Matériel et Méthodes
1. Génération de souris génétiquement invalidées pour le gène P2Y13... 76
1.1 Le vecteur de ciblage... 76
1.2 Transfection des cellules ES et sélection des clones ES P2Y13+/- ... 77
1.3 Génération de chimères et obtention des souris P2Y13+/- ... 77
2. Analyse de l’ADN génomique (génotypage) ... 78
2.1 Extraction de l’ADN génomique... 78
2.2 Digestion de l’ADN génomique... 78
2.3 Séparation de l’ADN en gel d’agarose... 79
2.4 Transfert de type Southern Blotting ... 79
2.4.1 Préparation d’une sonde radioactive ... 79
2.4.2 Hybridation de la membrane ... 80
2.4.3 Réaction de polymérisation en chaîne (PCR)... 80
3. Manipulation de l’ARN... 81
3.1 Extraction de l’ARN... 81
3.2 Rétro-transcription ... 81
3.3 Micro-array... 81
4. Immunohistochimie... 82
5. Les animaux ... 82
6. Culture cellulaire ... 83
6.1 Culture des cellules ES... 83
6.2 Préparation et culture des PEF ... 83
6.3 Congélation des cellules... 83
6.4 Purification des cellules dendritiques spléniques (DC)... 84
6.5 Préparation des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse (BMDC)... 84
6.6 Purification des lymphocytes T... 84
6.7 Purification des lymphocytes B... 85
7. Analyse par cytométrie de flux ... 85
8. Mesure du calcium cytoplasmique ... 85
9. Dosage protéique par ELISA ... 86
10. Dosage d’AMPc ... 86
11. Dosage de l’activité arginase... 87
11. Dosage des nitrites ... 87
13. Dosage du glucose... 88
14. Expérimentations animales ... 88
14.1 Induction d’une réponse humorale ... 88
14.2 Induction d’un choc septique ... 88
14.3 Hépatite aigue... 88
14.4 Réaction d’hypersensibilité de contact (CHS) ... 89
14.5 Test à la formaline... 89
14.6 Migration des cellules de Langerhans ... 89
14.7 Test de tolérance au glucose... 89
15. Matériel ... 90
16. Analyses statistiques ... 90
1. Génération de souris génétiquement invalidées pour le gène P2Y
13La délétion totale ou partielle d’un gène particulier est rendue possible par l’utilisation d’un vecteur de ciblage (ou d’invalidation) qui, lorsqu’il est introduit dans des cellules souches embryonnaires (cellule ES), se recombine à un endroit spécifique du génome. Les cellules ES mutées sont introduites dans un embryon hôte qui se sera réimplanté dans l’utérus d’une femelle porteuse (pseudo gestante). Les souriceaux issus de cette manipulation sont appelés des chimères puisque une partie de leurs cellules sera issue de l’embryon hôte et l’autre partie des cellules ES mutées. Dans le cas où les cellules ES ont colonisé les gonades des chimères, elles pourront transmettre la mutation à leurs progénitures. Les différentes étapes de ce long processus sont décrites plus en détails ci-dessous (voir également figure 1 chapitre Résultat).
1.1 Le vecteur de ciblage
La première étape de l’invalidation génique est la construction d’un vecteur de ciblage. A cette fin, il est nécessaire de cloner les séquences correspondant au gène à invalider à partir d’une banque d’ADN génomique (ADNg). Ce travail, ainsi que la construction du vecteur d’invalidation ont été réalisés avant notre arrivée dans le laboratoire. Pour cette raison, ces étapes seront décrites brièvement.
Le vecteur est construit en flanquant de part et d’autre du gène de résistance à la néomycine (néomycine phosphotransférase) deux séquences identiques au locus d’intérêt. La recombinaison de ce vecteur d’invalidation avec la zone ciblée permet de remplacer un fragment de 1Kb, situé entre les sites de restriction AccI et XbaI, de l’allèle sauvage par la cassette de sélection. Cette construction permet d’éliminer le premier exon non codant ainsi que les 187 premières bases en 5’ de l’exon codant du gène P2Y13.
La recombinaison homologue du vecteur d’invalidation dans les cellules souches embryonnaires est mise en évidence par Southern Blotting (voir section 2.1) en clivant leur ADN génomique par l’enzyme EcoRI. Cette digestion génère un fragment de 4.9Kb, correspondant à l’allèle muté, détectable par une sonde (située entre les sites de restriction EcoRI et HindIII) externe au vecteur de ciblage. Cette même sonde permet de détecter un fragment de 6.0Kb qui correspondant à l’allèle sauvage.
1.2 Transfection des cellules ES et sélection des clones ES P2Y13+/-
Le vecteur de ciblage linéarisé est électroporé dans des cellules souches embryonnaires isolées à partir d’une souche de souris agouti (129\Sv). Ces cellules peuvent être maintenues totipotentes in vitro pour une durée de temps suffisante à notre objectif. Les cellules sont étalées de telle manière qu’elles forment des colonies isolées. Les clones de cellules ES qui ont intégré le vecteur ciblage dans leur génome sont sélectionnés sur un milieu contenant du G418 (un analogue de la néomycine). Les cellules qui auront intégré ce vecteur par insertion aléatoire dans leur génome constituent une large majorité. Comme décrit à la section 1.1, il nous est possible de distinguer ces colonies de celles qui ont intégrées le vecteur de ciblage par recombinaison homologue en analysant leur ADN génomique. Les clones résistants à l’antibiotique sont récoltés par repiquage, amplifiés puis congelés (voir section 5.3). Peu de temps avant leur utilisation, les cellules ES sont décongelées et à nouveau amplifiées dans les mêmes conditions mais sans le G418.
