (Roukas 1999;
Vandenberghe et al. 2000). L’utilisation d’une souche d’Aspergillus niger mutée permet d’obtenir 616,5 mg/g de matière totale (Rodrigues et al. 2009).
b. L’acide lactique
L’acide lactique (C3H6O3) est un acide organique très utilisé dans le domaine alimentaire et pharmaceutique (Couto et Sanroman 2006). Depuis quelques années, il est utilisé dans la fabrication de polymère biodégradable (« Poly Lactic Acid » ou PLA) (Magnuson et Lasure 2004). La production d’acide lactique est réalisée principalement par fermentation en milieu liquide mais la production à grande échelle est limitée par le coût des matières premières (Soccol 2008). Ainsi, l’utilisation de co-produits agro-industriels tels que l’extrait de jus de
16 datte pour la production d’acide lactique par fermentation liquide (Nancib et al. 2009) peut être un moyen de diminuer ce coût de production. L’utilisation de co-produits solides, comme la bagasse de canne à sucre ou la pulpe de manioc, semble également être une bonne alternative pour la production d’acide lactique par la technique de fermentation en milieu solide (FMS). Pour cela, des travaux de production de cet acide, par FMS, sont réalisés. Les micro-organismes utilisés pour cette production peuvent être soit des bactéries telles que Lactobacillus soit des champignons filamenteux comme Rhizopus. Le taux d’humidité initiale joue un rôle important. En effet, l’augmentation du taux d’humidité initiale permet d’augmenter la production d’acide lactique. De plus, en FMS, l’acidification du milieu au cours de la fermentation entraîne une baisse de production de l’acide lactique, il est alors nécessaire de maintenir le pH à 6 par ajout de soude. La température de production est comprise entre 30°C et 37°C selon le micro-organisme utilisé. La production est également influencée par la concentration en glucose qui doit être comprise entre 120 et 240 g/L (Soccol, Marin et al. 1994). La production d’acide lactique est d’environ 500 mg/g de matière totale quelque soit le type de micro-organisme utilisé (Rojan et al. 2005; Phrueksawan et al. 2012).
Cependant, Rhizopus a tendance à produire, en plus de l’acide lactique, de l’acide fumarique et de l’éthanol (Magnuson et Lasure 2004). Ceci est un problème à contourner car la production d’autres molécules entraîne une diminution de production d’acide lactique.
c. L’acide gluconique
L’acide gluconique (C6H12O7) est un acide organique utilisé dans l’industrie alimentaire et pharmaceutique. De même que l’acide citrique et lactique, il est principalement produit par fermentation en milieu liquide, par Aspergillus niger, mais il peut également être produit par fermentation en milieu solide. Très peu d’études ont été publiées sur ce sujet. Cependant, des travaux ont montré que la concentration en glucose est très importante dans le procédé de production. En effet la concentration de glucose doit être comprise entre 120 et 200 g/L. Le pH initial est de 7 mais diminue fortement au cours de la culture jusqu’à 1,5. La température utilisée est comprise entre 25°C et 30°C. Au-delà, la concentration en acide gluconique diminue (Ramachandran et al. 2006). Une forte humidité initiale (75%) permet d’améliorer la production d’acide gluconique par rapport à une humidité initiale plus faible. Des études ont montré une production d’acide gluconique de 490 mg/g de matière sèche. Cette production
17 augmente de 490 à 685 mg/g de matière sèche après ajout de 6% de méthanol (p/p) (Roukas 2000).
En 2004, le Département de l’Energie Américain a rédigé un rapport classant 12 molécules différentes (parmi 300) appelées « building blocks » ou molécules « plateformes » qui ont une forte valeur ajoutée et qui peuvent être produites à partir de ressource renouvelable.
Ces molécules « plateformes » sont définies comme des molécules élémentaires qui possèdent le potentiel d’être transformées, par recombinaison chimique, en d’autres molécules plus complexes et très utiles dans l’industrie des polymères. Parmi ces douze molécules, deux acides organiques intéressants ont été listés : l’acide itaconique et l’acide fumarique (Werpy et Petersen 2004).
D. L’acide itaconique 1. Généralités
L’acide itaconique est aussi nommé :
Acide méthylène butanedioïque
Acide méthylène succinique
Acide 2-méthylène-but-3-ènoïque
Acide propylène dicarboxylique
C’est un acide organique dicarboxylique insaturé de formule brute C5O4H6 (Figure 1), cristallin blanc et de masse molaire 130,1 g/mol.
Il est considéré comme un acide acrylique ou méthacrylique substitué (Figure 2).
