FACULTE DE MEDECINE
Les souris déficientes pour les échangeurs sodium-calcium (NCX1 et NCX3): deux modèles murins
pour l'étude de leurs rôles physiologiques in vivo. Implication de NCX3 dans la fonction neuromusculaire.
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade académique de Docteur en Sciences Biomédicales
Sokolow Sophie
Promoteurs de Thèse:
Pr A. HERCHUELZ, Laboratoire de Pharmacodynamie et de Thérapeutique Dr S. SCHURMANS, Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie
Humaine Moléculaire (I. R. I. B. H. M)
Année académique 2003 - 2004
FACULTE DE MEDECINE
Les souris déficientes pour les échangeurs sodium-calcium (NCX1 et NCX3): deux modèles murins
pour l'étude de leurs rôles physiologiques in vivo. Implication de NCX3 dans la fonction neuromusculaire.
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade académique de Docteur en Sciences Biomédicales
Sokolow Sophie
Promoteurs de Thèse:
Pr A. HERCHUELZ, Laboratoire de Pharmacodynamie et de Thérapeutique Dr S. SCHURMANS, Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie
Humaine Moléculaire (I. R. I. B. H. M)
Année académique 2003 - 2004
FACULTE DE MEDECINE
Les souris déficientes pour les échangeurs sodium-calcium (NCX1 et NCX3): deux modèles murins
pour l'étude de leurs rôles physiologiques in vivo. Implication de NCX3 dans la fonction neuromusculaire.
Sokolow Sophie
Laboratoire de Pharmacodynamie et de Thérapeutique, Faculté de Médecine
Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine Moléculaire (IRIBHM), Institut de Biologie et de Médecine Moléculaires(IBMM)
Epreuve publique du 29 janvier 2004
Composition du Jury:
Pr S. SOHRABY Laboratoire de Physiologie - Unité de Physiologie Cellulaire, Faculté de Médecine, Université Libre de Bruxelles, Bruxelles, Belgique
Présidente du Jury
Pr A. HERCHUELZ Laboratoire de Pharmacodynamie et de Thérapeutique, Faculté de Médecine, Université Libre de Bruxelles, Bruxelles, Belgique
Secrétaire
Promoteur de thèse Dr S. SCHURMANS Institut de Recherche Interdisciplinaire en
Biologie Humaine Moléculaire (IRIBHM), Institut de Biologie et de Médecine Moléculaires (IBMM), Université Libre de Bruxelles, Gosselies, Belgique
Promoteur de thèse
Pr R. POCHET Laboratoire d'Histopathologie, Faculté de Médecine, Université Libre de Bruxelles, Bruxelles, Belgique
Expert de la Faculté
Pr S. SCHIFFMANN Laboratoire de Neurophysiologie, Faculté de Médecine, Université Libre de Bruxelles, Bruxelles, Belgique
Expert de la Faculté
Pr P. ROBBERECHT Laboratoire de chimie biologique et de la nutrition, Faculté de Médecine, Université Libre de Bruxelles, Bruxelles, Belgique
Expert de la Faculté
Pr A. BELAYEW Service de Biologie Moléculaire, Université de
Mons-Hainaut, Mons, Belgique Expert extérieur Pr JM. GILLIS Unité de physiologie générale des muscles,
Université Catholique de Louvain, Bruxelles, Belgique.
Expert extérieur
Je voudrais commencer par remercier le Professeur A. Herchuelz qui est le premier à m'avoir mise sur la voie d'une thèse de doctorat. Je le remercie également d'avoir accepté de relever le défi que je lui ai proposé à savoir la production de souris transgéniques alors que je venais à peine d'arriver dans son laboratoire. Il est vrai qu'il y avait de quoi hésiter puisque j'avais deux ans d'expériences non pas en biologie moléculaire mais en gestion d'officine!
Je remercie les Professeurs J. E. Dumont et G. Vassart de m’avoir accueillie à l’Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Moléculaire (IRIBHM) me permettant ainsi d’entreprendre la production de souris transgéniques dans les meilleures conditions possibles.
Je remercie le Dr Stéphane Schurmans d'avoir suivi l'évolution de mon travail de bout en bout. Stéphane, non seulement tu m'as transmis ton savoir et tes compétences en biologie moléculaire (clonage, génotypage, PCR,…), cellulaire (culture de cellules souches, manipulation d’embryons) et animale (production et élevage de souris transgéniques) mais en plus tu n'as cessé de m'apporter ton soutien et tes encouragements. Tu étais toujours enthousiaste même lors des désenchantements.
Je remercie le Professeur M. Pandolfo de m'avoir accueillie au Laboratoire de Neurologie Expérimentale (Hôpital Erasme) et d'avoir mis à ma disposition le dispositif d'électromyographie. C'est grâce au Dr Mario Manto que j'ai pu m’initier à l’électromyographie et surtout que j'ai pris goût à la neurologie. Mario, je te remercie d'avoir trouvé le temps de m'apprendre les différentes techniques d'électrodiagnostic entre tes consultations, tes mémorants, tes projets de recherche, tes enfants et tes cours du soir en informatique. C’est probablement ton dynamisme, ta bonne humeur, ta rigueur et tes compétences qui ont rendu cette collaboration aussi fructueuse. Merci aux filles (Marie-Aline et Nathalie) d'avoir contribué à cette bonne ambiance de travail.
J’en profite pour remercier mon frère, qui par sa profession de chirurgien, m’a ouvert certaines portes à l’Hôpital Erasme, et notamment celle du laboratoire de neurologie expérimentale.
Je remercie le Professeur S. Schiffman de m’avoir accueillie pendant de nombreuses semaines dans le laboratoire de Neurophysiologie (Faculté de Médecine) et d'avoir mis à ma disposition le microscope confocal. Je remercie le Dr Jean-Marie Vanderwinden pour son sens critique dans l'analyse des résultats d'immunohistochimie. Jean-Marie, je te remercie également pour les superbes images réalisées au confocal et surtout d’avoir accepté de travailler, pour une fois, sur du muscle squelettique plutôt que sur du tube digestif de souris. Merci à Karine de m’avoir appris différentes
préparation de fibres musculaires et de marquage des jonctions neuromusculaires.
