Polym´ erisation de l’α

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Chapitre 6

Polym´ erisation de l’α

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-antitrypsine

La superfamille des inhibiteurs de serine protéases (serpines) est composée d’environ 500 membres qui possèdent la capacité de subir une importante modification conformationnelle dans le cadre de leur activité biologique [1–6]. L’α1-antitrypsine appartient à la superfamille des serpines, et comprend 394 résidus qui forment trois feuilletsβ (A-C) et neuf hélices α (A-I). Sous certaines conditions, l’α1-antitrypsine, tout comme plusieurs autres serpines, est sujette à de dramatiques altérations conformationnelles qui mènent

à la formation de polymères inactifs et sont à l’origine de diverses maladies [7].

Afin d’identifier des résidus jouant un rôle crucial dans le processus de polymérisation, et de contribuer ainsi à une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans de telles modifications conformationnelles, nous avons entrepris une étude in silico ayant pour objectif la conception rationnelle de mutants qui présentent des propriétés de polymérisation contrôlées. Cette étude a été suivie d’une caractérisation expérimentale de certaines des mutations proposées [8].

6.1 Introduction

6.1.1 M´ecanisme d’inhibition

Le mécanisme qui permet aux serpines d’assurer leur fonctions d’inhibiteurs est assez particulier car il implique certaines modifications structurales majeures [1–6]. Une analogie amusante qui est parfois utilisée consiste à comparer ce mécanisme à celui d’un piège à souris. En effet, l’inhibiteur actif circule sous une forme tendue, souvent qualifiée de métastable, et se relache brusquement suite à l’interaction avec la protéase cible pour adopter une conformation plus stable, en complexe avec celle-ci.

La structure native de l’α1-antitrypsine, qui correspond à la forme active de cette protéine, est représentée en Figure 6.1.a. Le site actif est localisé dans un tournant flexible composé d’une quinzaine de résidus et exposé au solvant : le reactive center loop (RCL). La première étape du processus d’inhibition est l’interaction du RCL avec le site actif de la protéase. La protéase réagit alors comme s’il s’agissait d’un substrat, établit un lien covalent avec le site actif de l’inhibiteur et initie le clivage de celui-ci [9–12].

Cette action déclenche une modification dramatique de la conformation de la serpine : le RCL clivé s’insère rapidement dans le feuillet β A pour y former un brin β additionnel (Figure 6.1.b) [4, 13, 14]. La protéase, qui reste liée au RCL [15], est entraˆınée par ce

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mouvement d’un pôle de la serpine à l’autre, ce qui correspond à un déplacement relatif d’environ 70 ˚A [16–19]. Au cours de ce mouvement, la protéase subit également certaines modifications conformationnelles qui consistent notamment en une distortion de son site actif [19–22]. La protéase est alors inactivée et incapable de se libérer du complexe formé avec la serpine. Elle est également plus sensible à la digestion protéolytique [23, 24].

Figure6.1 – Réprésentation des structures native et complexée de l’α1-antitrypsine. Le RCL est coloré en mauve, et le feuilletβA en bleu. (a) Structure native (code PDB : 1qlp). (b) Structure du complexe avec la trypsine (code PDB : 1ezx). La trypsine est en colorée en jaune.

La force motrice de cet ingénieux mécanisme d’inhibition est la grande différence de stabilité qui existe entre la structure native (active) de la serpine et la structure insérée (après clivage). A titre d’exemple, dans le cas de l’α1-antitrypsine, la température de dénaturation de la forme active est de l’ordre de 60^◦C, tandis que la forme insérée est stable jusqu’à approximativement 100^◦C [25–27]. Il a été montré que cette différence de stabilité résulte de la présence d’un certain nombre de défauts structuraux au sein de la forme native de cette protéine. Ces défauts se traduisent par des empilements trop serrés de chaˆınes latérales [28], des interactions entre résidus polaires et non-polaires [29, 30], ou encore des cavités [31, 32]. La plupart sont localisés à proximité du feuillet β A et facilitent vraisemblablement son ouverture, avant l’insertion du RCL.

6.1.2 Conformations alternatives et pathologiques

La flexibilité du RCL et sa propension à adopter une conformation étendue de typeβ, ainsi que les défauts structuraux présents dans la forme active de la plupart des serpines, rendent ces protéines, et particulièrement celles affublées de mutations, très vulnérables

à des modifications conformationnelles anormales. Nous présentons ici quelques aspects de ces modifications, qui ont souvent de lourdes conséquences pathologiques.

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Forme latente

L’insertion prématurée du RCL d’une serpine dans son propre feuilletβ A, sans qu’il n’y ait eu clivage, mène à la génération d’une forme((latente)). La structure d’une serpine sous forme latente est assez similaire à la structure adoptée lorsqu’elle est en complexe avec une protéase [3]. Cependant, le RCL n’étant pas clivé, son insertion dans le feuillet β A de la serpine nécessite certains réarrangements structuraux supplémentaires, dont notamment un démantèlement partiel du feuilletβ C, situé à l’autre extrémité du RCL.

