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Rôle fonctionnel du Toll-Like Receptor 4 exprimé par les
plaquettes sanguines en tant que cellules inflammatoires
de l’immunité
Julien Berthet
To cite this version:
Année 2010
THESE de l’Université Jean Monnet de Saint-Etienne, Membre de l’Université de Lyon
Pour l’obtention du DIPLÔME DE DOCTORAT en Biologie, Médecine, Santé
Présentée et soutenue publiquement le 16 Décembre 2010 par
Julien BERTHET
R
ÔLE FONCTIONNEL DU
T
OLL
-L
IKE
R
ECEPTOR
4
EXPRIMÉ
PAR LES PLAQUETTES SANGUINES EN TANT QUE CELLULES
INFLAMMATOIRES DE L
’
IMMUNITÉ
Les membres du jury :
Dr Martine JANDROT-PERRUS Rapporteur INSERM - Université de Paris 7
Pr Bernard PAYRASTRE Rapporteur INSERM - Université de Toulouse 3
Pr Françoise DIGNAT-GEORGE Examinateur INSERM - Université de la Méditerranée
Dr Fabrice COGNASSE Examinateur Université de Saint-Etienne
Pr Bruno POZZETTO Président du jury Université de Saint-Etienne
3
Année 2010
THESE de l’Université Jean Monnet de Saint-Etienne, Membre de l’Université de Lyon
Pour l’obtention du DIPLÔME DE DOCTORAT
Présentée et soutenue publiquement le 16 Décembre 2010 par
Julien BERTHET
R
ÔLE FONCTIONNEL DU
T
OLL
-L
IKE
R
ECEPTOR
4
EXPRIMÉ
PAR LES PLAQUETTES SANGUINES EN TANT QUE CELLULES
INFLAMMATOIRES DE L
’
IMMUNITÉ
Les membres du jury :
Dr Martine JANDROT-PERRUS Rapporteur INSERM - Université de Paris 7
Pr Bernard PAYRASTRE Rapporteur INSERM - Université de Toulouse 3
Pr Françoise DIGNAT-GEORGE Examinateur INSERM - Université de la Méditerranée
Dr Fabrice COGNASSE Examinateur Université de Saint-Etienne
Pr Bruno POZZETTO Président du jury Université de Saint-Etienne
5
Remerciements
Je remercie le Docteur Martine JANDROT-PERRUS ainsi que le Professeur Bernard PEYRASTRE de m’avoir fait l’honneur d’accepter d’évaluer cette thèse.
Je tiens à remercier également le Professeur Françoise DIGNAT-GEORGE d’avoir accepté de faire partie de ce jury en tant qu’examinateur.
Je remercie le Professeur Bruno POZZETTO, directeur du GIMAP (Groupe Immunité des Muqueuses et Agents Pathogènes), pour m’avoir accueilli au sein de son laboratoire et pour avoir accepté de présider ce jury.
Je remercie vivement et sincèrement le Professeur Olivier GARRAUD pour avoir dirigé ma thèse, ainsi que pour sa disponibilité et son écoute mais aussi pour ses capacités à valoriser les travaux.
Je remercie tout particulièrement le Dr Fabrice COGNASSE pour sa présence au quotidien, son écoute, sa réactivité et son encadrement mais aussi sa bonne humeur. Je remercie également le Dr Hind HAMZEH-COGNASSE pour son aide et sa présence au quotidien.
Je souhaite remercier les Docteurs Dominique et Patrick FEVAL ainsi que le Docteur Frédérique BERTHOLON pour m’avoir permis d’enseigner la Physiologie au sein du CIDO (Centre International d’Ostéopathie).
6
aussi à remercier les donneurs de sang qui, en plus de l’importance de leur don, m’ont permis d’effectuer la majeure partie de mes travaux.
Je remercie particulièrement l’ensemble des personnes que j’ai rencontré durant mon parcours associatif associé à cette thèse, notamment les membres et partenaires de l’ASEC-St-Etienne, BioDocs-Lyon, Globule 38, du Réseau national BIOTechno que j’ai eu l’honneur de présider en 2009 et l’équipe de BioVision (et les membres de la Fondation Scientifique de Lyon) ; me permettant une bouffée d’air et surtout une grande ouverture d’esprit durant ce parcours doctoral. Il est toujours très difficile de citer toutes les personnes mais je me dois de nommer en particulier Emy, Elo, Nico, Tony, Simon, Mat’, Mél, Flo, Didier, GuiGui, Jean-Phi, ME, Stephy Klaus, Thomas L., Guillaume W, Lydie, Thomas, Karine et tout les autres pour lesquels je m’excuse par avance de ne pas les avoir cités.
Je tiens à remercier l’ensemble des membres du GIMAP mais aussi des autres laboratoires composants la Faculté de Médecine, dont je ne pourrais me permettre la liste complète mais qui se reconnaitrons. Merci pour cette bonne humeur permanente et pour l’entraide forte entre doctorants que beaucoup ne voient malheureusement pas. J’ai, en tout cas, passé 3 années sympathiques et rencontré des étudiants et doctorants que je n’oublierai pas. Merci à vous. Je n’oublierai ni les Fahd, Nico, Phil, Papa, Amadou, Thibaut, Aurélien, Lara, Olivier D, Olivier J, Yann, Réham, Séverine, Françoise(s), Baboulinet, Amandine M, Guenaelle, Maya et tout les autres que j’ai certainement du oublier et pour lesquels je m’excuse d’avance.
7
laboratoire va être une grande déchirure, pour des tonnes de raisons mais encore plus par rapport à toi, surtout car je ne pourrais plus passer mes journées à discuter avec toi, que ce soit pour se raconter nos vies ou pour boire une petite goutte de Chartreuse ! C’est aussi grâce à toi si je suis là. Tu es une vraie amie et je ferais tout pour que tu le restes même après mon départ du GIMAP (enfin, si tu le souhaites ;-) ). Ma didine, toi qui m’a initié au GIMAP mais aussi aux soirées avec paupau, merci d’être là et surtout d’avoir fait ce long déplacement depuis le pays des bucherons ! J’ai déjà remercié de nombreuses personnes de l’asso, mais je ne peux m’empêcher de replacer ici notamment Emy, Nico et Elo qui ont été aussi des amis avant d’être des collègues de l’asso, ainsi que mon Black Bamboo qui a le malheur de me supporter depuis tant d’années.