Je remercie le Professeur Philippe Gailly (Département de Physiologie, FYMU, UCL) pour les mesures de Ca2+ intracellulaire et pour ses discussions enrichissantes dans le domaine des maladies musculaires. Je remercie également ses collaborateurs, les Drs Clarisse Vandebrouck et Jean Marc Raymackers.
Je remercie le Professeur J. Molgo (Institut Fédératif de Neurobiologie Alfred Fessard, Laboratoire de Neurobiologie Cellulaire et Moléculaire, CNRS, Gif-sur-Yvette, France) pour sa collaboration et son expertise dans le domaine de la transmission neuromusculaire.
Je dois témoigner toute ma reconnaissance à Virginie Duquesne et à Bruno Pichon qui m’ont présentée et m'ont surtout permis de m’intégrer rapidement au sein des nombreux chercheurs de l’IRIBHM à Bruxelles. Parmi ceux-ci, je remercie tout d’abord Françoise Miot, Xavier De Deken et Liliane Colin de m’avoir hébergée dans leur laboratoire avant notre déménagement à l’IBMM à Gosselies. Je remercie Jens pour les nombreux services rendus et particulièrement lorsqu’il m’évitait des "aller-retour" Mons-Bruxelles le week-end.
Je remercie également tous les membres, passés et présents de l'IRIBHM (Erasme) pour leur collaboration ou leur soutien amical. Il s'agit notamment des filles du 4ème (Sarah, Isa Mini, Sandrine, Valérie, Christine…) et du 5ème (Katia, Anouck, Vanessa), de Catherine Ledent et de Patrick Laurent.
Ensuite, je remercie tous les chercheurs, passés et présents, avec qui j’ai travaillé à Gosselies à savoir Françoise, Fred, Bernard, Valérie, Serge, Christophe, Eileen, Marianne, Daniel, Christiane, Gilles, Réginald, Chiat, Nathalie, Annick, que ce soit pour leur bagage scientifique, leur aide technique ou leur soutien moral. Je remercie Jean-Denis tout d’abord pour ses conseils pertinents dans la désignation des peptides NCX3 immunogènes, pour la purification des anticorps anti-NCX3, pour ses nombreuses discussions scientifiques ou extra-scientifiques (notamment sur sa passion pour les bonsaïs) mais aussi pour son don d’animer la salle café le midi.
Je me dois d'accorder une mention spéciale à Sabine et Odile pour leur travail considérable dans le génotypage des souris, pendant mes nombreuses absences justifiées par ma présence à Bruxelles (à Erasme ou à l’UCL). Merci également à Evelyne, Dominique pour leur précieuse aide technique à différents moments de ma thèse. Merci à Marie-Jeanne pour le nettoyage quotidien de la verrerie,
dépanner (via nos voisins du DBM) en cas de rupture de stock.
Il me faut également remercier tous les membres, passés ou présents, du Laboratoire de Pharmacodynamie et Thérapeutique pour leur collaboration et leur soutien moral ou amical tout au long de ma thèse. Il s'agit du Professeur Ph. Lebrun, des Drs Marie-Hélène Antoine, Rami Saba, David Gall, Adama Kamagate, Jérôme Ouedraogo, de Mademoiselle Anne Van Praet, de Madame Christiane Pastiels et de Monsieur Marcel Hermans.
Je tiens à exprimer mes vifs remerciements à Cathy et à Julie pour leur aide administrative.
Merci à Sébastien Wuillot pour ses dépannages rapides en cas de pépins informatiques.
Je remercie Nathalie et Bélinda, qui travaillent dans l’ombre à l’animalerie mais qui veillent quotidiennement au bien-être et aux soins des souris.
Je remercie ma petite sœur Annissa et tous mes amis pour leurs encouragements et leur soutien moral.
Ma plus profonde gratitude s'adresse à ma famille et plus particulièrement à ma Maman qui m'a permis d’entreprendre ces études. Maman, je te remercie de m’avoir soutenue et encouragée tout au long de mon doctorat mais aussi d'avoir toujours été à mes côtés dans les moments difficiles.
François c'est probablement à toi que revient la Palme d'Or des remerciements car tu supportes quotidiennement mon caractère difficile et les nombreuses heures que je consacre à mes travaux de recherche plutôt qu'aux tâches ménagères. Tu as compris quelle importance j’attachais à mon travail.
Nombreux sont les week-ends que tu as sacrifiés pour les passer avec moi au labo. Merci encore pour ton soutien et pour ton dévouement continuel à rendre ma vie plus agréable.
Papa, malheureusement tu nous as quittés trop tôt, mais je te remercie de m’avoir transmis ton tempérament slave qui contribue pour beaucoup à ma force de caractère. Aujourd'hui je te dédie ce travail.
La réalisation de ce travail a bénéficié de subsides du "Fonds National pour la Recherche Scientifique", de la "Fondation Rose et Jean Hoguet" et du "Téléthon Belgique".