L’adoption d’une conformation latente par une serpine implique une perte quasi- totale de son activité, ce qui peut être à l’origine de certaines maladies. Par exemple, la forme latente de l’antithrombine sauvage n’est présente qu’en très faibles quantités dans des conditions normales [33], mais elle peut être induite, notamment, par traitement à témpérature élevée [34]. Toutefois, certains variants de cette protéine peuvent subir une transition vers la forme latente beaucoup plus aisément, et causer ainsi le développement d’une thrombose [25, 33, 35, 36].

La protéine PAI-1 (plasminogen activator inhibitor-1) est assez particulière parmi les serpines car elle adopte spontanément une forme latente [35,37–41], ce qui lui procure une plus grande résistance à la protéolyse et permet une régulation de son activité [35, 42].

La transition de la forme latente vers la forme active de cette protéine peut en effet être stimulée par l’interaction avec une autre protéine, la vitronectine [38, 42].

La forme latente de l’α1-antitrypsine peut être obtenue sous certaines conditions bien particulières [27]. Elle n’a cependant, à notre connaissance, jamais été observéein vivo.

Polym´erisation

Certains variants naturels de l’α₁-antitrypsine ont tendance à s’assembler bout à bout, par insertion du RCL d’une molécule dans le feuillet β A de la suivante, et à former ainsi de longues chaˆınes polymériques insolubles et inactives [7, 26, 43–46]. Une légère élévation de la température suffit à induire la formation de polymères dans le cas de l’α1-antitrypsine sauvage [47–49]. Le mécanisme de polymérisation de l’α1-antitrypsine implique la formation d’un état partiellement structuré, préalablement à l’établissement d’interactions intermoléculaires [47,48]. Cet état partiellement structuré peut être atteint de deux manières : au cours du reploiement initial de la protéine ou suite à un déploiement partiel de la structure native.

Dans le cas de l’α1-antitrypsine, la polymérisation constitue une double menace pour la santé [43, 50, 51]. D’une part, l’incapacité de cette protéine à assurer sa fonction biologique induit une défaillance de la protection des tissus pulmonaires qui peut, à terme, être à l’origine d’un emphysème. D’autre part, l’accumulation de polymères dans les hépatocytes du foie peut conduire au développement d’une cirrhose. Plusieurs autres membres de la famille des serpines peuvent être affectés par un processus de polymérisation similaire. Les conséquences pathologiques de la polymérisation des serpines sont nombreuses et variées : la thrombose dans le cas de l’antithrombine [33,35], l’angioedeme dans le cas de l’inhibiteur-C1 [52], la maladie pulmonaire obstructive chronique dans le cas de l’α1-chymotrypsine [53] ou encore la démence dans le cas de la neuroserpine [54].

Comme nous l’avons vu précédemment (Sections 1.3 et 5.1.3), les serpines ne sont pas les seules protéines qui sont responsables de maladies suite à leur polymérisation et/ou

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agrégation au sein du système biologique [50, 51, 55–57]. Par ailleurs, l’agrégation de plusieurs protéines qui ne sont pas associées à des maladies de ce type peut également être provoquée sous certaines conditions particulières [58–69]. Sur la base de ces observations, il a été suggéré que l’agrégation est une propriété générale des chaˆınes polypeptidiques [55, 65].

De manière générale, la déstabilisation de la structure native d’une protéine apparaˆıt favorable à l’agrégation de celle-ci, notamment via une augmentation de la population de conformations partiellement déployées [62, 70]. Cette observation semble également valable pour l’α1-antitrypsine. Il a par exemple été montré que l’introduction de la mutation stabilisante F51L dans la séquence d’un variant pathogène de cette protéine facilite son reploiement et empêche sa polymérisation [71]. Une stabilisation de l’état agrégé peut également avoir un impact favorable sur l’agrégation. Plusieurs études consacrées aux peptides amyloidogéniques ont en effet montré que des mutations stabilisant les interactions intermoléculaires avaient pour conséquence une augmentation de la propension de ces peptides à former des agrégats [72–77]. Par ailleurs, des mutations introduites dans des régions spécifiques peuvent moduler l’agrégation de manière essentiellement indépendante de la stabilité. Ainsi, certaines mutations dans des régions hydrophobes de l’acylphosphatase, qui présentent une forte propension à l’adoption de structures étendues de typeβ, influencent fortement la vitesse d’agrégation de cette protéine [69].

Remarquons qu’il existe tout de même une différence essentielle entre les protéines, comme les serpines, dont la polymérisation est responsable de maladies et les autres.

Pour ces dernières, les conditions dans lesquelles la polymérisation se réalise sont en effet généralement fort différentes de celles qui existent dans un environnement cellulaire.

Dans le cas des serpines, le mécanisme de polymérisation est intimement lié à leur activité biologique normale : ces deux processus dépendent de l’insertion du RCL dans le feuillet β A. En conséquence, la formation de polymères de serpines peut être induite sans difficulté et ne requiert aucune condition particulière de solvatation : une légère élévation de température est généralement suffisante.

Autres conformations

Diverses autres cons´equences structurales de la mobilit´e du RCL des serpines ont

été relevées. A titre d’exemple, nous pouvons citer la formation d’un dimère entre deux molécules d’antithrombine, l’une intacte et l’autre clivée (ou sous forme latente) [78–80].

Dans le cas de l’α1-antitrypsine, des formes oligomériques résultant de l’insertion du RCL d’une molécule dans le feuilletβ C d’une autre ont également été observées avec certains variants, ou sous certaines conditions de solvatation particulières [49, 81–83].