1.3 Génération de chimères et obtention des souris P2Y13+/-
Les femelles CD1 (lignée albinos de souris non consanguines), âgées de 3 semaines, destinées à produire des embryons sont injectées en i.p. avec 10U/mL de PMS afin induire la maturation d’un grand nombre d’ovules. Deux jours plus tard, elles sont injectées en i.p. avec 5U.I. d’HCG afin d’induire l’ovulation puis croisées avec des mâles CD1. Les femelles qui se sont accouplées sont identifiées grâce à la présence d’un bouchon vaginale laissé par le mâle.
Les embryons « receveurs » sont prélevés au stade morula (E2.5) en soufflant du milieu M2 (voir tableau 2) dans les cornes utérines à l’aide une aiguille. Les embryons récoltés sont traités avec une solution acide de tyrode afin de les débarrasser de leur membrane pellucide.
Les cellules ES destinées à être introduites dans les embryons sont décrochées des boîtes de culture par un léger traitement à la trypsine et mises en co-culture avec les embryons dépellucidés (environ 20 cellules ES par embryon) pendant une nuit dans une goutte de milieu M16 (voir tableau 2) recouverte d’huile de paraffine. Les cellules ES s’agrègent à l’embryon durant la co-culture. Les embryons qui ont atteint le stade blastula sont réimplantés, à l’aide d’un capillaire en verre, dans l’utérus de femelles pseudo gestantes (2.5 post coïtal). Les femelles qui se sont accouplées sont identifiées grâce à la présence d’un bouchon vaginal laissé par le mâle vasectomisé (ligature des canaux déférents). Si les femelles réimplantées n’ont pas mis bas au jour attendu (E19), les souriceaux sont libérés par césarienne et déposés au soin d’une femelle nourrice. Dans ces portées, les chimères sont aisément reconnaissables à leurs yeux noirs et/ou à leur pelage tacheté (ou agouti). Les souris chimériques sont croisées
avec des femelles CD1 afin d’obtenir des animaux hétérozygotes pour le gène P2Y13. Les souris P2Y13-/- sont obtenues par croisement des animaux héterozygotes P2Y13+/-. Afin de faciliter nos études, nous avons généré, par croisement successifs, des lignées congéniques P2Y13-/-
sur fond génétique C57BL\6 ou Balb\c.
2. Analyse de l’ADN génomique (génotypage)
Les cellules ES qui ont intégré le vecteur de ciblage dans leur génome par recombinaison homologue doivent être différenciées de celles qui l’ont intégré de manière aléatoire. Les souris issues des différents croisements doivent également être génotypées. Pour ce faire, nous disposons de plusieurs techniques qui peuvent être complémentaires : le Southern Blotting et la PCR.
2.1 Extraction de l’ADN génomique
Les cellules ES sont lysées dans le tampon I (SDS 1%, EDTA 1mM, Tris 10mM, pH 7.4) 1h à 37°C. Le lysat est traité 12 heures à 55°C par la protéinase K (1mg/mL). Les ADN sont extraits par précipitation des protéines par l’ajout de 37.5% (vol) d’une solution saturée en NaCl (>6M). Après une agitation vigoureuse (15 sec au vortex), les protéines sont éliminées par centrifugation (5min, 16000g à RT). L’ADN contenu dans le surnageant est alors précipité par de l’isopropanol (50%). L’ADN est récolté par centrifugation (16000g, 5min à 4°C) puis lavé par 2 fois par 1mL d’éthanol 70% maintenu à -20°C (centrifugation : 16000g, 5min à 4°C). Les culots d’ADN sont séchés au speed vacuum puis solubilisés dans 150µ L d’H2O.
L’ADNg des fragments de queues est obtenu par lyse du tissu dans la solution « Speedy » (Tris 50mM, KCl 50mM, EDTA 2.5mM, NP40 0.45%, Tween-20 0.45%, protéinase K 200µg/mL) pendant une nuit à 55°C. Les lysats sont vigoureusement agités (vortex) pendant 15sec puis centrifugés 1min à 1600g pour précipiter les débris cellulaires. Un µ L de ce lysat suffit à réaliser une PCR de génotypage. Il faut noter que ce traitement ne suffit pas pour obtenir de l’ADNg utilisable en Southern Blotting.
2.2 Digestion de l’ADN génomique
La digestion de l’ADNg est réalisée par 100U d’enzymes de restriction durant une nuit à la température et dans le tampon requis. L’ADN est précipité par une solution contenant du
NaCl 0.3M et de l’isopropanol (50%) après incubation 1h à -80°C. L’ADN est récolté par centrifugation (30min, 16000g à 4°C) puis lavé à l’éthanol 70% glacé. Les culots d’ADN sont séchés au speed vacuum et solubilisés dans 30µ L d’eau bidistillée.
2.3 Séparation de l’ADN en gel d’agarose
L’agarose est dissous dans une solution bouillante de TAE (Tris 40mM, acétate de sodium 20mM, EDTA 1mM, pH 8). Selon les applications, l’ADN est séparé en gel d’agarose 0.6%
(Southern Blotting), 1% (RT-PCR) ou 2% (génotypage par PCR). L’ADN est étiré sur le gel par électrophorèse dans le tampon TAE. L’ADN est visualisé sous U.V. après coloration au bromure d’éthidium.
