Faculté de Pharmacie
Ecole Doctorale en Sciences Biomédicales et Pharmaceutiques
Problématique de la dépigmentation cutanée au Rwanda.
Modulateurs de la tyrosinase extraits de plantes utilisées en
médecine traditionnelle.
Léocadie KAMAGAJU
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences
Biomédicales et Pharmaceutiques
Promoteur et co-promoteurs :
Prof.Ghanem GHANEM (Laboratoire d’Oncologie et de Chirurgie Expérimentale)
Prof Pierre DUEZ (Service de Chimie Thérapeutique et de Pharmacognosie, UMONS)
Prof Elias BIZURU (University of Rwanda)
Composition du jury:
Prof. Jean-Michel KAUFFMANN (Faculté de Pharmacie, Université Libre de Bruxelles) Prof. François DUFRASNE (Faculté de Pharmacie, Université Libre de Bruxelles) Prof Viviane HENSCHEL (Faculté de Pharmacie, Université Libre de Bruxelles) Prof Frédéric COTTON (Faculté de Pharmacie, Université Libre de Bruxelles) Prof Stéphanie POCHET (Faculté de Pharmacie, Université Libre de Bruxelles) Prof François BAILLEUL (Jury externe, Faculté des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques, Université de Lille)
Avril 2014
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«Les deux guerriers les plus puissants sont la patience et le temps.
N’oublie pas que les grandes réalisations prennent du temps et qu’il
ii
Dédicace
A ma feue mère Léoncie,
Source de mon existence,
Tu es partie tôt sans me voir faire un pas de géant.
iii
Remerciements
Ce travail a été réalisé dans deux laboratoires, je souhaiterais adresser mes remerciements aux personnes ayant participé à sa réalisation.
Je remercie le Professeur Pierre DUEZ pour m’avoir accueillie dans son laboratoire et pour avoir initié et encadré ce travail. J’ai eu le temps d’apprécier son esprit scientifique, d’analyse et de coordination. Je le remercie tout particulièrement pour avoir su gérer la fin difficile de ma thèse.
Je remercie le Professeur Ghanem GHANEM qui m’a aussi accueillie dans son laboratoire; votre expérience et vos connaissances que vous m’avez partagées ont été d’une grande importance pour pouvoir entrer dans le fond du travail. Un grand merci pour la confiance que vous m’avez témoignée en mettant tout le matériel de laboratoire à ma disposition.
Je remercie du fond de mon cœur le Dr Renato MORANDINI. Vous avez suivi ce travail depuis le tout début, vous avez connu mes premières manipulations en culture cellulaires. Un tout grand merci pour les connaissances que vous m’avez partagées, pour votre patience et pour les corrections de différentes parties de la thèse.
Je remercie le Professeur Caroline STÉVIGNY, pour sa disponibilité et pour le suivi journalier. Pour la dimension humaine qui a accompagné sa collaboration, qu’elle veuille bien trouver ici l’expression de ma gratitude.
Je remercie le Dr Elias BIZURU pour avoir accepté de codiriger ce travail, pour son amour du travail bien fait et pour sa rigueur scientifique.
Je remercie les membres du Comité d’accompagnement qui ont suivi, année par année, l’évolution de mes travaux; qu’ils trouvent ici l’expression de ma reconnaissance pour les conseils prodigués.
Ma gratitude va aussi à tous les membres du jury qui, malgré leurs multiples occupations, ont accepté de porter un jugement à cette thèse.
iv
Que toute l’équipe du Centre d’Instrumentation et de Résonance Magnétique Nucléaire (Mme Rita D’ORAZIO, Mme Stéphanie MUGENIWABAGARA et Mme Lidija STEFANOSKA) trouve ici l’expression de ma gratitude pour la disponibilité dont ils ont fait preuve dans le relevé des spectres RMN.
Mes remerciements vont à toute l’équipe de notre laboratoire : à Marie FAES et Olivier VAILLANT pour votre disponibilité et le matériel que vous avez mis à ma disposition. A vous mes chers collègues chercheurs et stagiaires (Marie-Jeanne, Philippe, Carole, Catherine, Valérian, Jérémie, Jacob, Hanène, Naïma, Fatiha, Sihem, Eddy, Eméry, Bakari, Albert, Aminata, Francine). Merci de vos encouragements et, tout particulièrement, de la bonne ambiance que votre présence a créée au laboratoire.
Je tiens à remercier toute l’équipe du Laboratoire d’Oncologie et de Chirurgie Expérimentale de l’Institut Bordet pour sa collaboration, pour son aide quand il le fallait. Un tout grand merci pour la bonne ambiance du laboratoire.