Enfin, le mot de la fin ira pour celle qui partage ma vie depuis presque 10 mois maintenant et qui me soutient de tout son cœur. Merci Rachel d’avoir illuminé ma vie et de m’avoir aidé à gérer ces derniers mois de thèse qui n’ont pas été les plus faciles. Merci à toi…
8
Sommaire
RÉSUMÉ ... 11
INDEX DES ABRÉVIATIONS ... 13
LISTE DES FIGURES ... 17
INTRODUCTION GÉNÉRALE... 20
SITUATION DU SUJET... 23
I) Les Plaquettes sanguines ...24
A. Physiologie plaquettaire... 24
1. Généralités et thrombopoïèse ... 24
a. Généralités ... 24
b. Thrombopoïèse ... 26
2. Les sous-populations de plaquettes ... 32
3. Morphologie des plaquettes ... 34
a. La membrane plasmique ... 34
b. Le cytosquelette ... 36
c. Les organites ... 37
i. Les granules α ... 38
ii. Les granules denses ... 39
iii. Les lysosomes ... 39
iv. Les autres organites ... 39
4. Méthode d’obtention de plaquettes pour les études in vitro ... 40
a. Plasma Riche en Plaquette (PRP)... 40
b. Plaquettes lavées ... 40
c. Les plaquettes dédiées à la transfusion sanguine ... 41
B. Activation plaquettaire ... 43
1. Les éléments activateurs des plaquettes ... 43
a. Les agonistes solubles ... 45
b. Les récepteurs d’adhésion ... 48
2. L’hémostase ... 49
a. Définition ... 49
b. Le rôle des plaquettes dans l'hémostase ... 51
3. Physiologie de la plaquette activée ... 53
a. Adhésion plaquettaire ... 53
b. Modifications morphologiques ... 55
c. Agrégation plaquettaire ... 57
C. L’impact de l’activation plaquettaire... 58
1. Les facteurs solubles plaquettaires ... 59
9
b. ARNm et épissage alternatif : synthèse de novo dans une cellule anucléée ... 60
c. Le relargage des facteurs solubles ... 64
d. Les microvésicules plaquettaires (MVP) ... 69
2. Effets indésirables liés aux produits plaquettaires délivrés lors d’une transfusion sanguine ... 70
D. Le rôle des plaquettes dans l’immunité et l’inflammation ... 71
1. Les interactions entre les plaquettes et les cellules de l’immunité ... 73
a. Les plaquettes et le couple CD40/CD40L, lien entre l’immunité innée et adaptative ... 73
b. Les autres interactions entre les plaquettes et les cellules de l’immunité ... 74
i. Plaquettes et lymphocytes... 74
ii. Plaquettes et monocytes ... 78
iii. Plaquettes et cellules dendritiques... 79
iv. Plaquettes et polynucléaires neutrophiles ... 79
2. Les interactions entre les plaquettes et les agents pathogènes ... 80
a. Plaquettes et bactéries ... 81
b. Plaquettes et virus ... 85
c. Plaquettes et parasites ... 86
II) Toll-like receptors ...88
A. Introduction ... 88
B. Description des différents TLR ... 89
1. Structure et ligands des TLR membranaires ... 91
a. TLR4 ... 91
b. TLR1, TLR2 et TLR6 ... 92
c. TLR5 ... 93
2. Les TLR intracytoplasmiques, spécifiques des acides nucléiques ... 93
a. Structure et ligands ... 94 i. TLR3 ... 94 ii. TLR7 ... 95 iii. TLR8 ... 95 iv. TLR9 ... 95 b. Localisation cellulaire ... 96
C. Les mécanismes moléculaires de la transduction du signal ... 96
D. Les voies de signalisation des TLR ... 98
1. La voie MyD88-dépendante (figure 23) ... 99
2. La voie TRIF-dépendante (figure 24)... 101
E. Régulation négative de la signalisation TLR ... 102
F. Les ligands endogènes ... 104
G. Les autres PRR ... 105
H. TLR et apoptose ... 105
I. Les spécificités du TLR4 ... 106
1. Les deux voies de signalisation... 106
2. Le LPS, un ligand, deux signalisations ... 108
10
A. Fonctions des TLR plaquettaires ... 111
B. Spécificité du TLR4 plaquettaire ... 114 C. Fonctionnalités du TLR4 plaquettaire... 115 1. LPS et ARNm ... 115 2. L’importance du NFB plaquettaire ... 116 OBJECTIF DU TRAVAIL ... 118 RÉSULTATS EXPÉRIMENTAUX ... 120
I) Article I : Altered release of regulated upon activation, normal T-cell expressed and secreted protein from human, normal platelets: contribution of distinct HIV-1MN gp41 peptides ... 121
A. But de l’étude ... 121
B. Article publié ... 122
C. Discussion ... 126
II) Article II: Toll-like receptor 4 signal transduction in platelets: novel pathways ... 127
A. But de l’étude ... 127
B. Article publié ... 128
C. Discussion ... 132
III) Article III : Differential platelet TLR4 engagement and subsequent mononuclear cells mobilization after LPS exposure ... 133
A. But de l’étude ... 133
B. Article en préparation ... 134
C. Discussion ... 166
DISCUSSION ET PERSPECTIVES... 168
ANNEXES ... 178
I) Participation aux activités de recherche du laboratoire ... 179
II) Communications affichées et orales ... 185
III) Curriculum vitae ... 187
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES ... 191
11
12
Les plaquettes sanguines sont des cellules anucléées qui jouent un rôle majeur dans l’hémostase primaire et ont aussi un rôle dans l’inflammation, aujourd’hui bien démontré. Les plaquettes contiennent et sécrètent une grande variété de facteurs solubles, dont des molécules immunomodulatrices, et elles contiennent plusieurs facteurs de transcription
exerçant des activités non génomiques, notamment le NFB.
Parmi les nombreux récepteurs qu’elles expriment à leur surface, les plaquettes expriment les « Toll-Like Receptor » (TLR), récepteurs clés de l’interaction entre l’immunité innée et adaptative. En réponse à un stimulus infectieux, comme le lipopolysaccharide (LPS) des bactéries Gram-négative, ligand naturel du TLR4, ou des peptides issus d’une partie de la protéine d’enveloppe du VIH (gp41), les plaquettes vont s’activer de manière différentielle. L’activation plaquettaire est variable en fonction de leur activation par à un stimulus hémostatique (exemple : la thrombine) vs. infectieux (exemple : le LPS) ; le panel de cytokines/chimiokines libéré dans le surnageant plaquettaire semble en fait finement régulé. Afin d’approfondir l’étude de cette régulation, nous avons démontré, dans un premier temps, la présence intra-plaquettaire de la majorité des protéines composant les voies de signalisation du TLR4 eucaryote. Nous avons ensuite montré que ces voies pouvaient être modulées. L’engagement du TLR4 plaquettaire par deux types biochimiques de LPS (smooth vs. rough) entraine un relargage différentiel des facteurs solubles immunomodulateurs dans le surnageant de culture ; ce surnageant génère une activation différentielle des cellules cibles, comme les cellules mononucléées du sang circulant.
13
14
ADAMTS13 A Disintegrin And Metalloprotease with ThromboSpondin type 1 repeats
ALI syndrome respiratoire aigu
ATBF African Tick Bite Fever
CAR Coxsackie-Adenovirus Receptor
CEI cellules épithéliales intestinales
CLEC-2 C-type lectin-like protein-2
COAT Collagen And Thrombine activated platelets
COX-2 cyclooxygénase-2
cPLA2 PhosphoLipaseA2
CR2 récepteur au complément de type II
CSH cellule souche hématopoïétique
DC cellule dendritique
DC-SIGN Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-Grabbing Non-integrin
DD Death Domain
DMS système membranaire de démarcation
dsRNA ARN double brin
ECC Complexe Cœur Exocytique
EGF Epidermal growth factor
EP3 Recepteur à la prostaglandine E2
EPO ErythroPOïétine
FADD Fas-Associated protein with Death Domain
FGF Fibroblast Growth Factor
GM-CSF Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor
GP glycoprotéine
HLA Human leukocyte antigen
HMGB1 High-mobility Group Protein B1
HNA human nuclear antigen
Hsp Heat-Shock Protein
Ig Immunoglobuline
IKK IB kinase
IRAK IL-1 Receptor-Associated Kinase
IRF Interferon Regulatory Factor
ITAM Immunoreceptor Tyrosine-based Activatory Motifs
JNK c-Jun N-terminal kinases
KO Knock-Out
LPS lipopolysaccharide
LRR Leucine-Rich Repeat
LTA acide lipoteichoique
Ly.B Lymphocyte B
15
Ly.Tc lymphocyte T cytotoxique
MAPK Mitogen-Activated Protein Kinases
MCP-1 Monocyte chemotactic protein-1
MCPS mélange de concentrés de plaquettes standard
MIP-1α Macrophage inflammatory protein 1α
MK mégacaryocytes
MVP microvésicules plaquettaires
MyD88 Myeloid differetiation primary response gene (88)
NAP2 Neutrophil-Activating Protein-2
NET NeutrophilExtracellularTras
NFB nuclear factor-kappa B
NK natural killer
NLR Nod-like Receptor
NSF N-ethylmaleimide-Sensitive Factor
OCS Open Canalicular System
PAF Platelet-Activating Factor
PAI-1 Plasminogen Activator Inhibitor-1
PAMP Pathogen-Associated Molecular Patterns