6.2 Identification in silico de mutations modulant la polym´erisation

Comme nous l’avons mentionné plus haut, l’objectif de cette étude est de concevoir des protéines mutantes caractérisées par une propension à polymériser modifiée, afin de contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes qui régulent la conversion de l’α1-antitrypsine en polymères. Tester expérimentalement toutes les mutations est

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irréalisable en pratique. Il y a en effet 19 mutations possibles par position dans la séquence, ce qui correspond à un total de plus de 7000 mutations ponctuelles dans le cas de l’α1-antitrypsine. Dans nombre d’études, des mutations sont choisies plus ou moins aléatoirement et les propriétés des protéines mutantes sont analysées expérimentalement afin de mieux cerner le rôle joué, au cours du processus de polymérisation, par la région dans laquelle les mutations sont situées [28, 29, 84–86]. La possibilité de concevoir rationnellement des protéines mutantes qui présentent des propriétés de polymérisation et d’agrégation contrôlées a cependant été suggérée par certains, notamment dans le cadre d’une étude de l’agrégation de la protéine Ada2H [63].

Nous avons suivi cette suggestion et élaboré une stratégie basée sur l’utilisation de PoPMuSiC, un programme qui permet de prédire les changements de stabilité de protéines à la suite de mutations ponctuelles (voir Annexe D), afin d’identifier des mutations susceptibles de diminuer, ou d’accroˆıtre, la propension de l’α1-antitrypsine

à polymériser. L’avantage de l’utilisation de PoPMuSiC est que ce programme permet d’analyser in silico l’impact thermodynamique de chacune des mutations possibles en un temps raisonnable, et de proposer un ensemble restreint de mutations susceptibles de présenter les propriétés désirées, qui pourront être testées expérimentalement par la suite.

6.2.1 Strat´egie

Afin de concevoir des protéines mutantes présentant une tendance réduite à la polymérisation, nous avons sélectionné des mutations qui stabilisent l’état natif et déstabilisent simultanément la forme polymérique. De telles mutations devraient en principe limiter la polymérisation, que celle-ci soit sous contrôle cinétique ou thermodynamique.

Supposons que la polymérisation est une réaction en deux étapes, qui implique la formation d’un état intermédiaire partiellement déployé et, qu’en première approximation, l’état intermédiaire et les états de transition ne sont pas affectés par la mutation (Figure 6.2.a). Si la réaction est sous contrôle cinétique, la stabilisation de l’état natif induira une diminution de la vitesse de polymérisation grâce à l’accroissement de la barrière

énergétique qui sépare l’état natif de l’état intermédiaire (∆G^∗_NI,mut >∆G^∗_NI). Si elle est sous contrôle thermodynamique, la polymérisation sera pénalisée par l’accroissement de la différence d’énergie libre entre l’état natif et l’état polymérique (∆Gô_NP,mut>∆Gô_NP).

Dans l’éventualité où les interactions impliquant le résidu muté sont conservées au sein de l’état intermédiaire, il est vraisemblable que la mutation induise également une stabilisation de l’état intermédiaire (Figure 6.2.b). On peut alors considérer que la barrière énergétique caractéristique de la transition de l’état natif vers l’état intermédiaire reste approximativement constante. La vitesse de polymérisation sera néanmoins affectée par l’accroissement de la barrière énergétique qui sépare l’état intermédiaire de l’état polymérique (∆G^∗_IP,mut > ∆G^∗_IP). Notons que dans ce cas, si l’état intermédiaire est atteint directement à partir de l’état déployé, le reploiement vers l’état natif sera favorisé cinétiquement, et thermodynamiquement, par rapport à la polymérisation.

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Figure 6.2 – Représentation schématique de l’effet de mutations sur la polymérisation de l’α1-antitrypsine. Les courbes en traits pleins et pointillés représentent le profil énergétique de la polymérisation avant et après mutation, respectivement. On suppose que le passage de l’état natif (N) vers l’état polymérique (P) se fait via un intermédiaire partiellement déployé (I). ∆Gô_NI et ∆Gô_NP sont les différences d’énergie libre entre les états N et I, et N et P, respectivement. ∆G^∗_NI est l’énergie libre d’activation du déploiement vers l’état intermédiaire et ∆G^∗_IP est l’énergie libre d’activation de la polymérisation à partir de l’état intermédiaire. ∆Gô_NI,mut, ∆Gô_NP,mut, ∆G^∗_NI,mut et ∆G^∗_IP,mut sont les valeurs correspondantes après mutation. Les valeurs représentées ici sont données à titre illustratif et ne correspondent pas nécessairement à la réalité. (a) La mutation stabilise l’état natif et déstabilise la forme polymérique. Ni l’état intermédiaire, ni les états de transition ne sont affectés. (b) La mutation stabilise l’état natif, l’état intermédiaire et l’état de transition qui les sépare, et déstabilise la forme polymérique. L’état de transition séparant l’état intermédiaire de l’état polymérique n’est pas affecté.