Table des matières:
LISTE DES ABREVIATIONS... VIII ABREVIATIONS DES ACIDES AMINES...XII GLOSSAIRE... XIII
I. INTRODUCTION... 1
I. 1. L’homéostasie calcique... 1
I. 2. Mécanismes contrôlant l'entrée du Ca2+... 2
I. 2. 1. Les canaux calciques membranaires... 2
I. 2. 2. Les canaux calciques intracellulaires... 2
I. 3. Protéines 'tampon'... 3
I. 4. Mécanismes contrôlant l'expulsion du Ca2+... 4
I. 4. 1. L'échangeur Na/Ca membranaire... 4
I. 4. 2. Les Ca2+-ATPases... 5
I. 5. Caractéristiques moléculaires de l'échangeur Na/Ca membranaire... 5
I. 5. 1. Clonage et localisation chromosomique de l'échangeur Na/Ca... 5
I. 5. 2. Epissage alternatif des échangeurs et distribution tissulaire de leurs variants d’épissage ... 6
I. 5. 3. Topologie membranaire de l'échangeur Na/Ca... 8
I. 6. Régulation de l'échangeur Na/Ca... 9
I. 6. 1. Régulation dépendante du Ca2+i... 9
I. 6. 2. Inactivation dépendante du Na+... 10
I. 6. 3. Régulation par le potentiel de membrane ... 11
I. 6. 4. Phosphorylation ... 11
I. 6. 4. a. La phosphorylation directe... 12
I. 6. 4. b. Les phosphatidylinositols... 13
I. 6. 4. c. Les protéines cytosoliques solubles ... 14
I. 6. 5. L'intéraction lipide-protéine... 14
I. 6. 6. Le pH ... 14
I. 7. Les inhibiteurs de l'échangeur Na/Ca... 15
I. 7. 1. Les composés inorganiques ... 16
I. 7. 2. Les composés organiques ... 16
I. 7. 3. Les peptides inhibiteurs de l'échangeur Na/Ca ... 18
I. 7. 4. La stratégie anti-sens... 19
I. 8. Similarité de fonction entre les 3 NCXs... 19
I. 9. Rôles physiologiques de l'échangeur Na/Ca... 20
I. 9. 1. L'échangeur Na/Ca dans le contrôle de la contraction cardiaque ... 20
I. 9. 2. L'échangeur Na/Ca dans le système nerveux central... 21
I. 9. 3. L'échangeur Na/Ca neuronal... 22
I. 9. 4. L'échangeur Na/Ca dans le muscle squelettique... 22
I. 9. 5. L'échangeur Na/Ca dans la cellule β-pancréatique... 23
I. 9. 6. L'échangeur Na/Ca dans les ostéoblastes... 23
I. 9. 7. Implications physiopathologique et thérapeutique de l'échange Na/Ca ... 24
I. 10. Le muscle strié squelettique... 25
I. 10. 1. Embryogenèse et structure de la fibre musculaire ... 25
I. 10. 2. Evénements de la contraction et de la relaxation musculaire ... 27
I. 10. 3. Mécanisme moléculaire de la contraction musculaire ... 27
I. 10. 4. Energétique de la contraction... 28
I. 10. 5. Types de fibres musculaires... 28
I. 10. 6. Recrutement des unités motrices ... 29
I. 10. 7. Physiologie de la jonction neuromusculaire ... 30
I. 10. 8. Pathologie de la jonction neuromusculaire ... 31
I. 10. 8. a. Le syndrome myasthénique... 31
I. 10. 8. b. La myasthénie ... 32
I. 10. 8. c. Le syndrome myasthénique de Lambert-Eaton... 34
I. 10. 9. L'électromyographie ... 35
II. BUT DU TRAVAIL... 39
III. MATERIEL ET METHODES... 40
III. 1. Production de souris transgéniques... 40
III. 1. 1. Criblage d'une banque d'ADN génomique de souris... 40
III. 1. 1. a. Etalement des bactéries ... 40
III. 1. 1. b. Préparation des répliques sur filtre de nitrocellulose ... 40
III. 1. 1. c. Préparation de la sonde nucléotidique spécifique du gène recherché ... 41
III. 1. 1. d. Hybridation des filtres de nitrocellulose ... 41
III. 1. 1. e. Lavages des filtres de nitrocellulose... 42
III. 1. 1. f. Autoradiographie ... 42
III.1. 2. Clonage des fragments du gène d'intérêt dans le vecteur plasmidique pSK Bluescript ... 43
III. 1. 3. Culture et électroporation de cellules souches embryonnaires de souris avec la construction, et identification des clones recombinants... 46
III. 1. 3. a. Préparation de fibroblastes embryonnaires primaires de souris (PEF) ... 46
III. 1. 3. b. Culture des cellules souches embryonnaires de souris (ES) ... 47
III. 1. 3. c. Electroporation et sélection à la généticine ... 48
III. 1. 3. d. Repiquage des clones résistants à la généticine ... 49
III. 1. 3. e. Congélation des clones et extraction de l'ADN des clones résistants à la généticine ... 50
III. 1. 4. Agrégation de morulas normales avec les clones ES recombinants ... 51
III. 1. 4. a. Superovulation des souris CD1 femelles... 51
III. 1. 4. b. Agrégation de morulas normales avec les clones ES recombinants ... 52
III. 1. 4. c. Réimplantation ... 54
III. 1. 5. Production de souris chimériques, de souris hétérozygotes puis homozygotes. 55 III. 2. Analyses génotypique et phénotypique des souris génétiquement modifiées... 56
III. 2. 1. Génotypage... 56
III. 2. 1. a. Transfert de type Southern... 56
III. 2. 1. b. Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) ... 57
III. 2. 2. Expression de l'ARNm... 58
III. 2. 2. a. Préparation d'ARN polyadénylé (ARN polyA ou ARNm) ... 58
III. 2. 2. b. Transfert de type Northern... 59
III. 2. 2. c. Sonde ARN radiomarquée... 59
III. 2. 2. d. RT-PCR... 60
III. 2. 3. Immunodétection des protéines membranaires ... 61
III. 2. 3. a Extraction de protéines membranaires à partir du muscle squelettique ... 61
III. 2. 3. b. Analyse par transfert de type Western... 61
III 2. 4. Mesure de la concentration de Ca2+ intracellulaire ... 62
III. 2. 4. a. Isolation des fibres musculaires... 62
III. 2. 4. b. Mesure de la [Ca2+]i... 63
III.2. 5. Histologie ... 64
III. 2. 5. a. Prélèvements... 64
III. 2. 5. b. Colorations ... 65
III. 2. 5. c. Coloration vitale par injection de Bleu Evans... 65
III. 2. 5. d. Immunohistochimie... 66
III. 2. 5. e. Microscopie confocale... 67
III. 2. 6. Tests in vivo... 68
III. 2. 6. a. Test du fil... 68
III. 2. 6. b. Rota-rod... 69
III. 2. 7. Electromyographie ... 69
III. 2. 7. a. Dispositif général mis au point chez la souris ... 69
III. 2. 7. b. Tracé d'insertion et activité motrice spontanée ... 70
III. 2. 7. c. Stimulodétection et courbe de recrutement ... 71
III. 2. 7. d. Stimulation répétitive ... 71
III. 2. 7. e. Exercice de fatigabilité ... 71
III. 2. 7. f. Electromyographie à fibre unique... 72
III. 2. 8. Statistiques ... 73
IV. RESULTATS EXPERIMENTAUX... 74
IV. 1. Production de souris déficientes pour le gène Ncx1... 75
IV. 1. 1. Clonage du gène Ncx1 murin ... 75