PAR Protease-Activated Receptor
PBMC Peripheral Blood Mononuclear Cell
PBP Platelet basic protein
pDC cellules dendritiques plasmacytoïdes
PDGF Platelet-Derived Growth Factor
PEM précurseur des érythrocytes et MK
PF4 Platelet Factor 4
PGI2 ProstaGlandine I2
PGM précurseur des granulocytes et des monocytes
PGN peptidoglycane
PIP2 Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate
PK kinocidines plaquettaires
PKC Protein Kinase C
PKG Protein Kinase G
PMN polynucléaires neutrophiles
PMP Protéines Microbicides Plaquettaires
PRP Plasma Riche en Plaquettes
PRR Pattern-Recognition Receptor
PS phosphatidylsérine
PSL Produits Sanguins Labiles
RANTES regulated upon activation, normal T cell expressed and secreted
RIP1 Receptor-Interacting Protein 1
RLR Rig-I-Like Receptor
RP105 RadioProtective 105
16
SCIP Sustained Calcium-Induced Platelet morphology
SDF-1 stromal cell-derived factor-1
SIGIRR Single ImmunoGlobulin IL-1R-Related molecule
SIPA Shear-Induced Platelet Aggregation
SNARE Soluble NSF Attachment Protein Receptor
SSP solutés de suspension des plaquettes
ssRNA ARN simple-brin
ST2L IL1R1
TAB TAK1 Binding protein
TAK Transforming growth factor-β-Activated Kinase 1
TANK TRAF family member-Associated NFkB activator
TBK TANK Binding Kinase
TF Tissue Factor
TFPI Tissue Factor Pathway Inhibitor
TGFβ Transforming Growth Factor-β
TIR Toll-Interleukin-1 Recepto
TIRAP IR domain containing Adaptor Protein
TLR Toll-Like Receptor
TNF Tumor Necrosis Factor
TNK tyrosine kinase nonreceptor
TP recepteur au TxA2
TPO thrombopoïétine
TRADD TNK Receptor type I-Associated Death Domain protein
TRAF TNF Receptor Associated Factor
TRAIL TNF-related-apoptosis-inducing-ligand
TRAM TRIF-related adaptor molecule
T-reg Lymphocyte T-regulator
TRIF TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β
TxA2 Thromboxane A2
uPAR urokinase Plasminogen Activator Receptor
VAMP Vesicule-Associated Membrane Protein
VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
vWF facteur von Willebrand
17
18
Figure 01 : Structure plaquettaire observée en microscopie électronique à balayage ... 25
Figure 02 : Représentation schématique de la thrombopoïèse ... 27
Figure 03 : Formation de pro-plaquettes à partir de mégacaryocytes murins en culture, observée en microscopie électronique à balayage ... 28
Figure 04 : les pro-plaquettes formées vont libérer les plaquettes directement dans la circulation sanguine ... 30
Figure 05 : Mouvement des rafts lipidiques après activation plaquettaire ... 36
Figure 06 : Cytosquelette d’actine plaquettaire au repos observé en microscopie électronique à balayage ... 37
Figure 07 : Schéma global de l’activation plaquettaire ... 44
Figure 08 : Effet de la thrombine sur son récepteur PAR-1 ... 46
Figure 08 : représentation schématique de l'hémostase ... 51
Figure 09 : Rôle de la GPIIb/IIIa dans l’activation plaquettaire ... 49
Figure 11 : Adhésion plaquettaire primaire ... 55
Figure 12 : Changement morphologique des plaquettes après activation, observé en microscopie électronique à balayage (A et B) ou à transmission (C et D) ... 56
Figure 13 : Cytosquelette d’actine de plaquettes activées, observé au microscope électronique à transmission ... 57
Figure 14 : Schéma de la traduction de novo plaquettaire ... 62
Figure 15 : Schéma de mécanisme de fusion des granules à la membrane, implication des protéines SNARE ... 65
Figure 16 : La fusion de membranes lors de la sécrétion du contenu des granules ... 66
Figure 17 : Observation de l’OCS... 68
Figure 18 : Les plaquettes sont au centre de l’immunité ... 72
19
Figure 20: Vue d’ensemble de récepteurs plaquettaires impliqués dans les interactions
plaquettes-virus ... 86
Figure 21 : Les TLR membranaires, leurs ligands et les voies de signalisation ... 93
Figure 22 : Les TLR intracellulaires, leurs ligands et les voies de signalisation ... 95
Figure 23 : Engagement des TLR et voie de signalisation MyD88-dépendante ... 101
Figure 24 : Engagement des TLR et voie de signalisation de la voie TRIF-dépendante ... 103
Figure 25 : Structure d’un dimère de TLR4 ... 108
Figure 26 : les différents types de LPS lisses et rugueux ... 110
Figure 27 : les voies de signalisation du TLR4 ... 111
Tableau 01: Interactions connues entre agents bactériens et plaquettes sanguines ... 84
20
21
Les plaquettes sanguines sont de petits éléments anucléés issus de la fragmentation des mégacaryocytes. Primordiales à la réparation vasculaire et au maintien de l’hémostase, la morphologie des plaquettes repose sur un cytosquelette dense mais aussi sur la présence de granules dont le contenu peut être libéré dans l’environnement plaquettaire. Les plaquettes expriment de nombreuses intégrines et récepteurs aux cytokines/chimiokines impliqués dans l’interaction plaquettaire avec son environnement, en particulier les cellules endothéliales mais aussi les cellules de l’immunité venues sur le site de la brèche. La présence en quantité importante, sur la membrane et à l’intérieur des granules, de cytokines, chimiokines, facteurs de croissance permet aux plaquettes de pouvoir influencer de manière conséquente l’environnement cellulaire et moléculaire.
Une activation plaquettaire va provoquer un réarrangement du cytosquelette, une modification de la morphologie avec l’extension de pseudopodes, une dégranulation, une agrégation homotypique voire une adhésion à l’endothélium. Cette activation peut engendrer une inflammation locale par la libération du contenu granulaire. Cependant, de nombreux éléments peuvent activer les plaquettes, pouvant alors mener à un changement de physiologie particulier avec seulement une dégranulation ou une adhésion. Parmi les stimuli activant de manière alternative les plaquettes on retrouve le lipopolysaccharide (LPS) des bactéries gram-négative, dont le récepteur, le TLR4, est présent à la surface des plaquettes sanguines humaines.
Le TLR4 appartient à la famille des PRR (Pattern Recognition Receptor), dont les ligands sont des éléments conservés par les pathogènes, par exemples des molécules composant la paroi bactérienne ou des acides nucléiques des pathogènes. Le TLR4 est particulier car il permet, lorsqu’il est exprimé par une cellule eucaryote, et après fixation du LPS, d’activer deux voies de signalisation différentes dont l’orientation initiale se fait par la fixation de protéines adaptatrices (MyD88 et TRIF) et menant à l’induction de facteur de transcription cellulaire pouvant activer la production de cytokines pro-inflammatoires et/ou d’interféron de type I.
22
important de l’interaction entre immunité innée et adaptative ; au même titre que le facteur immunomodulateur CD40L plaquettaire, déjà bien documenté.
23
24
I) Les Plaquettes sanguines
A.
Physiologie plaquettaire
1. Généralités et thrombopoïèse
a.
Généralités
Les plaquettes sont des éléments sanguins qui, après une durée de vie de huit à dix jours, sont dégradés dans la rate. Elles sont formées dans la moelle osseuse par la fragmentation des mégacaryocytes (MK) en petits éléments. Les plaquettes sont dépourvues de noyau et elles ne possèdent pas d’ADN nucléaire. Cependant, les plaquettes possèdent des mitochondries, on note donc la présence d’ADN mitochondrial. Néanmoins, il a été démontré que les plaquettes contenaient des pré-ARNm capables d'être traduits, dans certaines conditions, par le spliceosome [1],[2]. Leur cytoplasme contient ainsi (figure 1) [3]:
- Des organites : mitochondries, lysosomes (glycosidases, protéases et protéines cationiques), cytosquelette (actine et tubulines α et β).
- Des granulations dites « alpha » qui comprennent :
des molécules d'adhésion dont le CD62P, le facteur von Willebrand (vWF), la
glycoprotéine IIb/IIIa (GPIIb/IIIa) ;
des facteurs mitogéniques dont le PDGF (Platelet-Derived Growth Factor), le
VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) ;
Le TGF-β (Transforming Growth Factor-β), qui influence négativement la
croissance cellulaire ;
des facteurs de coagulation dont le fibrinogène, le plasminogène, les facteurs V,
25
des protéases inhibitrices dont le TFPI (Tissue Factor Pathway Inhibitor), le PAI-1
(Plasminogen Activator Inhibitor-1) et l'inhibiteur de C1 (système du complément).
