Production et analyses des souris déficientes pour le gène Ncx3

Ncx1^-/- décèdent entre le neuvième et le dixième jour de la vie embryonnaire suite à l'absence de battement cardiaque. De plus, l'analyse histologique des cardiomyocytes isolés à partir de ces embryons a révèlé la présence d'altérations morphologiques typiques de l'apoptose, comme par exemple la condensation des noyaux cellulaires (127).

L‘analyse phénotypique des souris déficientes pour le gène Ncx1 n'a donc pu être réalisée à l'âge adulte étant donné que les souris Ncx1^-/- ne sont pas viables. Cependant, les souris Ncx1 hétérozygotes (Ncx1^+/-) pourront servir de modèle pour étudier notamment le rôle physiologique de l'échangeur Na/Ca dans la sécrétion d'insuline et la protection de la cellule β pancréatique contre l'apoptose. En effet, Herchuelz et al. ont récemment montré que la surexpression de NCX1 dans des cellules tumorales sécrétrices d'insuline entraînait la mort cellulaire par apoptose (154-156).

Afin d'étudier la fonction biologique de NCX1 dans la régulation de l'homéostasie calcique et la sécrétion d'insuline, nous envisageons d'effectuer des mesures de la concentration de Ca²⁺ intracellulaire et de la sécrétion d'insuline en réponse à différents agents sécrétagogues sur des îlots de pancréas isolés à partir de souris Ncx1^+/-.

V. 2. Production et analyses des souris déficientes pour le gène Ncx3

Ncx3 est la troisième isoforme de l'échangeur Na/Ca à avoir été clonée.

L'expression de l'échangeur Na/Ca de type III semble être limitée au muscle squelettique et au cerveau. Cependant, son rôle physiologique est toujours inconnu à ce jour en raison du manque d'inhibiteurs spécifiques.

Afin d'identifier le rôle joué par l'échangeur Na/Ca de type III (Ncx3) dans le muscle squelettique, nous avons inactivé ce gène chez la souris.

Après avoir cloné l’exon 2 du gène murin codant pour cet échangeur Na/Ca (Sokolow, S. et al., Genbank:AF321404), nous avons produit des souris déficientes pour le gène Ncx3 (Ncx3^-/-) en utilisant la technique classique d'inactivation d'un gène (215). Les souris Ncx3^-/- sont viables, grandissent et se reproduisent normalement.

Nos analyses immunologiques de type "Western" ont confirmé l'absence complète d' immunoréactivité de NCX3 dans le muscle squelettique des souris Ncx3^-/-. Par cette technique, nous avons montré que d'autres mécanismes d'expulsion du Ca2+ comme NCX1 et la PMCA1 ont le même niveau d'expression dans le muscle squelettique de souris Ncx3^-/- et Ncx3^+/+, indiquant l'absence apparente de processus compensatoire en réponse au défaut total de NCX3.

L'expression de NCX3 dans les fibres musculaires de rat a été décrite par Fraysse et al. (24). Ces auteurs ont suggéré que l'expression de NCX3 était importante dans les fibres glycolytiques rapides (IIb) et qu'elle l'était moins dans les autres types de fibres musculaires (I et IIa). Ils ont également montré que NCX1 était très abondant dans les fibres de type IIa et peu dans les fibres de type IIb chez le rat. Cependant, il n'existe aucune étude concernant l'expression de NCX3 au niveau de la jonction neuromusculaire. Dès lors, nous avons choisi d'investiguer l'expression de NCX3 au niveau de la plaque motrice. Nos images obtenues en immunofluorescence montrent que NCX3 est présent non seulement au niveau de la membrane sarcoplasmique et du sarcoplasme des fibres musculaires mais aussi au niveau des faisceaux nerveux et de la jonction neuromusculaire.

Afin d'étudier le rôle joué par NCX3 dans la régulation de l'homéostasie calcique, nous avons étudié l'activité calcique de fibres musculaires isolées du Flexor digitorum brevis.