6.2.2 Mod´elisation de la forme polym´erique

La structure native de l’α1-antitrypsine, c’est-à-dire la forme active, a été résolue par cristallographie au rayons X et rendue disponible dans la Protein Data Bank (code PDB : 1qlp, Figure 6.1.a) [87]. Il est donc possible d’appliquer directement PoPMuSiC sur cette structure afin d’évaluer l’effet de mutations sur la stabilité de la forme active.

Par contre, aucune structure de la forme polymérique de l’α1-antitrypsine sauvage n’est disponible. Nous avons donc utilisé la structure de l’α1-antitrypsine en complexe avec une trypsine (code PDB : 1ezx, Figure 6.1.b) [19] en tant que modèle de la forme polymérique. Cette structure correspond à ce que nous appellerons la forme insérée. En effet, la différence principale entre les structures 1qlp et 1ezx tient au fait que, dans cette dernière, le RCL est clivé entre les positions 358 et 359, adopte une conformation étendue

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en brinβ et est inséré entre les brins A3 et A5 du feuillet β A (Figure 6.1.b). La forme insérée présente donc une certaine similarité avec la forme polymérique, dans laquelle le RCL intact est inséré dans le feuilletβ A d’une autre molécule. Notre choix d’utiliser la structure de la forme insérée comme modèle, approximatif, de la structure polymérique repose sur cette similarité et sur l’hypothèse que l’insertion du RCL dans le feuillet β A est au moins aussi importante que les autres interactions protéine-protéine impliquées dans la réaction de polymérisation.

6.2.3 S´election de mutations candidates

Nous avons introduit une à une, in silico, toutes les mutations ponctuelles possibles dans la séquence de l’α₁-antitrypsine. Le programme PoPMuSiC a été utilisé afin d’évaluer l’impact de chaque mutation sur la stabilité de la forme active et sur celle de la forme insérée. Afin d’identifier des mutations susceptibles de réduire la propension de l’α₁-antitrypsine à polymériser, nous avons sélectionné celles qui ont à la fois un effet stabilisant sur la forme active et un effet déstabilisant sur la forme insérée.

Notons que, de manière générale, les mutations qui stabilisent la structure native d’une protéine ne constituent qu’une petite fraction de l’ensemble des mutations possibles, ce qui indique que les séquences des protéines sont relativement bien optimisées vis-à-vis de la stabilité de leur structure native. C’est également le cas de l’α1- antitrypsine : lorsque les potentiels sont dérivés de la base de donnéesDB141, seulement 664 mutations sur un total de 7068 (c’est-à-dire 9.4%) sont prédites comme étant stabilisantes. Déstabiliser la forme insérée, qui est globalement assez similaire à la structure native, est par contre une tâche bien plus aisée. En effet, un impact déstabilisant sur cette forme est prédit pour 6317 mutations (89.4%).

Afin de considérer uniquement les mutations qui sont les plus susceptibles d’avoir les propriétés désirées, l’ensemble des mutations candidates est restreint à celles qui satisfont les critères suivants :

1. Les mutations qui impliquent un résidu de type proline ou cystéine sont ignorés. En effet, les prolines sont susceptibles de générer des réarrangements conformationnels qui ne sont pas pris en compte par PoPMuSiC. Par ailleurs, l’introduction d’une cystéine pourrait entraˆıner la formation d’un pont disulfure avec le résidu 232, la seule cystéine dans la séquence sauvage de l’α₁-antitrypsine, et perturber le processus de reploiement de la protéine.

2. La mutation candidate doit être prédite comme stabilisant la forme active de plus de 0.5 kcal/mole et déstabilisant la forme insérée de plus de 0.5 kcal/mole. En plus de limiter les conséquences d’éventuelles imprécisions dans les prédictions, ce critère permet d’assurer un impact significatif sur la stabilité des différentes formes.

3. Etant donné que la structure insérée en complexe avec la trypsine n’est qu’une approximation de la forme polymérique, nous nous limitons aux mutations pour lesquelles un effet déstabilisant sur la forme insérée est prédit lorsque la présence de la trypsine est prise en compte et lorsqu’elle ne l’est pas.

4. Afin de limiter les erreurs dues aux imperfections des potentiels de force moyenne, deux séries de prédictions sont réalisées, avec des potentiels dérivés de deux bases de données différentes (DB¹⁴¹ etDB⁷³⁵ : voir Annexe B). Seules les mutations qui présentent les propriétés requises dans les deux cas sont retenues.

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Cinq mutations satisfont l’ensemble de ces critères. Elles sont répertoriées en Table 6.1.

L’une d’elles implique la phénylalanine en position 352. Ce résidu fait partie du RCL, qui s’intègre au feuilletβ A, entre les brins A3 et A5, dans la forme insérée (Figure 6.3).

Les quatre autres mutations concernent le résidu K331, qui est situé au début du brin β A5. La position 331 semble donc cruciale vis-à-vis de la stabilité relative de la forme active et de la forme insérée. Sur les 19 mutations possibles à cette position, il y en a d’ailleurs 14 ou 11 (selon que les potentiels soient dérivés de DB¹⁴¹ ou de DB⁷³⁵) qui stabilisent la forme active et déstabilisent la forme insérée. Elles n’ont cependant pas toutes été retenues car certaines ne satisfont pas les autres critères définis ci-dessus.