- Des granulations dites « denses » reliées à la membrane et à la surface de la cellule par le système canaliculaire ouvert (Open Canalicular System, OCS). Elles contiennent des nucléotides (dont l'ADP), des ions (dont le calcium) et des amines (dont la sérotonine et l'histamine).
Figure 01 : Structure plaquettaire observée en microscopie électronique à transmission (MET) (T)= microtubules, (Gr)= granules α, (DB)= granules denses,
(Mi)= Mitochondries, (Gly)= glycogène De White et Krumwiede [4]
Sur cette image en MET, on distingue clairement la composition granulaire des plaquettes mais aussi les anneaux de tubuline permettant le maintien de la structure.
26
Néanmoins, depuis environ une quarantaine d'années, les plaquettes sont aussi décrites pour être associées aux réponses immunitaires avec une implication reconnue dans la défense immunitaire et l'inflammation ; si la participation des plaquettes aux mécanismes de défense immunitaire innée et surtout inflammatoires est reconnue de longue date, celui de régulateur possible de l’immunité adaptative est de description plus récente [5],[6],[7]. Par conséquent, les plaquettes font partie intégrante du système immunitaire [8]. En effet, elles participent à l'immunité en libérant une panoplie de médiateurs inflammatoires (IL-1β, RANTES (Regulated upon Activation Normal T cells Expressed and Secreted), PDGF) sous l'effet d'un agoniste, tel que la thrombine. Elles peuvent aussi agir en tant que cellules effectrices en interagissant directement avec des bactéries, virus, champignons et protozoaires et libérer des protéines antimicrobiennes afin de limiter l'infection [9],[10].
b.
Thrombopoïèse
27
Figure 02 : Représentation schématique de la thrombopoïèse D'après Deutsch et Tomer [12]
Les plaquettes sont issues des MK après plusieurs étapes de différenciation représentées ici et caractérisant la thrombopoïèse.
Comme toute cellule différenciée, la plaquette dérive d'une cellule souche totipotente, l'hémangioblaste CD34-, précurseur de toutes les cellules sanguines [12]. L'hémangioblaste se
différencie ensuite en cellule multipotente : la cellule souche hématopoïétique (CSH) CD34+, qui
se différencie à son tour en progéniteur myéloïde commun CD34+ CD33-. Cet ensemble donne
naissance aux précurseurs des granulocytes et monocytes CD34+ CD33+ CD13+ CD15+ et aux
précurseurs des érythrocytes et MK CD34+ CD33- CD41+. Ce paradigme est actuellement
28
Figure 03 : Formation de pro-plaquettes à partir de mégacaryocytes murins en culture, observée en microscopie électronique à balayage
De Italiano et al. [11]
Cette image montre la formation de pro-plaquette (flèche blanche) à partir de MK murins in vitro. Les plo-plaquettes sont formées au bout des extensions.
29
circulation sanguine, donnant alors naissance à jusqu’à 5000 plaquettes par MK [21] (figure 4). Les plaquettes sont alors libérées dans le flux sanguin afin qu'elles puissent remplir leur rôle fondamental hémostatique [11]. Les MK sont situés dans la moelle osseuse. Lorsqu’ils maturent, ils migrent dans la région sous-endothéliale, proche des sinusoïdes veineux. Les pro-plaquettes peuvent traverser la barrière endothéliale et entrer dans les vaisseaux sanguins. Cette migration est notamment provoquée par un gradient de SDF-1 (stromal cell-derived factor-1). Des images in vivo ont montré que les plaquettes peuvent être séparées à partir des extensions des plaquettes directement dans les vaisseaux sanguins [22]. De larges pro-plaquettes peuvent aussi être relarguées dans la circulation sanguine où elles peuvent alors former des plaquettes par fragmentation. Il a aussi été observé que certains MK matures migrent à travers la barrière endothéliale et sont alors présents en nombre significatif dans de petits vaisseaux pulmonaires. Ils sont alors capturés par les capillaires pulmonaires, et libèrent des plaquettes par fragmentation [23].
30
Figure 04 : Schéma de la migration des MK menant à la production des plaquettes sanguines
D’après Bluteau et al. [21]
Les MK migrent des niches ostéoblastiques jusqu’à la circulation où ils étendent des prolongements, les pro-plaquettes, qui vont libérer les plaquettes directement dans la circulation sanguine. Ces phénomènes sont régulés,
notamment par un gradient de SDF-1.
Ce réseau cytosquelettique va être utilisé pour organiser les organelles dans les pro-plaquettes. En effet, les extensions des pro-plaquettes sont riches en microtubules qui vont transporter les organelles et ainsi les distribuer. Ce transport est très caractéristique car il s’effectue de manière bi-directionnelle et plus lentement que le transport « classique » microtubulaire. Ces caractéristiques rendent compte de la répartition la plus égale possible des organelles au sein des pro-plaquettes puis des plaquettes matures au repos [27].
31
chimiokine est synthétisée par les cellules stromales de la moelle osseuse, les cellules endothéliales, les cellules dendritiques mais aussi les MK et les plaquettes [29]. De nombreuses études montrent un rôle direct du couple SDF-1/CXCR4 dans la différentiation des MK, notamment en induisant la polyploïdisation et la formation des pro-plaquettes (figure 4) [30]. A
contrario, certains facteurs ont un rôle d'inhibiteur sur la mégacaryocytopoïèse tels que le
TGF-β1, le PF4 (Platelet Factor 4) et l'IL-4 [12],[31],. L’interféron α a aussi un rôle inhibiteur principalement en agissant sur la synthèse de GATA1, facteur de transcription nucléaire primordial à la mégacaryocytopoïèse [14]. Enfin, le PF4 semble aussi être un régulateur négatif autocrine de la production plaquettaire [32]. De plus, l’impact de la matrice extracellulaire sur ces phénomènes est important : quand le MK commence à migrer à travers l’endothélium, il interagit avec les composants de la matrice extracellulaire, comme le fibrinogène ou le vWF, ce qui a pour conséquence d’accélérer la formation de pro-plaquettes [33]. La régulation de ces stades finaux est en grande partie réalisée par les intégrines GPIa/IIa, GPIIb/IIIa et GPIb, même si le mécanisme précis n’est pas encore connu [32].
Il est intéressant de noter que la formation des pro-plaquettes est la phase terminale du cycle de vie du MK, cette formation ayant des homologies avec la mort cellulaire programmée à plusieurs niveaux [34]. En effet, l’activation de la machinerie apoptotique (impliquant notamment les caspases) est nécessaire aux MK afin de former les pro-plaquettes. De plus, l’induction d’une apoptose des MK par le NO provoque une forte augmentation de la libération de plaquettes. Cependant, malgré le rôle important des caspases dans la thrombopoïèse, ce phénomène est différent de l’apoptose puisqu’il finit par la fragmentation des pro-plaquettes en plaquettes qui sont vivantes possédant des mitochondries, des protéines et des ARNm fonctionnels [35]. Après le relargage des plaquettes, le noyau du MK, son enveloppe, et le cytoplasme adjacent restent dans la moelle osseuse pour y être phagocytés par les macrophages.
32
taille inférieure aux MK (<4µm) possèdent des projections qui ressemblent fortement aux projections des pro-plaquettes [36].
Contrairement aux cellules nucléées, les plaquettes ne se séparent pas en deux cellules filles mais elles produisent des structures étendues avec plusieurs corps cellulaires qui contiennent leurs propres organelles, un cytosquelette et d’autres composants cellulaires. Les plaquettes nouvellement formées sont capables d’adhérer aux surfaces, de s’étendre, de répliquer leur ADN mitochondrial et de répondre à une stimulation par un agoniste en exprimant des marqueurs d’activation à sa surface [36]. L’utilité de ces divisions reste encore indéterminée mais les plaquettes nouvellement formées semblent réagir de façon différente aux stimuli (observation reportée par A. Weyrich).