2.4 Transfert de type Southern Blotting
Afin de réaliser le Southern Blotting, l’ADN contenu dans le gel d’agarose doit être transféré sur une membrane de nitrocellulose. Préalablement, le gel est traité 2 fois 10min à RT par une solution d’HCl 0.25M puis incubé 2 fois 30min à RT dans la solution neutralisation (NaOH 0.5M, NaCl 1.5M). Enfin, il est équilibré 2 fois 30min à RT dans la solution de transfert (NH4Ac 1M, NaOH 0.03M). Les membranes de nitrocellulose utilisées pour ce transfert doivent être hydratées 30min dans de l’eau puis équilibrée 30min dans la solution de transfert.
Le montage de transfert est réalisé de telle sorte que la solution de transfert, entraînée par la force de capillarité, traverse le gel d’agarose et emporte l’ADN vers la membrane de nitrocellulose. Après une nuit de transfert, la membrane contenant l’ADN est séchée sur table puis cuite 1h30 à 80°C.
2.4.1 Préparation d’une sonde radioactive
Pour préparer la sonde, il faut disposé d’un fragment d’ADN « modèle » que l’on dénature pour synthétiser des brins d’ADN complémentaires qui ont incorporés un nucléotide radio marqué. La réaction d’incorporation contient l’ADN « modèle » (50-100ng), du tampon Hepes 200mM, des nucléotides froid (dCTP, dGTP, dTTP 0.1mM chacun), de la BSA 80mg/mL, le dATP [α-32P] (10µCi/µL), des hexamères aléatoires (0.2µg/µ L) et le large fragment de Klenow (3.3U/µ L). Après 3h d’incubation à RT, la sonde est éluée (Tris 10mM, EDTA 1mM) sur une colonne d’exclusion (résine Sephadex G50 medium). La sélection des
fractions contenant la sonde se fait après comptage au Cerenkov (le premier pic de radioactivité correspond à la sonde et le second aux dATP-[α-32P] non incorporés).
2.4.2 Hybridation de la membrane
Après cuissons, la membrane de nitrocellulose est bloquée (saturée) dans la solution de pré- hybridation (formamide 40%, SSC 3X, Denharts, SDS 0.5%, ADN de sperme de hareng 20µg/mL) pendant 3h à 42°C. La sonde radioactive est dénaturée 5min à 100°C, refroidie sur glace puis ajoutée à cette même solution. L’hybridation se fait durant une nuit à 42°C sous agitation. La membrane est nettoyée dans différentes solutions de lavage (sous agitation):
2min à RT dans la solution 1 (SSCx2, SDS 0.1%) ; 20min dans la solution 1 en chauffant jusque 60°C ; 20min à 60°C dans la solution 1 et enfin 20min à 60°C dans la solution 2 (SSCx0.5, SDS 0.1%). La membrane est emballée dans du cellophane et exposée à un film autoradigraphique pendant au moins 6j à -80°C.
2.4.3 Réaction de polymérisation en chaîne (PCR)
Les PCR de génotypage sont réalisées sur 1µ L du lysat de queues (voir section 2.1). Le mélange réactionnel et la Taq polymérase ont été mis au point et sont produis par D. Fokan (IRIBHM, Gosselies). Les PCR « classiques » sont pratiquées sur l’appareil iCycler de Biorad. L’analyse de l’expression génique par PCR est réalisée sur 10-20ng d’ADNc en utilisant la Taq polymérase Qiagen. Les PCR quantitatives sont réalisées à l’aide du kit
« qPCR mastermix for Sybr Green I » (Eurogentec) sur l’appareil 7300 Real Time PCR Systems (Applied Biosystems). Le calcul des taux relatifs d’expression d’un ARN intérêt dans différents échantillons est basé sur la différence entre les Ct (Threshold Cycle) du gène d’intérêt et des gènes de normalisation (housekeeping gene) : Ratio = E1∆Ct
/ E2∆Ct
. E1 : efficience d’amplification du gène cible. E2 : efficience d’amplification des gènes de normalisation .Les amorces utilisées au cours de ce travail sont reprises dans le tableau 1. La spécificité des amorces utilisées en PCR quantitative est vérifiée sur gel d’agarose et en effectuant des courbes de dissociation sur les amplicons.
3. Manipulation de l’ARN
3.1 Extraction de l’ARN
Les tissus et les cellules sont homogénéisés dans du Tripure (Roche) à l’aide d’un homogénéisateur ou par pipetage, respectivement. L’ARN total est extrait en suivant les instructions du fabricant et re-suspendu dans de l’eau exempt de DNase et RNase. L’ARN utilisé dans les expériences de microarray est purifié sur colonne Qiagen. La pureté et la quantification des échantillons sont évaluées par spectrophotometrie (Nanodrop).
3.2 Rétro-transcription
Préalablement l’ARN est traité à la DNaseI (Fermentas). La rétro-transcription de l’ARN en ADNc est réalisée à l’aide du kit « RevertAid H Minus First Strand cDNA synthesis » (Fermentas). En routine, le traitement DNaseI est fait sur 1µg d’ARN. Une moitié est rétro transcrite en utilisant des hexamères aléatoires et l’autre moitié est employée comme contrôle RT-.
3.3 Micro-array
Les modifications de l’ARN et l’analyse des données sont réalisées par l’équipe du Dr F.