Mes remerciements vont à Cédric DELPORTE du service de Chimie Pharmaceutique Organique de la Faculté de Pharmacie, ULB, pour le relevé des spectres de masse.
Ce travail n’aurait sûrement jamais vu le jour sans le soutien financier de la Coopération Technique Belge (CTB) que je remercie vivement ; je remercie aussi tous les gestionnaires de mon dossier en Belgique, et surtout Gaëlle Ducarme, ainsi qu'au Rwanda. Merci au Fonds De Meurs – François, au Fonds David et Alice Van Buuren et au Fond CUD d’aide à la fin de thèse, pour le complément financier qui m’a été accordé.
Merci aux gestionnaires de l’ASBL « Escale Nord-Sud » (Mme Jeannine DELECLOS, Mme Marie Claire BAECKE) pour l’hébergement et surtout pour votre gentillesse qui m’a fort marquée durant tout le séjour au foyer.
Je remercie du fond du cœur Marie Lydie PELGRIMS et Sybille DEL MARMOL pour avoir rendu notre séjour en Belgique agréable.
v
Résumé
La dépigmentation volontaire est une pratique bien connue en Afrique sub-saharienne. Elle se définit comme une pratique par laquelle une personne, de sa propre initiative, tente de diminuer la pigmentation mélanique physiologique de sa propre peau. Les utilisateurs appliquent sur le corps, généralement sans surveillance médicale, de manière soutenue et prolongée, des produits ou des mélanges chimiques composés d’actifs dépigmentants souvent d’une grande nocivité.
Cette pratique est documentée dans plusieurs pays d’Afrique sub-saharienne (Sénégal, Mali, Burkina Faso, Togo, Nigéria, ….), et sur d’autres continents. Face à l’absence de données chiffrées pour le Rwanda, nous avons réalisé une étude des pratiques de la dépigmentation volontaire dans la capitale du pays, Kigali.
Au Rwanda, certaines plantes étaient utilisées lors des grandes cérémonies comme le mariage, spécialement par les femmes et les jeunes filles, pour éclaircir la peau. Une peau claire semble en fait un critère de beauté dans certaines traditions africaines. Nous avons donc réalisé une enquête ethnobotanique auprès de 61 tradipraticiens rwandais, afin de connaître les plantes qui, avant l’arrivée de la cosmétique moderne, étaient utilisées pour « embellir » (éclaircir) la peau, afin de vérifier si ces plantes pourraient interférer avec la production de la mélanine.
Notre enquête nous a permis de documenter 28 espèces, dont cinq [Brillantaisia cicatricosa LINDAU;
Chenopodium ugandae (Aellen) Aellen ; Dolichopentas longiflora Oliv.; Protea madiensis Oliv.
subsp. Madiensis et Sesamum angolense Welw.] se sont distinguées par leur pourcentage de citation par les tradipraticiens. Ces dernières ont fait objet de notre étude de laboratoire.
Des extraits de polarité croissante, préparés à partir de ces cinq plantes, ont été testés pour leur modulation de la mélanogénèse et de la tyrosinase (enzyme clé de la mélanogenèse) sur une série de modèles: (i) sur la tyrosinase humaine dans les extraits totaux de mélanocytes normaux; (ii) sur des mélanocytes malins en culture (pour évaluer l’effet global des extraits de plante sur la mélanogenèse);
(iii) sur la tyrosinase de champignon en solution et sur chromatoplaque de silice; et enfin (iv) sur
l’activité tyrosine hydroxylase de l'enzyme.
vi
champignon. Ces deux extraits ont été soumis à une série de fractionnements dans le but d’isoler et d’identifier des composés actifs. Trois composés ont été isolés de Protea madiensis (2-tridécanone, acide oléique et β-sitostérol). La 2-tridécanone et l’acide oléique ont montré une inhibition de la tyrosinase de champignon sur chromatoplaque et de la tyrosinase humaine dans les extraits cellulaires. De plus, la 2-tridécanone a montré une inhibition de l’activité tyrosine hydroxylase. Le β-sitostérol n’a pas montré d’effet sur nos modèles mais il a déjà été isolé dans d’autres études en tant qu'inhibiteur de la tyrosinase. De l’extrait à l’acétate d’éthyle de Sesamum angolense Welw., nous avons isolé l’acide ursolique qui a montré une augmentation de l’activité de la tyrosinase de champignon sur chromatoplaque.
L’enquête ethnobotanique nous a permis de constater que la flore rwandaise regorge de plantes aux vertus cosmétiques intéressantes; celles-ci pourraient représenter une alternative aux actifs dépigmentants connus pour leurs nombreux effets secondaires mais néanmoins largement disponibles sur le marché rwandais.