2. Les sous-populations de plaquettes
La durée de vie des plaquettes humaines est de 8 à 10 jours dans la circulation sanguine. L’élimination des plaquettes âgées s’effectue par phagocytose, grâce aux macrophages de la rate. On compte, à l’homéostasie, 130000 à 400000 plaquettes par microlitre de sang.
33
capacité à se fixer les premières à la matrice de collagène, probablement grâce à une activation de la GPIIb/IIIa [40]. Ces plaquettes servent alors de point d’ancrage pour l’adhésion et l’accumulation des autres plaquettes.
La sous-population la plus étudiée a été observé par l’équipe de GL Dale à Oklahoma en 2000 en reprenant le principe de la double stimulation par la thrombine et le collagène [41]. Cette double stimulation a permis d’observer une sous-population de plaquettes sur-exprimant à leur surface le Facteur V (FV) des granules α, originellement nommée COAT-FV (COllagen And Thrombine activated platelets with FV), et représentant environ 30% de la population totale de plaquettes. Plusieurs études permettent de voir que les agonistes peuvent être autres que le collagène et la thrombine (Convulxin, Ionophore A23187) [41],[42].
Deux ans plus tard, l’équipe de GL Dale a montré que cette sous-population plaquettaire n’est pas seulement différente en termes de fixation du FV et en exposition de PS, mais qu’on observe une surexpression de plusieurs protéines des granules α, comme le fibrinogène, le
vWF, la thrombospondine, l’antiplasmine α2 et la fibronectine [42]. Cette même équipe
propose alors de changer le nom en plaquettes COAT, montrant ainsi que cette sous-population n’est pas restreinte au FV. Ces plaquettes sont alors décrites pour retenir les protéines des granules α avec une affinité exceptionnelle. Ces conditions particulières stabilisent les complexes de fixations en surface et donc rendent ces plaquettes plus adhérentes.
Dans une revue de 2005, GL Dale propose une nomenclature plus universelle, en les nommant plaquettes « coated », faisant référence à leur grande capacité de fixation des protéines pro-coagulantes à la surface de ces plaquettes [43]. En parallèle, le groupe de Jackson en Australie a étudié une autre population de plaquettes, très adhérentes au collagène, qu’ils ont nommé « SCIP » (Sustained Calcium-Induced Platelet morphology) [44]. Ces plaquettes expriment des caractéristiques proches des plaquettes « coated ». En effet, elles ont une capacité de fixation au collagène fortement augmentée et sont plus réactives à la stimulation.
34
4 jours), mais ce n’est pas la seule explication [41]. L’observation d’une baisse de phosphotyrosine est une autre hypothèse mais, là encore, non suffisante [39]. Il est intéressant de noter que le pourcentage de plaquettes « coated » varie énormément suivant les prélèvements, de 15 à 55% pour une moyenne de 33% +/- 9% (1 SD), mais reste stable pour un même sujet testé [43]. Les différences physiologiques membranaires peuvent suggérer un rôle important de ces plaquettes, notamment dans les premiers stades de l’hémostase.
La description de plusieurs sous-populations de plaquettes montre qu’il reste beaucoup à investiguer sur ce sujet. Ces diverses études sont effectuées avec un objectif d’étude du rôle hémostatique des plaquettes mais peu de travaux sont faits sur ces diverses populations pour l’étude de leurs effets immunologiques et inflammatoires. L’explication retenue par GL Dale est que ces plaquettes « coated » résultent de la nature « tout ou rien » des plaquettes. En effet, lors de co-stimulation thrombine/collagène, ils observent bien 2 populations très distinctes en termes d’expression de FV, et surtout sans population intermédiaire. Il semble important de comprendre quel mécanisme est impliqué dans ce « tout ou rien » et surtout si les plaquettes réagissent de cette manière en permanence ou si ce n’est que lors de certaines conditions, comme l’exemple de la co-stimulation (thrombine et collagène) observée précédemment.
3. Morphologie des plaquettes
a.
La membrane plasmique
Les plaquettes ont une forme discoïde de 2 à 4 µm de diamètre pour un volume de 6 à 8
µm3. La bicouche lipidique constituant la membrane plasmique plaquettaire est riche en
35
36
réorganise les rafts qui retrouvent alors leur taille initiale, montrant l’importance de la température dans ces réarrangements lipidiques [51].
Figure 05 : Mouvement des rafts lipidiques après activation plaquettaire D’après Bodin et al. [45]
Les rafts lipidiques des membranes plaquettaires contiennent la majorité des récepteurs plaquettaires. Après activation ou variation de la température, ils vont se regrouper afin de mettre en contact les molécules présentes
au sein des rafts et ainsi initier les mécanismes intracellulaires.
b.
Le cytosquelette
37
microtubules des plaquettes lorsqu’elles sont circulantes, ni même si cette forme discoïde engendre un avantage quelconque aux plaquettes, même si on peut logiquement penser que cette forme procure un avantage pour la rhéologie du flux sanguin. De récents travaux montrent un « cross-talk » entre les microtubules et les filaments d’actine, sans pour autant argumenter sur un rôle pour les plaquettes circulantes [54]. Le cytosquelette d’actine est quant à lui responsable du maintien de l’intégrité plaquettaire et semble plus impliqué dans la sécrétion granulaire (voir paragraphe I.B.3.b).
Figure 06 : Cytosquelette d’actine plaquettaire au repos observé en microscopie électronique à balayage
D’après Hartwig et al. [52]
Sur cette image d’une plaquette au repos, le cytosquelette d’actine est marqué et on distingue clairement les ouvertures de l’OCS sur l’extérieur de la cellule (flèche blanche).
Au repos, la surface plaquettaire est marquée de petites ouvertures formant l’OCS (figure 6). Un squelette membranaire dense recouvre la face cytoplasmique de la membrane plasmique ainsi que la surface cytoplasmique de l’OCS. Ce système, primordial lors de la dégranulation provoquée par l’activation, est donc soutenu par le cytosquelette d’actine.
c.
Les organites
38 i. Les granules α
Les granules α sont les organites plaquettaires les plus grands (200-500 nm) et aussi les plus abondants (environ 80 par plaquette). Ils contiennent notamment des facteurs de croissance (PDGF, EGF (Epidermal growth factor)), des protéines de coagulation (Fibrinogène, FV), des molécules d’adhésion (CD62P, GPIIb/IIIa, vWF), des chimiokines (PF4, CXCL4) et des cytokines (IL-1β, TGFβ) [56]. Parmi ces molécules, certaines sont spécifiques aux plaquettes (synthétisées seulement par les MK (ou les plaquettes), comme PF4 ou la β-thromboglobuline (β-TG)), d’autres sont dites plaquettes-sélectives (synthétisées majoritairement par les MK mais aussi par d’autres cellules, comme la thrombospondine ou le CD62P) et d’autres ne sont pas synthétisées par les MK (comme le fibrinogène). Cette dernière catégorie de molécules peut être présente dans les plaquettes suivant deux méthodes, soit par endocytose passive à partir du plasma circulant (albumine ou IgG), soit par intégration dépendante de récepteurs, principalement la GPIIb/IIIa [57].
39 ii. Les granules denses
Plus petits que les granules α (100 à 200 nm), les granules denses sont aussi plus faiblement représentés dans les plaquettes (3 à 9 par cellules). Ils contiennent de grandes concentrations de petites molécules comme de l’ADP/ATP, du calcium, du magnésium ou de la sérotonine. Les granules denses apparaissent opaques aux électrons en microscopie électronique à transmission et sont faiblement acides (pH de 6,1). Beaucoup moins d’études sont faites sur les granules denses que sur les granules α mais l’importance de leur contenu les rend fondamentaux lors de l’activation plaquettaire, principalement pour le maintien de l’état activé, mais aussi pour activer les plaquettes adjacentes par sécrétion agoniste d’ADP.
iii. Les lysosomes
Les plaquettes contiennent seulement quelques lysosomes primaires et secondaires (les secondaires étant les lysosomes actifs, se formant après intégration du corps à dégrader) [58]. Les lysosomes sont formés rapidement lors de la maturation du MK, avant même le développement des granules α [59]. Ces organelles sont riches en hydrolases acides, protéases, cathepsines et en collagénases. Plusieurs équipes ont tenté de montrer une phagocytose plaquettaire, mais il semble que les substances absorbées restent retenues dans l’OCS. La digestion de matériel exogène par formation de phagolysosomes n’a jamais été démontrée et la fonction des enzymes lysosomales plaquettaires est toujours inconnue [60]. L’absence de digestion du matériel exogène est importante car les plaquettes sont connues pour intégrer des micro-organismes, tel que S. aureus et le VIH, pouvant alors favoriser l’échappement du système immunitaire et rester ainsi protégé dans les lysosomes plaquettaires [61].
iv. Les autres organites
40
4. Méthode d’obtention de plaquettes pour les études
in vitro
Il existe différentes méthodes pour obtenir des plaquettes in vitro, le type d’expérimentation est donc important dans le choix de la méthode d’obtention.
a.