IV. 1. 2. Construction du gène Ncx1 muté ... 77
IV. 1. 3. Obtention des cellules ES modifiées génétiquement ... 78
IV. 1. 4. Production de souris chimériques, de souris hétérozygotes et puis homozygotes ... 78
IV. 1. 5. Génotypage des souris déficientes pour le gène Ncx1... 79
IV. 2. Production de souris déficientes pour le gène Ncx3... 81
IV. 2. 1. Clonage du gène Ncx3 muté... 81
IV. 2. 2. Construction du gène Ncx3 muté ... 81
IV. 2. 3. Obtention des cellules ES modifiées génétiquement ... 81 IV. 2. 4. Production de souris chimériques, de souris hétérozygotes puis homozygotes. 82
IV. 3. Analyses génotypique et phénotypique des souris déficientes pour le gène Ncx3
... 83
IV. 3. 1. Génotypage des souris déficientes pour le gène Ncx3... 83
IV. 3. 2. Survie et analyse du poids des souris... 84
IV. 3. 3. Expression de l'ARNm de NCX3 dans le muscle squelettique de souris ... 85
IV. 3. 4. Immunodétection de NCX3, NCX1 et PMCA1 dans le muscle squelettique de souris par la technique du tranfert de type Western... 86
IV. 3. 5. Mesure de la concentration de Ca2+ intracellulaire... 87
IV. 3. 6. Histologie ... 89
IV. 3. 6. a. Colorations ... 89
IV. 3. 6. b. Coloration vitale par injection de Bleu Evans ... 89
IV. 3. 6. c. Immunohistochimie... 90
IV. 3. 7. Tests in vivo... 91
IV. 3. 7. a. Test du fil ... 91
IV. 3. 7. b. Rota-rod ... 92
IV. 4. Electromyographie... 92
IV. 4. 1. Tracé d'insertion et activité motrice spontanée... 93
IV. 4. 2. Courbe de recrutement ... 93
IV. 4. 3. Stimulation répétitive... 94
IV. 4. 4. Exercice de fatigabilité... 95
IV. 4. 5. Electromyographie à fibre unique... 96
V. DISCUSSION ET CONCLUSION GENERALE... 98
V. 1. Production de souris déficientes pour le gène Ncx1... 98
V. 2. Production et analyses des souris déficientes pour le gène Ncx3... 99
VI. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES... 106
V. ANNEXES... 125
V. 1. Publications... 125
V. 2. Communications orales... 126
V. 3. Communications écrites... 127
V. 4. Curriculum vitae... 128
V. 5. Thèse annexe (résumé)... 129
LISTE DES ABREVIATIONS
AAs: acides aminés
ACh: acétylcholine
AChR: récepteur à l'acétylcholine ADN: acide désoxyribonucléique ADNc: ADN complémentaire ARN: acide ribonucléique
ARNm: ARN messager
ARN polyA: ARN polyadénylé
ATP: adénosine 5'-triphosphate ATPase: adénosine 5'-triphosphatase
bp: paire de bases
CAM: calmoduline
Ca2+ER ou Ca2+SR: calcium du réticulum endoplasmique ou sarcoplasmique Ca2+i: calcium intracytoplasmique
Ca2+o : calcium extracellulaire
[Ca2+]i: concentration en calcium intracytoplasmique [Ca2+]o: concentration en calcium extracellulaire CD1: lignée de souris non-consanguine CD1 C57/6N: lignée de souris consanguine C57BL/6N
CK: créatine phosphokinase
CMAP: Compound Muscle Action Potential DMSO: diméthylsulfoxide
EBD: Bleu Evans
Em: potentiel d'action membranaire
ECa: potentiel d'équilibre pour le Ca2+
ENa: potentiel d'équilibre pour le Na+ ENa/Ca: potentiel de l'échangeur Na/Ca
ER: réticulum endoplasmique
ES: cellules souches embryonnaires FDB: Flexor digitorum brevis
FBS: Sérum fœtal Bovin
FITC: fluorescéine
G418: généticine
HCG (chorulon): hormone gonadotrophine chorionique HPRT: Hypoxanthine phosphoribosyltransférase IC50: concentration inhibitrice à 50%
Ins(1,4,5)P3: inositol 1, 4, 5-triphosphate
InsP3R: récepteur de l'inositol 1, 4, 5-triphosphate IPTG: isopropylthio-β−D-galactoside
kD: kilo Dalton
Ki: constante d'inhibition K1/2: constante d'affinité
LEMS: syndrome myasthénique de Lambert-Eaton LIF: Leukemia Inhibitory Factor
MCD: Mean Consecutive Discharge
MG: Myasthenia gravis
MuSK: tyrosine kinase musculaire Na+i: sodium intracellulaire Na+o: sodium extracellulaire
[Na+]i: concentration en sodium intracytoplasmique [Na+]o: concentration en sodium extracellulaire Na/Ca: sodium/calcium
NCX: échangeur Na/Ca
NHS: sérum normal de cheval NMDG: N-méthyl-D-glucamine NMJ: jonction neuromusculaire
NO: oxyde nitrique
PBS: tampon phosphate salin
PCR: réaction de polymérisation en chaîne PEF: fibroblastes embryonnaires de souris
PI: iodure de propidium
PIP2: phosphatidylinositol biphosphate PKA: protéine kinase A
PKC: protéine kinase C
PLC: phospholipase C
PMCA: Ca2+-ATPase membranaire
PMS (folligon): hormone chorionique de jument gestante PPM: potentiel de plaque motrice
PS: phosphatidylsérine
PtdIns(4,5)P2: phosphatidylinositol 4, 5 biphosphate (PIP2)
RH: recombinant homologue
RNase: ribonucléase A
ROC: canaux calciques récepteur-dépendant RyR: récepteur à la ryanodine
SCRP: protéine régulatrice cytosolique soluble SDS: dodécylsulfate de sodium
SEM: erreur standard de la moyenne
SERCA: Ca2+-ATPase du réticulum endo(sarco)plasmique SFAP: potentiel d'action d'une fibre unique
SFEMG: électromyographie à fibre unique (Single-Fiber
Electromyography) SNC: système nerveux central
SOC: canaux calciques stock-dépendant (Store Operated Channels) SR: réticulum sarcoplasmique
TBQ: 2,5-di(tert-butyl)-1,4-benzohydroquinone TBS: solution saline de Tris
TBS-TX: solution saline de Tris contenant du Triton X-100
TM: segment transmembranaire
Tp: troponine
Tris: 2-amino-2-(hydroxyméthyl)-1, 3-propanediol
TR: Texas red
VAChT: transporteur des vésicules d'acétylcholine VOC: canaux calciques potentiel-dépendant
Vs.: versus
WT: sauvage de l'anglais Wild-Type XIP: eXchange Inhibitory Peptide
X-Gal: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside
ABREVIATIONS DES ACIDES AMINES
A (Ala) alanine
C (Cys) cystéine
D (Asp) acide aspartique E (Glu) acide glutamique F (Phe) phénylalanine
G (Gly) glycine
H (His) histidine I (Ile) isoleucine
K (Lys) lysine
L (Leu) leucine M (Met) méthionine N (Asn) asparagine P (Pro) proline Q (Gln) glutamine
R (Arg) arginine
S (Ser) sérine
T (Thr) thréonine
V (Val) valine
Y (Tyr) tyrosine W (Trp) tryptophane
GLOSSAIRE
ALLELE
Désigne chacune des diverses formes possibles d'un gène. Les allèles occupent la même position (locus) sur des chromosomes homologues et gouvernent une même fonction CELLULES ES
Cellules souches embryonnaires totipotentes.