L’enquête réalisée dans la ville de Kigali, nous a permis de constater que 27 % de notre population d’étude sont des utilisateurs conscients de produits dépigmentants. Ce pourcentage nous semble fort élevé et des mesures devraient être prises pour la sensibilisation et la conscientisation de la population quant aux risques encourus et à l’existence de médecines traditionnelles à visée dépigmentante. Ces mesures devraient être combinées avec la recherche de composés naturels dans l'espoir d'identifier des molécules actives et faiblement toxiques, voire atoxiques.
L’étude de la modulation de la pigmentation par les extraits des cinq plantes sélectionnées, nous a permis de confirmer l’information reçue des tradipraticiens. Cette étude nous a également montré que ces extraits de plantes renferment des activateurs de la mélanogenèse, qui pourraient être exploités pour le bronzage recherché par les sujets de peau claire.
vii
Summary
Voluntary depigmentation, well-known in sub-Saharan Africa, is defined as a practice by which a person, by his/her own initiative, attempts to reduce his/her skin physiological melanin pigmentation. Users apply on the body, usually without medical supervision, in a sustained and prolonged manner, depigmenting compounds, single or in mixtures.
This quite harmful practice is documented in several sub-Saharan African countries (Senegal, Mali, Togo, Nigeria…) and in other continents. The absence of Rwandese data prompted us to conduct a study of the practices of voluntary depigmentation in the capital, Kigali.
In Rwanda, some plants were used during important ceremonies like wedding (marriage) especially by women and girls to lighten their skin. Fair skin is actually considered as a beauty criterion in some African traditions.
We conducted an ethnobotanical survey of 61 Rwandan traditional healers to identify the plants that were used before the introduction of modern cosmetics to "beautify" (lighten) the skin in order to check wether these plants could interfere with the production of melanin.
Our survey allowed us to identify and collect 28 species, of which 5 were selected (retained) for their higher percentage of citation by traditional healers [Brillantaisia cicatricosa LINDAU; Chenopodium
ugandae (Aellen) Aellen ; Dolichopentas longiflora Oliv.; Protea madiensis Oliv. subsp. madiensis
and Sesamum angolense Welw.]. These five species have been used for our laboratory study.
Extracts of increasing polarities were prepared from the five plants and tested for their ability to modulate melanogenesis and tyrosinase (the key enzyme of melanogenesis) in a series of models: (i) human tyrosinase in total extracts from normal melanocytes; (ii) malignant melanocytes in culture (in order to assess the global effect of plant extracts on melanogenesis); (iii) mushroom tyrosinase in solution and on TLC plate; and finally (iv) tyrosine hydroxylase activity of the enzyme.
viii
oleic acid showed an inhibition of mushroom tyrosinase on TLC and human tyrosinase in cellular extracts. In addition, 2-tridecanone showed an inhibition of the tyrosine hydroxylase activity. β-sitostérol showed no effect on our models but has been identified, in other studies, as a tyrosinase inhibitor. From the ethyl acetate extract of Sesamum angolense, we isolated ursolic acid which increases the mushroom tyrosinase activity on TLC.
The ethnobotanical survey allowed us to (state) notice that Rwandan flora contains plants that have interesting cosmetic properties and could be an alternative to the use of harmful depigmenting products which are sold on Rwandese markets.
The survey conducted in Kigali city indicates that 27 % of surveyed persons are conscious users of depigmenting products. This percentage seems very high so that measures should be taken to raise awareness about the involved risks and of the existence of traditional medicines with such depigmenting effects. These measures should be accompanied (combined) with the search for natural compounds with depigmenting effect in the hope to identify actives that would be weakly or even non toxic at all.
The study of the pigmentation modulation by five selected plant extracts allowed to confirm the information obtained from traditional healers. It also indicates that, apart from an inhibitory effect, some of our plant extracts also contain melanogenesis activators that could be further exploited for tanning, an aspiration of fair-skinned individuals.