Plasma Riche en Plaquette (PRP)
Les plaquettes dites "PRP" (Platelet-Rich Plasma) proviennent directement de prélèvements sanguins issus de donneurs volontaires. Pour obtenir les PRP, le sang total est déposé dans un tube contenant un anticoagulant, le citrate, et conservé à 37°C. Il est centrifugé à 300g peu de temps après le don (une heure au maximum). Cette méthode d’obtention permet d’avoir des plaquettes sanguines dans un environnement ex vivo car elles restent dans le plasma original donc en présence des nombreuses molécules plasmatiques. C’est donc pour cette raison que l’on a retenu cette méthode, en particulier pour notre étude concernant le rôle inflammatoire plaquettaire dans un contexte infectieux. Cette méthode est peu utilisée pour les études hémostatiques à cause de la présence en trop grande quantité de molécules pro- et anti-activatrices des plaquettes.
Pour toutes les études, l’anticoagulant utilisé pour le recueil des plaquettes est important. L’EDTA fixe de manière forte et irréversible le calcium, bloquant alors toute activation plaquettaire. Le citrate fixe également le calcium mais plus faiblement, permettant aux plaquettes de rester réactivables [62].
b.
Plaquettes lavées
Pour les études des propriétés hémostatiques des plaquettes, elles sont utilisées ex vivo ou in vitro et peuvent éventuellement être lavées avant utilisation. Pour cela, il existe plusieurs protocoles de lavage. D'après les travaux de référence du groupe de JP Cazenave à Strasbourg,
les plaquettes sont lavées deux fois dans des tampons tyrode-albumine supplémentés en PGI2
41
tyrode-albumine contenant de l'apyrase [62]. La PGI2 induit une augmentation de la
concentration en AMPc cytoplasmique qui active des protéines kinases. Ces dernières favorisent la séquestration du calcium dans les plaquettes puis l'expulsion du calcium vers le milieu extracellulaire. Quant à l'héparine, elle inhibe la coagulation en se liant à l'antithrombine III qui elle-même se lie à plusieurs facteurs de la coagulation. En fait, l'héparine accélère l'inactivation de ces facteurs par l'antithrombine III. L'apyrase est une enzyme qui dégrade l'ATP et l'ADP libéré par les plaquettes. L'ajout de cette enzyme permet donc d'éviter l'activation des plaquettes et d'empêcher l'installation d'un état réfractaire des plaquettes à l'ADP.
c.
Les plaquettes dédiées à la transfusion sanguine
Une prescription de concentrés plaquettaires par le clinicien s’effectue dans deux groupes de circonstances : thérapeutique et préventif. Dans les deux cas, l’objet de la transfusion est d’apporter au patient des cellules de la meilleure qualité hémostatique possible afin d’assurer l’hémostase et en particulier la première de ses étapes, l’hémostase primaire et le colmatage des microbrèches qui surviennent quotidiennement le long de l’axe circulatoire. Néanmoins, tel qu’obtenus auprès des dons de sang par des donneurs médicalement sélectionnés, les concentrés de plaquettes comprennent, en plus des plaquettes elles-mêmes, du plasma et d’infimes contaminants cellulaires autres que plaquettaires, des hématies et des leucocytes (principalement granulocytes). Les étapes de contrôle de la qualité des produits permettent de s’assurer du minimum admissible en cellules contaminantes, et les procédés de production permettent de limiter au minimum possible la quantité de plasma au bénéfice de solutés de suspension des plaquettes (SSP). Bien que les plaquettes soient optimalement fonctionnelles lorsqu’elles sont conservées dans leur plasma autologue, elles conservent une excellente qualité hémostatique lorsqu’elles sont resuspendues en SSP. La soustraction de plasma au bénéfice de l’addition de SSP obéit à une double logique : ne pas apporter d’une part un produit sanguin non nécessaire dans le cas d’une transfusion plaquettaire (le plasma), et récupérer d’autre part ce plasma pour la filière de fractionnement en médicaments dérivés du plasma.
42
plasma riche en plaquettes, décrit dans le paragraphe précédent. Les deux autres produits plaquettaires sont ainsi des concentrés extraits de couches leuco-plaquettaires ou buffy-coats, isolées à partir d’un don de sang total par centrifugation. En pratique, cinq à six concentrés unitaires du même groupe ABO et RH1 sont mélangés en une unité thérapeutique appelée mélange de concentrés de plaquettes standard (MCPS). Les MCPS sont constitués manuellement ou automatiquement grâce à des automates. Du plasma peut être extrait des concentrés unitaires et il leur est systématiquement substitué par du SSP dans la majeure partie des plateaux de production des Produits Sanguins Labiles (PSL) en France (depuis 2003 à l’EFS Auvergne-Loire, pionnier de cette technologie en France).
Le dernier produit est obtenu par séparation directe au cours du don des plaquettes sur un automate d’aphérèse. En fonction des automates, ainsi que du procédé de récupération et de concentration de plaquettes, du SSP peut être injecté directement dans le circuit de récupération permettant alors la récupération à part du plasma pour une destination vers le fractionnement. Certains automates ne permettent cependant pas encore cette substitution du plasma par du SSP et les concentrés plaquettaires obtenus sont ainsi en 100% de plasma autologue.
Chaque mode d’obtention des plaquettes est ainsi différent et « agresse » de façon variable les plaquettes, ce qui a été assez bien étudié pour leurs aspects hémostatiques mais pas réellement pour les aspects inflammatoires et sécrétoires autres que les protéines de l’hémostase. Néanmoins, quelques études récentes abordent cet aspect et un travail est également en cours dans notre laboratoire sur le sujet [63],[64],[65]. Cela signifie implicitement que les études ex vivo réalisées sur les plaquettes sanguines imposent que la méthode d’obtention des plaquettes soit d’une part correctement décrite et surtout homogène au sein de l’étude ; idéalement il devrait en être de même pour des études d’effets in vivo mais ce point est extrêmement difficile à réaliser compte tenu de l’hétérogénéité des méthodes utilisées pour préparer des concentrés plaquettaires, y compris au sein d’un même plateau de production de produits sanguins labiles.
43
patients après avoir été qualifiées sur le plan microbiologique dans un laps de temps allant de 1 à 5 jours ; au-delà de 5 jours, leur délivrance n’est plus autorisée pour des raisons de risque bactérien et de moindre fonctionnalité.
B.
Activation plaquettaire
1. Les éléments activateurs des plaquettes
44
Figure 07 : Schéma global de l’activation plaquettaire D’après la revue de Brass et al. [66]
Le mode d’action est différent suivant l’agoniste plaquettaire et peut entrainer des modifications morphologiques diverses allant du changement de forme à l’agrégation et la dégranulation. Certaines molécules sont produites en
réponses à l’activation et peuvent engendrer une boucle d’activation.
Les plaquettes humaines circulent dans les vaisseaux sanguins dans un état quiescent.
Cet état est maintenu par la présence d’inhibiteurs, comme la PGI2 et le NO, sécrétés
notamment par la monocouche de cellules endothéliales, ainsi que par la limitation d’accumulation d’agonistes plaquettaires, dont le CD39 limitant l’accumulation d’ATP et d’ADP dans la circulation. C’est seulement lorsque ces inhibitions disparaissent que les plaquettes deviennent activées. C’est le cas par exemple lors de traumatismes locaux ou en réponse à une rupture de la plaque athérosclérotique.