GENOTYPE
Ensemble du matériel génétique porté par un individu et représentant sa formule héréditaire.
LOCUS
Emplacement d'un gène sur un chromosome.
PHENOTYPE
Ensemble des caractères morphologiques et physiologiques observables chez un individu.
RECOMBINAISON HOMOLOGUE
Echange d'un brin d'ADN qui se conduit entre deux molécules dites homologues car leurs brins sont complémentaires.
SOURIS CHIMERE
Souris dont les tissus sont dérivés des cellules de l'embryon et des cellules ES agrégées.
SOURIS HETEROZYGOTES
Souris ayant deux allèles différents (deux versions) d'un même gène sur ses chromosomes homologues.
SOURIS HOMOZYGOTES
Souris possédant le même allèle (la même forme du gène) sur ses deux chromosomes homologues.
I. INTRODUCTION
I. 1. L’homéostasie calcique
L'ion calcium (Ca2+) est l'agent de signalisation cellulaire le plus versatile et universel du corps humain (1, 2). En effet, le Ca2+ joue un rôle de second messager intracellulaire dans de nombreux processus biologiques depuis la fertilisation jusqu'à la mort cellulaire, incluant entre autre la prolifération cellulaire, la contraction cardiaque et musculaire, la sécrétion d'hormones, la neurotransmission,…(1, 3)
L’homéostasie calcique est définie comme le maintien de la concentration en calcium intracytoplasmique [Ca2+]i à son niveau basal (10-100 nM). Dans ces conditions, les cellules sont quiescentes. Le Ca2+ extracellulaire qui entre dans la cellule, lors d’une dépolarisation membranaire par exemple, entraîne une augmentation de la quantité totale de Ca2+ intracellulaire. Lorsque la [Ca2+]i atteint la valeur de 500 à 1000 nM, les cellules sont activées et interviennent dans leur fonction particulière (Figure 1). Les cellules possèdent des protéines "senseur" comme la calmoduline (CAM) et la troponine C (TnC), qui détectent les élévations de la [Ca2+]i et transforment l'information en réponse cellulaire spécifique (4). Un des paradoxes de la signalisation calcique est que l'ion Ca2+ est un messager aussi bien pour la vie que pour la mort cellulaire: une élévation de la concentration [Ca2+]i est nécessaire pour que l’ion agisse comme signal, mais le maintien d'une concentration calcique élevée dans le cytoplasme pendant un temps prolongé est cytotoxique et peut causer la mort cellulaire par apoptose (5). Par conséquent, le maintien de l’homéostasie calcique nécessite la présence de systèmes d’expulsion du Ca2+ pour éviter une surcharge de l’ion divalent dans la cellule. Les signaux calciques sont donc très flexibles et hautement régulés.
Figure 1
Mécanismes de base de la signalisation du Ca2+ [adapté de Berridge et al., 1998.
(1) VOC, canaux calciques voltage-dépendant; (2) ROC, canaux calciques récepteur- dépendant ; (3) SOC pour canaux calciques stock-dépendant; (4) Récepteurs aux inositols triphosqhate; (5) Récepteurs à la ryanodine; (6) Signalisation de la phosphatidylinositol 3-OH kinase [PI(3)K].
Fertilisation Prolifération Sécrétion Métabolisme Contraction
Apoptose Mitochondrie
Réticulum Endoplasmique Neurotransmetteurs
Neurotransmetteurs
Métabolisme mitochondrial
anormal
↑↑Ca2+
↓↓ Ca2+
Vie cellulaire Mort cellulaire
I. 2. Mécanismes contrôlant l'entrée du Ca2+
Les cellules possèdent deux sources majeures de Ca2+: extracellulaire et intracellulaire.
Les stocks de Ca2+ intracellulaires sont localisés dans le réticulum endoplasmique (ER) ou sarcoplasmique (SR) et les mitochondries.
Les systèmes responsables de l'entrée du Ca2+ dans le cytoplasme incluent les canaux calciques membranaires et les canaux calciques intracellulaires (6).
I. 2. 1. Les canaux calciques membranaires
Il existe trois catégories de canaux calciques membranaires (Figure 1):
Canaux calciques voltage dépendants (VOC) présents essentiellement dans les cellules excitables comme les neurones et les cellules musculaires. Ils sont activés en réponse à une modification du potentiel de membrane (1, 2).
Canaux calciques récepteur-dépendant (ROC) présents essentiellement au niveau des neurones et des cellules musculaires lisses. Ils sont activés en réponse aux neurotransmetteurs (1, 2).
Canaux calciques stock-dépendant (SOC) sont abondants dans les cellules non excitables. Ils s’ouvrent lorsque les stocks internes du ER sont épuisés en Ca2+
(1, 2).