Mutant ∆∆G(kcal/mole) ∆∆G(kcal/mole) ∆∆G(kcal/mole)

Forme active Forme insérée (avec trypsine) Forme insérée (sans trypsine)

K331I -1.4 / -1.3 1.6 / 2.1 1.2 / 1.5

K331V -1.5 / -1.1 1.5 / 1.9 1.1 / 1.4

K331F -1.0 / -0.6 1.8 / 2.3 1.4 / 1.7

K331T -0.8 / -0.6 1.1 / 1.4 0.9 / 1.1

F352T -0.7 / -0.6 2.8 / 2.3 3.0 / 2.5

T102E 1.7 / 1.4 -0.6 / -0.7 -0.5 / -0.5

T102A 1.2 / 1.3 -0.7 / -0.8 -0.7 / -0.7

T102Q 0.8 / 0.8 -1.0 / -0.7 -0.9 / -0.6

G304A 0.8 / 0.9 -0.9 / -0.8 -0.9 / -0.8

S330R 1.4 / 1.3 -1.1 / -0.7 -1.1 / -0.7

Table 6.1 – Mutations ponctuelles stabilisant la forme active et déstabilisant la forme insérée, ou inversément. Les valeurs de ∆∆G sont calculées à l’aide de PoPMuSiC, en se basant sur les structures de code PDB 1qlp (forme active) et 1ezx (forme insérée). Deux colonnes sont consacrées aux prédictions concernant la forme insérée : la présence de la trypsine n’est prise en compte par les prédictions que dans un des deux cas. Les deux valeurs de ∆∆Gdonnées dans chaque colonne correspondent à celles obtenues lorsque les potentiels sont dérivés de laDB141 et de la DB735, respectivement.

Sur la base de critères analogues, nous avons également sélectionné cinq mutations susceptibles de renforcer la tendance à la polymérisation de l’α₁-antitrypsine (Table 6.1).

Trois d’entre elles impliquent le résidu T102, qui fait partie d’une hélice adjacente au feuillet β A (Figure 6.3). Une mutation concerne le résidu G304, qui appartient à une autre hélice, également localisée à proximité de ce feuillet. La dernière mutation implique le résidu S330, situé dans le tournant qui précède le brin β A5. Il est intéressant de remarquer que ce résidu est voisin du résidu K331, pour lequel de nombreuses mutations sont prédites comme ayant un effet opposé.

6.3 Caract´erisation exp´erimentale des mutations

Cinq mutations ont été choisies parmi celles sélectionnées au terme de l’analyse in silicodécrite ci-dessus. Selon nos prédictions, quatre d’entre elles (K331F, K331I, K331T et K331V) stabilisent la forme active et déstabilisent la forme insérée, ce qui devrait induire une diminution de la propension à polymériser de l’α1-antitrypsine. La dernière mutation (S330R) est censée avoir un effet opposé.

Chacun de ces cinq variants de l’α1-antitrypsine a été exprimé et purifié à partir d’Escherichia Coli, et sa structure secondaire, sa stabilité, sa propension à polymériser

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Figure 6.3 – Localisation des mutations sélectionnées à l’aide de PoPMuSiC. Le RCL est coloré en mauve, et le feuillet β A en bleu. Les résidus dont certaines mutations induisent une stabilisation de la forme active ainsi qu’une déstabilisation de la forme insérée sont mis en évidence en jaune. Les résidus dont certaines mutations induisent une déstabilisation de la forme active ainsi qu’une stabilisation de la forme insérée sont mis en évidence en rouge. (a) Forme active (code PDB : 1qlp). (b) Forme insérée (code PDB : 1ezx).

ainsi que son activité biologique ont été étudiées expérimentalement. Ces travaux ont été réalisés par le groupe du Professeur S.P. Bottomley, à laMonash University en Australie.

Nous ne nous attarderons donc pas sur la description des proc´edures exp´erimentales.

Les résultats de ces analyses sont riches d’intérêt, car elles constituent une validation expérimentale directe des prédictions effectuées à l’aveugle à l’aide de PoPMuSiC.

6.3.1 Impact des mutations sur la stabilit´e

La stabilité thermique de chacune des protéines mutantes a été déterminée par analyse de l’évolution du spectre UV lointain durant une augmentation graduelle de la température [8]. La température de fusion (Tm) de l’α1-antitrypsine sauvage (α1-AT), ainsi que celles des différents mutants sont données en Table 6.2.

Afin d’évaluer l’impact des mutations sur la stabilité thermodynamique, les courbes de déploiement à l’équilibre en présence d’urée ont été relevées à 25^◦C selon une procédure décrite dans des travaux antérieurs [8, 88, 89]. Il a été montré que le processus de déploiement de l’α₁-antitrypsine suit un parcours en deux étapes, avec un état intermédiaire peuplé pour de basses concentrations en dénaturant [90–92]. Les cinq protéines mutantes suivent également un déploiement en deux étapes. Cependant, comme l’indique la Table 6.2, les concentrations en urée correspondant à la transition de l’état natif vers l’état intermédiaire (DmNI) et à la transition de l’état intermédiaire vers l’état déployé (DmIU) sont affectées par les mutations.