D’un point de vue physiologique, lors de l’hémostase, l’activation plaquettaire a pour but de stopper le saignement, le caillot formé ensuite est nécessaire pour cicatriser, il doit donc être stable dans le temps. L’hémostase, qui sera abordé dans le paragraphe I.B.2, implique une activation plaquettaire hautement régulée, faisant intervenir de nombreux agonistes, qu’ils soient solubles (thrombine, ADP, Thromboxane A2 (TxA2)) ou adhésifs (collagène, vWF) [66].
45
l’activation plaquettaire, l’ADP, la thrombine et le TxA2 sont impliqués dans la propagation de l’activation, enfin, l’ADP et le fibrinogène permettent la stabilisation de cette activation.
a.
Les agonistes solubles
La thrombine, protéase clivant le fibrinogène en fibrine, joue alors un rôle primordial dans l’activation plaquettaire, notamment lors de la formation du clou plaquettaire [67]. Lorsque de la thrombine est ajoutée in vitro, elle entraine une forte activation : les plaquettes vont changer de forme, adhérer les unes aux autres et sécréter le contenu de leurs granules. C’est en 1990 que des travaux identifient des protéines G couplées à des récepteurs pouvant être activées par protéolyse grâce à la thrombine [68],[69]. Lorsque le récepteur nommé par la suite PAR-1 (Protease-Activated Receptor) a été identifié, il n’y avait pas de paradigme clair sur l’initiation du processus intracellulaire déclenché par une protéolyse extracellulaire, montrant pour la première fois qu’une protéine G peut être activée par un récepteur à une protéase.
46
physiologiques, lorsque de faibles quantités de thrombine sont libérées, PAR-1 est donc
rapidement activé, ce qui entraine l’activation des protéines G couplés à PAR-1, Gαi/o et Gα12/13.
La mise en jeu de ces protéines entraine une première vague d’activation des plaquettes, qui provoque une agrégation forte et transitoire [74]. Au contraire, la signalisation provoquée par l’activation de PAR-4 a un effet prolongé dans le temps, donc plutôt lors des dernières phases de l’agrégation plaquettaire [75]. De plus, l’activation de PAR-4 provoque une agrégation irréversible des plaquettes, fondamentale pour le maintien du clou plaquettaire à la fin de l’hémostase [76]. La signalisation en aval de PAR-4 utilise les protéines Gα12/13 et Gαq, l’activité
de cette dernière étant liée aux flux calciques [76].
Figure 08 : Effet de la thrombine sur son récepteur PAR-1 De Coughlin et Camerer [70]
Lorsque la thrombine rencontre son récepteur (ici PAR-1) elle va cliver la partie N-terminale extracellulaire. Le nouveau fragment N-terminal libéré, de séquence SFLLRN, devient alors ligand pour une des boucles extra-cellulaire
de PAR-1, entrainant alors l’activation du récepteur plaquettaire.
47
l’activation de la PLCβ, la PI 3-kinase (PI3k), des protéines G monomériques Rho, Rac et Rap1, et
aussi à l’augmentation de la concentration en Ca2+ cytosolique en inhibant la formation
d’AMPc. Ce processus est aidé par le relargage d’ADP et de TxA2 qui se fixent sur leurs
récepteurs respectifs sur la surface plaquettaire, et permettent alors l’auto-activation plaquettaire ainsi que le maintien de l’état activé. Il semble que le relargage d’ADP soit plus important si la stimulation est dépendante du PAR-4, entrainant alors un « feedback » positif important [76].
L’ADP et le TxA2 sont des facteurs agissant tous les deux sur des récepteurs couplés à
des protéines G. Ils permettent donc un « feedback » positif après activation, leur permettant d’être formés puis libérés, augmentant alors la réponse. Cette propagation de l’activation plaquettaire est d’une grande importance car elle renforce l’activation locale plaquettaire ainsi que celle des plaquettes adjacentes [77]. En effet, l’ADP, stockée en grande quantité dans les granules denses, est libérée après activation. L’activation plaquettaire par l’ADP est régulée par 2 récepteurs couplés à des protéines G, P2Y1 et P2Y12. Alors que le P2Y1 est couplé à la
protéine Gq, le P2Y12 est couplé principalement à la protéine Gi2 [78],[79]. Les plaquettes des
souris KO pour le P2Y1 ne peuvent pas changer de forme en réponse à une stimulation par l’ADP, l’agrégation est aussi sévèrement altérée [80]. De plus, les souris KO pour le P2Y1 ont des temps de saignement supérieur et sont relativement résistantes aux embolies induites par l’ADP [81]. En parallèle, les souris KO pour le P2Y12 ont des plaquettes normalement formées mais l’agrégation en réponse à une stimulation par l’ADP est aussi diminuée [82]. Ces animaux ont des temps de saignement supérieur et peuvent former des thrombi seulement petits et instables [83]. Ces 2 récepteurs sont donc tous les deux requis pour permettre une réponse complète de la plaquette (figure 7). Ils sont aussi impliqués dans les activités pro-coagulantes
plaquettaires [77]. Le TxA2 a une action forte et mais reste local de par sa faible durée de vie. Il
est produit à partir de l’acide arachidonique à travers la conversion par la cyclooxygenase-1. Le récepteur au TxA2 est nommé TP et son absence dans des souris KO va aussi entrainer des
temps de saignement supérieurs ainsi que l’incapacité à former des thrombus stables [84].
48
l’épinephrine qui est incapable d’activer seule les plaquettes mais modifie l’effet d’autres
activateurs en jouant sur le récepteur adrénergique α2A [85]. La prostaglandine E2 protège de
l’activation par son récepteur EP3 [86]. La sérotonine est stockée dans les granules denses et libérée après activation, et elle semble permettre le « feedback » positif [77]. De plus, certaines chimiokines comme RANTES pourraient aussi activer les plaquettes grâce à leurs récepteurs couplés à des protéines G et donc seraient aussi capables de potentialiser d’autres stimuli [87].
b.
Les récepteurs d’adhésion
Les plaquettes expriment de nombreuses intégrines, dont la principale est la GPIIb/IIIa ayant un rôle primordial dans la physiologie plaquettaire et qui, dans son état activé, peut lier le fibrinogène et le vWF (et aussi d’autres molécules, comme la vitronectine) [88]. La GPIIb/IIIa est donc primordiale pour les interactions plaquettes/plaquettes lors de l’agrégation (voir paragraphe I.B.2.a). L’activation de la GPIIb/IIIa se fait par l’intermédiaire du signal « inside-out », résultant d’une première activation plaquettaire par la majorité des agonistes plaquettaires connus (figure 9) [89]. La fixation du fibrinogène ou du vWF sur la GPIIb/IIIa va alors entrainer une signalisation « outside-in » permettant une deuxième vague d’activation plaquettaire.
49
Figure 09 : Rôle de la GPIIb/IIIa dans l’activation plaquettaire D’après Coller et Shattil [89]
Après une première phase d’activation plaquettaire, le signal « inside-out » qui en découle permet l’activation de la GPIIb/IIIa. Cette activation rend possible la fixation des ligands (fibrinogène ou vWF) entrainant alors une deuxième
phase d’activation plaquettaire grâce au signal « outside-in »
2. L’hémostase
a.
Définition
50
- La vasoconstriction : elle a lieu immédiatement après la lésion d'un vaisseau. Elle correspond à la constriction du vaisseau sanguin par les cellules musculaires de la paroi du vaisseau, c'est à dire la diminution du diamètre du vaisseau via le spasme vasculaire, ce qui ralentit le saignement. La vasoconstriction dure de 15 à 60 secondes et ralentit la circulation sanguine ce qui permet aux réactions suivantes d'être pleinement efficaces. - L'hémostase primaire (figure 10A et 10B) : elle implique les plaquettes qui se lient au
vWF via la GPIb/V/IX et, par la GPVI, au collagène dans les parois vasculaires exposées pour former un amas visqueux nommé le "clou plaquettaire". Ce phénomène se produit dans les secondes suivant le traumatisme vasculaire.