En absence de Na⁺ extracellulaire, nous avons observé une absence complète d'activité échangeuse (mode inverse) dans les fibres musculaires des souris Ncx3^-/-alors qu'en présence de caféine et de TBQ, une activité échangeuse résiduelle, liée à la

présence de NCX1, est présente et est inhibée lors du remplacement du Na⁺

extracellulaire par la NMDG. La raison pour laquelle, aucune activité échangeuse n'est

mesurée en mode inverse dans les fibres de souris Ncx3^-/- alors qu'une activité

échangeuse en mode normale reste opérationnelle, n'est pas claire. Ces résultats pourraient indiquer que dans les fibres musculaires squelettiques, NCX3 est l'isoforme fonctionnelle prédominante en mode inverse et que NCX1 montre une forte dépendance vis-à-vis de la [Ca²⁺]i, étant ainsi inactif en conditions basales (mode inverse) et opérationnel aux [Ca²⁺]i élevées (en présence de caféine et de TBQ).

D'autre part, il faut noter que l'activité échangeuse (mode inverse) observée dans les fibres musculaires squelettiques de souris Ncx3^+/+ est relativement faible (7 ± 3 nM) ce qui à nouveau, pourrait être dû à une sensibilité faible de l'échangeur NCX3 au Ca²⁺i, la [Ca²⁺]i basale étant très basse (~50 nM).

Nos résultats montrent pour la première fois, la contribution de NCX3 dans les mécanismes d'expulsion du Ca2+

i dans la fibre musculaire squelettique adulte.

Afin d'étudier les conséquences de l'inactivation de Ncx3 in vivo, nous avons analysé des coupes histologiques de gastrocnemius de souris Ncx3^-/- et mis au point différentes techniques d'électromyographie chez la souris.

Nos observations histologiques ont révélé la présence d'altérations pathologiques des fibres musculaires, comme des foyers de fibres nécrotiques et des infiltrats de cellules mononucléaires. Le processus de nécrose pourrait être liée à l'activation de certaines protéases suite à l'élévation de la [Ca²⁺]i dans les fibres musculaires déficientes en NCX3. Le pourcentage de fibres lésées dans le muscle gastrocnémien de souris

Ncx3^-/- est peut être lié à la composition en fibres de ce muscle. En effet, ce muscle est composé de 15% de fibres de type I, 20% de IIa, 45% de IIb; et 20% de IIx (216). Des études de spécificité d'expression de NCX3 dans les différents types de fibres musculaires s'avèrent donc nécessaires pour l'interprétation complète de ces résultats. Par ailleurs, le nombre d'ions Ca2+ transportés par l'échangeur Na/Ca dans les fibres musculaires squelettiques est 30 fois inférieur à celui de l'échangeur cardiaque (217). Donc, contrairement au muscle cardiaque où l'absence de NCX1 entraîne le décès des embryons suite à l'apoptose des cardiomyocytes (127), il est possible que l'absence de NCX3 dans le muscle squelettique des souris Ncx3^-/- s'avère moins importante pour la fonction et la régulation de l'homéostasie calcique de ce tissu.

Il faut également remarquer qu'aucune fibre musculaire de souris Ncx3^-/- ne présentait des noyaux centraux , ce qui est le signe d'une régénération altérée des fibres musculaires lésées dans la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Ces anomalies de localisation nucléaire sont caractéristiques de la présence de cellules satellites qui constituent le support de la régénération de la fibre musculaire, processus au cours duquel elles fusionnent entre elles pour former des myotubes multinucléés (165). Dans la DMD, les fibres nécrosées sont partiellement remplacées par régénération à partir des cellules satellites. Ce processus de régénération étant altéré dans la DMD, la dégénération excessive du muscle entraîne finalement la perte progressive des fibres musculaires et leur remplacement par du tissu fibreux et des infiltrats graisseux (218).

Figure 29

Mécanismes proposés pour le contrôle de l'homéostasie calcique lors de la transmission synaptique de la jonction neuromusculaire

(A) Principales étapes intervenant lors de la dépolarisation de la terminaison nerveuse: (a) ouverture des canaux calciques voltage-dépendant et entrée du Ca2+; (b) inversion de l'échangeur Na/Ca et entrée du Ca2+; (c) libération de l'ACh; (d) liaison de l'ACh sur ses récepteurs.

(B) Principales étapes lors de la repolarisation de la terminaison nerveuse: (a) le Ca2+ entré dans les terminaisons nerveuses suite à l'ouverture des canaux calciques voltage-dépendant est expulsé via (a) la PMCA et (b) NCX3. Na+ Ca2+ NCX3 Na+ Ca2+ NCX3 a b B. Na+ Ca2+ NCX3 Na+ Ca2+ NCX3 a c d b A.