I. 2. 2. Les canaux calciques intracellulaires
Le Ca2+ du réticulum endoplasmique (Ca2+ER) est relargué par deux types de canaux (Figure 1):
Récepteurs à l'inositol triphosphate: l’inositol 1, 4, 5-triphosphate (Ins(1,4,5)P3) agit sur les récepteurs aux inositols (IP3R) du réticulum endoplasmique. En réponse à
l’action de différents agents (neurotransmetteurs, hormones), la phopholipase C (PLC) catalyse l'hydrolyse du phosphatidylinositol 4, 5 biphosphate (PtdIns(4,5)P2) en diacylglycérol et en Ins(1,4,5)P3 qui activera ses récepteurs au niveau du réticulum endoplasmique et entraînera le relargage de Ca2+ER (1, 2).
Récepteurs à la ryanodine: les récepteurs à la ryanodine (RyR) permettent le relargage du Ca2+ER spécifiquement dans les cellules excitables (1, 2). La ryanodine est un alcaloïde de Ryania speciosa, possédant des propriétés insecticides. Cet agent pharmacologique a permis de mettre en évidence l'existence de ces canaux dans le muscle squelettique. Trois types de récepteurs à la ryanodine sont connus: RyR1, l'isoforme musculaire; RyR2, l'isoforme cardiaque; RyR3, l'isoforme des cellules non musculaires. Différentes molécules endogènes (ATP, cAMP, cADP ribose, NO, calmoduline) sensibilisent les RyR (6).
I. 3. Protéines 'tampon'
Les cellules possèdent une grande variété de protéines (calmoduline, calrétinine, calbindine, parvalbumine…) qui lient le Ca2+ et contribuent soit à la progression du signal Ca2+, en agissant comme "senseur" qui perpétue le rôle messager du Ca2+, soit à l'inactivation de ce signal, en tamponnant le Ca2+ libre intracellulaire (7). Les protéines
"tampon" sont localisées aussi bien dans le cytoplasme que dans le ER ou le SR. Une notion importante en matière de Ca2+ intracellulaire est de savoir que dans le cytoplasme, les protéines lient le Ca2+ avec une grande affinité, alors que dans le ER les protéines (exemple la calséquestrine) ont une faible affinité pour cet ion (8). Le complexe [Ca2+/Protéine] doit être dissocié pour permettre la sortie du Ca2+ hors de la cellule via les différents mécanismes d'expulsion (7).
Figure 2
Différents modes de fonctionnement de l'échangeur Na/Ca
(A) Mode normal; (B) Mode inverse; (C) Echange Na/Na; (D) Echange Ca/Ca Mode EFFLUX de Ca2+
ou
MODE NORMAL
Mode INFLUX de Ca2+
ou
MODE INVERSE 3Na+
Ca2+
Ca2+
3Na+
EC IC EC IC
ECHANGE Na/Na ECHANGE Ca/Ca
3Na+
3Na+
Ca2+
Ca2+
EC IC EC IC
A. B.
C. D.
I. 4. Mécanismes contrôlant l'expulsion du Ca2+
Deux systèmes localisés dans la membrane plasmique sont responsables de l’expulsion du Ca2+ hors de la cellule: la Ca2+- ATPase de la membrane plasmique (9) et l’échangeur Na/Ca (NCX) (Figure 1) (10). Comme la concentration extracellulaire ([Ca2+]o) (1mM) est 10.000 fois supérieure à la [Ca2+]i basale (100 nM), le Ca2+
extracellulaire constitue une menace considérable et permanente pour la survie cellulaire (5). Pour survivre, la cellule doit être équipée de systèmes permettant l'expulsion rapide de quantités importantes de Ca2+ vers l'extérieur.
I. 4. 1. L'échangeur Na/Ca membranaire
L'échangeur Na/Ca est un mécanisme d'expulsion du Ca2+ particulièrement bien développé dans les cellules excitables comme les cellules cardiaques, les cellules musculaires, les neurones, et les cellules β−pancréatiques (11-13). Il a une faible affinité (Km > 3 µM) mais aussi une grande capacité (Vmax = 30 – 40 mM) pour l’ion divalent (14). Le gradient de concentration des ions Na+ de part et d’autre de la membrane plasmique, en association avec le potentiel membranaire, constituent la force motrice pour le transport du Ca2+. C'est l'entrée de Na+ dans la cellule selon un gradient électrochimique favorable, qui fournit l'énergie au transport du Ca2+ vers l'extérieur de la cellule. En mode nomal (ou mode sortant), l’échangeur expulse un ion Ca2+ hors de la cellule en échange de l’entrée de 3 ions Na+ (Figure 2A). Le transport est par ailleurs réversible, et sous certaines conditions, l’échangeur peut fonctionner en mode inverse (ou mode entrant) (Figure 2B) (12, 15). De plus, l’échangeur Na/Ca peut aussi effectuer des échanges Ca2+/Ca2+ ou Na+/Na+ (Figure 2C & 2D).
I. 4. 2. Les Ca2+-ATPases
Deux familles de Ca2+-ATPases sont présentes dans la cellule: les Ca2+-ATPases membranaires (PMCAs) et les Ca2+-ATPases du reticulum endo/sarcoplasmique (SERCAs). Les Ca2+-ATPases utilisent l'énergie sous forme d'ATP pour permettre l'expulsion du Ca2+ du cytoplasme contre son gradient électrochimique (9, 16). La PMCA a une haute affinité (Km ~ 0.5 µM) mais une faible capacité pour le Ca2+ et joue donc un rôle important dans le maintien de la [Ca2+]i autour de la concentration basale dans la cellule au repos (7, 16, 17).