Dans le cas de la mutation S330R, qui est prédite par PoPMuSiC comme déstabilisant fortement la structure native, une valeur de 1.3 M d’urée est mesurée pour DmNI. Cette

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∆∆G^pred_NU DmNI ∆∆GNI DmIU ∆∆GIU Tm

(kcal/mole) (M) (kcal/mole) (M) (kcal/mole) (^◦C)

α1-AT 2.36 5.47 58

Mutant K331F -1.35 3.04 -1.31 6.08 -0.44 64

Mutant K331I -1.30 2.76 -0.77 5.46 -0.07 61

Mutant K331V -0.80 2.70 -0.65 5.80 -0.24 62

Mutant K331T -0.70 2.13 0.43 5.32 0.11 57

Mutant S330R 1.35 1.30 2.02 4.90 0.42 52

Table 6.2 – Stabilit´e thermique et thermodynamique des mutants de l’α1-antitrypsine.

∆∆G^pred_NU est la variation de la différence d’énergie libre entre l’état natif (N) et l’état déployé (U), telle que prédite par PoPMuSiC (voir Table 6.1).DmNIetDmIUsont les concentrations en urée correspondant

à la transition de l’état natif vers l’état intermédiaire (I) et à la transition de l’état intermédiaire vers l’état déployé, respectivement. Ces concentrations ont permis de calculer ∆∆GNI et ∆∆GIU, les différences d’énergie libre entre les mutants et la protéine native, pour ces deux transitions.Tm est la température de fusion.

concentration est nettement plus faible (de 1.1 M) que celle correspondant à la même transition pour la protéine sauvage, ce qui équivaut à une perte de stabilité de plus de 2 kcal/mole par rapport à l’état intermédiaire. Selon les prédictions décrites précédemment, les quatre mutations en position 331 devraient avoir un effet stabilisant sur la structure native. C’est effectivement le cas pour trois d’entre elles. La mutation K331F est la plus stabilisante, avec une transition de l’état natif vers l’état intermédiaire qui se produit

à 3 M d’urée, indiquant un accroissement de la stabilité d’environ 1.3 kcal/mole. Aux variants K331I et K331 correspondent des valeurs de ∆∆GNI de -0.77 kcal/mole et -0.65 kcal/mole, respectivement. La mutation K331T apparaˆıt cependant comme légèrement déstabilisante.

La Table 6.2 montre que les mutations ont également un effet relativement important sur la transition de l’état intermédiaire vers l’état déployé. C’est à nouveau la mutation S330R qui entraˆıne la déstabilisation la plus marquée, avec une perte de stabilité de l’état intermédiaire par rapport à l’état déployé d’environ 0.4 kcal/mole. A l’opposé, les mutations K331F et K331V induisent une stabilisation de l’état intermédiaire de 0.44 kcal/mole et 0.24 kcal/mole, respectivement. Le déploiement des variants K331I et K331T se produit à des concentrations en urée similaires à celle nécessaire au déploiement de la protéine sauvage.

Pour ce qui est de l’impact sur la stabilité de la structure native, ces résultats expérimentaux confirment donc les prédictions de PoPMuSiC pour quatre parmi les cinq mutations analysées.

6.3.2 Impact des mutations sur la propension `a polym´eriser

Afin d’évaluer la facilité avec laquelle chacune des cinq protéines mutantes est sujette

à la polymérisation, chaque protéine a été incubée à une température de 60^◦C et des échantillons ont été prélévés à différents instants. Après un refroidissement rapide permettant de mettre un terme à la réaction de polymérisation, ces échantillons ont été analysés à l’aide d’un système PAGE non-dénaturant [8, 93] (Figure 6.4).

On observe que la forme monomérique de l’α₁-antitrypsine sauvage disparaˆıt complètement au cours des dix premières minutes d’incubation à 60^◦C, suite à la

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Figure6.4 –Analyse PAGE native de la réaction de polymérisation de l’α1-antitrypsine et des mutants sélectionnés par PoPMuSiC. L’analyse, basée sur la mesure de la migration dans un gel, permet de déterminer s’il subsiste de la protéine non-polymérisée dans l’échantillon, après incubation à 60^◦C pendant le temps indiqué (en minutes).

formation de polymères qui sont incapables d’entrer dans le gel. Des comportements très différents sont observés pour les 5 protéines mutantes. De manière consistante avec l’accroissement de la stabilité thermique et thermodynamique, les mutants K331F, K331V et K331I sont stables à 60^◦C plus longtemps que la protéine sauvage. En particulier, la forme monomérique du variant K331F est toujours présente après 30 minutes d’incubation. Le temps nécessaire à la polymérisation du mutant K331T est comparable à celui correspondant à l’α1-antitrypsine sauvage, tandis que le variant S330R polymérise complètement au cours des cinq premières minutes d’incubation.

Ces résultats démontrent, de manière qualitative, que la stratégie définie sur la base de l’utilisation de PoPMuSiC a permis de sélectionner avec succès des mutations qui accroissent, ou diminuent, la propension à polymériser de l’α1-antitrypsine. En effet, expériences et prédictions sont en accord pour quatre mutations sur cinq, au niveau de leur impact sur la vitesse de polymérisation.