Actuellement, les acides acrylique et méthacrylique sont issus de la pétrochimie.
Figure 2 : Structure chimique de l’acide acrylique et méthacrylique Figure 1 : Structure chimique de l’acide itaconique
Acide acrylique Acide méthacrylique
18 Les caractéristiques physico-chimiques de l’acide itaconique sont listées dans le tableau 2.
Température de fusion 167-168°C Température d’ébullition 268°C
Solubilité dans l’eau 83 g/L
Densité 1,632
(20°C)
pKa 3,84 et 5,55
Tableau 2 : Caractéristiques physico-chimiques de l’acide itaconique (Willke et Vorlop 2001)
Son insaturation lui confère un haut degré de polymérisation avec des applications très variées que nous expliciterons ci-après.
En 2009, Okabe et al, précisent que 80 000 tonnes d’acide itaconique sont produits chaque année à travers le monde avec un prix d’environ 2$ le kilogramme (Okabe et al. 2009). Le prix a fluctué au cours du temps. Dans les années 1970, le prix du kilogramme était de 0,49$
(Willke et Vorlop 2001) pour atteindre 4,3$ en 2000 (Bressler et Braun 2000). Ce prix varie en fonction du cours des matières destinées à sa fabrication, la principale étant le glucose. Le prix du glucose étant indexé sur le prix des céréales qui a augmenté depuis 2009, le prix de l’acide itaconique doit avoir augmenté également.
2. Historique
L’acide itaconique a été découvert, en 1837, par Baup comme produit de décomposition de l’acide citrique (Baup 1837). En 1932, Kinoshita est le premier à décrire la production de cet acide par une souche de champignon osmophile nommé Aspergillus itaconicus à partir de glucose ou de saccharose (Kinoshita 1932). Quelques années après, Calam et al. (1939) arrivent à produire de l’acide itaconique, en quantité plus importante, à partir d’une autre souche fongique : Aspergillus terreus.
19 La première production d’acide itaconique par fermentation liquide à l’échelle industrielle a débuté en 1955 (Okabe et al. 2009). La production d’acide itaconique a beaucoup été étudiée jusque dans les années 1960 puis son intérêt a diminué pendant une quinzaine d’années, comme le montre le peu de littérature sur le sujet. A partir des années 1980, l’acide itaconique redevient attractif.
3. Méthodes de production a. Synthèse chimique
La première méthode employée pour la production d’acide itaconique est la pyrolyse de l’acide citrique puis l’hydrolyse des anhydrides (Baup 1837). Une seconde méthode a été développée. Elle consiste en la décarboxylation de l’acide aconitique (Willke et Vorlop 2001).
D’autres méthodes chimiques ont été étudiées mais aucune n’a pu, jusqu’à présent, réellement rivaliser avec la production d’acide itaconique par fermentation liquide (Okabe et al. 2009).
C’est pourquoi, aujourd’hui, aucune production commerciale n’est assurée par une synthèse chimique.
b. Production biotechnologique
La production d’acide itaconique à l’échelle commerciale se fait par fermentation en milieu liquide, majoritairement avec Aspergillus terreus mais d’autres micro-organismes peuvent être employés.
i. Micro-organismes utilisés
Différents micro-organismes peuvent être utilisés pour la production d’acide itaconique comme les levures ou encore les champignons filamenteux. Les souches utilisées et leur production sont décrites dans le tableau 3
20 Micro-organisme Concentration d’acide
itaconique en g/L
Référence
LEVURES
Candida sp. 35 Okabe et al.
2009 Candida
(micro-organisme muté)
42
Okabe et al.
2009
Pseudozyma
antarctica 16,7 Levinson et al.
2006
Rhodoturola 15 Okabe et al.
2009
CHAMPIGNONS FILAMENTEUX
Ustilago zeae 15 Okabe et al.
2009
Ustilago maydis 53 Okabe et al.
2009 Aspergillus terreus
TN-484 82 Okabe et al.
2009 Aspergillus terreus
DSM 23081 90 Kuenz et al.
2012
Tableau 3 : Micro-organismes utilisés pour la production d’acide itaconique et les concentrations obtenues
Dans la littérature, le micro-organisme le plus étudié appartient à l’espèce Aspergillus terreus (Willke et Vorlop 2001). A. terreus NRRL 1960 est la souche la plus particulièrement utilisée (Larsen et Eimhjellen 1955; Gyamerah 1995). D’autres souches sauvages ou mutantes sont également utilisées. Ces souches sont répertoriées dans le tableau 4.