I. 5. Caractéristiques moléculaires de l'échangeur Na/Ca membranaire
I. 5. 1. Clonage et localisation chromosomique de l'échangeur Na/Ca
L'échangeur Na/Ca a été identifié pour la première fois dans le muscle cardiaque à la fin des années soixante (18, 19). En 1990, l'échangeur de type I (NCX1) fut le premier échangeur Na/Ca à être purifié à partir du cœur de chien (20). Son ADNc fut ensuite cloné et séquencé (20, 21). Depuis, l'ARNm de NCX1 (~ 7 kb) a été localisé dans beaucoup d’autres tissus et cellules comme le muscle lisse, le muscle squelettique, les neurones et les cellules β-pancréatiques (11, 13, 22-26) et ce pour une large variété d’espèces allant de la drosophile, à l'homme (27, 28). En 1994 et 1996, deux autres gènes codant pour 2 échangeurs similaires ont été identifiés chez le rat: il s'agit de NCX2 (29), et NCX3 (30). Les transcrits de NCX2 (~ 5 kb) et de NCX3 (~ 6 kb) ont été localisés uniquement au niveau du cerveau et du muscle squelettique (30-33). La comparaison des séquences protéiques des trois isoformes de rat (NCX1, NCX2 et NCX3) révèle une forte identité de séquence: chez le rat, NCX1 présente 68% d'identité avec NCX2 et 73% d'identité avec NCX3, et NCX2 présente 75% d'identité avec NCX3
A.
B.
Figure 3
Organisation exon-intron du gène NCX1 et de la partie centrale des gènes NCX2 et NCX3
(A) Les exons sont représentés par des boîtes et les introns par des lignes de connexion. Ni les introns, ni les exons ne sont dessinés à l’échelle. Les exons de NCX1 sont numérotés de 1 à 12. Les portions d’exons codant pour des régions non traduites sont hachurées.
(B) Les exons de NCX2 et NCX3 sont illustrés avec les mêmes numéros* que leurs homologues pour NCX1 de manière à simplifier la comparaison des 3 isoformes.
exons 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 NCX1
exons 3* 4* 5* X 9* 10* NCX2
NCX3
(30).
Ce n’est qu’en 2002 que l’ADNc humain de NCX3 a été cloné (34). Chez l’homme, les trois gènes (Slc8a1, Slc8a2, et Slc8a3) qui codent pour les isoformes hautement conservées NCX1, NCX2, et NCX3 ont été identifiés comme membres des gènes transporteurs "Slc" de la sous-famille 8 "solute carrier 8, Slc8a". Leurs gènes ont été respectivement assignés aux chromosomes humains 2 (2p22-23), 19 (19q13.2) et 14 (14q24.2) (30). Les gènes murins (Ncx1, Ncx2 et Ncx3) correspondants sont respectivement situés sur les chromosomes 17, 7 et 12 (30).
I. 5. 2. Epissage alternatif des échangeurs et distribution tissulaire de leurs variants d’épissage
Le gène NCX1 se compose de 12 exons (Figure 3A). L'existence d'un épissage alternatif dans les transcrits de NCX1 a été suggérée par Kofuji et al. (35). Une diversité d'isoformes, dénommées NCX11.1, NCX1.2, …, NCX1.n, est ainsi générée par l'épissage alternatif des transcrits de NCX1 (Tableau 1) (21, 27, 35, 35-39).
L'organisation génomique du gène NCX1 comprend dans la zone d'épissage six exons (exons 3, 4, 5, 6, 7, et 8 - aussi désignés A, B, C, D, E, et F respectivement). Les exons A et B étant mutuellement exclusifs. Les ARNm matures contenant l’exon A sont exprimés uniquement dans le coeur, le cerveau, la rétine et le muscle squelettique. Les ARNm matures contenant l’exon B sont exprimés abondamment dans les cellules non excitables avec comme profil prédominant d’épissage les combinaisons BD et BDF.
Les gènes NCX2 et NCX3 ne possèdent pas les exons 6, 7 et 8 (Figure 3B) (31).
Aucun épissage alternatif dans les transcrits de NCX2 n’a été observé (29, 31). Pour NCX3 et contrairement à NCX1, ce sont les ARNm matures contenant l’exon B qui sont exprimés dans le cerveau (Tableau 1).
Tableau 1 Expression tissu-spécifique des isoformes de l'échangeur Na/Ca. Leur terminologie est basée sur la désignation des isoformes NCXs suivie par un numéro indiquant le variant d’épissage(30-32, 32, 33).
Isoformes et variants d’épissage Gènes NCX1 NCX2NCX3 Variants d’épisage 1. 1 1. 2 1. 3 1. 4 1. 5 1. 6 1. 7 1. 8 1. 9 1. 10 1. 11 1. 12 2. 1 3. 1 3. 2 Tissus Exons ACDEF BCDBDADADFACDBDFACDE BDEBDEFBCDEFADEFAC ACB Cœur + + Cerveau + + + + + + Yeux (rétine) + + + + Thymus + + Muscle squelettique + + + + + + + Intestin grêle + + Colon + + Foie + + Pancréas + + Rate + + Poumons + + Glandes surrénales + + Testicules + +
Figure 4
Topologie membranaire de l'échangeur Na/Ca
(A) Première modélisation [Adaptée de Philipson et al., 1996]: les rectangles jaunes représentent les segments transmembranaires (TMs), les zones ombrées en rouge illustrent les similarités de séquences, motifs α, au niveau des régions TM2 et TM3, et des régions de TM8 et TM9. La boucle intracytoplasmique contient diverses régions régulatrices incluant le site d’inactivation du Na+i ourégion XIP (rectangle gris), le site potentiel de phosphorylation (en bleu), le site d'activation du Ca2+ (rectangle rouge), la région variable de 110 AAs (rectangle vert).
(B) Modélisation actuelle [Adaptée de Shigekawa et Iwamoto, 2001]
I. 5. 3. Topologie membranaire de l'échangeur Na/Ca
L'échangeur Na/Ca de type I (NCX1) a un cadre de lecture ouverte de 2910 paires de bases codant pour une protéine de 970 acides aminés, de poids moléculaire théorique de 110 kDa (20).
Les premières analyses d'hydrophobicité de la protéine (20) prédisaient un modèle de topologie membranaire de l'échangeur Na/Ca avec 11 segments hydrophobes transmembranaires (5 dans la portion NH2-terminale et 6 dans la portion COOH- terminale), un segment NH2-terminal extracellulaire et la portion COOH-terminale intracytoplasmique. Une large boucle hydrophile intracytoplasmique (~ 550 acides aminés) contribuant à la régulation de la protéine sépare les segments transmembranaires TM5 et TM6 (Figure 4A).