6.3.3 Impact des mutations sur l’activit´e biologique

Afin d’accomplir sa tâche d’inhibiteur, la serpine agit en tant que substrat(( suicidaire )) de la protéase [11], selon un chemin réactionnel qui peut être décrit de la manière suivante :

Dans un premier temps, un complexe non-covalent (PA) se forme suite à l’interaction entre la protéase (P) et son inhibiteur (l’α1-antitrypsine, A). S’ensuit alors le passage par un état intermédiaire hypothétique (P-A^∗), qui précède l’étape finale de la réaction. Cette

étape consiste soit en la génération d’un complexe stable protéase-inhibiteur (P-A), soit en la séparation de la protéase et de l’inhibiteur clivé (A^†). La stoechiométrie d’inhibition, SI = 1+(ksub/kinh), décrit la répartition entre les deux dénouements possibles. Une valeur

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de SI proche de l’unité indique que la plupart des molécules d’inhibiteur remplissent correctement leur rôle et ne font pas office de substrat de la protéase.

L’activité inhibitoire de chaque protéine mutante a été testée vis-à-vis de la chymotrypsine. La constante de vitesse caractéristique de l’association initiale (kass) entre la chymotrypsine et le mutant de l’α1-antitrypsine, ainsi que la stoechiométrie de la réaction d’inhibition (SI), a été mesurée à 37^◦C selon une procédure décrite dans des travaux antérieurs [94]. La Table 6.3 permet de comparer ces valeurs avec celles propres à l’α1-antitrypsine sauvage. Les cinq protéines mutantes exercent leur activité d’inhibition de manière quasiment normale, avec des valeurs de kass et de SI similaires

à celles caractéristiques de la protéine sauvage. La seule exception concerne le variant S330R, qui joue plus fréquemment le rôle de substrat, comme en témoigne une valeur de SI légèrement supérieure.

kass(10⁶M⁻¹s⁻¹) SI

α1-AT 2.2 1.1

Mutant K331F 4.7 1.1

Mutant K331I 1.3 1.5

Mutant K331V 1.5 1.1

Mutant K331T 2.0 1.1

Mutant S330R 1.8 3.0

Table 6.3 – Activité inhibitoire des mutants de l’α1-antitrypsine. La constante de vitesse de l’association initiale protéase-inhibiteur (kass), ainsi que la stoechiométrie de la réaction d’inhibition (SI) sont donnés pour l’α1-antitrypsine sauvage et pour les cinq mutants testés.

Il n’est pas surprenant que les mutations testées affectent relativement peu la valeur dekass étant donné que, dans la forme non-clivée, ces mutations sont localisées dans une région éloignée du RCL, site de l’association initiale entre protéase et inhibiteur (Figure 6.3). Par contre, un certain impact des mutations sur SI pouvait être attendu. En effet, il est apparu que la vitesse d’insertion du RCL dans le feuillet β A après clivage est un

élément critique du point de vue de la répartion entre les rôles de substrat et d’inhibiteur [95]. Les mutations K331F, K331I et K331V stabilisent la structure native, sont prédits comme déstabilisant la structure en complexe avec la trypsine, et défavorisent l’insertion au cours de la polymérisation. Il semble donc probable que ces mutations défavorisent

également l’insertion du RCL lors de la formation du complexe avec la protéase, et soient en conséquence associés à des valeurs de SI supérieures. C’est effectivement le cas pour la mutation K331I, mais pas pour K331F et K331V (Table 6.3). D’autre part, la mutation S330R ayant un effet opposé sur la stabilité des deux formes et sur la propension à polymériser, elle devrait quant à elle favoriser l’insertion du RCL lors de la formation du complexe. Cependant, ce raisonnement intuitif ne reflète apparemment pas la réalité,

étant donné que la valeur de SI mesurée pour ce variant est largement supérieure à celle correspondant à la protéine sauvage.

L’influence de diverses mutations qui stabilisent la structure native de l’α1-antitrypsine sur la stoechiométrie d’inhibition a été décrite dans la littérature. Une corrélation linéaire entre l’accroissement de stabilité et l’augmentation du SI a pu être mise en évidence pour certaines mutations de résidus appartenant au feuillet β A, ou localisés à proximité de celui-ci [29,31]. Cette corrélation n’est cependant pas valable de manière générale, comme en témoigne l’existence de nombreuses mutations stabilisantes qui n’affectent pas, ou peu,

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l’activité inhibitoire [28, 29, 84, 86, 96, 97], ainsi que de mutations qui affectent l’activité sans modifier significativement la stabilité de la structure native [29]. Ces différents résultats suggèrent donc qu’il existe bel et bien une relation entre la stabilité de la structure native, la facilité avec laquelle le RCL peut s’insérer dans le feuillet β A, et la stoechiométrie d’inhibition, mais que cette relation n’est pas directe et que d’autres facteurs jouent vraisemblablement un rôle. Les interactions qui s’établissent entre la protéase et son inhibiteur doivent probablement être incluses parmi ces facteurs. Il est en effet apparu que l’impact de mutations sur la stoechiométrie d’inhibition des serpines peut dépendre de la protéase impliquée.

6.3.4 Impact des mutations sur la structure

Des spectres de dichroisme circulaire (UV lointain) ont été relevés pour chacune des cinq protéines mutantes. Ces spectres sont tous identiques à celui caractéristique de l’α₁-antitrypsine sauvage, indiquant que les différences de stabilité, de propension

à polymériser et d’activité d’inhibition ne sont liées à aucune modification structurale majeure.