- L'hémostase secondaire (figure 10C) : elle est aussi appelée coagulation. La coagulation implique une cascade complexe de facteurs de coagulation, ce qui débouche sur la transformation du fibrinogène plaquettaire en fibrine polymérisée, grâce à l’action de la thrombine, également stimulateur direct des plaquettes, permettant alors la création d'un caillot. Ce processus dure de 3 à 6 minutes après la rupture du vaisseau.
51
Figure 10 : représentation schématique de l'hémostase D'après Marcus [92] et Brass [66]
Les plaquettes circulent à l’état inactivé, maintenue par la PGI2 et le NO sécrété par les cellules endothéliales. Lors
d’une lésion (A), le collagène et le vWF vont se retrouver exposés, activant alors les plaquettes qui vont adhérer sur le site de la lésion (B). Une fois activées, les plaquettes vont sécréter différentes molécules dont l’ADP, le TxA2, la
sérotonine ou le PF4, ce qui va attirer les plaquettes avoisinantes et ainsi les activer. Elles vont alors s’agréger entre elles et avec d’autres cellules de la circulation et la sécrétion de thrombine va permettre la formation du clou
plaquettaire grâce à la fibrine.
b.
Le rôle des plaquettes dans l'hémostase
52
[1]. Après fixation sur la GPVI, le collagène induit le relargage d'autres agonistes tels que l'ADP
et la sérotonine provenant des granules denses mais aussi la TxA2, le PF4 venant des granules α
ainsi que des enzymes lysosomales. Ces substances ont un effet activateur des plaquettes proches, permettant le signal « inside-out » activant le GPIIb/IIIa, et active le recrutement
d'autres plaquettes sur le site de la blessure. L'ADP, la sérotonine et le TxA2 sont les composés
les plus efficaces pour recruter les plaquettes, notamment car ils activent les plaquettes arrivant par la phase sanguine. Les nouvelles plaquettes recrutées s'agrègent contre les premières plaquettes par l’intermédiaire des molécules de fibrinogène qui se fixent sur la GPIIb/IIIa activé [94]. Les membranes plaquettaires de cet agrégat fusionnent et l'amas ainsi formé constitue le clou plaquettaire.
Le clou plaquettaire imperméable est consolidé notamment la seconde vague d’activation menée notamment par la thrombine, mettant fin à l'hémorragie : les plaquettes et la fibrine forment donc une structure résistante à la pression artérielle [66]. Des mécanismes de
régulation (synthèse d'ADPase, de NO et de PGI2) des cellules endothéliales se mettent en place
afin de limiter la taille du caillot [92].
53
3. Physiologie de la plaquette activée
Lors de l’hémostase, l’immobilisation de la plaquette sur le lieu de la lésion vasculaire requiert l’adhésion des plaquettes à l’endothélium activé et/ou au sous-endothélium puis l’agrégation des plaquettes entre elles. En parallèle de ces deux phénomènes, les plaquettes s’activent, mobilisant alors les flux calciques, ce qui a pour conséquence d’augmenter la concentration de récepteurs membranaires (intégrines) ainsi que la libération de nombreux éléments sécrétables, activateurs plaquettaires mais aussi des autres cellules environnantes. L’agrégation des plaquettes est dépendante de la fixation du fibrinogène à son récepteur majoritaire, la GPIIb/IIIa sous sa forme activée, molécule essentielle pour la fixation des plaquettes entre elles.
a.
Adhésion plaquettaire
L’adhésion des plaquettes à la matrice sous-endothéliale est la première étape de l’hémostase primaire. Les plaquettes adhèrent aux protéines de la matrice extracellulaire grâce aux différentes GP et intégrines (figure 11) [90]. Parmi les composants majeurs de la matrice extracellulaire, le collagène joue un rôle clé dans l’adhésion plaquettaire par l’intermédiaire de nombreuses molécules [93]. En effet, le collagène peut se fixer de manière directe à la GPVI et à la GPIa/IIa et de manière indirecte à la GPIIb/IIIa et à la GPIb/V/IX via le vWF. Il semble acquis que la fixation à un de ces récepteurs est dépendante de l’état d’activation des plaquettes, de la structure du collagène mais aussi des conditions de flux sanguin. Par exemple, la fixation du collagène à la GPIa/IIa est possible lorsque le collagène est de type monomérique dans des conditions de forces de cisaillement peu élevées, alors que le collagène sous sa forme fibrillaire ne peut pas interagir directement avec cette glycoprotéine [97],[98]. La fixation du collagène par les plaquettes provoque alors une forte adhésion ainsi qu’une agrégation plaquettaire.
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la métalloprotéase ADAMTS13 limitant alors l’aspect très thrombogène de vWF et donc permettant une régulation de l’adhésion plaquettaire [99]. L’activation vWF dépendante entraine alors une sécrétion forte des granules denses et donc de l’ATP et de l’ADP qu’ils contiennent, permettant d’entretenir une boucle d’auto-activation [100]. La thrombospondine, glycoprotéine intégrée dans la matrice sous-endothéliale, a été identifiée comme un substrat alternatif au vWF pour la GPIb, notamment lors de forces de cisaillement élevées [101]. De plus, le complexe GPIb/V/IX peut permettre, comme le CD162, le roulement des plaquettes sur l’endothélium grâce à la P-selectine endothéliale (CD62P) [102],[103].
Constamment, les plaquettes sont soumises à des forces de cisaillement, dépendantes du flux laminaire sanguin. Ces forces peuvent activer les plaquettes de façon différentielle. En effet, lors d’une lésion artérielle les forces de cisaillement sont augmentées. L’activation plaquettaire et l’agrégation qui en dépend est nommée SIPA pour « Shear-Induced Platelet Aggregation » [104]. En cas de forces de cisaillement faibles, le vWF entre faiblement en contact avec son récepteur, le complexe GPIb/IX/V, entrainant alors qu’une simple adhésion réversible des plaquettes. Des forces de cisaillement élevées permettent une interaction forte entre le vWF et le complexe GPIb/IX/V. Cette activation entraine alors une rapide agrégation
GPIIb/IIIa-dépendante par le biais de variations en Ca2+, mais aussi une libération du contenu
des granules α et denses [105].
L’adhésion primaire des plaquettes va provoquer une première activation plaquettaire, principalement par engagement des flux calciques. Il s’en suit notamment une sécrétion d’ADP, de fibrinogène, de TxA2 et de fibronectine [106], éléments qui vont permettre d’augmenter
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Figure 11 : Adhésion primaire plaquettaire D’après Wei et al. [106]
L’adhésion primaire est médiée par des récepteurs d’adhésion : la GPIV (récepteur au collagène), la GPIIb/IIIa et la GPIb/V/IX (récepteurs au vWF). Elle est notamment provoquée par l’activation de la GPIIb/IIIa grâce à la
mobilisation des flux calciques.
b.
Modifications morphologiques
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facteurs solubles et l’augmentation de l’expression membranaire de certains recepteurs permet un maintient de l’état activé mais aussi une activation des plaquettes adjacentes.
Plaquettes au repos Plaquettes activées
Figure 12 : Changement morphologique des plaquettes après activation, observé en microscopie électronique à balayage (A et B) ou à transmission (C et D)
D’après Georges [31]
Les plaquettes, après activation, passe d’une forme discoïde (A) à une forme sphérique et possédant de nombreux prolongements (B). Ce changement s’accompagne d’une dégranulation et d’une réorganisation du cytosquelette.
En effet, alors que les plaquettes au repos possèdent des granules réparties sur l’ensemble du cytosol, lui-même soutenu par un réseau de tubuline (flèche bleue) (C), les plaquettes activées ont leurs granules réarrangés au centre
de la cellule, aidé par le réarengement de la structure du réseau de tubuline (D).
Ce changement de forme est rapide. En effet, l‘hélice de microtubules, qui maintient la plaquette au repos en forme discoïde, se réorganise pour former de multiples petits microtubules allant du centre vers les extrémités de la cellule formant les pseudopodes [52].
A B
