Correction mai 2010
Pour répondre à ce sujet, il fallait connaître un peu de biologie des champignons. Il fallait aussi connaître les bases de la génomique: comment sont séquencés les génomes et comment ils sont annotés et analysés.
- Pour établir la séquence des génomes de F. oxysporum et F. verticillioides, la technique la plus adaptée est celle du "shotgun". Le génome est fragmenté en petits morceaux qui sont clonés dans des plasmides. Les séquences des inserts de ces plasmides sont établies en utilisant une méthode dérivée de celle de Sanger. Les séquences sont faites en suffisamment grand nombre de façon à ce qu'elles recouvrent plusieurs fois le génome (10 fois est une bonne couverture). Les techniques "haut débit" de type pyrosequençage par solexa ou 454 sont aussi possibles. Puis le génome est reconstitué par bioinformatique en utilisant un programme qui compare les séquences et les assemble (Arachne, Phred-Phrap...). L'assemblage est alors annoté par différentes méthodes ab initio, par comparaison avec une collection d'EST ou par comparaison avec les gènes déjà connus. (2 points)
- Pour montrer que les trois espèces possèdent un cœur commun de gènes et que F.
oxysporum possède 19 Mb sur 4 chromosomes supplémentaires, il faut comparer les séquences des 3 génomes par bioinformatique (on utilise pour cela des programmes dérivés de BLAST, FASTA, CLUSTAL...). On constate que les génomes s'alignent sur un cœur commun de gènes et que 19 Mb du génome de F. oxysporum n'ont pas orthologue chez les deux autres Fusarium. Ces 19 Mb sont regroupés sous forme de 4 supercontigs. Pour vérifier qu'il s'agit bien de 4 chromosomes, il est possible d'établir le caryotype de F. oxysporum par électrophorèse en champ pulsé par exemple (il est possible de poursuivre en faisant un Southern Blot sur l'ADN ainsi séparé et de le sonder en utilisant des sondes spécifiques de chaque chromosome). (2 points)
- La comparaison avec le génome de F. solani se fait aussi par bioinformatique en utilisant la même procédure que ci-dessus. (1 point)
- L'identification de transposons et de gènes présents chez les autres champignons se fait aussi par bioinformatique en suivant le même protocole que ci-dessus. (2 points)
- Pour montrer que les souches non pathogènes de la tomate ne possèdent pas les chromosomes LS, il suffit d'utiliser des amorces permettant d'amplifier spécifiquement par PCR une région d'ADN pour chacun des 4 chromosomes. L'utilisation de ces amorces sur les souches non-pathogènes n'a pas conduit aux amplifications attendues.
Notez qu'un Southern Blot avec des sondes spécifiques est aussi possible (2 points)
- Pour montrer le transfert des chromosomes, il faut dans un premier temps marquer le génome de la souche receveuse (en lui intégrant par exemple un marqueur de résistance à un fongicide). La souche donneuse possédant les 4 chromosomes LS et les souches receveuses qui en sont dépourvues sont mises en contact (co-culture sur la même boîte de Petri): les anastomoses naturelles vont aboutir à la formation d'un hétérocaryon.
Dans cet hétérocaryon, visiblement les chromosomes LS peuvent changer de noyau! La
"souche receveuse" est ensuite récupérée en étalant des spores de l'hétérocaryon sur du milieu contenant de l'antifongique. Différentes spores sont analysées: leur ADN est extrait et analysé par PCR en utilisant les amorces spécifiques des chromosomes LS. (3 points)
- Pour tester la pathogénie, il suffit d'inoculer des tomates avec des spores de Fusarium avec comme témoin des plants non inoculés. Le degré de pathogénie est visualisé simplement par le pourcentage de plants infectés ainsi que la sévérité des lésions causées par F. oxysporum. (1 point)
Ce que l'on pouvait conclure de ces expériences,
- Elles démontrent des transferts horizontaux massifs d'ADN entre cellules eucaryotes, associés à des gains de pathogénicité. Ce type de transfert est usuellement décrit chez les procaryotes. (1.5 point)
- Les chromosomes LS semblent participer au large spectre d'hôte présenté par F.
oxysporum et F. solani (F. solani a aussi un spectre d'hôte large, cf. la présentation de vos camarades). Les espèces sans ces chromosomes LS ont elles un spectre plus réduit. (2 points)
- Si des gènes de pathogénies sont présents sur les chromosomes LS, d'autres peuvent être présents dans le cœur commun (au moins chez F. verticillioides et F. graminearum!).
De même N. crassa est un saprotrophe (et non un pathogène!). Les gènes des chromosomes LS ont des orthologues chez N. crassa. La situation est donc plus complexe qu'une simple partition: gène de pathogénie sur chromosome LS, gènes de "ménage"
sur le cœur commun. Eventuellement, des gènes pourraient avoir des rôles distincts chez les différentes espèces de champignons (1.5 point)
- Ceci a une implication sur la dynamique des infections par les Fusarium car on peut assister à la formation rapide de nouvelles associations pouvant potentiellement agrandir le spectre d'hôte de F. oxysporum, en réponse à des pressions de sélections telles que celles utilisées en agriculture (monoculture, utilisation de fongicide etc.). Notez que F. oxysporum est asexué, ce type d'échange d'ADN peut suppléer au manque de sexualité. La présence de nombreux transposons est aussi une source de réarrangements du génome. Cet organisme asexué pourrait donc avoir une adaptabilité aussi efficace que les espèces sexuées! (2 points)