ix
Table des matières
Dédicace ...i
Remerciements ... iii
Résumé ...v
Summary ... vii
Table des matières...ix
Liste des abréviations ... xv
1. Introduction ... 1
1.1. La dépigmentaon volontaire... 2
1.1.1. Notion de dépigmentation volontaire ... ……..2
1.1.2. Historique de la dépigmentation volontaire ... 3
1.1.3. Localisation géographique de la pratique de dépigmentation volontaire ... 4
1.1.4. Evolution de la domination de la peau claire ... 5
1.1.5. Les motivations à la dépigmentation volontaire ... 7
1.1.6. Le trafic des produits dépigmentants et la réglementation quant à leur utilisation. ... ……...11
1.1.7. Classification des actifs dépigmentants trouvés sur le marché de certains pays d’Afrique……. 13
1.1.8. Effets indésirables liés à l’usage de certains produits dépigmentants ...15
1.1.9. Les produits dépigmentants vendus sur le marché Européen et international contre les taches pigmentaires de la peau claire. ...19
1.2. La pigmentation de la peau humaine... 21
1.2.1. La peau ... 21
x
1.2.1.2. Les effets biologiques du soleil sur la peau ... 22
1.2.1.3. Structure de la peau ... 23
1.2.1.4. Les kératinocytes ... 25
1.2.1.5. Les mélanocytes ... 25
1.2.1.6. La mélanogenèse ... 27
1.2.1.7. Biochimie de la mélanogénèse. ... 28
1.2.1.7.1. La maturation des mélanosomes ... 28
1.2.1.7.2. La synthèse de la mélanine (mélanogenèse) ... 30
1.2.1.7.3. Transfert des mélanosomes... 31
1.2.2. La pigmentation chez les mammifères et sa régulation hormonale ... 32
1.2.3. Les différents types de peau ou phototypes ... 33
1.2.4. Peau « noire » et peau « blanche » ...36
1.3. Modulation de la pigmentation. ...37
1.3.1. Pourquoi inhiber la mélanogenèse ? ...38
1.3.2. Les cibles potentielles d’inhibition de la pigmentation. ...38
1.3.3. La tyrosinase (E.C. 1.14.18.1) ... 40
1.3.4. Classification des inhibiteurs de la tyrosinase ... 42
1.4. La recherche de composés hypopigmentants ...44
1.4.1. Les inhibiteurs de la tyrosinase ... 44
1.4.1.1. Les principales découvertes antérieures ...45
1.4.1.1.1. L’hydroquinone ...45
xi
1.4.1.1.3. Les dérivés mercuriels ...46
1.4.1.1.4. L’acide azélaïque ...47
1.4.1.2. Inhibiteurs naturels et synthétiques ...47
1.4.1.3. Extraits de plantes ...48
1.5. Description des plantes étudiées ... 51
1.5.1. Brillantaisia cicatricosa LINDAU ... 51
1.5.1.1. La famille des Acanthaceae ... 51
1.5.1.2. Le genre Brillantaisia P. BEAUV. ... 52
1.5.1.3. L’espèce Brillantaisia cicatricosa LINDAU ...52
1.5.2. Chenopodium ugandae (Aellen) Aellen ...……..54
1.5.2.1. La famille des Chenopodiaceae ... 54
1.5.2.2. Le genre Chenopodium L...54
1.5.2.3. L’espèce Chenopodium ugandae (Aellen) Aellen ...55
1.5.3. Dolichopentas longiflora Oliv. (Pentas longiflora Oliv.) ...56
1.5.3.1. La famille des Rubiaceae ...56
1.5.3.2. Le genre Pentas (Dolichopentas) ...57
1.5.3.3. L’espèce Dolichopentas longiflora Oliv. (Pentas longiflora Oliv.) ...57
1.5.4. Protea madiensis Oliv...58
1.5.4.1. La famille des Proteaceae ...58
1.5.4.2. Le genre Protea ...58
1.5.4.3. L’espèce Protea madiensis Oliv. ...59
xii
1.5.5.1. La famille des Pedaliaceae ...60
1.5.5.2. Le genre Sesamum L. ...61
1.5.5.3. L’espèce Sesamum angolense WELW. ...61
2. Objectifs du travail ...62
3. Matériel et méthodes ...65
3.1. Choix des plantes à étudier : enquête auprès des tradipraticiens ...66
3.1.1. Choix de la population d’étude. ...66
3.2. Enquête sur les pratiques de la dépigmentation volontaire dans la ville de Kigali ...67
3.3. Description du matériel végétal...68
3.3.1. Lieu de récolte des plantes et herbiers ...69
3.3.2. Identification des plantes étudiées ...71
3.4. Préparation des extraits pour tests biologiques et criblage phytochimique ... 72
3.5. Tests biologiques ... 75
3.5.1. Culture cellulaire ... 75
3.5.2. Milieu de culture ... 76
3.5.3. Lignées cellulaires ... 76
3.5.4. Comptage cellulaire ... 77
3.5.5. Solubilisation des extraits de plantes pour tests biologiques. ... 77