Nos observations cliniques animales montrent un électromyogramme anormal du muscle gastrocnémien de souris Ncx3^-/-, révélant une affection neuromusculaire pré- et post- synaptique caractérisée par (i) la petitesse de l'amplitude de la réponse M au repos, (ii) le décrément après stimulation répétitive à basse fréquence, (iii) l'incrément après stimulation répétitive à haute fréquence et (iv) la facilitation post-exercice (166, 185, 186). De plus, l'électromyographie à fibre unique chez les souris Ncx3^-/- a révélé une MCD anormalement élevée, des blocages anormaux de la transmission neuromusculaire et une amélioration de la MCD après stimulation à haute fréquence. L'ensemble de ces anomalies éléctromyographiques sont les caractéristiques du syndrome Myasthénique de Lambert-Eaton (211-213). Nos observations sont donc suggestives de l'implication possible de l'échangeur Na/Ca de type III dans la pathogenèse de ce syndrome, ce qui pourrait avoir des implications dans la connaissance de la physiopathologie de cette maladie.

Sur base des résultats observés chez les souris Ncx3^-/-, nous suggérons que NCX3 puisse participer à la régulation de l'homéostasie calcique et par conséquent au contrôle de la libération des vésicules d'acétylcholine au niveau des terminaisons pré-synaptique de la jonction neuromusculaire (Figure 29A-B).

En effet, dans les terminaisons nerveuses, le relargage de l'acétylcholine est régulée par l'entrée du Ca²⁺ induite par la dépolarisation membranaire (219). D'après Blaustein et al., l'échangeur Na/Ca pourrait s'inverser au cours de la dépolarisation et contribuer à l'entrée de Ca²⁺ dans les cellules nerveuses (11, 26). Nous proposons que l'absence de NCX3 chez les souris Ncx3^-/- contribue à diminuer l'influx calcique dans les terminaisons nerveuses, le relargage de neurotransmetteurs et l'amplitude du potentiel d'action musculaires, et favorise le décrément de la réponse observé après stimulation répétitive à basse fréquence. Par contre, durant la repolarisation, l'absence d'activité

échangeuse en mode normal dans les terminaisons nerveuses des souris Ncx3^-/- pourrait conduire à une accumulation progressive du Ca²⁺ résiduel au niveau des terminaisons pré-synaptiques. Il en résulterait une élévation de la quantité de neurotransmetteurs relargués au niveau de la fente synaptique, expliquant ainsi l'incrément et la facilitation post-exercice observé après stimulation axonale répétitive à haute fréquence chez les souris Ncx3^-/-.

Finalement, pour déterminer le rôle de l'inactivation de Ncx3 dans la faiblesse et la fatigue musculaire, nous avons réalisé les tests du fil et du Rota-rod sur les souris

Ncx3-/-. Ces tests comportementaux ont permis de détecter un épuisement et une

faiblesse musculaire accrus à l'effort chez les souris Ncx3^-/-. Cependant, NCX3 étant aussi exprimé dans le cerveau, nous n'excluons pas une composante centrale aux effets observés.

En conclusion, nos travaux ont permis d'élucider de façon partielle le rôle fonctionnel de NCX3 dans la fibre musculaire squelettique et de générer un modèle murin qui, par certains aspects, ressemble au syndrome myasthénique de Lambert-Eaton.

Comme perspectives de ce travail, nous envisageons de rechercher la présence d'anticorps dirigés contre NCX3 dans des sérums de patients atteints du LEMS afin de valider ou non notre hypothèse selon laquelle NCX3 pourrait jouer un rôle dans la pathogenèse du LEMS. Si c'est le cas, NCX3 constituerait alors une nouvelle cible antigénique du système immunitaire des patients présentant ce syndrome, à côté des canaux calciques potentiel-dépendant de type P/Q.

Par ailleurs, les souris déficientes pour Ncx3 seront croisées avec les souris

hétérozygotes pour Ncx1 et nous regarderons si le phénotype obtenu au niveau

musculaire est plus important que celui observé chez des souris déficientes uniquement pour Ncx3.

Finalement, nous envisageons d'analyser les conséquences de l'inactivation de

Ncx3 au niveau du système nerveux central par des techniques d'histologie,