6.4 Conclusions

Sur la base des résultats expérimentaux présentés ci-dessus, nous pouvons conclure que notre tentative de conception rationnelle de mutants de l’α1-antitrypsine présentant des propriétés de polymérisation contrôlées s’est révélée particulièrement fructueuse. En effet, pour trois des quatre mutations supposées stabiliser la structure native, ainsi que pour la mutation supposée la déstabiliser, l’effet prédit a été confirmé par l’expérience.

De plus, les valeurs prédites et observées de ∆∆G (de l’ordre de 1 kcal/mole) sont en bon accord d’un point de vue quantitatif. Remarquons également que la seule mutation incorrectement prédite est celle, parmi toutes les mutations testées, pour laquelle l’effet stabilisant prédit et l’effet déstabilisant observé sont les plus faibles.

Par ailleurs, les trois mutations pour lesquelles nous avons prédit un impact stabilisant sur la structure native ainsi qu’un impact déstabilisant sur la forme insérée, et qui stabilisent effectivement la structure native, ont également exhibé le comportement attendu du point de vue de la polymérisation. Au contraire de l’α1-antitrypsine sauvage, qui polymérise complètement au cours des dix premières minutes d’incubation à 60^◦C, la forme monomérique de ces mutants (K331F, K331V et K331I) est encore observée après 20 à 30 minutes d’incubation. L’augmentation de la propension à polymériser a également été accomplie avec succès : la forme monomérique du mutant S330R, prédit comme stabilisant la forme insérée et déstabilisant la forme native, disparaˆıt en effet dès les cinq premières minutes d’incubation. Notons qu’il est assez difficile de comparer directement les résultats expérimentaux, qui sont des mesures cinétiques à une température élevée, aux prédictions, qui sont basées sur la stabilité thermodynamique

à température ambiante. Ces résultats justifient néanmoins, a posteriori, notre choix de modéliser la forme polymérique à l’aide de la structure insérée en complexe avec la trypsine, ainsi que l’hypothèse selon laquelle la modification de la stabilité relative des deux formes permet de moduler leur interconversion.

(14)

Nous avons donc localisé deux résidus (S330 et K331) qui jouent un rôle important au cours du processus de polymérisation. Ces résidus sont localisés dans le bas du cinquième brin du feuilletβ A (Figure 6.3). Ce brinβest directement impliqué dans la modification conformationnelle entre la forme active et la forme insérée, vu que le RCL s’insère entre le troisième et le cinquième brin du feuillet β A. Le résidu S330 est conservé dans 60 à 70% des protéines de la famille des serpines, tandis que le résidu K331 est présent dans 40 à 50% des séquences connues de serpines [2]. Aucune maladie liée à une mutation naturelle de l’un de ces deux résidus n’est répertoriée à l’heure actuelle [7]. Le fait que des mutations de deux résidus voisins puissent avoir des effets diamétralement opposés sur la stabilité de la structure native et la tendance à polymériser souligne le rôle critique joué par cette région. Rappelons également qu’un certain nombre d’autres mutations ont été sélectionnées au terme de notre étude in silico (Table 6.1), mais n’ont pas été analysées expérimentalement. Ces mutations méritent une étude plus détaillée, afin de clarifier l’importance des résidus concernés dans le contrôle de la polymérisation.

D’autres études ont mis en évidence un certain nombre de résidus critiques vis-à- vis de la stabilité de la structure native de l’α1-antitrypsine [28, 29, 84–86, 97]. Il a été montré que des mutations de ces résidus permettent de stabiliser la structure native, avec des conséquences diverses sur l’activité inhibitoire et la tendance à polymériser.

Avec les critères de sélection que nous avons imposé, aucun de ces résidus n’a été retenu par PoPMuSiC, à l’exception du résidu K331 [29]. Nous nous sommes en effet restreints aux mutations pour lesquelles un effet stabilisant sur la structure native est prédit, parallèlement à un effet déstabilisant sur la structure insérée, ou inversément, alors que ces études étaient focalisées sur la stabilité de la structure native.

Un autre aspect intéressant de l’influence des mutations sur les propriétés de l’α1- antitrypsine est leur impact sur l’activité de cette protéine en tant qu’inhibiteur. La plupart des mutations que nous avons testées affectent relativement peu l’activité inhibitoire, bien qu’elles interfèrent visiblement avec l’insertion du RCL au cours de la polymérisation. L’effet le plus marqué sur l’activité inhibitoire concerne le mutant S330R. Ce mutant déstabilise la structure native, au niveau du feuillet β A, est prédit comme stabilisant la forme insérée, et favorise la formation de polymères. Pourtant, assez curieusement, ce mutant est nettement plus susceptible de jouer le rôle de substrat, c’est-à-dire de subir le clivage par la protéase sans parvenir à former un complexe stable avec celle-ci. Ces observations indiquent vraisemblablement une certaine différence entre le processus d’insertion du RCL lors de la polymérisation et lors de la formation du complexe avec une protéase. Des études plus détaillées sont bien entendu nécessaires afin d’en clarifier l’origine, mais cette différence apparaˆıt comme plutôt encourageante, dans l’optique de la mise au point de médicaments qui limitent la polymérisation sans pour autant nuire à l’activité biologique normale de l’α1-antitrypsine.

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