Cette boucle contient:
• un site d'inactivation par le Na+i qui se situeau niveau de la région de 20 acides aminés (AAs) riche en résidus basiques et hydrophobes (AAs 251-270) dont la séquence a été identifiée et correspond au peptide "XIP" ("eXchange Inhibitory Peptide") (chapitre I. 7. 3.)
• un site potentiel de phosphorylation
• un site d'activation par le Ca2+ (AAs 445-455)
• une région variable de 110 acides aminés
Deux domaines hydrophobes partageant un motif conservé désigné α sont importants pour la liaison et le transport des ions. Le site transporteur α1 se situe entre les segments transmembranaires TM2 et TM3. Le site transporteur α2 se situe entre les segments transmembranaires TM8 et TM9. Dans ce premier modèle, les sites α 1 et α 2 étaient extracellulaires (20, 40, 41).
Figure 5
Illustration des changements conformationels de l’échangeur Na/Ca induit par le Ca2+i [Schémas originaux, Saba et al., 2001]
(A) En absence de ligand, le domaine XIP endogène (AAs 251-270) est lié à son domaine de liaison. (B) Le Ca2+i est lié à son domaine de régulation chargé négativement (AAs 445-455), et provoque un changement de conformation de la protéine qui lève l’interaction du domaine XIP avec son site de liaison.
A
B
Des études plus récentes de mutagenèse et d'hydrophobicité (42-44) ont démontré que l'échangeur n'était constitué que de 9 segments transmembranaires (4 segments au lieu de 6 dans la portion COOH-terminale) et que le site transporteur d'ions α2 entre les segments TM8 et TM9 était intracytoplasmique et non extracellulaire (Figure 4B).
I. 6. Régulation de l'échangeur Na/Ca
L’activité de cet échangeur peut être régulée par de nombreux facteurs extra- et intracellulaires (tableau ci-dessous) incluant le Ca2+i, le Na+i, la phosphorylation, et le pH (45-48).
I. 6. 1. Régulation dépendante du Ca2+i
Différents laboratoires ont étudié la régulation Ca2+i -dépendante grâce à la technique du patch géant sur cellules cardiaques. Leurs résultats ont montré que la constante d’affinité pour l’activation Ca2+i -dépendante était comprise entre 0.1 et 0.4 µM (49-52).
Au cours de la régulation Ca2+i -dépendante, le Ca2+i se lie à un site à haute affinité situé dans la boucle intracytoplasmique (AAs 445-455), site qui est donc différent des sites transporteurs d’ions (Figure 5A).
Des études de mutagenèse dirigée ont montré qu’une délétion de 440 acides aminés au niveau la boucle intracytoplasmique inhibe totalement la régulation Ca2+i –
Activation Inhibition
Ca2+i (site de régulation K1/2 0.022 – 0.4 µM) Na+i (inactivation Na+-dépendante)
Phosphorylation (ATP, PIP2,…) Protons
Figure 6
Modèle simplifié du cycle de transport de l’échangeur Na/Ca cardiaque adapté de Shigekawa et Iwamoto, 2001.
E1 et E2 représentent les sites de transport intracellulaire (IC) et extracellulaire (EC). L’activité de l’échangeur est régulée par les concentrations intracellulaire de [Na+]i et de [Ca2+]i, l’affinité (K1/2) pour le [Ca2+]i est ~ 200 fois plus grande que pour le [Ca2+]o , les affinités pour le [Na+]i et [Na+]o sont quasi identiques.
K1/2 ~ 87.5 mM K1/2 ~ 1.4 mM
K1/2 ~ 20 mM K1/2 ~ 6 µM
K1/2 ~ 0.3 µM
dépendante (50, 53). Une délétion moins importante (~ 124 acides aminés) produit le même effet (53). Des mutations au niveau des régions riches en acides aspartiques et glutamiques (AAs 445-455 et AAs 497-509) provoquent une diminution de l’affinité de la liaison du Ca2+i au niveau de la boucle intracytoplasmique et inhibe la régulation de l’échangeur par le Ca2+i (54).
Les changements conformationels de l'échangeur Na/Ca induits par le Ca2+i ont fait l’objet de la thèse de R. Saba dans notre laboratoire. Saba et al. ont pu démontrer, par la technique de spectroscopie infrarouge, qu’il existait bien des changements conformationnels Ca2+i –dépendant au niveau de la boucle intracytoplasmique de l’échangeur Na/Ca (Figure 5B) (42, 55). L’importance des changements de conformation induits par la liaison du Ca2+i constitue probablement un des événements les plus cruciaux dans la régulation de cet échangeur. De plus, il semble que ces changements soient directement en relation avec l’inactivation Na+i –dépendante et l’inhibition liée au pH. Des expériences suggèrent aussi que ces changements de conformation puissent être la cible de régulation métabolique via l’ATP (55).
I. 6. 2. Inactivation dépendante du Na+
L’inactivation du courant de l’échangeur Na/Ca par le Na+i a été observée par la technique du patch géant sur cellules cardiaques par Hilgemann et al. (56, 57). La modélisation de l'échange Na/Ca montre que, lorsque 3 ions Na+ ont été initialement chargés à l’intérieur du transporteur, l’échangeur peut soit transporter le Na+ à travers la membrane plasmique et les faire sortir de la cellule, soit entrer dans un état inactivé (I1) (Figure 6) (51, 58).
Des expériences de mutagenèse dirigée suggèrent que la région XIP de l’échangeur Na/Ca est impliquée dans le processus d’inactivation Na+i –dépendant (59).
Figure 7
Potentiel d'action ventriculaire, d'après Bers, 2002.
Potentiel d'action typique (Em) et variation de la [Ca2+]i au cours du potentiel d'action ENa/Ca = 3 ENa – 2 ECa quand ENa et ECa sont au potentiels d'équilibre pour le Na+ et le Ca2+
INa/Ca = k {([Na+]3i [Ca2+]o exp(rEmF/RT) - {[Na+]3o [Ca2+]i exp(-(1 – r) EmF/RT)}
ENa/Ca = potentiel de l'échangeur Na/Ca; ENa= potentiel d'équilibre pour le Na+;ECa = potentiel d'équilibre pour le Ca2+; INa/Ca= courant de l'échangeur Na/Ca.