Libert (IRIBHM, ULB). L’ADNc est synthétisé à partir de 1µg d’ARN total ensuite l’ARN antisens contant le nucleotide modifié 5-(3-aminoallyl)-UTP est produit à l’aide du kit
« Amino Allyl MessageAmpTM II aRNA Amplification » (Ambion, Texas, USA). Après marquage avec le Cy3 ou le Cy5 (GE Healthcare Bio-Sciences, New Jersey, USA), les échantillons sont hybridés sur des lames MEEBO (Mouse Exonic Evidence Based Oligonucleotide, Stanford Functional Genomics Facility, California, USA). Les lames sont tapissées de 38 784 oligomères (70 bases) crées à partir de structures exoniques de locus génomiques. Les hybridations ont été réalisées en double par inversion des marquages (Cy3 et Cy5). Les lames ont été scannées à l’aide du « Molecular Devices 4000B laser scanner ». Les niveaux d’expression ont été quantifiés à l’aide du programme GenePix Pro 6.1 image (Axon Instruments, CA, USA). Les valeurs de fluorescence sont importées et analysées dans le programme Acuity 4.0 (Molecular Devices, Union City, CA, USA). Les gènes dont le log2- ratio normalisé est > 1, sont considérés comme étant modulés. Les régulations géniques sont confirmées par PCR quantitative sur 3-5 expériences indépendantes.
4. Immunohistochimie
Les tissus sont tissus sont fixés dans un fixateur sans formaldéhyde (Immunohistofix, APHASE) pendant 3j à 4°C. Les échantillons sont ensuite déshydratés par une série de bains d’éthanol de plus en plus concentrés (30%-50%-70%-90%-100%) pendant 30min chacun à RT. Les inclusions sont réalisées à 37°C au moyen de trois bains d’Immunohistowax (APHASE) pendant 20min. Les tissus sont alors enrobés dans l’Immunohistowax dans des moules en plastiques. Les blocs sont maintenus au moins une nuit à 4°C avant de couper les tissus enrobés en tranches de 3-5µm. Ces dernières sont immédiatement transférées sur des lames gélatinées. Après avoir laissé sécher les lames une nuit à RT, les coupes sont désenrobées par de l’acétone pendant 1-5min puis rincées dans du PBS. Les peroxydases endogènes sont inhibées par un traitement au H2O2 3% pendant 30-60min puis les lames sont rincées dans du PBS. Les sites de réactions non spécifiques sont saturés à l’aide du réactif bloquant 1% (Blocking Reagent, Roche) pendant 30min à RT. Les lames sont incubées avec les anticorps primaires (20-30µg/mL dans PBS + réactif bloquant 1%) pendant une nuit à 4°C puis sont rincées 3 fois dans du PBS. Les anticorps secondaires (anti-rabbit biot, Serotec, 1/100 dans PBS-RB) sont incubés 1h à RT puis rincés 3 fois dans du PBS. La présence d’anticorps sur les lames est révélée à l’aide du kit ABC (Vector). L’activité de la peroxydase est révélée par l’AEC (Sigma). Les lames sont montées en milieu Aquatex (Merck)
5. Les animaux
Les souris étudiées au niveau du système immunitaire sont élevées dans un environnement exempt de pathogène (animalerie SPF). La nourriture et la boisson sont fournies ad libitum sauf indication contraire.
La lignée congénique P2Y12-/- sur fond génétique C57BL\6 a été produite par le Dr. Conley (Portola Pharmaceuticals, San Francisco). Ces souris sont élevées dans notre animalerie SPF.
Les souris A2a-/- ont été générés par le Dr. Ledent (IRIBHM, ULB). Elles sont élevées dans l’animalerie conventionnelle du campus Erasme.
Les souris C57BL\6 et Balb\c sont pourvues par Charles River et sont maintenues au moins 1 semaine dans notre animalerie SPF avant qu’elles ne soient utilisées.
6. Culture cellulaire
Les cellules sont cultivées à 37°C dans une atmosphère saturée en humidité et contant 5% de CO2. La composition des différents milieux de cultures est reprise dans le tableau 2.
6.1 Culture des cellules ES
Les cellules ES destinées à générer des chimères sont maintenues totipotentes en les cultivant sur un tapis confluent de fibroblastes (PEF, voir section 6.2) et en présence de LIF 100U/mL (Leukemia Inhibitor Factor). Les cellules ES sont traitées à la trypsine et diluées tous les 2 jours.
Les cellules ES destinées à l’analyse de l’ADN sont simplement cultivées sur une surface gélatinée dans le même milieu de culture (voir tableau 2) mais sans fibroblastes ni LIF.
6.2 Préparation et culture des PEF
Les fibroblastes sont préparés à partir d’embryons (E13.5) porteurs du gène de résistance à la néomycine. Les fœtus sont décapités, vidées de toutes substances vascularisées (foie, cœur) puis émincées. Les morceaux sont dissociés à l’aide d’une pipette pasteur dans de la trypsine puis incubés 3min à 37°C. Cette opération est répétée 2ou 3 fois jusqu’à obtention d’une suspension cellulaire. Après lavage dans le milieu de culture (centrifugation à 300g pendant 5min) les cellules sont mises en culture pendant une nuit. Le lendemain, milieu de culture est changé afin d’éliminer les cellules en suspension. Dès que les PEF sont à confluence, elles sont décrochées par un traitement à la trypsine et congeler dans l’azote liquide (voir section 6.3). Lorsque les PEF sont utilisées comme cellules nourricières, elles sont préalablement traitées à la mitomycine (10µg/mL) pendant 2h à 37°C. Après lavage au PBS, ces cellules sont décrochées par un traitement à la trypsine et remise en culture dans des boîtes gélatinées (PBS/gélatine 0.1% pendant 1h 37°C).