3.5.6. Mesure de la survie cellulaire et de la Cytotoxicité ... 78
3.5.6.1. Principe ... 78
3.5.6.2. Protocole ... 79
xiii
3.5.7.1. Préparation des solutions et des extraits cellulaires ... 79
3.5.7.2. Dosage colorimétrique des protéines des extraits cellulaires ... 80
3.5.7.3. Mesure de l’activité tyrosinase ... 81
3.6. Inhibition de l’activité de la tyrosinase de champignon sur chromatoplaque couche mince. ... 81
3.6.1. Avant séparation chromatographique ... 82
3.6.2. Après séparation chromatographique ... 82
3.7. Inhibition de la tyrosinase de champignon en solution ... 83
3.7.1. Protocole ... 83
3.8. Inhibition de l’activité tyrosine hydroxylase: Méthode de Pomerantz ... 84
3.8.1. Principe ... 84
3.8.2. Réactifs utilisés ... 85
3.8.2. Protocole ... 86
3.9. Fractionnement chromatographique bioguidé ... 87
3.9.1. Solvants et réactifs ... 87
3.9.2. Méthodes chromatographiques ... 88
3.9.2.1. La Chromatographie sur Couche Mince (CCM) ... 88
3.9.2.2. La flash-chromatographie ... 88
3.9.2.3. La chromatographie sur couche mince préparative ... 89
3.9.2.4. Fractionnement de l’extrait acétate d’éthyle de Protea madiensis Oliv. ...89
3.9.2.5. Isolement et identification de molécule pigmentante à partir de l’extrait à l’acétate d’éthyle de Sesamum angolense Welw. ...94
xiv
3.9.3.1. Analyses par spectrométrie de masse ... 95
3.9.3.2. Analyses par Résonance Magnétique Nucléaire ... 95
4. Résultats et Discussion ... 96
4.1. Enquête ethnobotanique sur les plantes médicinales utilisées au Rwanda pour la dépigmentation volontaire. ... 99
4.2. Enquête sur les pratiques de la dépigmentation volontaire et cosmétiques dans la ville de Kigali, au Rwanda. ... 113
4.3. Modulation de la tyrosinase par cinq plantes de la médecine traditionnelle Rwandaise utilisées pour le traitement des problèmes de la peau. ... 135
4.4. Les modulateurs de la tyrosinase à partir Protea madiensis Oliv. (Proteaceae) et Sesamum angolense Welw. (Pedaliaceae)... 150
5. Conclusions et Perspectives ...174
5.1. Conclusions ... 175
5.2. Perspectives ... 176
6. Bibliographie ... 179
xv
Liste des abréviations
ADN : acide désoxyribonucléique
AMP cyclique : adénosine monophosphate cyclique
APCI : atmospheric pressure chemical ionisation (ionisation chimique à pression
atmosphérique)
CCM : chromatographie sur couche mince
Dct : dopachrome tautomérase
DEPT : distortionless enhancement by polarisation transfer
DHI : 5,6-dihydroxyindole
DHICA : acide 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylique
DMSO : diméthylsulfoxyde
DOPA : 3,4-dihydroxyphénylalanine;
GC : chromatographie gazeuse
HBTA : 5-hydroxy-1,4-benzothiazinylalanine.
HMQC :heteronuclear multiple bond correlation
HSQC : heteronuclear single quantum correlation
IC50 : inhibitory concentration 50 % (concentration inhibant 50 %)
ICAQ : acide 5-indole-2-carboxylique, 6-quinone
IQ : indole-5,6-quinone
IRST : Institut de Recherche Scientifique et Technologique
xvi
MC2R : melanocortin 2 receptor (Récepteur de la mélanocortine de type 2)
Mitf : microphtalmia-associated transcription factor (facteur de transcription associé
à une microphtalmie)
MS-MS : mass spectrometry – mass spectrometry (spectrométrie de masse –
spectrométrie de masse)
MTT : méthyltétrazolium
O3 : ozone
PAR-2 : proteinase-activated receptor 2 (récepteur 2 de la protéinase-activaté)
POMC : pro-opiomélanocortine
RMN : résonance magnétique nucléaire
ROS : reactive oxygen species (espèces réactives de l’oxygène)
TGF-β1 : transforming growth factor- β1 (facteur de croissance transformant-β1)
TMBC : 2,4, 2’, 4’-tétrahydroxy-3-(3-méthyl-2-butényl) -chalcone
TMS : triméthylsilane
TNF-α : tumor necrosis factor- α (facteur de nécrose tumorale- α)
TPA : 12-O-tétradécanoylphorbol-13-acétate
TYR : tyrosinase
TYRP1&2 : tyrosinase-related proteins 1&2
UV : ultraviolet
α-MSH : α-melanocyte stimulating hormone (hormone de stimulation des