6.3 Congélation des cellules
Les cellules sont congelées dans leur milieu de culture contenant du DMSO (10%). Avant d’être stockées dans l’azote liquide, elles sont incubées une nuit à -80°C dans une boîte de cryo congélation (Nalgene) contenant de l’isopropanol.
6.4 Purification des cellules dendritiques spléniques (DC)
Afin de récolter suffisamment de DC, des cellules tumorales B16 recombinantes qui expriment le Flt-3 ligand sont injectées en s.c. dans le flanc droit des souris (106 cellules/souris). Ce traitement permet d’amplifier le nombre de cellules dendritiques sans pour autant les activer. Quand la tumeur est bien développée (10-15j après l’injection), les souris sont sacrifiées par dislocation cervicale. Les rates sont prélevées stérilement, perfusées avec une solution de collagénase 100U/mL puis incubées 30min dans une solution de collagénase 400U/mL. Après ces traitements, les rates sont écrasées puis la suspension cellulaire est filtrée sur un voile (maillon de 140µm). Après centrifugation (6min, 200g à 4°C), les cellules sont re-suspendues dans 50µL de billes para-magnétiques couplées à l’anticorps anti-CD11c (Miltenyi Biotech) et incubées 15min à 4°C. Les cellules sont lavées dans le milieu de culture (voir tableau 2) et re-suspendues dans le tampon MACS (PBS, BSA 0.5%, EDTA 2mM, pH 7.4). La séparation des DC se fait par sélection positive sur colonne MACS (Miltenyi Biotech) en suivant les instructions du fabricant. La pureté des cellules est vérifiée par cytométrie de flux en utilisant le marqueur CD11c spécifique des DC.
6.5 Préparation des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse (BMDC)
Les tibias et fémurs des souris sont prélevés et dépiautés stérilement. La moelle osseuse est sortie des os en injectant du PBS à l’aide d’une seringue. Les cellules sont remises en suspension puis filtrées sur voile. Après centrifugation, elles sont comptées et mises à une concentration de 2.5x105 cellules/mL dans le milieu de culture adéquat (voir tableau 2). La différenciation des BMDC dure entre 9 et 14 jours. Le milieu culture est changé tous les 3 jours. L’état de différenciation de cellules est suivi par cytométrie de flux en utilisant le marqueur CD11c.
6.6 Purification des lymphocytes T
Les lymphocytes T sont purifiés à partir de la rate par sélection négative sur colonne MACS.
Les rates sont écrasées à l’aide d’un piston dans l’ACK (tampon de lyse des globules rouges ; Tris HCl 17mM, NH4Cl 144mM, pH 7.4) puis filtrées sur un voile. La lyse est stoppée en diluant l’ACK dans du milieu de culture. Après centrifugation (200g, 6min à 4°C), le culot est resuspendu dans un cocktail d’anticorps couplés à la biotine (anti-CD19, anti-CD11c, Ter119, anti-MHCII, LY6G, Pan Nk DX5) et incubé 30min à 4°C sous agitation (au tubula). Les cellules sont lavées puis le culot est re-suspendu dans 70µ L de billes para magnétiques
couplés à l’anticorps anti-biotine (Miltenyi Biotech) et incubé 30min à 4°C. Après lavage, les cellules sont re-suspendues dans le tampon MACS et passées sur colonne MACS. La fraction non retenue par la colonne aimantée contient les cellules d’intérêt. La pureté des lymphocytes T est vérifiée par cytométrie de flux en utilisant le marqueur CD3.
6.7 Purification des lymphocytes B
Les lymphocytes B sont purifiés à partir de la rate par sélection négative sur colonne MACS.
Le protocole est similaire à celui des LT avec deux modifications : le cocktail (anti-CD43, anti-CD11b et Ter119) est incubé 15min à 4°C sous agitation et le culot est resuspendu dans 50µ L de billes anti-biotine puis incubé 15min à 4°C. La pureté des lymphocytes B est vérifiée par cytométrie de flux en utilisant le marqueur IgM.
7. Analyse par cytométrie de flux
La pureté des cellules est mesurée par cytométrie de flux sur l’appareil Cytomics FC500 (Beckman Coulter). Les données sont analysées à l’aide d’un programme fourni par ce même fabricant. Les cellules sont marquées dans le milieu FACS (PBS, BSA 0.5%, NaN3 0.1%) pendant 20min à 4°C. Les anticorps utilisés au cours de ce travail sont couplés ou non à la biotine, au FITC ou au PE (Tableau 3). Les cellules sont lavées et éventuellement incubées 15min à 4°C avec la streptavidine PE/FITC puis de nouveau lavées.
8. Mesure du calcium cytoplasmique
Cette méthode est basée sur l’utilisation d’un indicateur fluorescent de calcium excitable à 488 nm. Lorsqu’il est lié au Ca2+, son pic d’émission se situe à 518 nm. Les cellules sont lavées 2 fois dans du HBSS (sans calcium) puis incubées dans le noir 30min à 37°C dans le milieu de charge (Fluo-4 5 µM, F-127 100 µg/mL, SPZ 250 µM, HBSS sans calcium). Les cellules sont lavées 2 fois puis re-suspendues à une concentration de 5x105 cellules/mL dans du milieu de culture contenant du SPZ (250 µM). Les mesures sont prises sur un cytomètre de flux (FACScan, Beckton Dickinson) en maintenant les cellules à 37°C. L’analyse des données est faite à l’aide du programme Winmdi (disponible gratuitement sur le site http://www.cyto.purdue.edu/flowcyt/software/Winmdi.htm). Les résultats sont exprimés en
« Ratio » de l’augmentation de fluorescence induite par le nucléotide sur celle induite par
l’ionomycine (300 ng/mL). La fluorescence basale (t1) est enregistrée pendant 30sec puis nous stimulons les cellules avec le nucléotide (t2) et finalement nous induisons une entrée massive du calcium extracellulaire à l’aide d’ionomycine (t3). Les temps t1 et t3 sont utilisés comme niveaux de référence pour calculer la réponse calcique. Le ratio s’obtient en faisant le rapport suivant : ratio = F(t3)-F(t2)/F(t3)-F(t1). Les résultats peuvent également être exprimés en concentration cytoplasmique de calcium à l’aide de l’équation de Tsien [Minta, 1989 #69] : [Ca2+]= Kd (F – Fmin)/ (Fmax- F). F : fluorescence. Fmin : fluorescence minimale (en l’absence totale de Ca2+). Fmax : fluorescence maximale (en présence d’ionomycine 300ng/mL). Kd : constante (fixée à 104).
9. Dosage protéique par ELISA
Les cytokines (IL-12p70, IL-23, IL-10, IL-6 et TNF-α) et les hormones (insuline et leptine) sont dosées à l’aide des kits commerciaux fournis par eBioscience et Linco, respectivement.
La quantification des anticorps anti-KLH dans les sera est réalisée sur des plaques à 96 puits tapissés durant une nuit avec un solution de KLH (5µg/mL, PBS). Les puits sont ensuite saturés 2h à 37°C
(BSA 1%, FCS 10%, Tween-20 0.05%). Les sérums sont dilués comme indiqué sur les graphiques et incubés pendant 2h à RT. Après lavages des puits, les anticorps secondaires (couplés à la peroxydase) dirigés contre les différents isotypes d’immunoglobulines (IgG1, IgG2a, IgM) de souris sont incubés 2h à RT. La présence d’anticorps secondaires dans les puits est révélée par le TMB (eBioscience) qui réagit avec la peroxydase. Les réactions sont stoppées par l’ajout d’H2SO4 (2N) puis la densité optique est mesurée à 450nm. Les immunoglobulines totales sont dosées de manière similaire mais en tapissant les puits avec des anticorps dirigés contre les Ig murines. Pour ces deux types d’ELISA, les résultats sont exprimés en densité optique (DO).
10. Dosage d’AMPc
Les cellules sont préincubées 30 min à 37°C dans le tampon KRH (NaCl 124 mM, KCl 5 mM, 1,25 mM, MgSO4 1,25 mM, CaCl2 1,45 mM, KH2PO4 1,25 mM, Hepes 25 mM, glucose 8 mM) en présence de rolipram 25 µM. Les antagonistes et inhibiteurs sont ajoutés 5 min avant la stimulation. La réaction est arrêtée par l’ajout d’HCl 100mM puis laissée sur table
pendant 20 min. Le lysat est séché au speed vacuum puis re-suspendu dans l’eau bidistillé.
L’AMPc est acétylé en présence de KOH 0.2 M et d’anhydride acétique 1/100 (vol) pendant 30 min à RT. La réaction est stoppée par l’ajout de tampon imidazole (imidazole 100mM, EDTA 1mM, pH 7) Cent µ L de cette réaction est incubé 18 h à 4°C en présence de 100µ L d’anticorps anti-AMPc acétylé (dilué dans le tampon acétate -100mM, pH 6- auquel est ajouté de la BSA 1mg/mL et de la γ-globuline 10 mg/mL) et de 50 µ L d’AMPc marqué à l’iode 125 (125I-ScAMPTME, 23000 cpm/tube ; dilué dans le tampon acétate auquel est ajouté de la BSA 1mg/mL). Les protéines sont précipitées par l’ajout de 1.2mL d’isopropanol (incubation 45 min à 4°C) puis centrifugées (3000rpm) 30 min à 4°C. La concentration en AMPc dans les échantillons est déterminée par comparaison aux valeurs obtenues pour une courbe standard réalisée en parallèle.
11. Dosage de l’activité arginase
Après stimulation, les cellules sont lysés dans une solution de Triton X-100 0.1% par agitation vigoureuse (30min à 4°C). Le lysat est mélangé à la solution d’activation (Tris-HCl 12mM, MnCl2 1mM) et incubé 10 min à 56°C. Le substrat (L-arginine, 0.2M, pH 9) est ajouté dans le lysat et incubé pendant 30-60min à 37°C. La réaction est stoppée par l’ajout d’un mélange acide (H2SO4/ H3PO4 (89%)/ H2O, ratio1/ 3 / 7). La présence d’urée (un des produits de dégradation de la L-arginine) dans le lysat est révélée par l’isonitrosopropiophenone (1%, stock à 9% dissout dans l’éthanol). Après incubation pendant 30min à 95°C, l’absorbance des échantillons est mesurée à 550nM. La concentration d’urée dans les échantillons est déterminée par comparaison aux valeurs obtenues pour une courbe standard réalisée en parallèle.
11. Dosage des nitrites
Le NO est indirectement mesuré par la présence de son produit de dégradation le nitrite. Des aliquots de surnageants sont mélangés à des volumes équivalents du réactif de Griess (Sigma) et incubés pendant 10min à RT. L’absorbance des échantillons est mesurée à 550nM. La concentration de nitrite dans les échantillons est déterminée par comparaison aux valeurs obtenues pour une courbe standard réalisée en parallèle.
13. Dosage du glucose
Le dosage du glucose est dosé dans le plasma des souris à l’aide du test enzymatique et colorimétrique fournis par Cypress Diagnostic. La concentration de glucose dans les échantillons est calculée en suivant les instructions du fabricant.
14. Expérimentations animales
14.1 Induction d’une réponse humorale
Cent micros litres d’une émulsion contenant de l’adjuvant complet de Freund (CFA) et du KLH 2 mg/mL (ratio 1/1, vol/vol) sont injectés en s.c. à la base de la queue. Pour mesurer la réponse primaire, le sang est prélevé en rétro orbitale sept jours plus tard puis incubé 2h-18h à 4°C. Les sérums sont récoltés après centrifugation (5min à 4°C, 16000g) et congelés à -80°C.
Le dosage des anticorps anti-KLH contenus dans les sérums est réalisé comme décrit plus haut.
14.2 Induction d’un choc septique
Un volume de 100µ L de LPS est injecté en r.o. Pour le dosage de cytokines (TNF-α, IL-6, IL-10) le sang est ponctionné en r.o. aux temps mentionnés. Les sérums sont récoltés après centrifugation (5min à 4°C, 16000g) et congelés à -80°C. Les cytokines sont dosées comme indiqué à la section 8.
14.3 Hépatite aigue
Pour étudier le recrutement des neutrophiles et les effets toxiques du choc septique au niveau du foie, le LPS est injecté simultanément avec de la D-galactosamine 70mg/mL en i .p. Les foies sont prélevés aux temps indiqués et traités selon le protocole d’immunohistochimie (voir section 4). Le recrutement des neutrophiles est quantifié en comptant les cellules MPO+ sur 10 surfaces identiques. Les résultats sont exprimés en nombre moyen de cellules comptées par champ.
14.4 Réaction d’hypersensibilité de contact (CHS)
Les CHS reprennent plusieurs types de réponses immunes. Nous utiliserons le modèle de dermatite par allergie de contact (ACD). Cette réaction est induite par l’application topique de DNFB (10µ L, 0.5%) sur l’oreille droite et le solvant (10µ L, 1 vol huile d’olive/ 4 vol acétone) sur l’oreille gauche. La réponse immune est quantifiée par des mesures, à l’aide d’un microcaliper (Mitutoyo), journalières de l’épaississement de l’oreille droite. Le gonflement est calculé comme suit : (OxD-O0D)-(OGx-O0G). O : épaisseur de l’oreille. x et 0 : temps. D et G : gauche et droite, respectivement.
14.5 Test à la formaline
Cinq µL d’une solution saline (NaCl 0,9%) contenant de la formaline (5%) sont injectés, à l’aide d’un stylo à insuline (OptiPrep, Aventis), dans le coussinet plantaire de la patte arrière droite tandis que la patte arrière gauche est injectée avec le même volume de la solution saline. L’épaisseur des pattes est mesurée, à intervalles réguliers, à l’aide d’un microcaliper (Mitutoyo). Le gonflement est calculé comme suit : (PxD-P0D)-(PGx-P0G). P : épaisseur de la patte. x et 0 : temps. D et G : gauche et droite, respectivement.
14.6 Migration des cellules de Langerhans
Dix µL d’une solution de FITC 0.8% sont appliqués sur l’oreille droite et le solvant (acétone/dibutylphtalate, 1 : 1) sur l’oreille gauche. Vingt-quatre heures plus tard, les ganglions drainants sont prélevés, traités pendant 45min à la collagénase III puis écrasés. La proportion de cellules FITC+qui expriment le marqueur CD11c (CD11c+) dans les ganglions est déterminée par cytométrie de flux.
14.7 Test de tolérance au glucose
Les souris (8-10 sem) sont privées une nuit (15-18h) de nourriture. Un premier échantillon (temps 0) de sang est prélevé en r.o. à l’aide d’un capillaire hépariné. Une dose de D-glucose (3mg/g) est injectée en i.p. puis du sang est prélevé aux temps indiqués. Le plasma est récupéré par centrifugation immédiate du sang et est congelé à -80°C.
15. Matériel
Sigma : ATPγS, ADPβS, adénosine, AMPc, UDP, UTP, uridine, NECA, CGS21680, CHA, IB-MECA, MRS1754, MRS2179, ionomycine, SPZ, D-galactosamine, KLH, CFA, LPS O111 :B4, BSA, γ-globuline, FITC, tyrode.
Astra-Zeneca : AR-C69931MX, AR-C67085MX Molecular probes : Fluo-4, F-127
Amersham : [α-32P]dATP Intervet : HCG, PMS
16. Analyses statistiques
Les analyses statistiques sont réalisées à l’aide du programme GraphPad Prism version 3.00 (GraphPad Software, San Diego, CA)
Tableau 1. Amorces utilisées au cours de ce travail
CCL12 AGAATCACAAGCAGCCAGTGT TCAGCACAGATCTCCTTATCCA CCL2 GTCACCAAGCTCAAGAGAGAGAGGT ACTGTCACACTGGTCACTCCTA CCL3 ATGAAGGTCTCCACCACTGCCCTTG GGCATTCAGTTCCAGGTCAGTGAT CXCL9 TCCTCTTGGGCATCATCTTC GCATCGTGCATTCCTTATCA Arginase I TGGCAGAGGTCCAGAAGAAT ATGCTTCCAACTGCCAGACT Arginase II AGGAACTGGCTGAAGTGGTT ATGGTACCTATTGCCAGGCTGT IL-27p28 TGTCCACAGCTTTGCTGAAT CCTGGAAAGTCAGGGAAACA VEGF AGCAGAAGTCCCATGAAGTGA ATGTCCACCAGGGTCTCAAT VitD3R AGCTGAACCTCCATGAGGAA GGCTTCAACCAGCTTAGCAT CD14 TGAATCCCACTCGGAGAAGT AGCAAAGCCAGAGTTCCTGA IL-10 TGAATTCCCTGGGTGAGAAG GCTCCACTGCCTTGCTCTTA TNF-α GCCTCCCTCTCATCATCAGTTCTA GCTACGACGTGGGCTAAG P2Y12 GTGTTGACACCAGGCACATC TCCCGGAGACACTCATATCC RPL 32 AACCCAGAGGCATTGACAAC AACCCAGAGGCATTGACAAC CANX TTGCTGACTCCTTTGACAGAGG CCACTTTCCATCATATTTGGCA YWHAZ TGCAACGATCTACTGTCTCTT CGGTAGTAGTCACCCTTCATTTTCA Krt14 GACCATCGAGGACCTGAAGA GTCGATCTGCAGGAGGACAT
RT-PCR Amorces sens Amorces anti-sens
A1 CATTGGGCCACAGACCTACT GCTTGCGGATCAGGTAGAAG A2A CACGCAGAGTTCCATCTTCA AGGTAGATGGCCAGCATGAG A2B TGCTCACACAGAGCTCCATC GGAAGGACACACCCAAAGAA A3 GGACTGGCTGAACATCACCT CAGCAAAGGCCCAAGAATAG P2Y12 CCGGAGACACTCATATCCTTC GCCCAGATGACAACAGAAAG P2Y13 (trans-intron) ATTCGTGGGTTGAGCTAGTAA ATCAGGGACCAGACGGAAAT P2Y13 CAGACTTGATAATGGCAC TCAGAATAAACACAGCCC
HPRT CCTGCTGGATTACATTAAAGCACTG GTCAAGGGCATATCCAACAACAAAC Néo TGCTCCTGCCGAGAAAGTAT CAACAGATGGCTGGCAACTA
Génotypage
gen 1 ATCCCCAGCAATTCCACCT
gen 2 CCTGCTGTCCTTACTCCTAAACTTC gen 3 GGCTCGACTAGAGGATCAGCTTG
Tableau 2. Milieux de culture utilisés au cours de ce travail
DMEM (invitrogen) DMEM (invitrogen)
FBS (Invitrogen) 10% décomplémenté FCS (MultiCell) 10% décomplémenté Acides aminés non essentiels 0.1mM chacun Acides aminés non essentiels 0.1mM chacun
L-glutamine 2mM L-glutamine 2mM
Pyruvate de sodium 1mM Pyruvate de sodium 1mM
β-mercaptoethanol 50µM β-mercaptoethanol 50µM
Péniciline 50U/mL Péniciline 50U/mL
Streptomycine 50µg/mL Streptomycine 50µg/mL
LIF 100U/mL
M2/M16 BMDC
M2/M16 (Eurogentec) RPMI1640 (Invitrogen)
FCS (MultiCell) 10% décomplémenté FCS (MultiCell) 10% décomplémenté
Péniciline 50U/mL Acides aminés non essentiels 0.1mM chacun
Streptomycine 50µg/mL L-glutamine 2mM
Pyruvate de sodium 1mM
DC spléniques β-mercaptoethanol 50µM
RPMI1640 (Invitrogen) Péniciline 50U/mL
Ultroser HY (Ciphergen) 2% Streptomycine 50µg/mL
Acides aminés non essentiels 0.1mM chacun GM-CSF (Invitrogen) 20ng/mL L-glutamine 2mM
Pyruvate de sodium 1mM β-mercaptoethanol 50µM Péniciline 50U/mL Streptomycine 50µg/mL
Tableau 3. Liste des anticorps utilisés au cours de ce travail
CD80 16-10A1 eBioscience
CD86 P03.1 eBioscience
MHCII 2G9 BD Pharmingen
CD11c N418 *
IgM eB121-15F9 eBioscience
B220 RA3-6B6 eBioscience
CD21 eBio4E3 eBioscience
CD24 M1/69 eBioscience
CD3 145-2C11 *
GR-1 RB6-8C5 eBioscience
F4/80 BM8 eBioscience
MPO (polyclonal) Serotec
CD11b M1/70 eBioscience
Ter119 Ter-119 eBioscience
CD8α 53-6.7 eBioscience
Pan NK DX5 eBioscience
CD43 S7 BD Pharmingen
CD19 MB19-1 eBioscience
CD40 1C10 eBioscience
CD14 Sa2-8 eBioscience
* Laboratoire de Physiologie Animale (IBMM, ULB)
